Інститут фармакології та токсикології

ДЕРИМЕДВіДЬ ЛЮДМИЛА ВІТАЛІЇВНА

УДК: 615.24.244

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ ЗАСТОСУВАННЯ ПРЕПАРАТІВ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗИ при патологічних станах, обумовлених активацією процесів вільнорадикального окислення

14.03.05 - фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового

ступеня доктора медичних наук

Київ – 2006

Дисертація є рукописом.

Робота виконана на кафедрі фармакології Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий

консультант: | доктор біологічних наук, академік АМН України, професор Стефанов Олександр Вікторович, директор Інституту фармакології та токсикології АМН України

Офіційні

опоненти: | доктор медичних наук Літвінова Надія Володимирівна, Інститут фармакології та токсикології АМН України, головний науковий співробітник

доктор медичних наук, професор Степанюк Георгій Іванович, Вінницький Національний медичний університет ім. М.І. Пирогова МОЗ України, завідувач кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології

доктор медичних наук професор Гудивок Ярослава Степанівна, Івано-Франківський Державний медичний університет, професор кафедри фармакології

Провідна

установа: |

Одеський державний медичний університет МОЗ України, м. Одеса

Захист відбудеться “21” червня 2006 року о 13.00 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д. 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Потьє, 14.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України ( 03057, м. Київ, вул. Е. Потьє, 14).

Автореферат розісланий “20” травня 2006 року.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради

Д. 26.550.01

кандидат біологічних наук І.В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Результатами багатьох досліджень, що проводились протягом останніх 15 років показано, що майже 60% усіх патологічних станів супроводжується дискоординацією систем антиоксидантного захисту та надмірною активацією процесів вільнорадикального окислення (ВРО) з формуванням так званого “оксидативного стресу” (Dang Yinhu, Wang Shichen, 2000; T. Nishikawa, D. Edelstein, 2000; В.А. Беленичев, 2002; О.Н. Соболєв, 2003; А.К. Воробьев, 2005).

Для фармакологічної корекції ВРО-обумовленої патології виправданим є використання лікарських препаратів, які знижують рівень активних форм кисню (АФК) у організмі і зменшують інтенсивність і виразність реакцій ВРО. Тому в комплексну фармакотерапію цих станів включають антиоксиданти (Н.О. Горчакова, 2005). Їхнє використання дозволяє знизити надмірну активність ВРО, відновити функцію антиоксидантної системи (АОС) організму, поліпшити метаболічні процеси в організмі і як результат - нормалізувати процеси саногенезу (R Marchioli, C. Schweiger, 2001; В.В. Абрамченко, 2003; І.С. Чекман, Н.О. Горчакова, М.І. Загородний, 2003; О.О. Мойбенко, 2004). Крім того, антиоксиданти характеризуються низькою токсичністю і не порушують хімічний гомеостаз організму (Т.С. Сахарова, 2003, Л.Д. Лукьяненко, 2006).

На сьогодні асортимент антиоксидантів на українському фармацевтичному ринку невеликий – в Україні зареєстровано всього 7 монокомпонентних (усі вони належать до групи неферментативних) антиоксидантів. Спектр фармакологічної дії цих препаратів дуже різноманітний та обумовлений здатністю нейтралізувати негативні ефекти продуктів ВРО на організм. Однак більшість з них діють не на початкових, а на пізніх стадіях ВРО (коли патологічний каскад уже запущено), що зменшує їхню клінічну ефективність.

Найбільш раціональним з цього погляду є використання ендогенних ферментативних антиоксидантів і, зокрема, супероксиддисмутази (СОД), що діє на початковій, "нульовій" стадії ВРО і є найефективнішим антиоксидантом для нейтралізації високореакційноспроможного супероксидного аніон-радикала, який ініціює каскад вільнорадикальних змін (I. Fridovich, 1997; И.В.Чурилова, 2005). На світовому фармацевтичному ринку є препарати СОД, які отримані з еритроцитів та печінки великої рогатої худоби: пероксинорм, орготеїн, онтосеїн, палосеїн.

Однак застосування їх у клініці, на тлі безсумнівного терапевтичного ефекту, виявило наявність певної кількості алергійних реакцій, що в деяких випадках призвело до анафілактичного шоку. Саме цим обумовлено інформаційне повідомлення ВООЗ №2 від 12 квітня 1994 р. про обмеження ринкового продажу пероксинорму й орготеіну. Тому пошук і розробка нових засобів на основі СОД, які б не мали вказаного недоліку та проявляли високу ефективність при надмірній активації процесів ВРО, є актуальною задачею фармакології. Ця робота присвячена проблемі застосування рекомбінантної супероксиддисмутази (СОДrec) та інших природних антиоксидантів у медицині.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася згідно з планом науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету (НФаУ) “Створення нових лікарських препаратів на основі рослинної та природної сировини, зокрема продуктів бджільництва, для дорослих та дітей” (№ державної реєстрації 0198U007008), а також наукової тематики кафедри фармакології "Створення на основі супероксиддисмутази нового антиокислювального препарату” (№ державної реєстрації 0100U005125) і "Створення на основі супероксиддисмутази препарату для корекції цукрового діабету і його ускладнень" (№ Державної реєстрації 0198U007001). Автор є співвиконавцем цих тем.

Метою досліджень було створення на основі рекомбінантної супероксиддисмутази нового антиокислювального препарату – “Рексод” та встановлення його лікувально-профілактичних властивостей при станах, які зумовлені активацією процесів вільнорадикального окислення.

Для досягнення поставленої мети були визначені наступні завдання дослідження :

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Об'єктом дослідження були експериментальні тварини (миші, щури, кролі) з модельною патологією, що супроводжуються активацією процесів ВРО.

Предмет досліджень: субстанція рекомбінантної Cu-Zn СОД (Содrec), отриманої методом генної інженерії з культури штаму дріжджів-продуцентів Saccharomyces cerevіsіae Y 2134, препарат на основі Содrec - рексод і препарат людської еритроцитарної Cu-Zn СОД (Cодer) – ерисод.

Методи досліджень: фармакологічні, біохімічні, гістологічні, імунологічні, радіологічні, електрофізіологічні, статистичні. Робота проводилася на білих мишах, щурах, кролях з урахуванням вимог біоетики.

Наукова новизна отриманих результатів полягає в тому, що вперше систематизовано й досліджено спектр фармакодинаміки препаратів СОД різного походження при експериментальних вільнорадикальних патологічних пошкодженнях.

На основі комплексних досліджень встановлено, що препарати СОД реактивують антиоксидантну систему, зменшують інтенсивність імунного запалення, проявляють мембранопротекторні та метаболічні ефекти.

Встановлено наявність у препаратів СОД кардіо-, ангіопротекторних і протипроменевих властивостей. Визначено переваги СОДrec перед класичними антиоксидантами та вперше проведено порівняльний аналіз ефективності застосування препаратів СОД різного походження.

Вперше встановлено потенціювання антиексудативної дії НПЗЗ препаратами СОД, а також визначені найбільш оптимальні комбінації СОДrec з НПЗЗ та антиоксидантами. Вперше виявлено хронофармакологічну залежність реалізації кардіопротекторної і протизапальної дії препаратів Сод.

Наукову новизну підтверджено деклараційними патентами на винахід: "Лікарський засіб з кардіопротекторною, ангіопротекторною та імунокорегуючою активністю" (Патент України № 20002129594) і “Гастропротекторний засіб” (Патент України № 2002119153).

Практичне значення отриманих результатів. На підставі фармакологічних і токсикологічних досліджень препаратів СОД доведена їх нешкідливість і ефективність у лікуванні ВРО-зумовлених захворювань, що дозволяє розширити арсенал сучасних антиоксидантних засобів. За результатами проведених досліджень видано 3 методичні рекомендації для практичної медицини, фармакології та фармації.

Результати проведених досліджень впроваджено в науково-педагогічну діяльність кафедр фармакології ХДМУ, ДДМУ, ХМАПО, ЛугДМУ, КДМУ, ВДМУ, ЛДМУ, ТДМА, УМСА, ДніпрДМА, ІФДМА, ОДМУ.

Препарат еритроцитарної людської СОД “Ерісод” дозволено до клінічного застосування. На сьогодні закінчено другу фазу клінічних випробувань препарату “Рексод” для фармакологічної корекції ускладнень цукрового діабету.

Особистий внесок дисертанта. Дисертація є самостійною завершеною науковою працею. Автором був здійснений патентно-інформаційний пошук та проведено аналіз даних літератури за темою дисертації; визначені мета і завдання досліджень, розроблені програмі та визначені методичні підходи до експериментальних досліджень фармакодинаміки препаратів СОД; проведені експериментальні дослідження, статистична обробка даних, аналіз і систематизація отриманих результатів, сформульовані висновки.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені на міжнародній конференції “Іnternatіonal conference of SOD” (Франція, м. Париж, 1998), Республіканській науково-практичній конференції "Досягнення та невирішені питання гастроентерології (м. Харків,1998), V Національному з'їзді фармацевтів України (м. Харків, 1999), Науково-практичнії конференції "Вчені України - вітчизняній фармації" (м. Харків, 2000), ІІ Національному з'їзді фармакологів України (м. Дніпропетровськ, 2001), конференціях молодих вчених і студентів НФаУ (м. Харків, 1999, 2000, 2001 рр.), російських національних конгресах “Человек и лекарство (м. Москва, 1997, 1998, 2000, 2001 рр.), ІІ Міжнародній науково-практичній конференції "Гепатопротектори в Україні - реалії і перспективи" (м. Харків, 2003), Міжнародній науково-практичній конференції “Клінічна фармація: 10 років в Україні” (м. Харків, 2003), VI Національному з’їзді фармацевтів України (м. Харків, 2005), Науково-практичних конференціях “Лекарства – человеку” (м. Харків, 2002, 2006), щорічних терапевтичних читаннях ”Терапевтична клініка від науки до практичної охорони здоров’я”, присвячених пам’яті академіка Л.Т.Малої (м. Харків, 2006) .

Публікації. За темою дисертації опубліковано: 1 монографія, 44 наукові роботи, з них 24 статті в центральних наукових журналах, 15 тез, 2 патенти, 3 методичні рекомендації.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена на 320 сторінках машинописного тексту і складається з огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, аналізу результатів досліджень, висновків, списку використаної літератури. Робота містить 13 рисунків, 77 таблиць, 6 схем, 6 фотографій. Бібліографія включає 425 джерел інформації, з них 322 вітчизняних та ближнього зарубіжжя і 103 – іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Як предмет дослідження використовували субстанцію рекомбінантної людської Cu-Zn СОД (Содrec) і препарат на її основі - рексод, отриманих у ВАТ "РЭСБИО” (м. Санкт-Петербург, РФ).

Для встановлення фармакологічної активності Содrec використовували наступну схему дослідження (схема 1):

\

Схема 1. Етапи фармакологічного вивчення препаратів СОД

На всіх етапах дослідження ефективність рекомбінантної Сод порівнювали з іншими препаратами Cu-Zn СОД: Содer (ерісод) – препарат Cu-Zn СОД, отриманої з еритроцитів людини (фірми "РЭСБИО", м. Санкт-Петербург, РФ) та препаратом СОД, отриманим з еритроцитів великої рогатої худоби, пероксинормом (фірма Грюненталь, Німеччина). Cодer і пероксинорм вводили внутрішьом’язово у дозах 0,020 мг/кг (ЕД50 за антиоксидантною активністю) і 0,065 мг/кг (ЕД50 за антицитолітичною активністю). Крім цього, як препарати порівняння використовували класичні антиоксиданти – - токоферолу ацетат (виробник ІCN Октябрь, РФ), кверцетин, (виробник Борщагівський ХФЗ, Україна) та емоксипін (виробник Олайнфарм, Латвія). Емоксипін та - токоферолу ацетат вводили внутрішьом’язово в дозі 50 мг/кг (Н.Д. Сало, 2000), а кверцетин – перорально в дозі 5 мг/кг (Л.В. Яковлева, Т.С. Сахарова, 2000). Вибір інших препаратів порівняння було обумовлено характером патології та вимогами ДФЦ МОЗ України з доклінічного вивчення лікарських засобів.

Вивчення фармакологічної активності Содrec проводили на моделях ушкоджень міокарда, цукрового діабету, гіперліпідемії, запалення, променевої хвороби (табл. 1).

Таблиця 1

Моделі експериментальних досліджень препаратів СОД

Експериментальна модель | Метод

Іммобілізаційний стрес | Іммобілізація на 3 год., лежачи на спині

Ізадриновий міокардит | Ізадрин 60 мг/кг внутрішньом’язово протягом 4 діб

Адреналіновий міокардит | 0,5 мг/кг адреналіну гідрохлориду внутрішньовенно*

Пітуітриновий коронароспазм | 1 ОД пітуїтрину на тварину внутрішньоочеревинно*

Доксорубіцинова кардіомопатія | 20 мг/кг доксорубіцину внутрішньоочеревинно*

Алкоголь-фуразолідонова кардіоміопатія | Етанол у вигляді 25% розчину внутрішньошлунково 5 г/кг + фуразолідон 200 мг/кг на протязі 10 тижнів

Гіперліпідемія | Холестерин внутрішньошлунково на соняшниковій олії протягом 3 міс. по 0,3 г/кг

Дитизоновий діабет | Дитизон внутрішньоочеревинно по 35 мг/кг*

Судинна проникність | Метод О.П.Голікова *

Карагеніновий набряк | 0,1 мл 1% розчину карагініну субплантарно*

Зимозановий набряк | 0,1 мл 1% розчину зимозану субплантарно*

Ватяна гранульома | Імплантація ватяної кульки вагою 20 мг підшкірно

Ад’ювантний артрит | Субплантарне введення 0,1 мл ад'юванта Фрейнда*

Феноловий вульвовагініт | 0,1 мл 5% фенолу інтравагінальго у вигляді піни - 5 діб

Оцетові виразки | Підшкірно 0,5 мл 9% р-ну оцетової кислоти і одночасно внутрішньоочеревинно 6% р-ну декстрану (300 мг/кг)*

Променеве ушкодження | Опромінення у дозах 5,8 Гр і 7,5 Гр (миші) та 6,2 Гр і 8,0 Гр (щури) *

Мембраностабілізуюча дія | Метод F.S. Jager (1996 р.)

При вивченні гострої токсичності Содrec використовували метод Т.В. Пастушенка і співавторів (1985). Встановлено, що Содrec належить до VI класу токсичності – відносно нешкідливі (LD50 при внутрішньоочеревинному введенні була більше 5000 мг/кг).

Фармакологічні дослідження проведено на білих мишах, щурах і кролях, які були вирощено у віварії ЦНДЛ НФаУ. Тварини знаходилися на стандартному раціоні та в стандартних умовах відповідно до санітарно-гігієнічних норм (Методичні рекомендації з доклінічного вивчення лікарських засобів, 2001). Усі досліди проводили відповідно до методик і вимог ДФЦ МОЗ України (Методичні рекомендації, 2001). Отримані результати обробляли методами варіаційної статистики. Досліди на тваринах проводили відповідно до правил “Європейської конвенції захисту хребетних тварин, яких використовують в експериментальних та інших наукових цілях” (м. Страсбург, 1986 р.).

Як відомо, однією з універсальних реакцій організму на пошкодження, які супроводжуються активацією процесів ВРО, є запалення. Для вивчення протизапальних властивостей препаратів СОД використовували моделі, що характеризують процеси альтерації, ексудації і проліферації. Препаратами порівняння, крім антиоксидантів (кверцетину та токоферолу ацетату), були диклоран - ін'єкційний препарат диклофенаку натрію (виробник Unіque, Індія) та індометацин (виробник Ніжфарм, РФ).

Антиексудативну активність препаратів СОД вивчали на моделях карагенінового та зимозанового набряку у щурів. Протизапальну активність препаратів оцінювали за здатністю пригнічувати розвиток набряку в порівнянні з контролем.

Для вивчення хронофармакологічної залежності протизапальної дії рекомбінантної СОД проводили вивчення залежності ефективності препарату від часу доби і сезону року. Для цього використовували модель карагенінового набряку у щурів. Дослідження проводили узимку (грудень), навесні (квітень), влітку (липень) і восени (жовтень). При вивченні добових коливань антиексудативної активності Содrec її вводили ранком (800), удень (1400) і ввечері (2000).

Антиальтеративну активність препаратів СОД вивчали на моделі оцтових виразок у щурів та на розробленій нами моделі фенолового вульвовагініту (С.М. Дроговоз і співав., 2003).

Антипроліферативну активність препаратів СОД досліджували на моделі "ватяної" гранульоми та ад’ювантного артриту в щурів. У зв'язку з тим, що модель ад’ювантного артриту є аналогом ревматоїдного артриту в людини, на цій модельній патології проведено додатково вивчення впливу препаратів СОД на основні імунологічні показники пошкодження (табл. 2).

У зв'язку з тим, що антиоксиданти не застосовуються для монотерапії запалення, становило інтерес вивчити доцільність спільного застосування Содrec з іншими НПЗЗ та антиоксидантами. . Для вивчення можливостей потенціювання препаратом Содrec протизапальної дії диклофенаку натрію, індометацину використовували модель карагенінового набряку в щурів. Ефективність комбінації порівнювали з ефектами Содrec, диклофенака натрію, індометацину і кверцетину. В досліді були використані наступні комбінації:

№ комбінації | Склад комбінації

№ 1 | Содrec у дозі 0,020мг/кг (ЕД50) + диклофенак натрію в дозі 8 мг/кг (ЕД50)

№ 2 | Содrec у дозі ЕД50 + диклофенак натрію в дозі ? ЕД50

№ 3 | СОДrec у дозі ЕД50 + індометацин у дозі 2 мг/кг (ЕД50)

№ 4 | Содrec у дозі ЕД50 + індометацин у дозі ?ЕД50

№ 5 | Кверцетин в дозі 5 мг/кг (ЕД50) + диклофенак натрію в дозі ЕД50

№ 6 | Диклофенак натрію +кверцетин в дозах ? ЕД50

№7 | Індометацин + кверцетин у дозах ЕД50

№8 | Кверцетин у дозі ЕД50 + індометацин у дозах ? ЕД50

№9 | Содrec і кверцетин у дозах ЕД50

Вивчення кардіопротекторних властивостей рекомбінантної СОД у порівнянні з Содer, пероксинормом, кверцетином, -токоферолом і емоксипіном проводили на фоні катехоламін- і вазопресинобумовленій патології міокарда. Для цього використовували найбільш інформативні та апробовані методи: модель імобілізаційного стресу у щурів, модель ізадринового та адреналінового міокардиту та пітуїтринового коронароспазму (табл. 1).

У зв'язку з тим, що в літературі зустрічаються суперечливі дані про хронофармакологічні особливості перебігу захворювань серцево-судинної системи (Р.М. Заславская, 2000; И.М. Мартыненков, 2000; В. И.Бакшеев ., Н. М. Коломоец, Г. Ф. Турсунова, 2005) та особливостей їх хронофармакологічної корекції, нами проведені дослідження залежності реалізації кардіопротекторної дії препаратів СОД при ізадриновому міокардиті від пори року. Досліджувані препарати вводили взимку (грудень), навесні (квітень), влітку (липень) і восени (жовтень) у лікувально-профілактичному режимі.

Одними з відносно мало вивчених патологій міокарда є кардіоміопатії (КМП), які характеризуються проградієнтно прогресуючим перебігом, супроводжуються тяжкими порушеннями скорочувальної функції міокарда і нерідко закінчуються летально. Для більш поглибленого вивчення кардіопротекторних властивостей препаратів СОД використовували моделі доксорубіцинової (адріаміцинової) і алкоголь- фуразолідонової КМП (табл. 1).

В основі більшості захворювань серцево-судинної системи лежать метаболічні порушення з наступним розвитком ангіопатій (И.Г. Березняков, 2003). Ангіопротекторні властивості СОДrec досліджували при модельній гіперліпідемії (яку викликали у кролів шляхом 3-місячного перорального введення холестерину) та на моделі довготривалої абсолютної інсулінової недостатності, викликаної введенням дитизону

У зв'язку з тим, що при ангіопатіях порушується судинна проникність, проводили вивчення впливу препаратів СОД на проникність судин за методом О.П. Голікова (1987) .

Активація процесів ВРО є головним чинником виникнення променевої хвороби. Нами проведено вивчення протипроменевої дії Содrec в різних режимах застосування на мишах і білих щурах. Тварин піддавали загальному одноразовому рентгенівському опроміненню в середньолетальній (LД50/30) і мінімально летальній дозах (LД100/30), встановлених експериментально для даної групи. Для мишей LД50/30 становила 5,8 Гp, для щурів – 6,2 Гр. LД100/30 для мишей склала 7,5 Гр, для щурів - 8,0 Гр. Тварин опромінювали на рентгенівській установці РУМ-17 за таких технічних умов: напруга - 150 кв, сила струму - 7 ма, фільтри 1 мм Cu + 1 мм Al, потужність дози - 0,35 Гр/хв.

Для оцінки впливу на опромінених тварин препарату Содrec і вибору оптимальної схеми його застосування було обрано: виживаність, середня тривалість життя та динаміка загибелі тварин. Спостереження проводили протягом 30 діб. Показники крові і кісткового мозку в щурів визначали в період розпалу променевої хвороби - на 10 добу після опромінення. Статистичну обробку отриманих даних проводили на ПЕОМ за допомогою пакета програм STATІSTІCA, дані щодо летальності тварин обробляли за допомогою програми Survіval analіsys. Вірогідність розбіжність при порівнянні показників оцінювали за допомогою критерію Log-rank test.

У зв’язку з можливістю тривалого використання Содrec було доцільно провести порівняння токсикологічних характеристик Содrec і Содer. Хронічну токсичність Содrec у порівнянні із Содer вивчали на щурах лінії Вістар вагою 155-170 г. Содer і Содrec вводили внутрішньом’язово в дозі 10 ЕД50. Тривалість дослідів - 6 місяців. Дослідження функції життєво важливих органів проводили в динаміці: вихідний фон (перед уведенням препаратів), через 1, 3 і 6 місяців після початку щоденного введення (Методичні рекомендації, 2001 р.).

При проведенні всіх досліджень використовували загальноприйняті біохімічні, імунологічні і статистичні методи дослідження (табл. 2).

Таблиця 2

Методи дослідження фармакологічної активності СОДrec

№ | Методи | Показники

1. | Біохімічний:

сироватка крові

плазма крові

міокард

жовч

сеча | Аланінамінотрансфераза (Алат)*, аспартатаміно-трансфераза (Асат)*, креатинфосфокіназа (КФК)*, лактатдегідрогеназа (ЛДГ)*, ТБК-активні продукти*; відновлений глутатіон (ВГ), супероксиддисмутаза (СОД)*, каталаза, загальні ліпіди*, загальний білок*, холестерин*, ліпопротеїди дуже низької щільності (ЛПДНЩ), ліпопротеїди низької щільності (ЛПНЩ), ліпопротеїди високої щільності (ЛПВЩ), глюкоза*, сечовина*

С- реактивний білок (С-РБ)*, ТБК-активні продукти*,

глутатіонпероксидаза, СОД*, каталаза

ТБК-активні продукти*, глутатіонпероксидаза, СОД, каталаза, адреналін, норадреналін, глікоген, фосфоліпіди, цитохром С, цитохром – С- оксидаза

Швидкість секреції жовчі, жовчні кислоти, холестерин, холато-холестериновий коефіцієнт

Білок*, глюкоза*, альбуміни

2. | Імунологічний | Циркулюючі імунні комплекси (ЦІК), загальний комплемент, активність фагоцитозу, Е-РОК

3. |

Фармакологічний, інструментальний, гістологічний, радіологічний | Ступінь атаксії, % загибелі тварин, клінічний аналіз крові,

ЕКГ, ваговий коефіцієнт серця (ВКС), гістологічні дослідження, середня тривалість життя, метод спонтанного гемолізу еритроцитів

4. | Статистичний | Критерій “?” Стьюдента, критерій Log-rank test

*- Дослідження проводили згідно з інструкціями до відповідних наборів для біохімічних досліджень

Усього в дослідах було застосовано 25 моделей досліджень. Використано 720 щурів, 60 мишей, 48 кролів.

Результати досліджень та їх обговорення. Як відомо, дія АФК і, особливо, супероксидного аніон-радикала (О2– ) на цитоплазматичну мембрану призводить до збільшення її плинності, втрати частини лабільноз’язаних з нею білків, до порушення структури інтегральних мембранних білків (О.Г.Ваксютина, 2000). При надмірній генерації АФК процес ВРО набуває ланцюгового характеру; метаболіти ВРО інтенсифікують каскад перетворень арахідонової кислоти, що є важливим компонентом перебігу запальних процесів. У структурі формування запальної патології, крім активації процесів ВРО, спостерігається порушення імунного гомеостазу (Я.В. Рожковський, 2002). Діючи синергічно, ці механізми ушкодження спричиняють більш тяжкий перебіг запального процесу. Виникає замкнуте коло, розірвати яке можливо з використанням протизапальних засобів та антиоксидантів (Ю.И. Губский, А.Г.Горюшко, 1999).

Аналіз результатів досліджень антиальтеративної активності препаратів СОД на моделі "оцтових виразок" у щурів у порівнянні зі стандартними препаратами – диклофенаком натрію та індометацином показав, що Содrec в дозах 0,020 і 0,065 мг/кг (ЕД50) виявляла виражену антиальтеративну активність, що підтверджувалося швидким загоєнням виразок. Так, на 8у добу досліду антиальтеративна активність Содrec склала більше 40%. Наприкінці досліду (21 доба) у 75% тварин, яким вводили Содrec, спостерігалося рубцювання ран, а при застосуванні кверцетину – у 59,6%. Антиальтеративна активність диклофенаку натрію склала 21%, а стандартний препарат індометацин антиальтеративної дії не чинив. Аналізуючи вплив Содrec на процес альтерації, встановлено, що найбільш значну антиальтеративну й антиокисну активність рекомбінантна СОД виявляла в дозі 0,065 мг/кг, а мембранозахисну - у дозі 0,020 мг/кг.

Подальше вивчення антиальтеративної дії СОД проводили на моделі фенолового вульвовагініту. Встановлено, що у тварин з феноловим вульвовагінітом спостерігалися множинні ерозії, геморагії, виразки; визначався виражений лейкоцитоз, зростання ШОЕ та гіпертермія. Так, площа пошкодження вульви у щурів склала 57%, кількість точкових крововиливів – 60%, спостерігалося підвищення температури тіла у 1,2 рази, кількість лейкоцитів збільшилася на 43,6%, ШОЕ – на 45,7%. Мала місце активізація процесів ВРО, що підтверджується збільшенням рівня ТБК- активних продуктів в 1,4 рази, а каталази - у 1,8 рази.

Використання антиоксидантів сприяло зменшенню токсичних проявів фенолового вульвовагініту. Слід зазначити, що ефективність антиоксидантів при феноловому вульвовагініті виражена по-різному, найбільшою вона є при застосуванні препаратів Содrec і Содer: рівень лейкоцитів зменшився в 1,2 рази, а ШОЕ - у 1,3 рази (р ? 0,05). Що ж стосується референс-препаратів – -токоферолу ацетату й обліпихової олії, то при їх застосуванні спостерігалась лише тенденція до зменшення цих показників. Таким чином, при феноловому вульвовагініті ефективність препаратів знаходиться в такій залежності: препарати СОД ? токоферолу ацетат > обліпихова олія.

Наступним етапом нашої роботи було вивчення впливу препаратів СОД у широкому діапазоні доз на ексудативну фазу гострого асептичного запалення на класичних моделях запалення, у механізмі розвитку яких беруть участь різноманітні флогогенні агенти.

Досліджено, що за умов карагенінового набряку в щурів Содrec у дозах 0,020 мг/кг і 0,065 мг/кг чинить максимальну антиексудативну (рис. 1) та антиокисну дії. Експериментально встановлено полімодальну залежність “доза— ефект” – максимум активності препаратів СОД спостерігається в певних інтервалах доз, які розділені між собою так званою “мертвою зоною”. Це відповідає теорії О.Б. Бурлакової, А.А. Конрадов, Е.Л. Мальцева (2001) про ефекти супермалих доз ендогених біологічно-активних речовин.

Рис. 1. Антиексудативна активність (%) препаратів СОД, НПЗЗ та антиоксидантів при карагеніновому набряку у щурів

Антиексудативна дія Содrec, на наш погляд, зумовлена її антиоксидантними властивостями. Останнє підтверджується більш вираженим зниженням під впливом рекомбінантної СОД рівня ТБК-активних продуктів – у 1,5 рази. Використання препаратів СОД зберігало активність ферментів-антиокислювачів (каталази, глутатіон-пероксидази та глутатіон-трансферази) , що забезпечувало стабільність протікання процесів ВРО. За антиексудативною активністю (рис. 1) СОДer та пероксинорм дещо поступались СОДrec. Токоферолу ацетат та кверцетин також пригнічують процеси ВРО і захищають ферменти-антиокислювачі від ушкодження. Однак ці препарати діють на більш пізніх стадіях ВРО, коли вже відбулося порушення інтимних структур клітин АФК і їх метаболітів, що зменшує їхню терапевтичну цінність.

При застосуванні класичних антифлогістиків - індометацину і диклофенаку натрію - спостерігалась виразна тенденція до нормалізації цих показників. Вони меншою мірою, ніж препарати СОД, знижували рівень ТБК-активних продуктів (у середньому на 20%), що ймовірно, зумовлено розбіжностями у механізмах дії цих препаратів. Препарати СОД і кверцетин більш активні у водній фазі, а -токоферолу ацетат – у ліпідній, а оскільки генерація АФК починається саме у водній фазі, роль гідрофільних антиоксидантів є більш істотною, ніж вважали раніше (М.В.Биленко, 1998; В.В. Абрамченко, 2001). Однак, традиційні антиоксиданти, діючи на більш пізніх стадіях ВРО, недостатньою мірою попереджають окислювальну модифікацію фосфоліпаз, що зумовлює менш виразний протизапальних ефект.

У результаті проведених досліджень було виявлено високу антиексудативну активність препаратів СОД і при зимозановому набряку, у патогенезі якого істотна роль належить лейкотрієнам, що запускають каскад запальних, алергічних та ін. деструктивних процесів (В.А.Насонова, 2002). На відміну від препаратів порівняння, антиексудативний ефект препаратів СОД спостерігався протягом 3 годин. Максимум дії диклофенаку (32,6%) та індометацину (38,5%) спостерігався на 3 годину досліду (простагландинова фаза набряку), а кверцетину – на 1у (37,4%) та 2у годину (39,2%) досліду (лейкотрієнова фаза набряку). Цей факт свідчить про те, що препарати СОД прямо не впливають на ЦОГ і ЛОГ, а ймовірніше за все зменшують окислювальну модифікацію фосфоліпаз. Це підтверджується також і даними літератури (В.В. Абрамченко, 2001).

У процесі розвитку набряку в гострій фазі запалення, незважаючи на етіологічний чинник, одним з найбільш виразних і характерних порушень є збільшення проникності судин. Механізми підвищення судинної проникності при асептичному запаленні різноманітні, але завжди включають підвищення вмісту в біологічних рідинах факторів проникності. При вивченні вазопротекторної дії препаратів СОД ми використовували різноманітні агенти, що ушкоджують стінки судин: каолін, серотонін, гістамін, карагенін, формалін. Встановлено, що введення рекомбінантної СОД супроводжується судиностабілізуючим ефектом, але характер і виразність її дії залежить від генезe ушкодження судин. Так, для препаратів СОД більш виражена антиексудативна активність при введенні формаліну, карагеніну, а активність при введенні гістаміну і серотоніну була близька до такої індометацину. Можливо, що в механізмі судиностабілізувального ефекту препаратів СОД, крім антиоксидантного, важливу роль відіграє пригнічення вивільнення лізосомальних ферментів за рахунок інших, опосередкованих механізмів.

Відомо, що ефективність фармакотерапії багатьох запальних захворювань певною мірою залежить від циркадних ритмів організму (С.А.Сєров, 2001). Урахування цих біоритмів дозволяє не тільки підвищити якість лікування хворих, але й знизити кількість ускладнень фармакотерапії. У зв'язку з тим, що Содrec є високоактивною речовиною і, як усі БАР, залежить від циркадних ритмів, становило інтерес вивчити залежність її антиексудативної дії від пори року і доби. Результати досліджень показують, що антиексудативна активність Содrec має хронологічну залежність. У денний час (1400) Содrec починає діяти набагато раніше, ніж введена ранком і ввечері. Крім добового біоритму, активність Содrec підлягає і сезонним впливам. У весняний час максимум антиексудативної активності Содrec припадає на першу (42,5%) і другу (40,5%) години після її введення, а в зимовий - на другу (38,5%) і п'яту (39,9%) години. Найменша антиексудативна активність у препаратів СОД (20%) спостерігається восени. Таким чином, застосування Содrec найбільш ефективне в зимовий і весняний період у ранкові години.

Завершальною стадією запального процесу є проліферація.

Вивчення антипроліферативної й антиексудативної дії Содrec проводили на моделі ад’ювантного артриту, що вважається найбільш адекватним ревматоїдному артриту (РА) в людини, і на моделі "ватяної гранульоми".

На моделі "ватяної гранульоми" встановлено (рис. 2), що за антипроліферативною активністю СОДrec поступається індометацину (на 18%) і майже не поступається диклофенаку натрію.

Рис.2. Антипроліферативна активність (%) препаратів СОД та НПЗЗ

Антипроліферативна активність (рис. 2) СОДer та пероксинорму майже не відрізнялись від дії СОДrec. У той же час, за антиокислювальною та антицитолітичною активністю препарати СОД перевищували дію диклофенаку натрію на 24,5%, а індометацину – на 37,4%.

Як відомо, у патогенезі РА провідним компонентом ушкодження є імунний фактор, що підтверджується збільшенням рівня ЦІК, загального комплементу, зниженням рівня Е-РОК. Однією з причин збільшення рівня ЦІК при ад’ювантному артриті, є посилене утворення та надходження екзо- і ендоантигенів. ЦІК активують систему комплементу з наступним ушкодженням мембран еритроцитів і їхнім гемолізом (Я.В.Рожковський, 2002). Ці ушкодження пов'язані з утворенням О2–, тому застосування препаратів СОД є патогенетично виправданим, що й підтверджують результати наших досліджень, які свідчать про більш виражене зниження під впливом Содrec при ад’ювантному артриті у щурів рівня ЦІК: у 1,7 рази (доза Содrec 0,02 мг/кг) і 1,6 рази (доза 0,065 мг/кг) та загального комплементу, рівень якого знизився в 1,6 рази (доза 0,020 мг/кг) і 1,5 рази (доза 0,065 мг/кг). Рівень загального комплементу при застосуванні диклофенаку знизився в 1,24 рази, низькомолекулярних ЦІК - у 1,28 рази, високомолекулярних - у 1,1 рази. На наш погляд, отримані результати обумовлені тим, що фермент СОД зменшує активуючий вплив О2–? на імунну систему. Таким чином, у проліферативній фазі запалення при інтенсифікації процесів ВРО, що призводить до виникнення грануляційної тканини, виправдане застосування препаратів СОД, а при сформованій гранульомі краще використовувати класичні НПЗЗ (табл. 3).

Таблиця 3

Порівняльна ефективність препаратів СОД при запаленні різного генезу

Стадія запалення | Модель | Відповідність патології у людини | Ефективність

Альтерація | Феноловий

вульвовагініт | Неспецифічний вульвовагініт, вульвіт | СОДrec = СОДer -- токоферолу ацетат обліпихова олія

Оцетові виразки | Трофічні виразки | СОДrec = дилофенак натрію індометацин

Ексудація | Карагеніновий набряк | Будь-який запальний процес що супровод-жується ексудацією | Індометацин диклофенак натрію СОДrec = СОДer

пероксинорм кверцетин -токоферолу ацетат

Зимозановий

набряк | Будь-який запальний процес що супроводжуєть-ся ексудацією, алергічний набряк | Кверцетин СОДrec = СОДer пероксинорм диклофенак натрію -токоферолу

ацетат

Проліферація | Ватяна

гранульома | Надлишкове утворення грануляційної тканини | Індометацин СОДrec диклофенак натрію

Ад’ювантний артрит | Ревматоїдний артрит та ін. ураження сполучної тканини | CОДrec диклофенак натрію

З наявністю вираженої антиоксидантної й антицитолітичної дії препаратів СОД ми пов'язуємо і потенціюючий ефект протизапальної дії Содrec при комбінованому її застосуванні з НПЗЗ і класичними антиоксидантами. Впливаючи на різні ланки патогенезу запалення, запропоновані комбінації дозволяють значно підвищити ефективність антиексудативної терапії.

Результати досліджень свідчать (рис. 3), що за антиексудативною активністю з 9 комбінацій, що досліджували, найбільш ефективними виявилися наступні комбінації: №3 ? №1 ?4 , які значно перевищували ефективність монотерпапії індометацином, диклофенаком натрію, СОДrec і кверцетином.

Встановлено, що при комбінованому використанні Содrec з кверцетином, диклофенаком натрія та індометацином спостерігається потенційований синергізм, причому підсилюється не тільки ефективність, але й спостерігається пролонгація ефекту. Отже, препарати СОД, кверцетин, індометацин чи диклофенак натрію можна використовувати в комплексній терапії запальних захворювань в дозі ? ЕД50, що свідчить про можливість застосування менших доз антифлогістиків при комбінованій терапії.

Рис. 3. Антиексудативна активність (%) комбінованого застосування Содrec і традиційних НПЗЗ

Примітка: комбінація №1 - Содrec + диклофенак натрію в дозах ЕД50; №3 - СОДrec + індометацин у дозах ЕД50; №4 - Содrec у дозі ЕД50 + індометацин у дозі ?ЕД50.

Дисбаланс системи ВРО/АОС відіграє ключову роль і в формуванні атеросклеротичних пошкоджень (О.Д. Кучеренко, В.Н. Погорелов, 2000). Так, на тлі розвитку експериментального холестеринозу (ЕХ) у кролів спостерігалися вірогідні зміни активності ендогенних антиоксидантів: зниження активності СОД на 58%, глутатіонпероксидази на 53% і незначне підвищення активності каталази (на 17%). Ймовірно, підвищення активності каталази є компенсаторною реакцією на активацію процесів ВРО і "збій" глутатіонпероксидазної системи, що виконує подібні з каталазою функції (М.В.Биленко, 2004).

Застосування препарату Содrec призвело до зниження інтенсивності процесів ВРО в 2 рази (при використанні -токоферолу ацетату – в 1,7 рази) та збільшило активність ендогенної СОД, каталази і глутатіонпероксидази в середньому в 2 рази у порівнянні з нелікованим контролем. При цьому вміст ЛПДНЩ, ЛПНЩ на тлі застосування Содrec зменшився в 1,3 рази, загального холестерину - в 1,4 рази, ТГ - в 1,35 рази, у той час як рівень ЛПВЩ підвищився в 1,3 рази. При використанні - токоферолу рівень ТГ знизився в 1,26 рази; загальний холестерин і вміст ЛПНП знизився в 1,2 рази, а зміни рівнів ЛПДНЩ і ЛПВЩ були мінімальні.

Ці зміни супроводжувались покращенням реологічних властивостей крові , однак ефективність Содrec була в 1,8 рази вище, ніж - токоферолу ацетату. Як відомо, захисний антиоксидантний потенціал екстрацелюлярного матриксу та кліток судинної стінки формується, у тому числі, і завдяки концентруванню на ній екстрацелюлярної СОД. Є ряд публікацій, у яких повідомлялося про захист ендотелиального фактора релаксації судин (EDRF) завдяки дії СОД, що, сповільнює розвиток тромбоцит - залежного тромбозу (а.в. Максименко, е.г. тищенко, в.л. голубых, 1999). Отримані дані про зменшення активності процесів ВРО, рівня атерогенних ліпідів, покращення реологічних властивостей крові при експериментальному холестеринозі у кролів на фоні застосування Содrec свідчать про доцільність її використання у комплексі антиатеросклеротичної терапії.

Гіперліпідемія разом із гіперглікемією є основними факторами розвитку ангіопатій (Н.І Горбенко, 2005). Вивчення впливу препаратів СОД на стан обмінних процесів і виразність ангіодеструктивних порушень при дитизоновому діабеті у кролів показало, що один з шляхів реалізації ангіопротекторної дії препаратів СОД пов'язаний з пригніченням процесів ВРО. Останнє призводить до зниженню рівня альбумінурії (непрямий маркер мікроангіопатії) в 3,8 рази в порівнянні з нелікованими тваринами.

Токоферолу ацетат за впливом на ці показники поступався Содrec у середньому у 1,7 рази. За ступенем впливу препаратів на показники інтенсивності процесів ВРО і зниження альбумінурії, ефективність препаратів СОД при модельному цукровому діабеті в 1,6 рази перевищувала ефекти ?-токоферолу ацетату (рис.4).

Рис. 4. Вплив препаратів СОД на рівень альбумінурії (ммоль/о) у кролів з дитизоновим діабетом.

Активація процесів ВРО є одним з чинників формування кардіальної патології (И.Г. Березняков, 2006). Як відомо, ступінь активації процесів ВРО є об'єктивним критерієм адренергічного впливу та індивідуальної чутливості організму до стресу (И.Т. Волошин, 2002). Будь-яка стресорна дія активує процеси ВРО, що призводить до формування так званої "ліпідної тріади ушкодження", яка складається з активації фосфоліпаз і ліпаз, активації ПОЛ і детергентної дії лізофосфатидилхоліну і надлишку жирних кислот (М.В. Биленко, 2003).

Таким чином, з одного боку, підвищення рівня ПОЛ є відображенням міри і глибини метаболічних розладів, а з іншого – накопичення ліпоперекисів викликає низку серйозних вторинних патологічних феноменів з боку серцево-судинної системи (наприклад, аритмогений ефект, негативну інотропну дію й ін.).

Катехоламінобумовлені пошкодження міокарду (КОПМ) характеризуються істотною активацією процесів ВРО. Про це свідчить збільшення рівня ТБК - активних продуктів у міокарді в середньому на 47 % і на 25 % у сироватці крові. При цьому спостерігається пригнічення загальної антиокислювальної активності (ЗАА) ліпідів плазми крові на 42 %. Застосування СоДrec більш виразно вплинуло на інтенсивність процесів ВРО й ЗАА: рівень ТБК - активних продуктів у міокарді під впливом Содrec і СОДer практично нормалізувався, а ЗАА плазми крові наблизилася до показників у інтактних тварин. Менш вираженими були зміни у тварин, яким вводили - токоферол: рівень ТБК - активних продуктів у них знижувався, однак не так істотно, як у тварин, лікованих Содer і Содrec (р 0,05).

Таким чином, за ступенем впливу на процеси ВРО при КОПМ ефективність засобів, які досліджували, розташувалась наступним чином; СОДrec > СОДer ? пероксинорм > емоксипін >кверцетин >?-токоферолу ацетат.

Застосування препаратів СОД при КОПМ у лікувально-профілактичному режимі супроводжувалося поліпшенням функціонального стану серцевого м'яза. Про це свідчить відновлення під впливом препаратів СОД часу розповсюдження потенціалу в передсердях (РQ), зменшення електрокардіографічних показників ішемії міокарда (підйом сегмента SТ над ізолінією), нормалізація шлуночкової провідності (інтервал QRS), а також інших показників ЕКГ.

Введення препаратів СОД при КОПМ сприяло зниженню інтенсивності вільнорадикальних процесів (у середньому на 30-42%). Використання антиоксидантів також сприяло поліпшенню метаболічних перетворень у міокарді, що підтверджувалося збільшенням накопичення в міокарді одного з основних енергосубстратів – глікогену та нормалізацією рівнів АТФ і АДФ і фосфокреатину.

На фоні застосування препаратів СОД при КОМП спостерігалося достовірне (стосовно контрольної патології) зменшення ВКС (в 1,3 –1,8 рази), АсАТ, ЛДГ та КФК (у 1,3-2,1 рази), що свідчить про обмеження цитодеструктивних процесів у міокарді та підтверджено гістологічно.

Так, серцевий м'яз тварин з ізадриновим міокардитом, яким вводили препарат СОД, був без патологічних змін: серцево-м'язові волокна були однакові за величиною і забарвленням, не переривались, помірно анастомозували одне з одним. Спостерігалось видиме збільшення чисельності ядер у м'язових волокнах у порівнянні з контрольною патологією. Ці зміни практично відповідали інтактному контролю.

В результаті проведених дослідів встановлено, що за кардіопротекторною активністю СОДrec на 30-40% ефективніше за референс-препарати: емоксипін, кверцетин та - токоферола (табл. 4).

Однак не тільки гіперкатехоламінемія визначає виразність патології серцево-судинної системи. При активації симпато-адреналової системи підвищується рівень вазопресину -