НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д. К. ЗАБОЛОТНОГО

ДАНКЕВИЧ ЛЮДМИЛА АНАТОЛІЇВНА

УДК 579.8+841.1

ФЕНОТИПОВІ ТА ГЕНОТИПОВІ ВЛАСТИВОСТІ БАКТЕРІЙ РОДУ PSEUDOMONAS – ЗБУДНИКІВ БУРОЇ БАКТЕРІАЛЬНОЇ ПЛЯМИСТОСТІ ЛЮПИНУ

03.00.07 ? мікробіологія

Автореферат

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ-2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук,

професор

Гвоздяк Ростислав Ілліч,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу фітопатогенних бактерій.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Кіпріанова Олена Андріївна,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу антибіотиків

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Коваленко Павло Григорович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

старший науковий співробітник відділу молекулярної генетики.

Провідна установа: Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться 18 жовтня 2006 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології
ім. Д.К. Заболотного за адресою: Д 03680, м. Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154

Автореферат розіслано "16" вересня 2006 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Л.М. Пуріш

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Люпин є цінною бобовою культурою, яку широко використовують у тваринництві та рослинництві, а також хімічній, парфумерній та харчовій промисловостях. Сучасна селекція дозволяє значно розширювати застосування люпину, яке у минулому обмежувалось високим природним вмістом у ньому алкалоїдів. Проте виведені районовані сорти люпину більше уражаються збудниками захворювань різної етіології, що призводить до значної втрати врожайності [Лісовий, 1999; Бардаков, 2002]. Увагу сучасних фітопатологів здебільшого привертають збудники хвороб люпину грибної етіології [Rozs, Kovies, 1999; Бардаков, 2002], хоча загальновідомо, що бактеріальні хвороби є не менш шкідливими, ніж грибні [Билай и др., 1988; Лісовий, 1999].

Як показано в роботах І. Б. Корольової 1963-1965 років, серед збудників бактеріозів найбільшої шкоди люпину завдавали бактерії родів Pseudomonas та Erwinia. На думку багатьох дослідників до найбільш шкідливих захворювань люпину належить бура бактеріальна плямистість, яка викликається „Pseudomonas lupinі та знижує врожайність на 25-30% [Бельтюкова и др., 1974; Лісовий, 1999]. На теперішній час змінилися сорти та технології вирощування люпину, а також практично відсутні дані про роль „P. lupinі у захворюванні рослин [Билай и др., 1988; Васинаускене, 1990; Vasinauskiene, 1995]. Крім того, незважаючи на понад сорокарічний термін з моменту виділення та характеристики деяких фенотипових ознак, в сучасній літературі з систематики бактерій [Young et al., 1996; Дж. Хоулт и др., 1997] не значиться окремий вид „P. lupini”, запропонований І.Б.Корольовою та К.І. Бельтюковою [1971].

На часі невід'ємними критеріями бактеріального виду є жирнокислотний склад загальних клітинних ліпідів, співвідношення гуаніну та цитозину у геномній ДНК, спорідненість геномних ДНК, встановлена ДНК-ДНК гібридизацією, та гомологія нуклеотидної послідовності гену 16S pPHК [Wayne et al., 1987; Stackerbrandt, Goebel 1994; Ross-Mora, Amann, 2001; Романовская и др., 2003; Скрипаль, 2005; Ленгелер и др., 2005]. Разом з тим у спірних питаннях систематики актуальним є поліфазний підхід, який полягає у поєднанні аналізу фенотипових ознак з даними молекулярно-генетичних досліджень [Marques et al., 2000; Cыven et al., 2004; Коцофляк и др., 2004].

Тому дослідження фенотипових та генотипових властивостей збудника бурої бактеріальної плямистості люпину з метою встановлення його систематичного положення є актуальними.

Зв'язок теми з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у межах плану науково-дослідних робіт відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за бюджетними темами „Дослідження фітопатогенних бактерій фітоценозу та їх генопротекторних, мутагенних та протипухлинних властивостей” (державний реєстраційний номер № 0101U009312, 2002-2006 рр.) і „Збереження та забезпечення належного функціонування об'єкта, що становить національне надбання ? Колекція Мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України” (державний реєстраційний номер № 0105U003954, 2003-2005 рр.).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було встановлення систематичного положення „Pseudomonas lupinіBeltjukova, Koroljova [1971] збудника бурої бактеріальної плямистості люпину, на основі вивчення фенотипових та генотипових ознак колекційних та ізольованих нами штамів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Виділити з уражених тканин люпину штами бактерій для подальшого їх вивчення в порівнянні з колекційними штамами.

2. Вивчити стійкість сучасних районованих сортів люпину та інших бобових культур до ізольованих нами та колекційних штамів „P. lupini.

3. Охарактеризувати морфологічні, культуральні, фізіологічні та біохімічні властивості і ознаки збудника бурої бактеріальної плямистості люпину.

4. Дослідити спорідненість антигенних детермінант ізольованих нами і колекційних штамів „P. lupinі між собою та з типовими представниками чотирьох серогруп.

5. Визначити жирнокислотний склад загальних клітинних ліпідів свіжовиділених та колекційних штамів „P. lupinі.

6. Встановити молярні відсотки гуаніну і цитозину у геномній ДНК штамів
„P. lupinі.

7. Визначити нуклеотидні послідовності гену 16S pPHК штамів „P. lupinі.

8. На основі аналізу фенотипових та генотипових ознак встановити видовий статус „P. lupinі.

Об'єкти досліджень ? 18 штамів виділених нами з уражених тканин люпину та 5 колекційних штамів „P. lupinі; 2 видотипових та 4 серотипових штами, які зберігаються у колекції відділу фітопатогенних бактерій; рослини люпину з наявними ознаками ураження; 9 районованих сортів 2 видів люпину (Lupinus albus, Lupinus luteus), багаторічний люпин (Lupinus polyphyllus) та 6 видів бобових культур (Phaseolus vulgaris, Pisum sativum, Glycine max, Cicer arietinum, Vicia faba, Vicia sativa).

Предмет дослідження ? патогенні, морфологічні, культуральні, фізіологічні, біохімічні, серологічні, хемотаксономічні та молекулярно-генетичні властивості і ознаки збудника бурої бактеріальної плямистості люпину.

Методи дослідження ? фітопатологічні, мікробіологічні, імунологічні, біохімічні, фізико-хімічні та молекулярно-генетичні, зокрема ПЛР, клонування та сиквенування, а також статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів:

Встановлена подібність морфологічних, культуральних, фізіологічних, біохімічних властивостей свіжовиділених та колекційних штамів „P. lupinі до типового штаму Pseudomonas syringae pv. syringae В1027. Проведено серогрупування 17 свіжовиділених штамів „P. lupinі на основі спорідненості їх антигенних детермінант як з колекційними штамами „P. lupinі”, так із штамами типових представників І та ІІІ серогруп.

Вперше виявлена подібність жирнокислотного складу клітинних ліпідів штамів „P. lupinі” та типового штаму P. syringae pv. syringae В1027.

Вперше виявлено розбіжності кількості гуаніну та цитозину у геномної ДНК 5 колекційних, 2 свіжовиділених штамів „P. lupinі” та типового P. syringae pv. syringae В1027. Штам 8531 має вищий на 3,1 мол.% вміст ГЦ пар у геномній ДНК порівняно з іншими штамами та типовим штамом P. syringae pv. syringae В1027. Вищу на 1 – 0,7 мол.% порівняно з іншими штамами кількість гуаніну та цитозину у геномної ДНК також мають штами 8535, 8532 та 17.

Вперше визначено гомологію (99-100%) нуклеотидних послідовностей генів 16S pPHК 7 штамів „P. lupinі із задепонованими у GenBank нуклеотидними послідовностями цього гену деяких патоварів видів Pseudomonas syringae та Pseudomonas sаvastanoi. Проведено депонування у GenBank послідовностей генів 16S pPHК 7 штамів „P. lupinі та типового штаму P. syringae pv. syringae В1027.

За комплексом фенотипових та генотипових ознак рекласифіковано 7 штамів „P. lupinі”, з яких 6 штамів віднесено до P. syringae pv. syringae і лише штам 8531 до P. savastanoi pv. glycinea.

Показана залежність між вмістом алкалоїдів у сортах люпину та їх стійкістю до штамів „P. lupinі”. Найменш стійкими до збудника бурої бактеріальної плямистості виявилися безалкалоїдні сорти люпину, відносно стійкими малоалкалоїдні сорти, а найстійкішим високоалколоїдний багаторічний люпин. Показана здатність як свіжовиділених так і колекційних штамів „P. lupinі уражати широке коло бобових культур. Чутливими до збудника бурої бактеріальної плямистості люпину є квасоля, горох, нут, соя, а не чутливими ? кормові боби та вика.

Практичне значення одержаних результатів. Виділені високоагресивні штами фітопатогенних бактерій роду Pseudomonas можуть бути використані для тестування стійкості нових сортів бобових культур до збудника бурої бактеріальної плямистості люпину. Встановлену спеціалізацію збудника необхідно враховувати при створенні оптимальних сівозмін сільськогосподарських культур з врахуванням поліфаговості збудника бурої бактеріальної плямистості люпину.

Комплексна характеристика фенотипових та генотипових ознак штамів фітопатогенних представників роду Pseudomonas може бути використана у їхній ідентифікації науковими та практичними лабораторіями.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації підібрано літературу та методики, виконані представлені в дисертації експериментальні дослідження. Аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретація та формулювання основних положень і висновків, підготовка до друку наукових статей проведені особисто під керівництвом наукового керівника дисертаційної роботи д.б.н., проф. Р.І. Гвоздяка. Ідентифікація метилових ефірів жирних кислот проведена на базі хроматографічної лабораторії Науково-дослідного центру Укрметртестстандарт за участю інж.
О.В. Голубець та к.т.н., зав.лаб. В.А. Кищенко, з якими автор має спільні публікації. Ампліфікування, клонування та сиквенування генів 16S рРНК штамів фітопатогенних бактерій роду Pseudomonas здійснено автором особисто на базі відділу молекулярно-діагностичних досліджень, лабораторії якості та безпеки продукції АПК Національного аграрного університету. Імунізація тварин проведена автором спільно з к.б.н., ст.н.с. Інституту мікробіології і вірусології НАН України Л.М. Яковлевою.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідалися на трьох конкурсах робіт молодих вчених Інституту мікробіології та вірусології
ім. Д.К. Заболотного НАН України, Міжнародній конференції „Сучасний стан та перспективи розвитку мікробіології і біотехнології” (Мінськ, Білорусь, 2004), Міжнародній науково-теоретичній конференції молодих учених „Молодь і досягнення науки у вирішенні проблем сучасності” (Чернівці, Україна, 2003), ІІІ(Х) з’їзді Товариства Мікробіологів України (Одеса, Україна, 2004), восьмій та дев'ятій Міжнародній Пущінській школі-конференції молодих вчених „Биология ? наука ХХІ века” (Пущино, Росія, 2004, 2005), першій Міжнародній конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ в біології” (Львів, Україна, 2005) та Міжнародній конференції „Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія.” (Київ, Україна, 2005).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 12 робіт (6 статей в профільних журналах і 6 тез доповідей).

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, розділів експериментальних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних літературних джерел та додатків. Повний обсяг складає 165 сторінок друкованого тексту, що включає 26 рисунків, 22 таблиці, 3 додатки та перелік використаних джерел ? 162 найменування, з яких 98 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. У роботі були використані 5 колекційних штамів „Pseudomonas lupini” Beltjukova, Koroljova [1971] та 18 ізольованих нами з уражених тканин люпину. У дослідженнях також використані два типових штами P. syringae pv. syringae УКМ В1027Т (ATCC 19310, NCPPB 281) та P. savastanoi pv. phaseolicola УКМ В1123Т (ІСМР 2740, NСРРВ 52), три штами P. syringae pv. syringae 8566, 8569, 8651 та один – P. syringae pv. atrofaciens 8254, які зберігаються у колекції відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології та вірусології НАН України ім. Д.К. Заболотного.

Вірулентні властивості штамів вивчали методом штучного зараження рослин наприкінці періоду квітнення та фази молочної стиглості бобів, водною суспензією однодобових клітин бактерій (107 кл/мл). Облік вірулентності штамів проводили на сьомий день після зараження за 10-ти бальною шкалою. Дослідження здійснювали на 7-ми районованих сортах люпину білого – Володимир, Борки, Піщовий, Олєжка, Вересневий, Туман, Синій парус та 2-х сортах люпину жовтого – Обрій та Промінь, а також квасолі сорту Мавка, гороху ? Харківський 29, сої ? Київська 98, нуту ? Колорит, кормових бобах ? Хоростківські та виці ? Білоцерківська 9. Реакцію надчутливості на листках тютюну проводили за методом Klement [Klement, Rudolf, 1990].

Культуральні та фізіологічні властивості бактерій вивчали загальноприйнятими методами [Kovacs, 1965; Бельтюкова и др., 1968; Герхард, 1983;]. Здатність засвоювати вуглеводи, спирти, органічні кислоти та амінокислоти, які були єдиним джерелом живлення, визначали за ростом бактерій та зміною забарвлення середовища Омелянського, що містило 5% досліджуваного вуглеводу чи спирту, 0,15% калієвих та натрієвих солей органічних кислот або 0,1% різних амінокислот. Облік результатів здійснювали на 3, 7, 14 та 21-у добу культивування.

Антигенні властивості штамів бактерій вивчали за допомогою реакцій аглютинації та преципітації в агарі за Оухтерлоні [Ouchterlony, 1958]. Сироватки до живих клітин бактерій одержували описаними Пастушенко, Симонович методами [1971]. Термостабільні та термолабільні антигени одержували за модифікованим методом Грасе [Пастушенко, Симонович, 1971].

Для визначення клітинних жирних кислот використали 10 мг клітин у перерахунку на суху масу бактерій. Метилові ефіри жирних кислот одержували шляхом гідролізу у 5% розчині ацетил хлориду у метанолі, протягом 4 годин при 100 оС. Ефіри екстрагували двічі сумішшю ефір-гексан (1:1) [Жеребило, Вишталюк, 1991]. Склад метилових ефірів жирних кислот аналізували на газовому хроматографі Hewlett-Packard 6890 та мас-спектрометрі Hewlett-Packard 5973. Метилові ефіри жирних кислот ідентифікували за тривалістю утримання їх порівняно зі стандартами. Як стандарти використовували метилові ефіри жирних кислот фірми „Supelco”. Вміст жирних кислот у відсотках від загальної площі піків визначали за допомогою програмного забезпечення ChemStation.

Виділення та очищення хромосомної ДНК проводили згідно загальноприйнятих методик [Aljanabi, Martines 1997]. Температуру плавлення ДНК визначали за кривою денатурації ДНК, побудованої за даними, одержаними на спектрофотометрі DU-8 фірми Beckman. Вміст ГЦ пар у ДНК розрахували за формулою [Леванова и др., 1995]. При виділенні ДНК для полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР) використовували Silica Spin колонки фірми Qiagen та набір реактивів „ДНК-сорб-В”. ДНК копію гену 16S pPHK ампліфікували з використанням універсальних праймерів рА ? 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (8-27, нумерація за E.coli) та рН ? 3'-ААGGAGGTGATCCAGCCGCA-5'(1542-1523, нумерація за E. coli) [Edwars et al., 1989] за експериментально підібраних умов: денатурація ДНК – 940С/15c, відпалювання ? 650С/15c, елонгація ? 720С/5хв. Продукти ампліфікації клонували з урахуванням наявності додаткового аденозину на 3/ кінці фрагменту за рахунок термінальної трансферазної активності Tag ДНК - полімерази в Т-вектор на основі плазміди pBLuescript SK(+) фірми Promega, по сайту рестрикції Есо RV [Marques et al., 2000]. Рекомбінантні вектори, які несли вставку продукту ампліфікації, виділяли із трансформованих клітин E.coli XL 1-blue методом лужного лізису [Birnboim, 1983, Sambrook, 1989]. Ампліфікати 16S рДНК сиквенували з 5'- і 3'- кінців на автоматичному сиквенаторі 3130 Genetic Analyzer. Початок і кінець гену встановили порівняльним аналізом отриманих нуклеотидних послідовностей з нуклеотидної послідовністю 16S рДНК E. coli Z832051, наданою GenBank, за допомогою програми Vector NTI 8 (1994-2002 InforMax. Inc.). Пошук гомологічних, задепонованих у GenBank, нуклеотидних послідовностей що кодують ген 16S рРНК проводили за допомогою програми BLASTN (). Гомологічні ділянки послідовностей з відповідністю не нижче 98% відібрали за допомогою програми AliBee, доступної на сервері Інституту ім. Белозерського (http://www.genebee.msu.su/genebee.html). Побудову філогенетичного дерева проведено на основі матриці подібності за допомогою програми TreeTop – Phylogenetic Tree Prediction ().

Наведені результати є середнім значенням результатів дослідів, здійснених не менш, як у трьох повторах. Математичну обробку результатів досліджень здійснювали методами математичної статистики [Лакин, 1980] за t-критерієм Стьюдента (р=0,05) із застосуванням програми EXCEL.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.

Патогенні властивості збудника бурої бактеріальної плямистості люпину.

При обстеженні посівів люпину у Київській області з уражених рослинних тканин виділено 34 штами бактерій патогенних для люпину сорту Піщовий. Для подальших досліджень відібрано 18 високо- та середньоагресивних штамів та 5 колекційних штамів „P. lupinі. Як колекційні так і виділені нами штами, а також типовий штам P. syringae pv. syringae В1027 індукували реакцію надчутливості на листі тютюну, що свідчить про їхню патогенну здатність. За умов штучного інфікування рослин люпину свіжовиділеними штамами розвивалися симптоми, характерні для описаної раніше бурої бактеріальної плямистості [Бельтюкова, Корольова 1971]. За результатами штучного зараження 9 районованих сортів люпину встановлено, що найчутливішими до збудника бурої бактеріальної плямистості були безалкалоїдні сорти білого (Володимир, Борки, Піщовий) та жовтого (Обрій і Промінь) люпинів, а відносно стійкими ? мало та середньо алкалоїдні сорти білого люпину (Туман, Синій парус, Вересневий, Олєжка) та високоалкалоїдний багаторічний люпин (рис.1).

Рис. 1. Чутливість різних бобових культур до 23 штамів “Pseudomonas lupinі” (узагальнені дані).

Примітка: Кількість алкалоїдів вказана у % від сухої речовини насіння люпину.

Штами „P. lupinі мали високий та середній рівень агресивності стосовно квасолі сорту Мавка, гороху сорту Харківський 29, сої сорту Київська 98 та нуту сорту Колорит і низький рівень агресивності по відношенню до кормових бобів сорту Хоростківські та вики сорту Білоцерківська 9, що свідчить про широку спеціалізацію збудника до ряду бобових культур. Подібність стійкості сортів до грибних та бактеріальних хвороб підтверджує їхню однакову генетичну детермінованість, що полегшує селекційну роботу із виведення сортів, які мають широку стійкість до патогенів.

Штами гетерогенні за агресивністю. Найагресивнішим серед виділених нами виявився штам 6, а серед колекційних 8531 (рис.2).

Рис. 2. Агресивність 23 штамів „P. lupinі та штаму P. syringae pv. syringae В1027 до 9 районованих сортів люпину та багаторічного люпину (узагальнені дані).

Таким чином, встановлена залежність між стійкістю сортів до збудника бурої бактеріальної плямистості люпину та вмістом у них алкалоїдів. Більш стійкими до даного збудника є сорти з високим вмістом алкалоїдів порівняно з мало та безалкалоїдними. Вивчення чутливості 9 районованих сортів люпину до збудника бурої бактеріальної плямистості дало можливість встановити подібність стійкості сортів до грибних та бактеріальних хвороб, що дозволяє відбирати найбільш перспективні сорти для використання їх в рослинництві. Широку спеціалізацію патогена до ряду бобових культур необхідно враховувати при створенні коректної сівозміни. За вірулентними властивостями досліджені штами „P. lupinі” не відрізняються від типового штаму P. syringae pv. syringae В1027, який також здатний уражати широке коло рослин, у тому числі люпин.

Морфологічні, культуральні, фізіологічні та біохімічні властивості „Pseudomonas lupini”.

За понад сторічний період існування мікробіології сформувалась фенотипова систематика бактерій, яка, в основному, базується на подібності бактерій за сукупністю їхніх морфологічних, культуральних, фізіологічних та біохімічних ознак [Смирнов, Киприанова, 1990; Хоулт и др., 1997; Романовская и др., 2003].

За морфологією клітини „P. lupinі” є прямими паличками, які розташовуються поодинці або парами, лофотрихи, грамнегативні і не утворюють спор. На картопляному агарі через дві доби утворюють сірувато-білі, напівпрозорі, блискучі, круглі, діаметром 1,0-2,5 мм, плоскі, з припіднятим центром та, здебільшого, слабко хвилястим краєм колонії. На м'ясопептонному бульйоні спостерігається шовковисте помутніння середовища і слабкий осад. Всі досліджені штами
P. lupinі” здатні утворювати каталазу, але не оксидазу, коагулювати молоко, пошарово розріджувати желатин, підлужнювати лакмусову сироватку; вони не утворюють індол та сірководень і варіабельні за здатністю редукувати нітрати. Виключення склав штам „P. lupinі 2, який є оксидазопозитивним, що, на нашу думку, може свідчити про належність даного штаму до іншого виду бактерій роду Pseudomonas. Решта штамів „P. lupini” на мінеральному середовищі Омелянського, до якого додавали як єдине джерело вуглецевого живлення глюкозу, галактозу, арабінозу, ксилозу, манозу, фруктозу, сахарозу, рафінозу та маніт, утворюють кислоту. Не засвоюють лактозу, мальтозу, дульцит, саліцин і варіабельні за споживанням рамнози. Всі досліджені штами „P. lupini” здатні рости на середовищі, яке містить як єдине джерело азоту та вуглецю аланін, аспарагінову та глютамінову кислоти, серин, пролін і гістидин, вони слабо ростуть на середовищі з глікоколом та цистеїном, не засвоюють лейцин, валін, лізин, треонін, фенілаланін, тирозин, триптофан, цистин. Засвоюють з утворенням лугу калієві та натрієві солі мурашиної, яблучної, оцтової та лимонної кислот, але не ростуть на середовищі, яке містить солі янтарної кислоти. Отже як колекційні так і свіжовиділені штами „P. lupini за основними фізіологічними та біохімічними властивостями подібні до типового штаму P. syringae рv. syringae В1027. Відмінністю штамів „P. lupini від типового штаму P. syringae рv. syringae В1027 є здатність засвоювати ксилозу, варіабельне споживання рамнози, цистеїну та аланіну, що узгоджується з даними літератури та підтверджує думку про неможливість ідентифікації фітопатогенних

бактерій роду Pseudomomas на рівні виду та патовару виключно за морфологічними, культуральними, фізіологічними та біохімічними властивостями [Koushi, 1998].

Антигенний склад „Pseudomonas lupini”.

Для більш детальної характеристики фенотипу даного збудника дослідили антигенні властивості свіжовиділених штамів „P. lupinі”. Раніше І.Б. Корольовою (1963), Л.Т. Пастушенко і І.Д. Симонович (1979) були досліджені серологічні властивості збудника бурої бактеріальної плямистості люпину. На основі спорідненості антигенних епітопів 7 штамів „P. lupinі” були розділені на чотири серологічні групи – І, ІІ, ІІІ, ІV [Пастушенко, Симонович, 1979]. За результатами реакції аглютинації з сироватками до колекційних штамів „P. lupinі” чітко відмежувалися лише два свіжовиділених штами, які віднесли до І серогрупи. Уособлено від штамів „P. lupinі стоїть штам 2, який реагував у низькому титрі реакції аглютинації (1:50) з антисироваткими до всіх колекційних штамів „P. lupinі (табл.1).

Таблиця 1

Результати реакцій аглютинації і преципітації антигенів свіжовиділених штамів “Pseudomonas lupinі” з сироватками до колекційних штамів “Pseudomonas lupinі”.

Антигени штамів | Титр реакції аглютинації* | Кількість ліній преципітації | Сироватки до колекційних штамів „P. lupinі представників

І ? ІV серогруп | І ? 8534 | ІІ ? 8535 | ІІІ ? 8532 | ІV ? 8531, 8533 | І ? 8534 | ІІ ? 8535 | ІІІ ? 8532 | ІV ? 8531, 8533 | P. lupinі 1,3-16 | -** | 200-1600 | 1600-6400 | 100-3200 | - | 1(2) | 1(2) | 1 | P. lupinі 17,18 | 6400 | - | - | - | 1(2) | - | - | - | Штам 2 | 50 | 50 | 50 | 50 | - | - | - | - | Гомологічні реакції | 6400 | 6400 | 6400 | 3200 | 2 | 2 | 2 | 1 |

Примітка тут і у табл. 2:

*? титр сироваток наведений у реципрокних показниках;

**? „-” відсутня реакція аглютинації в розведенні 1:50 або реакція преципітації.

Решта штамів у зв’язку із наявністю спільного термостабільного антигену реагували з колекційними штамами „P. lupinі” представниками як ІІ, ІІІ так і ІV серогруп. Дані реакції аглютинації підтвердилися результатами подвійної дифузії в агарі за Оухтерлоні.

Отже, серогрупування виділених нами штамів „P. lupinі на основі їхньої взаємодії з колекційними штамами P. lupinі у реакціях аглютинації та преципітації є проблемним. Ці дані узгоджуються з твердженням Л. Т. Пастушенко та І. Д. Симонович [1979] про наявність у штамів P. lupinі” спільного термостабільного антигену з представникам ІІ, ІІІ, ІV серогруп.

На нашу думку, неможливість серогрупування виділених нами штамів пов’язана з однаковим екологічним походженням свіжовиділених та колекційних штамів „P. lupinі. Тому на наступному етапі використали сироватки до типових представників серогруп, ізольованих не з люпину, а з яблуні – P. syringae pv. syringae 8651, P. syringae pv. syringae 8566, P. syringae pv. syringae 8569 та пшениці – P. syringae pv. atrofaciens 8254 (табл. 2). За результатами реакції аглютинації та преципітації 15 штамів було віднесено до ІІІ серогрупи (табл.2). Таким чином, за даними реакції аглютинації та преципітації штами „P. lupinі, ізольовані з уражених тканин люпину у Київському регіоні у 2002 р. споріднені з колекційними штамами та віднесені до двох серологічних груп – І та ІІІ. Відповідно, більша частина штамів належить до ІІІ серогрупи, а менша ? до І (табл.1, 2).

Таблиця 2

Результати реакції аглютинації і преципітації антигенів свіжовиділених штамів „Pseudomonas lupinі” з сироватками до штамів типових представників І, ІІ, ІІІ, ІV серогруп.

Антигени штамів | Титр реакції аглютинації* | Кількість ліній преципітації | Сироватки до колекційних штамів P. syringae типових представників І ? ІV серогруп | І ? 8651, В1027 | ІІ ? 8566 | ІІІ ? 8569 | ІV ? 8254 | І ? 8651, В1027 | ІІ ? 8566 | ІІІ ? 8569 | ІV ? 8254 | P. lupinі 1,3-16 | -** | 50-100 | 6400-51200 | 100-800 | - | - | 2(3) | - | P. lupinі 17,18 | 6400-51200 | - | - | - | 1 | - | - | - | Штам 2 | 50 | 50 | 50 | 50 | - | - | - | - | Гомологічні реакції | 12800-51200 | 25600 | 51200 | 12800 | 1 | 1 | 2(3) | 1 |

Тобто, результати серогрупування збудника бурої бактеріальної плямистості люпину вказують на відсутність окремого виду „P. lupinі і спорідненість його антигенів з двома серотипами виду P. syringae. Встановлена нами антигенна приуроченість збудника бурої бактеріальної плямистості люпину дозволяє використовувати полівалентні сироватки для його швидкого діагностування, що має практичне значення.

Жирнокислотний склад загальних клітинних ліпідів „Pseudomonas lupini”.

На думку багатьох дослідників відмінності у жирнокислотному складі загальних клітинних ліпідів є однією з важливих хемотаксономічних ознак на рівні виду, а у окремих випадках і патовару та біовару. Слід відмітити, що результати цього хемотаксономічного аналізу корелюють із результатами досліджень геному бактерій [Yabuuchi, et all 1992, 1995; Stead, et all 1998].

З літературних джерел відомо, що якісний та кількісний вміст жирних кислот залежить від умов культивування мікроорганізму, методики отримання ефірів жирних кислот, тощо [Жеребило, Вишталюк, 1991; Stead, 1992]. Ми порівняли три методи виділення ефірів жирних кислот загальних клітинних ліпідів. Відмінності цих методів полягають в умовах гідролізу клітинних жирних кислот. У першому та третьому методах на етапі гідролізу використовують 1,5% та 1% розчини Н2SO4 у метанолі. При отриманні ефірів жирних кислот клітинних ліпідів другим методом на стадії гідролізу використовують 5%-й розчин ацетилхлориду в метанолі. Застосування різних методів виділення жирних кислот клітинних ліпідів дещо вплинуло на співвідношення гексадеканової (С16:0) до гексадеценової (С16:1) та кількість оксикислот. Оскільки для фітопатогенних бактерій роду Pseudomonas диференційною ознакою є наявність та кількість оксикислот [Stead D.E, 1992], то оптимальним для штамів „P. lupinі є саме другий метод, який і використано у подальших дослідженнях.

У клітинах колекційних і виділених нами штамів „P. lupinі виявлено жирні кислоти з довжиною вуглецевого ланцюгу від С10 до С19, а саме: ненасичені – гекса- (С16:1) та оксадеценову (С18:1); насичені – деканову (С10:0) додеканову (С12:0), тетрадеканову (С14:0), гексадеканову (С16:0) та октадеканову (С18:0) кислоти; оксикислоти – 3-оксидеканову (3-ОН–С10:0), 2-оксидодеканову (2-ОН–С12:0), 3-оксидодеканову (3-ОН–С12:0) та циклопропанові кислоти з 17 та 19 атомами вуглецю.

Як видно з таблиці 3, гексадеканова, гексадеценова та октадеценова жирні кислоти є домінуючими у загальних клітинних ліпідах як штамів „P. lupinі так і штамів P. syringae рv. syringae В1027 і P. savastanoi pv. phaseolicola В1123 і складають приблизно 80% усіх жирних кислот клітин. Винятком є ізолят 2, у клітинах якого їх кількість була меншою 80%.

Таблиця 3

Жирнокислотний склад загальних клітинних ліпідів штамів „P. lupinі,
P. syringae pv. syringаe В1027 та P. savastanoi pv. phaseolicola В1123.

Жирні кислоти * | Виділені нами штами

P. lupinі | Колекційні штами

P. lupinі | P. syringae рv. syringae В1027 | P. savastanoi pv. phaseolicola В1123 | С10:00,09±0,01 | 0,098±0,05 | 0,01±0,05 | 0,18±0,05 | 3-ОН ? С10:00,12±0,06 | 0,33±0,16 | 0,08±0,1 | 0,01±0,09 | С12:03,94±0,14 | 4,14±0,5 | 3,71±0,1 | 2,73±0,1 | 2-ОН ? С12:01,97±0,06 | 1,93±0,36 | 1,90±0,1 | 1,62±0,5 | 3-ОН ? С12:00,37±0,14 | 0,55±0,15 | 0,49±0,1 | 0,78±0 | С14:00,36±0,05 | 0,32±0,16 | 0,42±0,1 | 0,35±0,05 | С16:135,56±0,65 | 34,07±1,05 | 37,44±0,1 | 32,50±1,03 | С16:029,31±0,53 | 26,64±2,22 | 29,70±0,5 | 33,35±0,1 | С17:00,94±0,45 | 1,5±0,23 | 0,01±0,05 | 1,32±0 | С17:0 cyclo0,61±0,11 | 0,91±0,52 | 0,55±0,1 | 2,00±0 | С18:124,75±0,83 | 26,38±2,89 | 23,68±0,2 | 23,27±0,1 | С18:01,93±0,13 | 2,44±0,46 | 1,93±0,1 | 1,62±0,05 | С19:0 cyclo0,22±0,08 | 0,61±0,23 | 0,10±0,1 | 0,28±0 |

Примітка: тут і в табл. 4 вміст жирних кислот вказаний у % від загальної площі піків

За даними багатьох дослідників гексадеканова, гексадеценова та октадеценова жирні кислоти виявляються не тільки у складі загальних клітинних ліпідів, а й у складі ліпіду А ліпополіцукриду фітопатогенних бактерій роду Pseudomonas [Здоровенко, и др., 1995; Позур и др., 2003]. За даними багатьох дослідників усі флуоресцентні псевдомонади містять у складі жирнокислотних спектрів клітинних ліпідів, в тому числі ліпіду А молекули ЛПС [Здоровенко, и др., 1995; Ващенко др., 2004], 3-оксидеканову (3-ОН–С10:0), 2-оксидодеканову (2-ОН–С12:0), 3-оксидодеканову (3-ОН–С12:0) кислоти. Зазначені вище оксикислоти виявлено у жирнокислотних спектрах як штамів „P. lupinі” так і штамів P. syringae. рv. syringae В1027 та P. sаvastanoi pv. phaseolicola В1123 (табл.3, 4).

Таблиця 4

Характерні особливості жирнокислотних профілів 22 штамів „P. lupinі, ізоляту 2 і типових штамів P. syringae pv. syringаe В1027 та P. savastanoi pv. phaseolicola В1123.

Штами | Вміст

2-ОН–С12:0Сума ненасичених жирних кислот (С16:1+ С18:1) | Співвідношення С16:0 до С16:1Колекційні штами „P. lupinі | 1,92±0,35 | 60,45±3,01 | 0,78±0,07 | Виділені нами штами „P. lupinі | 1,84±0,13 | 59,96±0,46 | 0,83±0,02 | штам 2 | 2,00 | 30,420,05 | 3,420,1 | P. syringae pv. syringаe В1027 | 1,90±0 | 61,12±0 | 0,79±0 | P. savastanoi pv. phaseolicola В1123 | 1,62±0 | 60,27±0 | 0,9±0 |

Правило, встановлене D.E. Stead [1992] для всіх фітопатогенних псевдомонад (2-ОН–С12:0 менше 3%, С16:1 +С18:1 більше 52% від загальної площі піків, відношення С16:0 до С16:1 менше або дорівнює 0,9), є достовірним для більшості жирнокислотних спектрів досліджених штамів „P. lupinі, які найвірогідніше відносяться до виду P. syringae (табл.4). Винятком є лише штам 2, який не належить до P. syringae і, можливо, є представником виду P. fluorescens.

Кластерний аналіз підтвердив спорідненість 22 досліджених штамів „P. lupinі та типових штамів P. syringae рv. syringae В1027 та P. savastanoi pv. phaseolicola В1123 за жирнокислотним складом загальних клітинних ліпідів. Лише штам 2 не виявив спорідненості до обох типових штамів.

Аналізуючи дані жирнокислотного та антигенного складу клітин, а також патогенні, морфологічні, культуральні та біохімічні властивості 22 штамів, можна висловити припущення, що „P. lupinі” не є самостійним видом і належить до P. syringae. Остаточне вирішення питання систематичного положення збудника бурої бактеріальної плямистості люпину можливо лише на основі аналізу як фенотипових, так і генотипових властивостей.

Генотипові властивості штамів „Pseudomonas lupinі”.

Кількість ГЦ пар у геномній ДНК, як одна з важливих характеристик виду, на сьогодні є єдиною з генотипових ознак, що включена у 9-видання „Визначника бактерій Берджі” [Хоулт и др., 1997]. Наприкінці 80-х років минулого сторіччя Комітет з узгодження підходів у систематиці бактерій визначив, що вид повинен об'єднувати штами з 70% або більше спорідненості молекул ДНК, встановлених за даними ДНК-ДНК гібридизації, різницею температури плавлення (Tп ) рівною або меншою за 5°С та рівнем гомології нуклеотидних послідовностей гену 16S рРНК не нижче 97% [Wayne et al., 1987; Ross-Mora, Amann, 2001]. У зв'язку із заплутаністю ідентифікації фітопатогенних псевдомонад на основі ДНК-ДНК гібридизації [Young et all., 1996; Gardan et all., 1999], для встановлення видового статусу збудника бурої бактеріальної плямистості люпину нами вперше було визначено вміст гуаніну та цитозину у ДНК та нуклеотидні послідовності гену 16S рРНК 5 колекційних та 2 свіжовиділених штамів „P. lupinі.

Встановлено, що для більшості досліджених штамів „P. lupinі” молярний відсоток ГЦ пар коливається у межах від 58,8 до 60,7 мол %. Вміст ГЦ пар у ДНК типового штаму становить 58,8 мол % (табл.5). Таку ж кількість ГЦ пар у ДНК мають штами 6 та 8533. Виключення становив штам „P. lupinі” 8531, для якого молярний відсоток ГЦ пар у геномній ДНК становить 62,6 (табл.5). Тобто вміст ГЦ пар у молекулі ДНК „P. lupinі 8531 на 3,1 мол.% вище ніж у інших штамів. На думку деяких дослідників [Романовская и др., 2003] це свідчить про його належність до іншого виду. Вищий на 1 мол.% вміст ГЦ пар у молекулі ДНК, порівняно з рештою штамів та типовим штамом, також має штам „P. lupinі 8535 та на 0,7 мол.% – штами 8532 та 17. Вміст ГЦ пар для 7 штамів „P. lupinі та типового штаму P. syringae рv. syringae В1027 не виходить за межі (59,0-63,6 мол.%) встановлені Yamamoto et al [2000] для ІІ кластеру в складі роду Pseudomonas, до якого також віднесені види P. syringae та P. savastanoi.

Таблиця 5

Молярний відсоток ГЦ пар у ДНК штамів „P. lupinі” та типового штаму P. syringae рv. syringae В1027.

Штам | Температура плавлення Тп | Вміст ГЦ у мол.% | P. lupinі 8531 | 77,15±0,05 | 62,6±0,2 | P. lupinі 8532 | 76,67±0,05 | 60,5±0,5 | P. lupinі 8533 | 76,4±0 | 58,8±0 | P. lupinі 8534 | 76,37±0,05 | 58,7±0,2 | P. lupinі 8535 | 76,78±0,03 | 60,7±0,2 | P. syringae рv. syringae В1027 | 76,4±0 | 58,8±0 | P. lupinі 6 | 76,4±0 | 58,8±0 | P. lupinі 17 | 76,68±0,03 | 60,2±0,09 |

На думку багатьох дослідників значення вмісту ГЦ пар для патоварів у складі виду P. syringae становить 59-61 мол.% [DeLey, 1986; Хоулт и др., 1997], що є справедливим для більшості досліджених штамів, окрім „P. lupinі8531.

Отже, виявлено гетерогенність штамів „P. lupinі за кількістю гуаніну та цитозину в молекулі ДНК. Визначена кількість ГЦ пар у ДНК досліджуваних штамів „P. lupinі підтверджує належність більшості штамів „P. lupinі до виду P. syringae. І тільки штам P. lupinі 8531 має таку кількість ГЦ пар, яка виходить за межі значень, встановлених для виду P. syringae [DeLey, 1986].

За результатами аналізу даних сиквенсу ДНК копій гену 16S рРНК 8 досліджених штамів виключно штам 8531 має 100% гомологію нуклеотидної послідовності гену 16S рРНК з задепонованою у GenBank нуклеотидною послідовністю цього гену P. savastanoi pv. glycinea (табл.6).

Таблиця 6

Ідентичність нуклеотидних послідовностей гену 16S рРНК штамів „P. lupinі з нуклеотидними послідовностями гену 16S рРНК бактерій, які зберігаються у нуклеотидній базі GenBank

Штам Назва виду, патовару (і) номер референт - штаму у нуклеотидній базі GenBankКількість нуклеотидів у фрагментах гену 16S рРНК | Ідентичність послідовностей, (%) | 8531 DQ318862 | P. savastanoi pv. glycinea1478 | 100 | P. syringae рv. syringae СFBP 2341T | 99 | P. savastanoi pv. phaseolicola | P. savastanoi pv. savastanoi ATCC 13522T | 8532, DQ318861; 8533, DQ318863; 8534, DQ318864; 8535, DQ318865; 6, DQ318867; 17, DQ318868 | P. syringae рv. pisi |

1476-1491 | P. syringae рv. syringae B 728a |

Решта досліджених штамів, незважаючи на варіабельність ГЦ складу геномної ДНК, високо споріднені з нуклеотидними послідовностями, що кодують ген 16S pPHK (98-99% гомології), задепонованими у GenBank, деяких патоварів, які за сучасними даними входять як до виду P. syringae, так і до P. sаvastanoi(табл.6).

Серед точкових змін, виявлених в результаті вирівнювання нуклеотидних послідовностей, зустрічаються такі, що притаманні цілій групі різних видів, та такі, що властиві лише окремим штамам. Як видно з рис. 3 серед усіх досліджених штамів „P. lupinі найбільша варіабельність нуклеотидної послідовності гену 16S pPHK спостерігається у штаму 8533. Жодної точкової зміни нуклеотидних послідовностей гену 16S pPHK не виявлено як у штаму 8531, так і у задепонованої у GenBank нуклеотидної послідовності цього гену P. savastanoi pv. glycinea.

Рис. 3. Фрагменти вирівнювання послідовностей гену 16S рРНК штамів
„P. lupinі” та патоварів і видів роду Pseudomonas задепонованих у нуклеотидній базі GenBank

Графічне відображення філогенетичних зв’язків штамів встановлених за даними аналізу нуклеотидних послідовностей гену 16S pPHK, представлено на рисунках 4 і 5.

Рис. 4. Філогенетичне дерево (топологічний алгоритм), побудоване на основі послідовностей фрагменту гену 16S рРНК. Цифри, вказані над сегментами, відображують статистичну достовірність (%) порядку розгалуження, встановлену за допомогою „bootstrap”-аналізу. Масштабу 0,02 відповідає заміщення 2 нуклеотидні пари на кожні 100 нуклеотидів.

Всі 7 штамів „P. lupinі”, а також типовий штам P. syringae рv. syringae В1027, утворили окрему групу значно споріднену з групою P. syringae рv. syringae,
P. savastanoi рv. phaseolicola