НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ
Денисова Ольга Миколаївна
УДК:57.043:612.111:599
КРІОЧУТЛИВІСТЬ ЕРИТРОЦИТІВ РІЗНИХ ВИДІВ ССАВЦІВ
03.00.19 – кріобіологія
Автореферерат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Харків - 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Харківській державній зооветеринарній академії
Міністерства аграрної політики України та Інституті проблем кріобіології і
кріомедицини Національної Академії наук України
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Жегунов Геннадій Федорович, Харківська державна зооветеринарна академія МАП України, завідувач кафедри хімії та біохімії, м. Харків
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Гулевський Олександр Кирилович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу біохімії холодової адаптації, м. Харків
доктор біологічних наук, професор, академік УААН Осташко Федір Іванович, Харківський біотехнологічний центр УААН, головний науковий співробітник, м. Харків
Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, відділ експериментальних клітинних систем, м. Київ
Захист відбудеться "16'' травня 2006 р. о "13-30" годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків - 15, вул. Переяславська, 23
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків-15, вул. Переяславська. 23
Автореферат розіслано '' 12" квітня 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради—
член-кореспондент НАН України Гольцев А. М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність роботи. Вивчення механізмів кріопошкодження та кріозахисту| біологічних об'єктів є|з'являється,являється| однією з актуальних проблем сучасної кріобіології. Виявлення загальних|спільних| закономірностей змін структури і функцій клітин|клітин| в стресових умовах надасть можливість|спроможність| розробити ефективні методи кріоконсервування клітинних|кліткових| суспензій.
У ветеринарній практиці останнім часом для лікування тварин широко використовують метод переливання крові. |в,біля| Собакам в зарубіжній практиці застосовують гемотрансфузію з 50-х років, зокрема, при гострій крововтраті, гострій гемолітичній анемії, хронічній анемії, тромбоцитопенії та інш. [Hohenhaus A.E., 1992; Kristensen A.T. et al., 1995]. Гемотрансфузія є|з'являється,являється| також високоефективним методом інтенсивної терапії. Багато ветеринарних лікарів|лікарок| використовують кров, заготовлену на цитратратному буфері або “Глюгіцирі”. Проте|однак| така кров при позитивних температурах може зберігатися протягом обмеженого часу. При гіпотермічному зберіганні погіршуються морфофункціональні| властивості клітин|клітин|. Тому створення|створіння| запасів донорської крові тварин можливе лише при довгостроковому зберіганні клітин|клітин| в замороженому стані.
Існують численні|багаточисельні| роботи по вивченню впливу кріопротекторів| різного механізму дії на збереження еритроцитів людини і ефективності різних способів їх кріоконсервування [Аграненко В.А. и др. 1980; Wagner C.T. et al., 2002; Scott K.L. et al., 2005]. Зараз|нині| розроблено методи низькотемпературного консервування крові людини для її збереження|зберігання| протягом тривалого часу [Sumida S., 1999; Бабійчук Л.О. та інш., 2000]. Для клітин|клітин| тварин таких технологій не існує. Однак еритроцити різних видів ссавців мають особливості структури мембрани:|споруди| мембранно-цитоскелетного| комплексу, фосфоліпідного| складу і регуляції іонного гомеостазу [Harvey J.W., 1997]. Зокрема, було показано, що в мембрані еритроцитів коня відсутній білок смуги 4.2 [Matei H. et al., 2000], в еритроцитах бика виявлено високий рівень сфінгомієліну| та відсутність фосфотидилхоліну| [Florin-Christensen J.et al., 2001]. Особливістю еритроцитів собаки та бика є|з'являється,являється| велика концентрація іонів натрію в клітинах|клітинах| [Parker J.C., 1977; Zeidler R.B. et al., 1979]. Це багато в чому може визначати їх різну реакцію на дію кріопротекторів| та інших факторів кріоконсервування.
Тому дослідження стійкості еритроцитів, що відрізняються особливостями будови та організації мембрани, при дії кріопротекторів| і інших чинників|факторів| низькотемпературного консервування дозволить чіткіше виявити причини кріочутливості та розробити методи, спрямовані|спрямовані| на підвищення збереженості клітин|клітин| в умовах заморожування-відігрівання.
Таким чином, вивчення механізмів кріозахисту| і кріопошкодження| еритроцитів різних видів ссавців дозволить розробити низькотемпературні технології зберігання клітин і створити банк крові тварин, що надасть можливість|спроможність| завжди мати запас крові, особливо рідкісних їх|рідких| груп.
Зв'язок з| науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до наукового напрямку роботи кафедри хімії і біохімії Харківської державної зооветеринарної академії МАП України | в рамках теми: “Експериментальне обґрунтування та розробка методів кріоконсервування клітин та тканин домашніх і сільськогосподарських тварин”, № держреєстрації 0104U009818 та у відділі кріоцитології та кількісної морфології Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за темою: “Вивчення молекулярних механізмів структурно-функціональних змін плазматичних мембран і цитоскелета еритроцитів донорської і кордової крові людини під впливом температурно-осмотичних ефектів і кріпротекторів різного механізму дії”, № держреєстрації 0104U006436, де автор самостійно виконувала окремі розділи.
Мета|ціль| і задачі|задачі| дослідження. Мета|ціль| роботи – вивчити чутливість еритроцитів різних видів ссавців (кінь, бик і собака) до кріоконсервування під захистом кріопротекторів| різного механізму дії і оцінити структурно-функціональний стан деконсервованих| клітин|клітин|.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити|розв'язати| такі задачі|задачі|:
1. Оцінити збереження еритроцитів коня, бика і собаки після |потім| кріоконсервування з|із| проникаючими|проникними| (гліцерин, ДМСО|) і непроникаючим|проникним| (ПЕО-1500|) кріопротекторами||, а також після|потім| повернення деконсервованих клітин до фізіологічних умов.
2. Визначити коефіцієнти проникності мембран еритроцитів для проникаючих|проникних| кріопротекторів|.
3. Охарактеризувати морфологічні зміни еритроцитів коня, бика і собаки на етапі інкубації з|із| кріопротектором|, після|потім| заморожування-відігрівання і оцінити оборотність цих трансформацій.
4. Визначити основні метаболічні показники клітин|клітин| (АТФ, 2,3-ДФГ|) після|потім| низькотемпературного консервування з кріопротекторами| різного механізму дії.
5. Вивчити характер|вдачу| модифікації просторового упакування білків мембранно-цитоскелетного| комплексу еритроцитів коня, бика і собаки за даними гель-електрофорезу| після|потім| інкубації еритроцитів з|із| кріопротекторами|, заморожування-відігрівання і повернення деконсервованих| клітин|клітин| до фізіологічних умов.
Об'єкт дослідження – кріоконсервування еритроцитів коня, бика і собаки.
Предмет дослідження – кріочутливість| еритроцитів коня, бика і собаки до факторів низькотемпературного консервування.
Методи дослідження: спектрофотометричний|, фотоколориметричний, світлової мікроскопії, малокутового розсіяння, електрофорезу| в ПААГ.
Наукова новизна|новинка| одержаних результатів. Уперше|уперше| показано, що ДМСО в концентрації 10 %| забезпечує достатньо|досить| високий рівень захисту еритроцитів коня, бика і собаки в процесі кріоконсервування. Встановлено|установлено|, що гліцерин не має|робить,виявляє,чинить| захисного ефекту на досліджені клітини|клітини| при низькотемпературному консервуванні. Доведено, що ДМСО| проникає в еритроцити коня, бика і собаки набагато швидше, ніж гліцерин. Відзначено|установлено|, що ПЕО-1500| здатний|здібний| захищати еритроцити ссавців від пошкодження при заморожуванні-відігріві. Проте|однак| перенесення таких клітин|клітин| до фізіологічних умов приводить|призводить,наводить| до підвищення їх осмотичної крихкості і значного гемолізу.
У роботі встановлено|установлено|, що кріопротектори| (ДМСО| і ПЕО-1500|) істотно|суттєвий| впливають на форму еритроцитів коня, бика і собаки. Після|потім| кріоконсервування клітин|клітин| у присутності ДМСО| (10 %) і подальшого|наступного| видалення|віддалення| кріопротектора вони набувають форми ехіноцитів|. При перенесенні таких клітин|клітин| до аутоплазми| вони трансформуються у початкові|вихідні| форми. Кріоконсервування з|із| ПЕО-1500| (15%) супроводжується|супроводиться| утворенням стоматоцитоподібних| форм, які не зникають при поверненні їх до фізіологічних умов.
Доведено, що після|потім| кріоконсервування еритроцитів коня, бика і собаки з|із| ДМСО| і ПЕО-1500| рівень основних макроергів (АТФ і 2,3-ДФГ|), які визначають функціональні показники еритроцитів, не змінюється.
Використання методу електрофорезу| в ПААГ| у присутності діаміду дозволило встановити, що кріоконсервування еритроцитів з|із| кріопротекторами| ПЕО-1500| і ДМСО| веде до перерозподілу окремих фракцій у білковому спектрі, який відображає|відбиває| модифікацію структурного стану і зміни просторової упаковки білків мембрани еритроцитів. Виявлено, що модифікація мембрани еритроцитів, кріоконсервированих| з|із| ДМСО|, менша, ніж модифікація з|із| ПЕО-1500|, що відповідає показникам збереження клітин|клітин| крові тварин після|потім| моделювання трансфузії|.
Практичне значення одержаних результатів. В результаті|унаслідок,внаслідок| дослідження кріочутливості еритроцитів різних видів ссавців одержані|отримані| дані, які дозволять розробити нові ефективні технології кріоконсервування цих клітин зі збереженням їх структурно-функціональних показників на достатньо високому рівні. Це надасть можливість надалі |спроможність| створити банк крові домашніх|хатніх| тварин.
Експериментальні дані щодо порівняльного вивчення еритроцитів ссавців можуть бути рекомендовані для вивчення у ВУЗах зі спеціальностями біохімії та фізіології.
Особистий|особовий| внесок|вклад| здобувача|конкурсанта|. Дисертація є|з'являється,являється| самостійним дослідженням здобувача|конкурсанта|. Разом з науковим|із| керівником дисертант сформульовав мету|ціль| і визначив задачі|задачі| дослідження. Претендентом|конкурсантом| одержано|отримані| експериментальні дані у всіх розділах досліджень, проведено їх статистичну обробку. Автором роботи самостійно проаналізовано отримані результати і зроблено висновки|виведення|. В опублікованих спільно зі співавторами працях| особистий| внесок| здобувача| полягає:
- у|в,біля| роботі [1] у|в,біля| вивченні впливу процесів кріоконсервування і кріопротекторів| на морфологічні зміни еритроцитів коня, бика і собаки;
- у|в,біля| роботах [3, 4] у|в,біля| визначенні рівня АТФ і 2,3-ДФГ| в еритроцитах| досліджуваних| тварин після|потім| заморожування-відігрівання;
- у|в,біля| роботах [2, 3, 5 – 8] у|в,біля| вивченні впливу кріоконсервування і кріопротекторів| на збереження еритроцитів ссавців, а також у вивченні кріочутливості| еритроцитів тварин;
- у|в,біля| роботі [9] у|в,біля| вивченні зміни білків мембрани і цитоскелета еритроцитів після кріоконсервування.
Апробація|випробування| результатів дисертації. Результати проведених досліджень доповідались|уявлені| на конференції “Дні науки 2005|” (Дніпропетровськ, 2005), конференції “Молодь і поступ в біології ” (Львів, 2005), конференції молодих учених ІПКіК НАН України “Холод в биологии и медицине” (Харків, 2005), конференції молодих учених “Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии – 2005” (Київ, 2005), конференції “Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна і функціональна організація стовбурових клітин за умов дії низьких температур ” (Харків, 2005).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 робіт, з яких 5 - |із| у спеціалізованих фахових виданнях.|часописах|
Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена| на 169 сторінках друкованого тексту, з яких 126 сторінки основного змісту. Дисертація складається зі вступу|, огляду| літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних| досліджень, аналізу і узагальнення| результатів досліджень, висновків, переліку використаної літератури (245 джерел|, розміщено на 24 сторінках) і додатка (на 19 сторінках)|. Робота ілюстрована 10 таблицями|, 19 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ|вміст,утримання|
Матеріали і методи дослідження
Матеріалом дослідження були еритроцити донорської крові коня, бика, собаки, яку заготовляли на глюгіцировому| консерванті.
Обробка еритроцитів кріопротекторами|, заморожування-відігрівання і видалення|віддалення| проникаючих|проникних| кріопротекторів|. До еритроцитів тварин додавали|добавляли| кріоконсерванти на основі гліцерину, диметилсульфоксиду (ДМСО)| або поліетиленоксиду м.м. 1500 (ПЕО-1500)| у співвідношенні 1:1 за об'ємом. Заморожування здійснювали до температури -196 °С шляхом занурення контейнера в рідкий азот. Відігрівання після|потім| зберігання проводили|виробляли,справляли| на водяній бані при|бані| |із| 42 - 45 °С. Для видалення|віддалення| проникаючих|проникних| кріопротекторів| проводили триразове відмивання еритроцитів відповідно до стандартних (для еритроцитів людини) методик [Терехов Н.Т., 1983, Sumida S. et al., 1999].
Моделювання трансфузії|. Здійснювали перенесенням клітин до|клітин| ізотонічного розчину NaCl, що містить|утримує| 10 мМ| фосфатного буфера, рН| 7,4 або до аутоплазми| при 37 °С. Розведення еритроцитів складало 1:10 відповідно до|із| встановлених|установленими| процедур трансфузії| доз крові реципієнтам.
Осмотична крихкість. Визначали за методом [Тодоров Й., 1960], оцінюючи стійкість клітин|клітин| в гіпотонічних розчинах NaCl 0,1 - 0,9 %. Індекс осмотичної крихкості визначали як концентрацію NaCl, коли відбувається|походить| 50 %-й| гемоліз.
Визначення рівня гемолізу еритроцитів. Визначали за вмістом вільного гемоглобіну в супернатанті спектрофотометричним методом| на СФ-46| (ЛОМО|, Росія) при довжині хвилі 543 нм| [Дервиз Г.В. и др., 1966].
Спосіб визначення коефіцієнта проникності еритроцитів для кріопротекторів|. | Визначали за методом [Gordienko E.A. еt al., 2003] на основі фізико-математичної моделі гіпотонічного гемолізу еритроцитів.
Мікроскопічні дослідження. Проводили за методом світлової мікроскопії на мікроскопах МБІ-15У| (ЛОМО|, Росія) і K. Zeiss (JENA, Німеччина|Германія|) з|із| фотографічною реєстрацією морфологічної картини крові. Загальний|спільний| стан клітин|клітин| після|потім| експериментальних дій оцінювали в краплі|краплині|, яку поміщали між предметним|предметним| і покривним стеклами, і рівномірно розподіляли тонким шаром. Для морфологічної оцінки особливостей форми і поверхневої|поверхової,зверхньої| структури еритроцитів використовували загальноприйняту класифікацію [Bessis M. еt al., 1973].
Неферментативний метод визначення 2,3-ДФГ еритроцитів. Визначення концентрації 2,3-ДФГ| в еритроцитах проводили за методом [Шарова Ю.А. и др., 1978].
Спектрофотометричний| гексокіназний| метод визначення вмісту|вмісту,утримання| АТФ. Рівень АТФ вимірювали|виміряли| спектрофотометрично| за методом [Beutler E., 1975].
Отримання|здобуття| білих тіней еритроцитів. Білі тіні еритроцитів, піддані відповідним чином експериментальним діям, одержували|отримували| гіпотонічним шоком за методом [Fairbanks G. еt al., 1971].
Обробка клітин|клітин| діамідом. Після|потім| експериментальних дій аліквоти| клітин|клітин| інкубували при 37 °С у присутності 2,5 мМ| діаміду протягом 1 години [Haest C.W.H. еt al., 1977], після чого одержували|отримували| тіні, як описано вище.
Електрофорез| білків мембран еритроцитів. Проводили в| SDS-ПААГ за системою Лемлі [Fairbanks G. еt al., 1971]. Використовували градієнтний гель 5-20Т4С. Для визначення молекулярної маси білків використовували маркери фірми Fluka. Оцінку відносного вмісту|вмісту,утримання| білків різних фракцій на доріжці SDS-ПААГ проводили за допомогою денситометрування| (денситометр DM2120 “Solar”) і комп'ютерної програми Scion Image .
Статистична обробка результатів. Отримані результати обробляли за методом Стюдента-Фішера.
Результати досліджень та їх обговорення
Збереження еритроцитів ссавців після|потім| кріоконсервування. Співвідношення захисної дії кріопротектора | і його цитотоксичного ефекту залежить від багатьох факторів|факторів|: умов інкубації, концентрації, температури, швидкості введення|вступу| кріопротектора| до клітинної|кліткову| суспензії. Тому на першому етапі роботи були проведені дослідження щодо вибору кріоконсервантів, умов їх введення|вступу| і видалення|віддалення| з|із| клітинної|кліткової| суспензії після|потім| заморожування-відігрівання. Доведено, що при кріоконсервуванні гліцерин мало ефективний для захисту еритроцитів собаки і взагалі не має|робить,виявляє,чинить| захисного ефекту для еритроцитів коня і бика (рис.1).
Рис. 1. Рівень гемолізу деконсервованих| еритроцитів: ¦ – еритроцити, кріоконсервовані| під захистом 15 %-го| ПЕО-1500|; ? – еритроцити, кріоконсервовані| під захистом 10 %-го| ДМСО|; – еритроцити, кріоконсервовані| під захистом 15 %-го| гліцерину. Результати подані з|із| 8 незалежних експериментів як |уявлені| середнє значення ± середня помилка (М±м).
Використання ДМСО | як кріопротектора довело, що його 10 % концентрація здатна|здібна| захищати еритроцити досліджених тварин від пошкоджувальної низькотемпературної дії. Визначення коефіцієнта проникності еритроцитів тварин для проникаючих|проникних| кріопротекторів| показало, що гліцерин дуже повільно|повільно| проникає в еритроцити коня, бика і собаки, на відміну від ДМСО|. Перспективним напрямком|направленням| розробки способів кріоконсервування еритроцитів є|з'являються,являються| технології, засновані на застосуванні|вживання| непроникаючих|проникних| кріопротекторів|. Враховуючи дані низькотемпературного збереження еритроцитів людини, були проведені експерименти щодо вивчення стійкості еритроцитів тварин до заморожування під захистом ПЕО-1500|. Одержані|отримані| дані (рис.1) показали, що відразу після|потім| кріоконсервування еритроцитів визначається незначний рівень гемолізу (~ 1-5 %).
Проте|однак| збереження клітин|клітин| відразу після|потім| розморожування – це недостатня оцінка можливості|спроможності| застосування|вживання| деконсервованих| еритроцитів у практиці. Для успішного переливання крові клітини|клітини| повинні бути стабільні у фізіологічних умовах і мати достатні механоеластичні| властивості.
При перенесенні еритроцитів коня, бика і собаки, кріоконсервованих| з|із| ДМСО після видалення кріопротектора з клітин до ізотонічного середовища при 37 °С, відзначається їх стабільність|клітин|, тоді як після|потім| заморожування з|із| ПЕО-1500| відбувається|походить| їх пошкодження|ушкодження|, яке супроводжується|супроводиться| зростанням|зростом| гемолізу протягом 24 годин дослідження (рис. 2).
Рис. 2. Рівень гемолізу деконсервованих| еритроцитів після|потім| моделювання трансфузії|: ¦ – контрольні клітини|клітини|, ? – клітини|клітини|, кріоконсервовані| з|із| ДМСО|, – клітини|клітинами|, кріоконсервовані| з|із| ПЕО-1500. Результати подані з|із| 8 незалежних експериментів як |уявлені| середнє значення ± середня помилка (М±м); * - достовірно відносно контролю; р< 0,05.
Індекс осмотичної крихкості еритроцитів тварин після|потім| низькотемпературного збереження з|із| ДМСО| не відрізняється від нативних клітин|клітин|, тоді як для еритроцитів, кріоконсервованих| з|із| ПЕО-1500,| відзначається достовірне збільшення даного параметра (рис. 3). Це свідчить про те, що в клітинах|клітинах| після|потім| заморожування-відігрівання з|із| ПЕО-1500| значно порушуються механоеластичні властивості, і клітини стають крихкішими і менш еластичними.
При порівнянні індексу осмотичної крихкості еритроцитів досліджених тварин можна зробити висновок|показно|, що еритроцити коня є|з'являються,являються| менш осмотично| стійкими та міцними, тоді як еритроцити собаки – найбільш осмотично| стійкими в групі досліджуваних тварин. Аналогічні закономірності стійкості клітин|клітин| до кріоконсервування були визначені після|потім| заморожування-відігрівання еритроцитів. Видова специфіка стійкості еритроцитів до стресових дій, очевидно, пов'язана із структурними особливостями мембранно-цитоскелетного| комплексу.
Рис. 3. Індекс осмотичної крихкості еритроцитів ссавців, кріоконсервованих| під захистом різних кріопротекторів|: ¦ – контрольні клітини|клітини|, ? – клітини|клітини|, кріоконсервовані| з|із| ДМСО|, – клітини|клітинами|, кріоконсервовані| з|із| ПЕО-1500. Результати подані з|із| 8 незалежних експериментів як |уявлені| середнє значення ± середня помилка (М±м); * - достовірно відносно контролю; р< 0,05.
Морфологічні показники еритроцитів ссавців під впливом кріопротекторів| і заморожування-відігрівання. Трансформація клітин у|клітин| розчинах кріопротекторів| та після|потім| заморожування-відігрівання відбиває зміни фізико-хімічних|фізико-хімічних| властивостей цитоплазматичної| мембрани і цитоскелета [Кулешова Л.Г. и др., 1980]. Дослідження морфологічних характеристик еритроцитів дозволили оцінити зміни їх форми при експериментальних діях. Інкубація еритроцитів коня, бика і собаки в 10 %-му розчині ДМСО| призводить|призводить,наводить| до трансформації клітин|клітин|, які набувають форми здутих дисків|із|. Після|потім| заморожування-відігрівання і відмивання клітин|клітин| від кріопротектора| основною формою в популяції є|з'являються,являються| ехіноцити|. Було відмічено, що еритроцити бика і собаки при перенесенні до плазми мають форму дискоцитів| на фоні|на фоні| підвищеної кількості дискоехіноцитів| і деформованих клітин|клітин|, а еритроцитів коня в аналогічному експерименті утворюють “монетні стовпчики”. Взагалі|загалом| форма еритроцитів тварин після|потім| перенесення до фізіологічних умов подібна тій, якої вони набувають|придбавають| у розчині “Глюгіцир” після|потім| нетривалого гіпотермічного зберігання. Застосування|вживання| 15 %-го| розчину ПЕО-1500| веде до появи в процесі інкубації сплощених дисків. Стоматоцити з’являються після заморожування-відігрівання таких клітин і не зникають|потім| після|потім| перенесення до аутоплазми|. Особливістю трансформації клітин|клітин| в розчині ПЕО-1500| є|з'являється,являється| посилення їх агрегації і утворення значних конгломератів|.
Дія заморожування-відігрівання і кріопротекторів| на метаболічну стабільність деконсервованих| клітин|клітин|. Виконання основної функції еритроцитів можливо при нормальному енергетичному потенціалі, показником якої є|з'являється,являється| вміст|вміст,утримання| АТФ [Schilling C.H. et al., 1998], та нормальному рівні 2,3-ДФГ |[Harvey J. W., 1997], що відповідає за спорідненість гемоглобіну до кисню. У зв'язку з тим, що в еритроцитах бика низький рівень 2,3-ДФГ| [Bunn H.F., 1981], концентрацію цього метаболіту| в даних клітинах не визначали|клітинах|. Встановлено|установлено|, що відразу після|потім| заморожування-відігрівання еритроцитів коня і собаки у всіх експериментальних варіантах відсутні відмінності|відзнак| концентрації АТФ і 2,3-ДФГ|, а еритроцитів бика – у вмісті|вмісті,утриманні| АТФ від контрольних показників. Одержані|отримані| дані свідчать про те, що під час кріоконсервування, включаючи етап відмивання від кріопротектора|, витік даних метаболітів| не відбувався|походило|. При інкубації еритроцитів тварин, кріоконсервованих| під захистом ПЕО-1500|, у фізіологічних умовах протягом 24 годин достовірно знижуються рівень цих макроергів (рис. 4, 5), що не характерно для контрольних|клітин| та кріоконсервованих| у присутності ДМСО клітин|.
Рис. 4. Динаміка змін рівня АТФ у еритроцитах після|потім| кріоконсервування: ? – нативні еритроцити, – еритроцити, кріоконсервовані| під захистом ДМСО,| – еритроцити, кріоконсервовані| під захистом ПЕО-1500. Результати подані з|із| 6 незалежних експериментів як |уявлені| середнє значення ± середня помилка (М±м); * - достовірно відносно контролю; р< 0,05.
Падіння концентрації даних метаболітів| може бути пов'язано з декількома причинами. По-перше|передусім|, це може бути результатом формування мембранних дефектів під час кріоконсервування, внаслідок чого в процесі інкубації з|із| клітин|клітин| елімінують| макромолекули. По-друге, при перенесенні клітин до|клітин| ізотонічних умов при 37 °С|походить| відновлюються метаболічні процеси, зокрема гліколіз, який пов'язаний із витратою глюкози як природного енергетичного субстрату. По-третє, при фізіологічній температурі в клітинах|клітинах|, кріоконсервованих| під захистом ПЕО-1500,| може збільшитися|походити| витрачання енергії різними транспортними системами і ферментами, необхідне для відновлення клітинного|кліткового| гомеостазу.
Рис. 5. Динаміка змін рівня 2,3-ДФГ| в еритроцитах після|потім| кріоконсервування: ? – нативні еритроцити, – еритроцити, кріоконсервовані| під захистом ДМСО|, – еритроцити, кріоконсервовані| під захистом ПЕО-1500. Результати подані з|із| 10 незалежних експериментів як |уявлені| середнє значення ± середня помилка (М±м); * - достовірно відносно контролю; р< 0,05.
Таким чином, рівень даних метаболітів| в еритроцитах досліджуваних тварин, кріоконсервованих| під захистом ДМСО|, зберігаються на рівні контрольних величин впродовж|упродовж| всього часу при моделюванні трансфузії|, що свідчить про структурно-функціональну повноцінність клітин|клітин|.
Модифікація білкового складу мембран і цитоскелета еритроцитів під впливом кріоконсервування|. Стійкість еритроцитів до заморожування після|потім| інкубації з|із| кріопротекторами| щонайбільше пов'язана з станом мембранно-цитоскелетного| комплекса еритроцитів [Рязанцев В.В. и др., 1991]. При дослідженні модифікації білків цитоскелета методом електрофорезу| в ПААГ| не було виявлено значних відмінностей|відзнак| у всіх експериментальних варіантах, які оцінювалися традиційними методами. Це свідчить про те, що характер|вдача| змін білків мембранно-цитоскелетного| комплексу еритроцитів під час кріоконсервування під захистом непроникаючого|проникного| і проникаючого|проникного| кріопротекторів| важко|скрутно| виявити. Адекватним методичним підходом для вивчення структурних змін, що виникають в цитоскелетній| білковій мережі|сіті| під дією факторів кріоконсервування, є|з'являється,являється| використання діаміду, який фіксує SH-групи білків, призводячи|призводячи,наводячи| до формування дисульфідних містків [Haest G.W.M. et al., 1977; Gaffny BG.J., 1985]. В умовах заморожування-відігрівання і дії розчинів кріопротекторів| можуть відбуватися|походити| зміни просторового розташування молекул цитоскелета, зближення окремих ділянок білків у рамках|у рамках| комплексів, об'єднаних|з'єднаних| взаємодіями типів „спектрин-актин”, „актин-актин”, „спектрин-актин-білок| смуги 4.1”, „спектрин-актин-адуцин”| і т.д. Інкубація еритроцитів у розчині ПЕО-1500| і ДМСО| та подальше заморожування-відігрівання призводить|призводить,наводить| до деякого порушення просторового розташування білків цитоскелета, внаслідок чого з'являються|появляються| доступні для діаміду SH-групи. При цьому змінюється і вміст білків в окремих фракціях: зокрема знижується вміст|вміст,утримання| спектрину|, анкирину|, білків смуги 4.2, 4.9 і 5, а також відбувається|походить| повна|цілковита| втрата білків смуги 6 і 8. Зниження вмісту окремих фракцій білків пов’язана, насамперед, із залученням частини цих білків у процес агрегації під дією діаміду, про що свідчить утворення білкових агрегатів на старті гелю. Модифікація мембранно-цитоскелетного| комплексу виражена|виказані,висловлені| сильніше для еритроцитів, кріоконсервованих| в присутності ПЕО-1500,| і носить необоротний|незворотний,безповоротний| характер|вдачу|, оскільки|тому що| не зникає після|потім| повернення деконсервованих| клітин|клітин| до фізіологічних умов.
Різний ступінь|міра| збереження еритроцитів всіх досліджених тварин після|потім| кріоконсервування, можливо пов'язаний з різним механізмом захисту клітин|клітин| проникаючим|проникним| і непроникаючим|проникним| кріопротекторами| від низькотемпературних пошкоджень|ушкоджень|. Непроникаючий|проникний| кріопротектор| здійснює захист еритроцитів шляхом дегідратації. Відсутність усередині клітин|клітини| речовин, здатних|здібних| стабілізувати структуру води, може приводити|призводити,наводити| до негативних наслідків, пов'язаних з необоротною|незворотною,безповоротною| втратою зв'язаної води гідратних| оболонок білків. Крім того, внаслідок дегідратації еритроцитів підвищується іонна сила розчину усередині клітин|клітини|, що зрештою|врешті решт| може викликати|спричиняти| конформаційні зміни білкових макромолекул. Концентрування солей|соль| і дегідратація молекул здатні|здібні| додатково підсилювати|посилювати| денатурацію білків, яка може бути необоротною,|незворотною,безповоротною| і після|потім| повернення клітин|клітин| до нормальних фізіологічних умов приведе до метаболічного дисбалансу в результаті|унаслідок,внаслідок| порушення ферментативних реакцій і зміни структурної цілісності мембрани і цитоскелета.
ВИСНОВКИ
Механізми кріочутливості еритроцитів людини достатньо вивчено та розроблено ефективні методи їх кріоконсервування, однак для еритроцитів тварин цей напрямок дослідження залишається досить актуальним. У дисертаційній роботі представлено|уявлено| теоретичне узагальнення наукової проблеми щодо порівняльного вивчення чутливості еритроцитів ссавців до кріоконсервування у присутності кріопротекторів| проникаючого|проникного| і непроникаючого|проникного| типів, а також розробки підходів, спрямованих|спрямованих| на зменшення пошкодження|ушкодження| клітин|клітин| в процесі кріоконсервування.
1. Встановлено|установлено|, що гліцерин не здатний|здібний| забезпечити захист еритроцитів досліджених тварин при низькотемпературному консервуванні. Високе збереження клітин|клітин| досягається при використанні ДМСО| і ПЕО-1500|. Еритроцити, кріоконсервовані| з|із| ДМСО|, порівняно з ПЕО-1500| проявляють|виявляють| високу стійкість (на рівні контролю) в моделі трансфузії| з|із| підтримкою нормальної осмотичної крихкості.
2. Коефіцієнт проникності мембран еритроцитів коня, бика та собаки для гліцерину значно нижчий, ніж для ДМСО .
3. Найбільш стійкими до процесу кріоконсервування у присутності кріопротекторів| різного механізму дії є|з'являються,являються| еритроцити собаки, найменш стійкими – еритроцити коня.
4. Виявлено морфологічні зміни клітин|клітин| при кріоконсервуванні в присутності кріопротекторів |. У випадку ДМСО після заморожування-відігрівання та видалення з клітин кріопротектора спостерігається ехіноцитоз, а після перенесення деконсервованих еритроцитів до | аутоплазми відновлюється їх початкова|вихідна| форма|клітин|. При кріоконсервуванні еритроцитів з|із| ПЕО-1500| спостерігається стоматоцитоподібна| трансформація, яка зберігається і після|потім| повернення клітин до фізіологічних умов.
5. При кріоконсервуванні еритроцитів ссавців з|із| ДМСО| і ПЕО-1500| вміст|вміст,утримання| АТФ і 2,3-ДФГ| зберігається на рівні контролю. При моделюванні трансфузії| концентрації цих макроергів в еритроцитах, кріоконсервованих| у присутності ПЕО-1500|, достовірно знижується в процесі інкубації, що не характерно для контрольних і кріоконсервованих| з|із| ДМСО| клітинами|клітинами|.
6. Кріоконсервування еритроцитів у присутності ПЕО-1500 і ДМСО призводить до модифікації білкового спектру мембран, яка виявляється методом електрофорезу| із застосуванням діаміду. При кріоконсервуванні з ПЕО-1500 модифікація мембранно-цитоскелетеного комплексу більш виражена.
ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ
1. Денисова О.Н., Кулешова Л.Г., Землянских Н.Г., Жегунов Г.Ф. Трансформация эритроцитов животных после криоконсервирования // Вісник проблем біології і медицини. – 2005. – Вип.4. – С. 41-45.
2. Денисова О.Н., Жегунов Г. Ф., Бабийчук Л. А. Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленгликоля, глицерина // Проблемы криобиологии. – 2005. – №2. – С. 195-201.
3. Жегунов Г.Ф., Денисова О.Н., Землянских Н.Г. Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных // Проблемы криобиологии. – 2005. – Т.3. – №3. – С. 566 – 569.
4. Денисова О.Н. Исследование уровня 2,3-ДФГ и АТФ в эритроцитах животных после низкотемпературного консервирования под защитой диметилсульфоксида и полиэтиленоксида м.м. 1500 // Вісник проблем біології і медицини. – 2005. – Вип.3. – С. 33-38.
5. Денисова О.М., Жегунов Г.Ф., Бабійчук Л.О. Кріоконсервування еритроцитів тварин під захистом поліетиленоксида // Біологія тварин. – 2004. – Т.6. – №1-2. – С.107-110.
6. Жегунов Г.Ф., Денисова О.Н. Резистентность эритроцитов домашних животных к криоконсервированию // Ветеринарна медицина. – 2005. – Т.1. – С. 433-434.
7. Денисова О.М. Стійкість еритроцитів коня, бика, собаки до кріоконсервування: Тези доповідей 1 Міжнародної конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ в біології.” – Львів, 2005. – С.13.
8. Денисова О.Н. Вивчення ефекту диметилсульфоксиду та поліетиленгліколя при кріоконсервуванні еритроцитів бика, коня: Тези конференції-конкурсу робіт молодих учених, присвяченої 100-річчю від Дня народження М.Ф. Гулого. – Київ, 2005. - С. 12.
9. Денисова О.Н., Землянских Н.Г., Жегунов Г.Ф. Структурные изменения мембран эритроцитов животных при криоконсервировании под защитой ПЭО-1500: Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції „Дні науки 2005”. – Дніпропетровськ: Наука і освіта, 2005. – Т.2. „Біологія.” – С. 17-18.
АНОТАЦІЇ
Денисова О.М. Кріочутливість еритроцитів різних видів ссавців. – Рукопис.
Дисертація на здобуття|конкурс| наукового |ученого| ступеня|міри| кандидата біологічних наук за фахом 03.00.19 – кріобіологія. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини| НАН України, Харків, 2006.
Дисертаційна робота присвячена вивченню чутливості еритроцитів різних видів ссавців (кінь, бик і собака) до кріоконсервування під захистом кріопротекторів| і оцінці структурно-функціонального стану деконсервованих| клітин|клітин|.
Одержані|отримані| в роботі результаті свідчать про те, що найбільш ефективним кріопротектором| в процесі кріоконсервування для еритроцитів коня, бика і собаки є|з'являється,являється| ДМСО|. ПЕО-1500| здатний|здібний| зберігати клітини|клітини| в процесі заморожування-відігрівання, проте|однак| після|потім| перенесення таких деконсервованих| клітин|клітин| до фізіологічних умов вони ушкоджуються. Після|потім| кріоконсервування з|із| 10 %-м ДМСО|, на відміну від 15 %-го ПЕО-1500|, клітини|клітини| зберігають морфологічні показники. Після заморожування-відігріву клітин з ПЕО-1500 та ДМСО концентрації АТФ і 2,3-ДФГ зберігаються на рівні контролю.| Дослідження білків мембрани еритроцитів всіх видів тварин методом електрофорезу| в ПААГ з використанням діаміду показало порушення їх просторового розташування. Модифікація мембранно-цитоскелетного| комплексу виявляється у більшій мірі|виказані,висловлені| для еритроцитів, кріоконсервованих| під захистом ПЕО-1500.|
Ключові|джерельні| слова: кріоконсервування, кріочутливість|, еритроцити коня, бика і собаки, кріопротектори|, мембрана, цитоскелет, АТФ, 2,3-ДФГ|.
Денисова О.Н. Криочувствительность эритроцитов различных видов млекопитающих. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2006.
Диссертационная работа посвящена изучению чувствительности эритроцитов различных видов млекопитающих (лошадь, бык и собака) к криоконсервированию под защитой криопротекторов различного механизма действия и оценке структурно-функционального состояния деконсервированных клеток.
Эритроциты криоконсервировали в присутствии глицерина, ДМСО и ПЭО-1500. После замораживания-отогрева оценивали уровень гемолиза, осмотическую хрупкость, устойчивость клеток при моделировании трансфузии. Морфологические исследования проведены методом световой микроскопии. Модификацию метаболической стабильности определяли по изменению концентраций АТФ и 2,3-ДФГ. Перестройку белков мембранно-цитоскелетного комплекса изучали с использованием метода электрофореза в ПААГ.
Установлено, что при криоконсервировании глицерин не оказывает эффективного криопротекторного действия в отношении эритроцитов лошади, быка и собаки. Изучение влияния концентраций ДМСО 5 – 20 % на выживаемость эритроцитов млекопитающих в процессе криоконсервирования показало, что наиболее приемлемый уровень защиты клеток обеспечивается при 10 %-м содержании криопротектора в среде. Оценка коэффициента проницаемости мембран клеток исследованных животных для проникающих криопротекторов свидетельствует о соответствии данного показателя с их криопротекторной эффективностью. Низкий коэффициент проницаемости глицерина по сравнению с ДМСО согласуется с его малой криопротекторной эффективностью. Незначительный уровень гемолиза (1–5 %) эритроцитов лошади, быка и собаки достигается в присутствии 15 %-го ПЭО-1500 при замораживании до -196 °С.
Клетки, криоконсервированные с 10 %-м ДМСО, проявляют высокую устойчивость при моделировании трансфузии в отличие от эритроцитов, замороженных в присутствии ПЭО-1500. При оценке осмотической хрупкости деконсервированных эритроцитов лошади, быка и собаки были установлены аналогичные закономерности, свидетельствующие о нарушении данного функционального параметра при криоконсервировании под защитой непроникающего криопротектора и способности ДМСО эффективно сохранять клетки.
При морфологических исследованиях было подтверждено, что нативные эритроциты животных представлены дискоцитами. Анализ формы клеток, криоконсервированных под защитой 10 %-го ДМСО, показал, что после удаления криопротектора из клеток основная их часть представлена эхиноцитами, а после перенесения в аутоплазму они приобретают исходные формы. Эритроциты после замораживания-отогрева в присутствии 15 %-го ПЭО-1500 представлены в большей степени стоматоцитами, которые не исчезают после возвращения их в физиологические условия.
Физиологическая роль эритроцитов млекопитающих связана с газообменом. Эффективная доставка кислорода и удаление углекислого газа возможны в условиях нормального метаболического потенциала клетки, который обусловлен продукцией АТФ и 2,3-ДФГ. Следует отметить, что концентрация данных метаболитов сразу после криоконсервирования в присутствии ДМСО и ПЭО-1500 не отличается от контрольных величин. Однако с течением времени при инкубировании в физиологических условиях эритроцитов животных, подвергнутых замораживанию до -196 °С под защитой ПЭО-1500, отмечено достоверное снижение уровня АТФ и 2,3-ДФГ, что не характерно для клеток, криоконсервированных в присутствии ДМСО.
Криочувствительность эритроцитов лошади, быка и собаки к замораживанию после инкубации с криопротектором во многом зависит от состояния их мембранно-цитоскелетного комплекса. Исследование структурных белков мембраны нативных эритроцитов всех видов животных методом электрофореза в ПААГ показало, что общая картина белкового спектра характеризуется стандартным набором компонентов. Однако был отмечен ряд видовых отличий, касающихся, в частности дефицита белка полосы 4.2 и 6, а также более высокого содержания белка полосы 4.9 и 7 в эритроцитах лошади. При традиционном методическом подходе к анализу модификаций мембранно-цитоскелетного комплекса под влиянием криопротекторов, низких температур, возврате деконсервированных клеток в физиологические условия не было выявлено каких-либо отличий по сравнению с контролем. Использование диамида позволило обнаружить нарушение пространственного расположения белков цитоскелета эритроцитов исследованных животных после инкубации с криопротекторами и последующего замораживания-отогрева. При этом уменьшается относительное содержание белков в отдельных фракциях: в частности снижается относительное содержание спектрина, анкирина, белков полосы 4.2, 4.9 и 5, а также происходит полная потеря белков полосы 6 и 8. Снижение содержания отдельных фракций белков связана, прежде всего, с включением части белков в процесс агрегации под действием диамида, про что свидетельствует образование белковых агрегатов на старте геля. Модификация мембранно-цитоскелетного комплекса выражены сильнее для эритроцитов, криоконсервированных под защитой ПЭО-1500, и имеет необратимый характер, так как не исчезает после возврата деконсервированных клеток в физиологические условия, в отличие от ДМСО, где отклонения возвращаются к норме после перенесения в аутоплазму.
Ключевые слова: криоконсервирование, криочувствительность, эритроциты лошади, быка и собаки, криопротекторы, мембрана, цитоскелет, АТФ, 2,3-ДФГ.
Denisova O.N. Cryosensitivity of erythrocytes in different mammalian species.- A manuscript.
Thesis for the candidate of biological sciences degree in specialty 03.00.19 – Cryobiology. Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov – 2006.
Thesis covers study of erythrocyte sensitivity of different mammalian species (horse, bull, dog) to cryopreservation with cryoprotectants and estimation of structural and functional state of frozen-thawed cells.
The results obtained in the work testify to the fact, that DMSO is the most efficient cryoprotectant during cryopreservation for horse, bull and dog erythrocytes. PEO-1500 is capable to preserve cells during cryopreservation, but after transferring such frozen-thawed cells under physiological conditions they undergo damages. After cryopreservation with 10% DMSO in contrast to 15% PEO-1500 the cells preserve morphological indexes. ATP and 2,3-DPG concentrations after cryopresevation the control level keep. Investigation of erythrocyte membrane proteins of animals using electrophoresis method in PAG with protein-cross-linking reagent diamide demonstrated a disorder in their spatial location. Modifications of membrane-cytoskeletal complex are stronger manifested for erythrocytes, cryopreserved under PEO-1500 protection in contrast to DMSO.
Key words: cryopreservation, cryosensitivity, horse, bull and dog erythrocytes, cryoprotectants, membrane, cytoskeleton, ATP, 2,3-DPG.
Відповідальний за випуск Г.О. Бабійчук
Підписано до друку 14.03.2006. Формат 60x84 1/16. Папір офсетний. Наклад 100 прим. Умов. друк. арк. 0,9. Друк, на ризографі.
ПП Ходаков В.Г. м. Харків, пр. 50 років ВЛКСМ. 56,
Тел. (057)757-55-63
