КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Дворщенко Олег Станіславович

УДК 57.083:611.018.53:678.046.361:661.8

ВПЛИВ НАНОКОМПОЗИТІВ САЛІЦИЛАЛЬІМІНАТІВ

ТА ФУЛЕРЕНІВ НА СТАН ІМУННОЇ СИСТЕМИ У

ІНТАКТНИХ ТВАРИН І ПУХЛИНОНОСІЇВ

03.00.09 – імунологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі мікробіології та загальної імунології

біологічного факультету

Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор

Позур Володимир Костянтинович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедри мікробіології та загальної імунології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Савцова Зоя Дмитрівна,

Національний Університет “Києво-Могилянская Академія”,

професор кафедри біології факультету природничих наук

доктор біологічних наук, професор

Цудзевич Борис Олександрович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

старший науковий співробітник кафедри біохімії

Провідна установа: Інститут фтизіатрії і пульмонології

імені Ф.Г. Яновського АМН України, м. Київ

Захист відбудеться 26 вересня 2006 р. о 16 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д26.001.14 у Київському національному

університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ,

проспект Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 433 (конференцзал).

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.

Спецрада Д 26.001.14, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:

м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 11 травня 2006 року

Вчений секретар

cпеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Молчанець О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розвиток методів рекомбінантної технології та технологій штучного синтезу дозволили одержувати нові сполуки, які мають певний вплив на клітини імунної системи. Це дозволило розширити пошук протипухлинних препаратів.В останні роки виявлені нові природні і штучно синтезовані сполуки, які мають ад’ювантну активність: а) природні високополімерні сполуки, що включають у себе полісахариди бактеріального і рослинного походження, бактеріальні глікопептиди, нуклеїнові кислоти (Johnson A.G., 1994, Eck J., 1999); б) штучно синтезовані аналоги природних полімерних сполук — синтетичні полінуклеотиди, поліпептиди, глікопептиди (Toka F.N., 2003); в) штучно синтезовані полімерні сполуки, що не мають природних аналогів — синтетичні карболанцюгові і гетероланцюгові поліаніони і полікатіони (Чизмаджев Ю.А., 2000, Dockrell D.H., 2001).

Основний наголос у створенні нових медичних препаратів і конструюванні вакцин робиться на розробці перспективних кон’югатів і знаходженні активних ад’ювантних речовин. В останній час все більше уваги приділяють синтезу кон’югатів і ад’ювантних речовин на базі нанокомпозитів Шифа і фулеренів (Moghimi S.M., 2005, Thrall J.H. 2004).

Відомо, що основи Шифа відносяться до сполук, котрі характеризуються імуностимулюючою дією, яка пов’язана з активацією CD-4+ та CD-8+ лімфоцитів (Chen H., 1996). Основи Шифа підвищують силу імунної відповіді на антигени різної природи при первинному контакті з ними комітованих лімфоцитів, особливо цитотоксичну активність Т-лімфоцитів, спрямовану проти клітин уражених вірусом і пухлинних клітин (Brown F., 1999).

Фулерени характеризуються високою антивірусною (Schinazi F.F., 1995, Straface E., 1995), антиоксидантною (Murugan M.A., 2002), хемотаксичною (Toniolo C., 1994), антимікробною (Nina T., 1999) і протипухлинною активністю (Miyata N., 1997, Miyata N., 1997).

Дослідження протипухлинної дії нанокомпозитів саліцилальімінатів та фулеренів, визначення їх ролі у підвищенні імунного статусу організму за умови канцерогенезу, є важливою проблемою сьогодення, що дозволяє удосконалювати та суттєво покращувати імуномодулюючі препарати, збільшуючи термін тривалості життя осіб з онкологічною патологією.

Наведене обумовлює актуальність проблеми і обґрунтовує вибір теми дисертаційної роботи.

Зв’язок роботи з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи кафедри мікробіології та загальної імунології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та виконана у рамках теми № 01БФ036-08 “Закономірності формування імунної відповіді на біополімери бактеріального походження”.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було порівняльне дослідження у модельних експериментах на інтактних тваринах та за умови ізогенного росту пухлини стану імунної системи під дією саліцилальімінатів та фулеренів для з’ясування закономірностей прояву імуномодулюючого ефекту цих сполук.

Відповідно до цього, були поставлені такі завдання: 1) дослідити електроктрофоретичну рухомість клітин та визначити величину їх електрокінетичного потенціалу під впливом нанокомпозитів похідних саліцилальімінів та фулеренів; 2) визначити функціональну активність перитонеальних макрофагів за дії досліджуваних чинників in vitro; 3) визначити динаміку росту пухлин та виживаність тварин пухлиноносіїв, які піддавались дії нанокомпозитів саліцилальімінатів, фулеренів та модифікованої за їх допомогою вакцини; 4) оцінити цитотоксичність лімфоцитів мишей за умови розвитку перещепленої модельної пухлини після введення досліджуваних сполук та модифікованої вакцини; 5) встановити рівень циркулюючих імунних комплексів, вміст антитіл у сироватці крові та активність перитонеальних макрофагів у мишей, яким проводили ін’єкції досліджуваних сполук і модифікованої вакцини за умов пухлинного росту;

Об’єкт дослідження — функціональний стан імунної системи інтактних тварин та тварин з експериментальними моделями онкологічної патології під дією нанокомпозитів саліцилальімінатів, фулеренів та модифікованої за їх допомогою вакцини.

Предмет дослідження — електрокінетичний потенціал клітин, вміст лейкоцитів та лейкоцитарна формула, рівень циркулюючих імунних комплексів, функціональна активність перитонеальних макрофагів, цитотоксична активність лімфоцитів, рівень протипухлинних антитіл у крові, об’єм пухлини, виживаність тварин.

Методи дослідження — світлова мікроскопія, НСТ-тест, визначення електрокінетичного потенціалу клітин методом електрофорезу, визначення циркулюючих імунних комплексів методом преципітації, дослідження величин цитотоксичної активності нормальних кілерів, визначення рівня протипухлинних антитіл імуноферментним методом, оцінка протипухлинної активності препаратів за динамікою росту пухлин та виживаністю тварин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження імунологічного статусу і порівняльну оцінку впливу нанокомпозитів аеросилу з саліцилальімінатами і фулереном С60 у тварин за умови ізогенного росту пухлини саркома 37. Отримані результати значно поглиблюють і уточнюють знання про механізми імунологічних змін in vivo та in vitro в умовах дії саліцилальімінатів та фулеренів на інтактних тварин та за умови ізогенного росту пухлини. Встановлено, що композити аеросилу з саліцилальімінами і нанокомпозити фулерену С60 здатні значно затримувати розвиток пухлини, збільшувати виживаність тварин у 2,7 рази, підтримувати на високому рівні показники неспецифічного захисту організму, а також показники гуморального і клітинного імунітету. Вперше проведено спробу модифікації протипухлинної вакцини виготовленої на основі продуктів метаболізму Bacillus subtilis B-7025 нанокомпозитами фулерену С60. Встановлено, що така модифікована вакцина викликає регресію пухлини саркома 37 у 11% дослідних тварин.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати можуть бути використані для подальшого впровадження в практику при лікуванні злоякісних новоутворень та є науковим обґрунтуванням розробки методів лікування онкологічних захворювань шляхом впливу на організм нанокомпозитів саліцилальімінатів, фулеренів та модифікованої за їх допомогою протипухлинної вакцини.

Особистий внесок здобувача. Текст дисертації, формулювання основних положень та оформлення всіх розділів роботи виконано безпосередньо автором. Дисертантом особисто проаналізовано літературу за обраною темою, проведено статистичну обробку, аналіз та узагальнення результатів досліджень, сформульовано висновки. Всі результати отримані дисертантом особисто або за його безпосередньої участі. Результати розділу 3.1. отримані за участі п.н.с., к.б.н. Ю.В. Яніша Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Кавецького.

Апробація результатів роботи. Основні результати дисертаційної роботи були висвітлені на V Українській конференції молодих вчених онкологів (Київ, 2002), на наукових семінарах в ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького (Київ, 2005), VII міжнародній конференції молодих онкологів (Киев, 2006), Міжнародній науковій конференції (Новосибирск, 2006).

Публікація матеріалів. Основні положення дисертаційної роботи викладено в 8 наукових публікаціях, з них 5 статтей у фахових журналах і 3 тези доповідей.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 136 сторінках друкованого тексту. Робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, заключення, висновків, списку використаних джерел з 243 найменувань, 5 рисунків, 34 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ.

Матеріали та методи досліджень. В дослідах використовували самців щурів лінії Вістар вагою 120–150 г та мишей лінії Balb/c вагою 20–24 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію.

Нанокомпозити фулерену С60 одержували за методом (Golub A.A., 2001). Концентрація фізично адсорбованих фулеренів на поверхні аеросилу складала 0,15 µмоль/м2. Концентрація хемосорбованих фулеренів на амінопропілаеросилі складала 0,51 µмоль/м2. Нанокомпозити саліцилальімінів отримували за методом (Antoachuk V.V., 1995). Концентрація саліцилальімінуаеросилу (СІА) складала 3,1 µмоль/м2, купруму (ІІ) (CuСІА) — 0,5 µмоль/м2, ванадію (ІІ) (VOСІА) — 0,51 µмоль/м2, мангану (ІІ) (MnСІА) — 0,17 µмоль/м2 та цинку (ІІ) (ZnСІА) — 0,51 µмоль/м2.

Дослідження впливу нанокомпозитів саліцилальімінатів на інтактних щурах проводили за наступною схемою — досліджувані сполуки вводили тричі з інтервалом у 7 днів підшкірно в ділянку шиї. Препарати вводили з розрахунку 2 мг/тварину на весь курс в об’ємі 0,3 мл. Показники кількості лейкоцитів і активність нейтрофілів периферичної крові визначали на 3, 7, 14 та 21 добу.

Вивчення впливу нанокомпозитів саліцилальімінатів на мишах-пухлиноносіях проводили за схемою — клітини саркоми 37 в кількості 1·106 трансплантували під шкіру стегна мишам–самцям лінії Balb/c. Через дві доби починали імунізацію тварин. Ін’єкції робили підшкірно у ділянку шиї, триразово з інтервалом 7 діб. Препарати вводили з розрахунку 2 мг/тварину на весь курс в об’ємі 0,3 мл. Показники стану імунної системи визначали на 7, 14, 21 та 28 добу, титри протипухлинних антитіл визначали на 7, 14 та 35 добу.

Модифікацію протипухлинної вакцини (ПВ) для підвищення її ефективності проводили за схемою — ПВ готували із співвідношення 1 мг білку на 1·106 клітин саркоми 37 в 1 мл (Новиков Л.К., 1979). Сорбцію вакцини на досліджуваних сполуках проводили протягом 120 хв при +37°С з подальшим зберіганням виготовленої вакцини при –20°С. Пухлину саркома 37 у дозі 1·106 клітин трансплантували під шкіру стегна мишам-самцям лінії Balb/c, а модифіковану ПВ вводили через 2 дні із розрахунку 2 мг/тварину нанокомпозиту на весь курс вакцинотерапії. Препарати тваринам вводили 3 разово, підшкірно в ділянку шиї, з інтервалом в 7 днів, в об’ємі 0,3 мл. Показники стану імунної системи визначали на 7, 14, 21 та 28 добу, титри протипухлинних антитіл визначали на 7, 14 та 35 добу.

Розрахунок величини електрокінетичного потенціалу клітин проводили після їх електрофоретичного розділення у фосфатному буфері (Иенсен Г.Л., 1979).

Визначення лейкоцитарної формули та одержання сироватки крові піддослідних тварин проводили за стандартними методами. Тимоцити отримували шляхом протирання тимуса через нейлонову сітку у середовище RPMI-1640. Лімфоцити отримували шляхом градієнтного центрифугування на фікол–верографіні (с=1,077) суспензії клітин селезінки (Sashchenko L.P., 1996). Клітини перитонеального ексудату (макрофаги) — одержували з черевної порожнини шляхом промивання середовищем RPMI-1640. Оцінку життєздатності клітин проводили з використанням 0,4% розчину вітального барвника трипанового синього. Інкубацію клітин здійснювали у термостаті при 37°С у середовищі RPMI-1640, що містило 10% ембріональну телячу сироватку. Активність природніх кілерних клітин визначали в цитотоксичному тесті in vitro за методикою (Frederik M., 1998). Рівень протипухлинних антитіл у сироватці крові мишей оцінювали за допомогою імуноферментної реакції (ІФР), яку проводили в 96-лункових мікроплатах (Dynatech, Швеція) (Антитела. Методы, 1991). Рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) в сироватці крові визначали методом преципітації поліетиленгліколем-6000 (ПЕГ-6000) (Фролов В.М., 2002). Визначення функціональної активності перитонеальних макрофагів (Кондратьева И.А., 2001) та нейтрофілів (Передерий В.Г., 1995) оцінювали за їх здатністю відновлювати тетранітротетразолієвий синій в спонтанному НСТ-тесті.

Протипухлинну активність препаратів оцінювали за динамікою росту пухлини, а також за показником виживаності.

Статистичний аналіз результатів проводили, використовуючи t-критерій Стьюдента, та критерій Пірсона (Лакін Г.Ф., 1980).

Дослідження впливу нанокомпозитів саліцилальімінатів та фулеренів на інтактних тваринах. Результати вивчення змін електрокінетичного потенціалу тимоцитів та макрофагів щурів під впливом досліджуваних сполук показали, що клітини різного походження неоднаково реагують на попередню інкубацію з досліджуваними сполуками. Значення електрокінетичного потенціалу (ЕКП) наведено у таблиці 1. Кожна цифра являє собою середню величину, обчислену за результатами вимірів лінійної швидкості 25 клітин кожного типу згідно рівняння Смолуховського (Богач П.Г., 1983).

Макрофаги щурів відповідали на преінкубацію з усіма досліджуваними препаратами вірогідним зниженням ЕКП на 81–55%. Ця обставина сама собою дуже важлива для неспецифічної стимуляції роботи клітинної ланки імунної відповіді: зниження електрокінетичного потенціалу макрофагів свідчить про зменшення їх від’ємного поверхневого заряду, що автоматично полегшує їх зближення і контакт з однойменно зарядженими клітинами-мішенями під час акту фагоцитозу або при презентації антигену Т- і В- лімфоцитам (Munn D.H., 2003).

Дослідження змін ЕКП тимоцитів щурів показало (табл. 1), що тимоцити не однаково реагують на преінкубацію з досліджуваними сполуками. Так, металокомплексні сполуки викликали зниження ЕКП, що в свою чергу свідчить про виникнення специфічної сенсибілізації тимоцитів, в той же час аеросил і фулерен-сорбований виходять за межі загальної закономірності — більшість речовин знижують ЕКП клітин-ефекторів, аеросил підвищує ЕКП тимоцитів на 66,7%, а фулерен-сорбований на 111,7%. Розподіл контрольних тимоцитів за конкретними значеннями ЕКП свідчить про наявність двох пулів тимоцитів: тимоцити з низькими значеннями ЕКП, це тимоцити коркового шару тимусу, тоді як тимоцити з більшим значенням ЕКП — медулярні. Тобто, підвищення ЕКП тимоцитів свідчить про здатність цих сполук стимулювати дозрівання медулярних тимоцитів. Також треба відмітити, що близькі за будовою фулерен-сорбований і фулерен-ковалентний показали діаметрально протилежний вплив на ЕКП тимоцитів, що свідчить про велике значення стереохімічної будови нанокомпозиту, який використовується в тих або інших медико-біологічних цілях.

Таблиця 1

Величина ЕКП клітин після 60 хв інкубації з досліджуваною речовиною

Досліджуваний препарат | ЕКП, мВМакрофаги | Тимоцити

Контроль | 44,512,88 | 19,452,4 | СІА | 19,761,45* | 16,42,66 | VOСІА | 8,280,61* | 13,571,92* | CuСІА | 11,490,89* | 13,261,72* | Аеросил | 14,372,02* | 32,442,88* | Фулерен-сорбований | 28,782,56* | 41,17±2,49* | Фулерен-ковалентний | 28,351,94* | 19,08±1,07 | Примітка. 1. * — р<0,05.

В наступній серії експериментів було вивчено здатність досліджуваних нанокомпозитів до неспецифічної стимуляції макрофагів мишей в НСТ-тесті in vitro (рис. 1). Було встановлено, що для CuСІА і MnСІА рівень відновлення НСТ макрофагами достовірно не відрізнявся від величин нестимульованого контролю, а для аеросилу, ZnСІА, VOСІА, фулерену-сорбованого і фулерену-ковалентного цей показник вірогідно збільшувався на 300–326%. На даній моделі ми знову спостерігаємо ефект коли однакові за будовою речовини, зокрема металокомплексні сполуки, в залежності від природи координаційного металу діють за різною схемою, тобто знову підтверджується теза, що хімічна і стереохімічна структура нанокомпозиту має суттєве значення і проявляється в його дії.

Рис. 1. Вплив нанокомпозитів саліцилальіміну (А) та фулерену С60 (Б) на відновлення НСТ ПМ. А: 1 – контроль; 2 – VOСІА; 3 – CuСІА; 4 – MnСІА; 5 – аеросил. Б: 1 –контроль; 2 – фулерен-ковалентний; 3 – фулерен-сорбований; 4 –аеросил.

Примітка. 1. * — р<0,05.

Вірогідне підвищення функціональної активності перитонеальних макрофагів in vitro у піддослідних тварин внаслідок дії саліцилальімінатів, свідчать про активацію системи неспецифічного захисту організму, зокрема — фагоцитарної функції. Це є ще одним внесенням в підсилення протипухлинної резистентності.В експериментах на щурах in vivo було встановлено, що досліджувані сполуки викликають збільшення і абсолютної, і відносної кількості лейкоцитів, а також підвищують кількість НСТ-позитивних нейтрофілів у периферичній крові щурів. Такі зміни показників клітинного гомеостазу носять вірогідний характер протягом перших двох–трьох тижнів спостереження.

Дослідження впливу нанокомпозитів саліцилальімінатів та фулеренів на мишах за умови розвитку пухлини саркома 37. Наступним етапом роботи було дослідження впливу чистих нанокомпозитів на піддослідних мишах лінії Balb/c за умови росту модельної пухлини саркома-37. Досліджували наступні показники — виживаність, динаміка росту пухлини, а також показники стану гуморального і клітинного імунітету у тварин.

Дослідження виживаності піддослідних тварин за умови росту пухлини саркома 37 показало (рис. 2), що найкраща виживаність тварин спостерігалась при використанні фулерен-ковалентного (виживаність склала 56 діб) і в групах де застосовували ZnСІА і фулерен-сорбований (виживаність складала 35 діб). Гальмування пухлинного росту (рис. 3), порівняно з контролем, спостерігали в групах де застосовували ZnСІА, MnСІА, фулерен-сорбований і ковалентний, в CuСІА групі цей показник був на рівні контролю. При застосуванні аеросилу і VOСІА спостерігали значну затримку пухлинного росту і розміри пухлини складали 1/4–1/5 від контрольних показників відповідно. Аналізуючи данні гальмування пухлинного росту, досліджувані препарати за дією можна розділити на дві групи: в першій групі тварини гинуть за малих об’ємів пухлини (аеросилова і VOСІА групи), до другої групи можна віднести тварин, у яких ми спостерігали дві хвилі активного розвитку пухлини з другим періодом маніфестації пухлинного процесу, що починався з 28 доби (MnСІА, ZnСІА, CuСІА групи і група, яка отримувала ін’єкції фулерену-ковалентного).

Рис. 2. Виживаність мишей з прищепленою саркомою 37 після введення нанокомпозитів саліцилальіміну (А) та фулерену С60 (Б).

Рис. 3. Об’єм пухлини саркома 37 у мишей після введення нанокомпозитів саліцилальіміну (А) та фулерену С60 (Б).

Примітка. 1. * — р<0,05.

Вивчення ЦАЛ показало (рис. 4), що в усіх дослідних групах до 21 доби спостереження рівень ЦАЛ перевищує контрольні показники в 1,5–2,5 рази для аеросилу і металокомплексних сполук, а для фулеренових груп в 3–4 рази. Звертає на себе увагу той факт, що у групах тварин спостерігається два типи вираженості ЦАЛ: до першого типу можна віднести тварин, яким вводили аеросил і VOСІА, де ЦАЛ різко зростала до 14 доби, після чого різко знижувалась майже до контрольних значень. До другого типу можна віднести всі інші групи, в яких рівень ЦАЛ стабільно вищий від контролю, що, в свою чергу, корелює з показниками виживаності і динамікою розвитку пухлинного процесу.

Рис. 4. Цитотоксична активність лімфоцитів мишей з прищепленою пухлиною саркома 37 під впливом нанокомпозитів саліцилальімініну (А) та фулерену С60 (Б).

Примітка. 1. * — р<0,05.

Визначення рівнів антитіл до пухлинних антигенів у сироватці крові в ІФА-тесті показало (рис. 5), що вірогідно значиме підвищення титрів антитіл відбувається тільки у тварин, яким вводили MnСІА, фулерен-ковалентний і сорбований на 7 добу спостереження, а на 14 добу спостереження в групах, що отримували ін’єкції MnСІА, ZnСІА і фулерену-ковалентного. Також особливо треба відмітити, що у тварин, яким вводили фулерен-ковалентний, титри протипухлинних антитіл на 14 добу перевищували контрольні показники вдвічі.

Показники накопичення середньомолекулярних ЦІК (рис. 6) у тварин, яким вводили аеросил і металокомплексні сполуки до 21 доби спостереження, стабільно нижчі від контролю, але на 28 добу в усіх дослідних групах відбувається різке зниження рівнів середньомолекулярних ЦІК до показників безпухлинного контролю. Випадає з загальної закономірності лише група тварин, які отримували ін’єкції фулерену-ковалентного, де на 7-му добу спостереження величини кількості середньомолекулярних ЦІК знаходилися на рівні безпухлинного контролю, а на 14 добу різко підвищуються до показників у пухлинних тварин з наступним спадом. Така динаміка накопичення середньомолекулярних ЦІК корелює з рівнем синтезу протипухлинних антитіл у цій дослідній групі.

Рис. 5. Рівень протипухлинних антитіл визначений в ІФА-тесті у мишей з пухлиною саркома 37, після введення нанокомпозитів саліцилальімініну (А) та фулерену С60 (Б).

Примітка. 1. * — р<0,05.

Рис. 6. Вплив нанокомпозитів саліцилальімініну (А) та фулерену С60 (Б) на рівні ЦІК у тварин з перещепленою солідною пухлиною саркома 37.

Примітка. 1. * — р<0,05.

Рівні спонтанного відновлення НСТ перитонеальними макрофагами (рис. 7) у дослідних групах протягом всього періоду спостереження перевищують контрольні показники в 1,5–2 рази і тільки в групі, де був застосований аеросил і фулерен сорбований, на 21 добу рівень відновлення НСТ не відрізняється від контролю.

Протипухлинна ефективність аутовакцини при її модифікації досліджуваними нанокомпозитами. Загалом треба відмітити позитивний вплив нанокомпозитів фулерену практично на всі досліджувані чинники протипухлинної стійкості організму тварин в експерименті. І тому, як найбільш ефективний препарат, фулерен-ковалентний був відібраний для подальшого дослідження в якості ад’юванта для протипухлинної аутовакцини (ПАГ), виготовленої із сингенних пухлинних клітин, зруйнованих глікопротеїдним компонентом культуральної рідини B. subtilis B-7025. В якості позитивного контролю був використаний аеросил.

Рис. 7. Вплив нанокомпозитів саліцилальімініну (А) та фулерену С60 (Б) на на відновлення НСТ перитонеальними макрофагами.

Примітка. 1. * — р<0,05.

Рис. 8. Виживаність мишей з пухлиною саркома 37 після вакцинації класичною і модифікованою вакцинами

Примітка. 1. * — р<0,05.

Рис. 9. Динаміка росту пухлини саркома 37 у мишей після вакцинації

Примітка. 1. * — р<0,05.

Модифікація протипухлинної аутовакцини фулереном-ковалентним призвела до збільшення виживаності в дослідній групі тварин порівняно з контролем в 2,6 рази, а порівняно з групою тварин, яких імунізували не модифікованою ПАГ, в 1,6 рази (на 56-ту добу відмічається повна регресія пухлини у 11% тварин) (рис. 8). Модифікація ПАГ аеросилом не призвело до змін виживаності порівняно з позитивним контролем, який отримував ПАГ. При використанні ПАГ модифікованого як фулереном-ковалентним, так і аеросилом відбувається значне гальмування росту пухлини і практично повторює до 42 доби динаміку розвитку пухлини в групі тварин, які отримували ін’єкцію ПАГ (рис. 9). Особливо слід відмітити, що у дослідній групі тварин, яка отримувала ПАГ модифікований фулереном ковалентним, у 11% тварин ми спостерігали повну регресію пухлини.

Вивчення ЦАЛ показало (рис. 10), що модифікація ПАГ аеросилом призводила до вірогідних змін порівняно з позитивним контролем (група тварин, яка отримувала ПАГ) лише на 7-му добу і далі повторювала динаміку позитивного контролю. В той же час, модифікація ПАГ фулереном-ковалентним призводила до вірогідно вищих показників ЦАЛ протягом всього періоду спостереження і перевищувала показники позитивного контролю на 14–40% в динаміці.

Рівні спонтанного відновлення НСТ перитонеальними макрофагами (рис. 11), у групах яким робили ін’єкції ПАГ модифікованого нанокомпозитами, перевищують показники позитивного контролю до 21 доби на 70%, а з 28 доби зрівнюються і не набувають вірогідно значимих величин.

Рис. 10. Цитотоксична активність лімфоцитів мишей з прищепленою пухлиною саркома 37 при імунізації вакцинами

Примітка. 1. * — р<0,05.

Рис. 11. Вплив вакцинації на відновлення НСТ ПМ

Примітка. 1. * — р<0,05.

Визначення титрів антитіл до пухлинних антигенів в сироватці крові в ІФА-тесті показало (рис. 12), що у тварин, які отримували ПАГ модифікований фулереном-ковалентним і аеросилом, вже на 14-ту добу титри антитіл вищі за такий показник позитивного контролю на 51% і 26% відповідно, для фулеренової групи він залишається вищим і на 35 добу (на 46%), хоча для аеросилової групи цей показник вже нижчий за такий позитивного контролю на 31%. Показники накопичення середньомолекулярних ЦІК в сироватці крові (рис. 13) після модифікації ПАГ нанокомпозитами корелюють з показниками накопичення ЦІК при використанні відповідних чистих нанокомпозитів, в той час, як при використанні не модифікованої ПАГ, не відбувається різкого зниження рівнів ЦІК після 21 доби.

Таким чином, в результі проведеного комплексного дослідження різних елементів імунної системи в реалізації протипухлинного ефекта, який ми отримували при імунізації тварин досліджуваними препаратами, показано, що реакція імунної системи проявляється в першу чергу, в підсиленні природної кілерної активності лімфоцитів і модифікації неспецифічної ланки захисту через активацію клітин моноцитарно-макрофагального ряду. Роль гуморального фактору не однозначна і залежить від фази розвитку імунного процесу. Захисний ефект проявляється через спільну дію всіх елементів імунної системи, яка направлена на елімінацію пухлинних клітин і підсилення активності цитотоксичних реакцій.

Рис. 12. Титри протипухлинних антитіл визначені в ІФА-тесті у мишей з пухлиною саркома 37, після імунізації досліджуваними вакцинами

Примітка. 1. * — р<0,05.

Рис. 13 Рівні ЦІК у тварин імунізованих вакцинами

Примітка. 1. * — р<0,05.

Результати представленої роботи можуть слугувати теоретичним обгрунтуванням для поліпшення вивчених і створення нових імуногенних препаратів, які підвищують резистентність організма.

ВИСНОВКИ

У дисертації здійснено наукове узагальнення і наведено нове вирішення наукового завдання щодо визначення впливу нанокомпозитів саліцилальімінатів та фулерену С60 на клітинну і гуморальну ланки імунної системи (як у безпухлинних тварин, так і за умови розвитку солідної пухлини саркома 37) та підвищення протипухлинної ефективності аутовакцини, виготовленої на основі продуктів синтезу B. subtilis B-7025, модифікованої за допомогою нанокомпозитів фулерену С60.

1. В системі in vitro нанокомпозити саліцилальіміну та фулерен-ковалентний викликають зменшення дзета-потенціалу тимоцитів та макрофагів, що свідчить про активацію клітин, але у випадку застосування фулерену-сорбованого відмічається збільшення дзета-потенціалу, що свідчить про диференціацію кортикальних тимоцитів в медулярні.

2. В активації перитонеальних макрофагів in vitro основну роль відіграє аеросил; досліджувані нанокомпозити аеросилу та фулерену не впливають на їх активнісь, але при застосуванні фулерену-сорбованого, а також CuСІА і MnСІА композитів спостерігається пригнічення активності макрофагів.

3. У безпухлинних тварин досліджені металокомплекси аеросилу викликають лейкоцитоз і стимулюють фагоцитарну активність нейтрофільних гранулоцитів, що робить саліцилальіміни перспективними модуляторами неспецифічного захисту для підвищення протипухлинної резистентності організму.

4. Нанокомпозити аеросилу з металокомплексами та фулереном С60 підвищують виживаність піддослідних тварин та гальмують ріст пухлини саркома 37, стимулюють значне підвищення цитотоксичної активності лімфоцитів, підвищення рівня протипухлинних антитіл на фоні низького рівня середньомолекулярних циркулюючих імунних комплексів, викликають активацію перитонеальних макрофагів протягом всьго періоду спостереження.

5. Модифікація досліджуваної протипухлинної вакцини, виготовленої на основі продуктів метаболізму B. subtilis B-7025 за допомогою відібраних нанокомпозитів, значно підвищує її протипухлинні властивості.

6. Модифікація аутовакцини за допомогою нанокомпозитів фулерену С60 підвищує показники специфічного імунітету та неспецифічних факторів захисту. При використанні фулерену-ковалентного для модифікації протипухлинної вакцини у 11% тварин спостерігається регрессія пухлини саркома 37.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Дворщенко О.С., Голуб А.А., Позур В.К. Біологічна дія основ Шифа // Гігієна населених місць. — 2002. — Вип. 39. — С. 304–309. (Дисертантом особисто проведено підбір та переклад оглядового матеріалу).

2. Дворщенко О.С., Яніш Ю.В., Голуб О.А., Позур В.К. Вплив нанокомпозитів фулерену С60 на поверхневий потенціал лімфоцитів та макрофагів щурів // Гігієна населених місць. — 2002. — Вип. 40. — С. 306–310. (Дисертантом особисто проведено отримання лімфоцитів та макрофагів, підрахунок клітин, їх інкубація, визначення поверхневого потенціалу лімфоцитів та макрофагів. Особисто проведено математичну обробку та аналіз отриманих результатів).

3. Дворщенко О.С., Діденко Г.В., Голуб О.А., Позур В.К., Прилуцький Ю.І. Вплив іммобілізованих на аеросилі саліцилальімінатів металів на функціональну активність перитонеальних макрофагів щурів // Вісник Київського Національного Університету. Біологія. — 2003. — Вип. 41. — С. 147–148. (Дисертант особисто отримував лімфоцити та макрофаги, проводив підрахунок клітин, їх інкубацію, визначав поверхневий потенціал лімфоцитів та макрофагів. Особисто проводив математичну обробку та аналіз отриманих результатів).

4. Диденко Г.В., Дворщенко О.С., Лисовенко Г.С., Коваленко Н.Г., Потебня Г.П., Кикоть В.В., Позур В.К., Голуб А.А. Модификация противоопухолевой аутовакцины на основе продуктов метаболизма B. subtilis B-7025 при помощи сорбентов и аутомакрофагов // Эксперим. Онкология. — 2003. — № 2. — С. 116–118. (Дисертантом особисто проведено перещеплення тваринам пухлини, вакцинацію тварин, отримання лімфоцитів та макрофагів, підрахунок клітин, їх інкубація, визначення ЦАЛ, ЦИК і визначення рівня протипухлинних антитіл в ІФА-тесті, постановка НСТ-тесту. Особисто проведено математичну обробку та аналіз отриманих результатів).

5. Дворщенко О.С., Яніш Ю.В., Голуб О.А., Позур В.К. Вплив іммобілізованих на аеросилі саліцилальімінатів металів на поверхневий потенціал лімфоцитів та макрофагів щурів // Гігієна населених місць. — 2004. — Вип. 44. — С. 627–631. (Особисто проведено отримання лімфоцитів та макрофагів, підрахунок клітин, їх інкубація, визначення поверхневого потенціалу лімфоцитів та макрофагів. Особисто проведено математичну обробку та аналіз отриманих результатів).

6. Діденко Г.В., Дворщенко О.С. Модифікація протипухлинної аутовакцини, виготовленої на основі продуктів метаболізму B. subtilis B-7025 за допомогою імуносорбентів // V конференція молодих онкологів України “Сучасні аспекти експериментальної та клінічної онкології”. – Київ, 2002. — С. 4.

7. Дворщенко О.С., Діденко Г.В., Перепнихатка Н.П. Протипухлинна активність нанокомпозитів аеросилу // VII международная конференция молодых онкологов “Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии”. – Киев, 2006. – С. 27.

8. Токарь А.В., Дворщенко О.С., Диденко Г.В. Противоопухолевая активность аутовакцины, на основе гликопротеида В. subtilis B-7025, после модификации нанокомпозитами аэросила // Международная научная конференция “Студент и научно-технический прогресс”. — Новосибирск, 2006. – С. 56.

АНОТАЦІЯ

Дворщенко О.С. Вплив нанокомпозитів саліцилальімінатів та фулеренів на стан імунної системи у інтактних тварин і пухлиноносіїв. — Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук зі спеціальності 03.00.09 — імунологія. — Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2006.

Дисертація присвячена дослідженню впливу нанокомпозитів саліцилальімінатів та фулерену С60 на клітинну і гуморальну ланки імунної системи як у безпухлинних тварин, так і за умови розвитку солідної пухлини саркома 37, а також проблемі підвищення протипухлинної ефективності аутовакцини, виготовленої на основі продуктів синтезу B. subtilis B-7025, модифікованої за допомогою нанокомпозитів фулерену С60. Встановлено, що у безпухлинних тварин досліджені металокомплекси аеросилу викликають лейкоцитоз і стимулюють фагоцитарну активність нейтрофільних гранулоцитів. В системі in vitro нанокомпозити саліцилальіміну та фулерен-ковалентний викликають зменшення дзета-потенціалу тимоцитів та макрофагів, що свідчить про активацію клітин, але фулерен-сорбований збільшує показник дзета-потенціалу, що свідчить про диференціацію кортикальних тимоцитів в медулярні. Встановлено, що в активації перитонеальних макрофагів in vitro основну роль відіграє аеросил. Виявлено, що нанокомпозити аеросилу з металокомплексами та фулереном С60 підвищують виживаність піддослідних тварин та гальмують ріст пухлини саркома 37, стимулюють значне підвищення цитотоксичної активності лімфоцитів, підвищення рівня протипухлинних антитіл на фоні низького рівня середньомолекулярних циркулюючих імунних комплексів, викликають активацію перитонеальних макрофагів протягом усього періоду спостереження. Модифікація досліджуваної протипухлинної вакцини, виготовленої на основі продуктів метаболізму B. subtilis B-7025 за допомогою нанокомпозиту фулерену С60, значно підвищує її протипухлинні властивості за рахунок стимуляції специфічного імунітету та неспецифічних факторів захисту. При використанні фулерену-ковалентного для модифікації протипухлинної вакцини у 11% тварин відмічалась регресія пухлини саркома 37.

Ключові слова: нанокомпозити, саліцилальімінати, фулерен С60, протипухлинна аутовакцина, експериментальні тварини з пухлинами.

АННОТАЦИЯ

Дворщенко О.С. Влияние нанокомпозитов салицилальиминатов и фуллеренов на состояние иммунной системы у интактных животных и опухоленосителей. — Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.09 — иммунология. — Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2006.

Диссертация посвящена исследованию влияния нанокомпозитов салицилальиминатов и фулерена С60 на клеточное и гуморальное звенья иммунной системы как у безопухолевых животных, так и при условии развития солидной опухоли саркома 37, а также проблеме повышения противоопухолевой эффективности аутовакцины, приготовленой на основе продуктов синтеза B. subtіlіs B-7025 с помощью нанокомпозита фулерена С60. Установлено, что у безопухолевых животных металлокомплексы аэросила вызывают лейкоцитоз и стимулируют фагоцитарную активность нейтрофильных гранулоцитов. In vіtro нанокомпозиты салицилальимина и фулерен-ковалентный вызывают уменьшение дзета-потенциала тимоцитов и макрофагов в 1,5–5,4 раза, что свидетельствует об активации данного типа клеток, но близкий по структуре с фулереном-ковалентным фулерен-сорбированный увеличивает показатель дзета-потенциала у тимоцитов в 2,1 раза, что, в свою очередь, свидетельствует о стимуляции дифференциации кортикальных тимоцитов в медуллярные. Установлено, что в активации перитонеальных макрофагов іn vіtro основную роль играет аэросил, повышая показатель восстановления НСТ макрофагами в 3,1 раза по сравнению с контролем, в то же время показатели восстановления НСТ для нанокомпозитов аэросила — ZnСІА, VOСІА, фулереном-сорбированным и фулереном-ковалентным увеличивались в 3–3,3 раза. Установлено, что нанокомпозиты аэросила с CuCIA, ZnСІА, MnCIA и фулерен-сорбированный повышают выживаемость подопытных животных в 1,67 раз, а фулерен-ковалентный в 2,67 раз и тормозят рост опухоли саркома 37. Цитотоксическая активность лимфоцитов во всех опытных группах до 21 суток наблюдения выше контрольных показателей в 1,5–2,5 раз для аеросиловой и металокомплексных производных, а для фулереновых групп в 3–4 раза. Значительное повышение титров противоопухолевых антител отмечалось только в группе животных, которая получала фулерен-ковалентный, в которой на 14 сутки уровень антител к антигенам саркомы 37 превышал контрольные показатели в два раза. Во всех группах, получавщих нанокомпозиты аэросила, отмечается низкий уровень среднемолекулярных циркулирующих иммунных комплексов на 28 сутки. Введение нанокомпозитов аэросила вызывает активацию перитонеальных макрофагов на протяжении всего периода наблюдения. Модификация противоопухолевой вакцины, приготовленной на основе продуктов метаболизма B. subtіlіs B-7025 с помощью нанокомпозитов фулерена С60, повышает ее противоопухолевые свойства за счет стимуляции ЦАЛ на протяжении всего периода наблюдения на 14–40% в динамике по сравнению с группой, которая получала не модифицированную ПАГ.

В группе, получавшей ПАГ модифицированный, титры антител к антигенам саркомы 37 на 14 и 35 сутки превышали соответствующий показатель позитивного контроля на 51–46% соответственно. При использовании фулерена-ковалентного для модификации противоопухолевой вакцины у 11% животных отмечалась регрессия опухоли саркома 37.

Ключевые слова: нанокомпозиты, салицилальиминаты, фуллерен С60, противоопухолевая аутовакцина, экспериментальные животные с опухолями.

SUMMARY

Dvorshchenko O.S. Influence of nanocompositions of salicylaliminates and fullerenes on the state of immune system at intact animals and animals with tumors. — Manuscript.

Dissertation for candidate degree in biology by speciality 03.00.09 — immunology. Kyiv Taras Shevchenko National University, Kyiv, 2006.

The dissertation is devoted to the investigation of influence of nanocompositions of salicylaliminates and fullerenes C60 on the cellular and humoral parts of immune system both at experimental animals without tumors and under development of solid tumour sarcoma 37, and also to the problem of rising of antitumoral efficacy of autovaccine made on the basis of products of synthesis of B. subtіlіs B-7025 with the help of nanocomposition of fullerene C60. It is established that at animals without tumors metal compounds of aerosil invoke leukocytosis and stimulate cytophagous activity of neutrocytes. In system іn vіtro nanocompositions of salicylaliminates and fullerene-covalent invoke reduction of zeta-potential of thymocytes and macrophages which testifies to activation of cells, but fullerene-sorbed ones increase the parameter of zeta-potential at thymocytes, that, in its turn, testifies to differentiation of cortical thymocytes in medullary. It is also established that aerosil plays the basic role in activation of peritoneal macrophages іn vіtro. It is fixed, that nanocompositions of aerosil with metal compounds and fullerenes C60 raise survival rate of experimental animals and inhibit growth of tumour sarcoma 37, stimulate substantial increase of cytotoxic activity of lymphocytes, raise level of antitumoral antibodies on the background of low level mean-molecular circulating immune complexes, invoke activation of peritoneal macrophages during the term of observation. Modification of antitumoral vaccine prepared on the basis of products of metabolism of B. subtіlіs B-7025 with the help nanocomposition of fullerene C60 considerably raises its antitumoral properties due to stimulation of specific immunity and non-specific factors of protection. Regression of tumour sarcoma 37 was observed in 11% of animals at use of fullerene-covalent for modification of antitumoral vaccine.

Key words: nanocompositions, salicylaliminate, fullerene C60, anticancer autovaccine, experimental animal with tumors.