МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ДОЛЖИКОВА ОЛЕНА ВІКТОРІВНА

УДК: 615.453.6:638.178.8

АНТИКОАГУЛЯНТНА АКТИВНІСТЬ ТАБЛЕТОК НА ОСНОВІ БДЖОЛИНОЇ ОТРУТИ – “АПІВЕН”

14.03.05 – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі фізіології Національного фармацевтичного університету МОЗ України, м. Харків.

Науковий керівник: | доктор біологічних наук, професор

Малоштан Людмила Миколаївна,

Національний фармацевтичний університет

Завідувачка кафедри фізіології

Офіційні опоненти: | доктор фармацевтичних наук, професор

Яковлєва Лариса Василівна,

Національний фармацевтичний університет

Завідувачка Центральної науково-дослідної лабораторії

доктор медичних наук, професор

Степанюк Георгій Іванович,

Вінницький національний медичний університет

Завідувач кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології

Провідна установа: | Одеський державний медичний університет МОЗ України (м. Одеса)

Захист відбудеться “_9_” __червня__2006 р. о_12_год.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4)

Автореферат розісланий “_5_”__травня__2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, д.фарм.н., проф. Д.І.Дмитрієвський

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність. Тромботичні захворювання вен є однією з важких патологій, лікування якої – актуальна проблема для сучасної медицини та фармації. Це обумовлено тим, що розповсюдженість і частота захворювань вен нижніх кінцівок постійно збільшуються. Нижня порожниста вена та її магістральні притоки характеризуються великою кількістю патологій переважно тромботичного характеру. Кількість хворих на венозні тромбози складає 130-160 на 10000 населення України. У більшості пацієнтів тромбози вен нижніх кінцівок сприяють формуванню хронічної венозної недостатності з переходом у посттромбофлебітичний синдром, що виникає у 45-55% працеспроможного населення (Мишалов В.Г., 2003). У 80-90% випадків венозний тромбоз є причиною легеневої тромбоемболії (Кириенко А.И., 2001; Безюк Н.Н., 2003).

Основна мета терапії венозного тромбозу – обмежити розповсюдження процесу тромбоутворення в проксимальному напрямку і зменшити тим самим ризик розвитку тромбоемболії легеневої артерії. Серед різних форм консервативного лікування тромбозу поширення отримала методика комплексної антитромботичної терапії, розроблена і патогенетично обґрунтована Ільїним В.Н. і співавт. (1981). Суть її в тім, що для усунення тромботичного стану системи гемостазу одночасно призначаються препарати, які чинять антикоагулянтну дію: прямі (гепарини) та непрямі (варфарин) антикоагулянти; дезагрегантну дію: ацетилсаліцилова кислота, клопідогрель; та фібринолітичну дію: стрептокіназа та інш. Препарати вищеназваних груп, які представлені на ринку України, переважно закордонного виробництва та мають високу ціну (Листопад А., 1999). Все вищезазначене свідчить про актуальність пошуку та створення нових вітчизняних лікарських засобів, які ефективно впливають на процеси тромбоутворення та є доступними за ціною.

Останнім часом збільшується зацікавленість дослідників природними засобами. Наявність достатньої вітчизняної сировинної бази і широкий фармакологічний спектр дії пояснює інтерес до вивчення фізіологічно активних речовин природного походження. У зв'язку з цим як перспективна сировина для створення антикоагулянтного препарату була обрана бджолина отрута, яка за даними літератури багата на ферменти, пептиди, білки, аміни та інші природні сполуки, що обумовлює різнобічний спектр її дії: протизапальну, знеболювальну, спазмолітичну, антикоагулянтну, імуностимулюючу, десенсибілізуючу, протимікробну та інш. (Могирьова Л.А. та співавт., 1997; Солоденко Г.Н. та співав., 2001; Рузанкина Т.В., 2004).

Враховуючи поширеність тромботичних ускладнень, відсутність вітчизняних препаратів та спектр дії бджолиної отрути, можна зробити висновок, що перспективним є створення антикоагулянтного препарату на основі бджолиної отрути для зовнішнього застосування у вигляді примочок з метою впровадження на фармацевтичний ринок України.

Зв'язок роботи з науковими працями, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану НДР Національного фармацевтичного університету (НФаУ) “Створення нових лікарських препаратів на основі рослинної та природної сировини, у тому числі продуктів бджільництва, для дорослих і дітей” (№ державної реєстрації 0198U007008), а також відповідно до плану робіт Державного комітету України з питань науки, техніки та галузевої політики.

Мета та завдання дослідження. Мета даної роботи – експериментальне обґрунтування створення та фармакологічне вивчення нового антикоагулянтного препарату на основі бджолиної отрути у вигляді таблеток для зовнішнього застосування, призначених для лікування тромбозів та тромбофлебітів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

-

-

-

-

-

-

-

-

Об’єкт дослідження – таблетки на основі бджолиної отрути, умовно названі „Апівен”, розроблені на кафедрі АТЛ НФаУ під керівництвом проф. Тихонова О.І.

Предмет дослідження. Фармакологічна активність таблеток на основі бджолиної отрути – „Апівен”, призначених для зовнішнього застосування.

Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи були використані фармакологічні, біохімічні, токсикологічні, гістологічні, мікроскопічні методи дослідження та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Наукова новизна даної роботи полягає в тому, що вперше в Україні вивчена антикоагулянтна дія таблеток на основі бджолиної отрути – „Апівен”, призначених для зовнішнього застосування у вигляді водного розчину для примочок. На моделях травматичного набряку стопи щурів та “ватної гранульоми” доведений протизапальний ефект таблеток “Апівен”. Розроблена модель експериментального тромбофлебіту периферичних вен у кролів, що відображено у інформаційному листі. На моделі експериментального тромбофлебіту доведено, що Апівен перевершує за антикоагулянтною, антиоксидантною, протизапальною активністю та регулюючим впливом на систему перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) референс-препарат – гепаринову мазь. Доведена відсутність істотного токсичного впливу таблеток „Апівен” при зовнішньому застосуванні на органи і системи тварин у експерименті при тривалому застосуванні, а також відсутність істотних алергічних проявів.

Подана заявка № а 2005 01532 від 18.02.2005 на оформлення патенту України, за якою отримане “Повідомлення про проведення кваліфікаційної експертизи заявки на винахід”.

Практичне значення одержаних результатів. Матеріали дисертаційної роботи є фрагментом доклінічного вивчення антикоагулянтного препарату “Апівен”. За результатами досліджень оформлена документація по доклінічному вивченню таблеток “Апівен”, яка прийнята для розгляду у Державний Фармакологічний центр МОЗ України (Лист № 1995 від 03.04.1998 р.).

Розроблений метод моделювання тромбофлебітів периферичних судин у кролів, за результатами якого оформлений інформаційний лист „Спосіб моделювання тромбофлебітів периферичних судин” (№ 255 – 2002). Описана в інформаційному листі модель, впроваджена в практику у відділі патофізіології Інституту фармакології та токсикології АМН України та на кафедрах ряду ВУЗів України, про що свідчать акти впровадження.

Одержані результати стали експериментальним обґрунтуванням доцільності використання таблеток на основі бджолиної отрути “Апівен” при тромбозах та тромбофлебітах.

Особистий внесок здобувача. Разом з керівником встановлені мета та завдання, розроблені методичні підходи та обрані моделі для проведення експериментальних досліджень. Здобувачем особисто проведений патентно-інформаційний пошук, написаний огляд літератури, відпрацьовані методи дослідження, виконані експериментальні дослідження, проведені аналіз, узагальнення та статистична обробка результатів, сформульовані висновки дисертації. Опубліковані у співавторстві наукові праці, в яких наведені результати особистих експериментальних досліджень, та разом зі співавторами зроблений їх аналіз та узагальнення. Гістологічні дослідження проведені на базі Харківського науково-дослідного інституту ортопедії та травматології ім. проф. М.І.Сітенка.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи викладені та обговорені на Міжнародній конференції, присвяченій 75-тиріччю з дня народження ректора ХФІ (1970-1980 р.) д.ф.н., проф. Сало Д.П. (Харків, 1998 р.); Науково-медичній конференції студентів і молодих вчених (Київ, 1998 р.); Студентських наукових конференціях УкрФА (Харків, 1997, 1998, 2000, 2002 рр.) та НФаУ (2005 р.); ІІ Національному з’їзді фармакологів України “Фармакологія 2001 – крок у майбутнє” (Дніпропетровськ, 2001 р.); V Всеукраїнській науково-практичній конференції “Клінічна фармація в Україні” (Харків, 2005 р.); VІ Національному з’їзді фармацевтів України „Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України” (Харків, 2005 р.); Науково-практичній конференції “Научные исследования и их практическое применение. Современное состояние и пути развития” (Одесса, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 17 наукових робіт, з яких 7 статей (в тому числі 5 у фахових наукових виданнях), 1 інформаційний лист та 9 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу “Об’єкти та методи дослідження”, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел літератури, додатків. Робота викладена на 142 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 29 таблицями та 11 рисунками. Перелік використаних джерел містить 225 найменувань, з яких 55 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи дослідження. Обєктом фармакологічних досліджень були таблетки “Апівен”, які у своєму складі містять (в грамах) основної діючої речовини: бджолиної отрути – 0,006; допоміжних речовин: маніту – 0,0914, кальцію стеарату – 0,001, аеросилу – 0,001, полівінілпіролідону низькомолекулярного – 0,0006. За фізичними властивостями – це таблетки-ядра білого кольору з сірим відтінком.

У зв’язку з тим, що складові бджолиної отрути при потраплянні до шлунково-кишкового тракту руйнуються під дією ферментів пепсину та трипсину (Омаров Ш.М., 1977), таблетки “Апівен” призначені для зовнішнього застосування у вигляді водного розчину для примочок.

Досліди проводили у відповідності до вимог біоетики на 100 білих нелінійних статевозрілих мишах масою 18-25 г, 210 білих нелінійних статевозрілих щурах масою 180-220 г, 50 мурчаках масою 350-550 г та 52 кролях породи шиншила масою 2,5-3,0 кг, вирощених у розпліднику ЦНДЛ НФаУ згідно з санітарно-гігієнічними нормами та вимогами GLP.

Метою наших першочергових досліджень було встановлення наявності у таблеток антикоагулянтних властивостей. Відповідно до Методичних рекомендацій з експериментального вивчення антикоагулянтних препаратів (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001) наявність протизгортаючої активності встановлюють в умовах іn vitro. Антикоагулянтну активність таблеток “Апівен” з різним вмістом бджолиної отрути визначали за здатністю змінювати швидкість згортання крові за методом Альтгаузена А.Я. (1988) іn vitro.

Наступним кроком наших досліджень був пошук ефективної дози (ЕД50) діючої речовини, яку визначали на мурчаках. Розрахунок ЕД50 та її довірчих меж проводили за допомогою графічного методу Хаджая Я.І. У зв'язку з тим, що таблетки “Апівен” призначені для зовнішнього застосування, їх ефективну дозу розраховували на 1 мл водного розчину. Таблетки “Апівен” розчиняли у дистильованій воді, змочували цим розчином марлеві серветки та у вигляді аплікацій наносили тваринам на депільовані ділянки шкіри, що складали 5% від площі шкірних покривів тварин (Западнюк М.П., ЗападнюкВ.И., Захария Е.А., 1983).

У нашій роботі більшість досліджень проведені в порівнянні з гепариновою маззю в дозі 100 ОД/1 г („Нижфарм”, Росія), яка була обрана як референс-препарат. Гепаринова мазь – антикоагулянтний препарат прямої дії, який чинить антиагрегаційний та антикоагулянтний вплив, гальмуючи утворення тромбіну та перехід фібриногену у фібрин, має природнє походження, використовується для зовнішнього застосування для блокування запальних та тромботичних процесів.

При тромбофлебіті необхідно блокувати в стінках судин та оточуючих тканинах явища запалення, які супроводжують тромбоутворення (Кириенко А.И., Золотухин И.А., 1999.). При дослідженні протизапальної активності поряд з гепариновою маззю як препарат порівняння використовували також засіб для зовнішнього застосування на основі диклофенака натрію, який найчастіше застосовується у медицині, – гель диклофенак 1% (ВАТ ФФ “Здоров’я”, Україна).

Дані літератури свідчать про те, що бджолина отрута має протизапальну дію (Орлов Б.Н., Гелашвили Д.Б., 1985). Як модель для вивчення протизапальної активності нами був обраний травматичний набряк стопи щурів (Чайка Л.О. та співавт., 2001), бо за патогенезом судинних розладів та тривалістю перебігу ця модель є адекватною де-яким ланкам венозних захворювань.

Під час перебігу тромбофлебіту на зміну процесу ретракції приходить процес сполучнотканинного заміщення тромбу, швидкість якого прямо пропорційна ступеню важкості запального процесу (Аверьянов М.Ю., 2002). З метою вивчення антипроліферативної дії таблеток “Апівен” доцільним було дослідити їх вплив на процес утворення сполучної тканини на моделі ватної гранульоми у щурів (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001).

Метою подальших досліджень стало вивчення впливу таблеток „Апівен” на процес згортання крові, що проводили в дослідах in vivo і in vitro на приладі “Коагулограф Н334”. Наш вибір обумовлений тим, що цей метод простий і високоефективний (Воробьев В.Б., 2004), дозволяє реєструвати початок, тривалість, швидкість згортання крові, а також ретракцію і фібриноліз згустку – тобто весь процес згортання. Обчислення показників згортання крові проводили відповідно до методики Воробйова В.Б. (2004).

Наступним етапом дослідження було вивчення впливу таблеток “Апівен” на перебіг експериментального тромбофлебіту. Вплив на експериментальний тромбофлебіт вивчали на моделі тромбофлебіту, розробленій нами на кафедрі фізіології НФаУ під керівництвом проф. Малоштан Л.М. (2002). На тлі тромбофлебіту вимірювали в динаміці довжину тромба (мм), площу гіперемії (мм2), досліджували біохімічні та гематологічні показники: протромбіновий час за методом Квіка (Балуда В.П. и соавт., 1980), вміст фібриногену та кількість лейкоцитів (Лабораторные методы исследования в клинике, 1987). Оцінювали інтенсивність системи ПОЛ за рівнем ТБК-активних речовин та дієнових кон’югатів (ДК) (Колб В.Г., 1982) та стан АОС за вмістом відновленого глутатіону (ВГ) за методом Beutler E.D. et al. (1963). Визначали ступінь активності маркерних ферментів цитолізу АлАТ, АсАТ за допомогою тест-наборів фірми “Lachema”.

По закінченні експерименту проводили гістологічні дослідження тромбованої вени з прилеглими до неї тканинами (Автандилов Г.Г., 1980; Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1982) за допомогою світлової мікроскопії.

Наступним етапом нашого дослідження було встановлення деяких механізмів антикоагулянтної дії таблеток “Апівен”, а саме: на які ланки та фактори системи гемостазу вони впливають.

Вплив на тромбоцитарну ланку системи гемостазу досліджували на моделі адинозиндифосфат(АДФ)-індукованої агрегації тромбоцитів за макроскопічним методом за Caen J. та співавт. (1968). Вплив таблеток “Апівен” на плазменну ланку системи гемостазу вивчали за часом рекальціфікації плазми за методом Бегердорфа (Балуда В.П. и соавт., 1980). Досліджували зміну протромбінового часу за методом Квіка, тромбінового часу та кількості фібриногену в крові (Балуда В.П. и соавт., 1980).

Детальне вивчення впливу таблеток “Апівен”на деякі фактори згортання крові включало вивчення можливого впливу таблеток “Апівен” на активність ХІІІ фактору за методом Сидора Н.В. та Момота А.П. (2003), на активність фактору V за методом, описаним Баркаган З.С. зі співавт. (2001). Вплив таблеток “Апівен” на активність фактору VІІІ визначали за методом Єликомова В.А. та спіавт. (1991).

Важливою характеристикою нових лікарських засобів, як і лікарських засобів взагалі, є їх нешкідливість, тому поряд з фармакологічними дослідженнями доцільним було вивчити гостру та хронічну токсичності таблеток, а також їх алергізувальні властивості.

Весь фактичний матеріал обробляли методами варіаційної статистики з застосуванням t – критерію Ст’юдента (Лапач С.М. и соавт., 2001; Гацура В.В. Сернов Л.Н., 2000.).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження фармакодинаміки таблеток “Апівен” (розділ 3). На підставі отриманих даних можна зробити висновок, що таблетки “Апівен” проявляють антикоагулянтну активність, яка збільшується прямо пропорційно збільшенню дози (рис. 1), що співпадає з даними літератури (Омаров Ш.М., 1977).

Рис. 1. Антикоагулянтна активність різних за вмістом бджолиної отрути таблеток “Апівен”

* - відхилення вірогідне стосовно інтактного контролю (р0,05).

Для подальшого дослідження таблеток “Апівен” як антикоагулянтного засобу необхідно визначити їх ефективну дозу (ЕД50). Таблетки вивчали в дозах 0,2 мг/мл; 0,4мг/мл і 0,6 мг/мл за основною діючою речовиною – бджолиною отрутою. За даними, отриманими в експерименті, ЕД50 = 0,3 (0,22ч0,38) мг/мл.

У розвитку тромбозів запальні процеси відіграють важливу роль, так як під час запального процесу відбувається активація ендотелію та лейкоцитів. Ця активація включає виділення медіаторів запалення (тканинного фактору, МАС-1) на поверхні моноцитів і лімфоцитів та тканинного фактора на поверхні ендотеліальних клітин судин з наступним зв’язуванням та активацією факторів зовнішнього шляху згортання. Ці фактори сприяють продукуванню тромбіну у всьому внутрішньосудинному просторі. Тромбін в свою чергу є не тільки активатором фібриногену, але й, володіючи властивостями медіатора запалення, ще більше активує судинний ендотелій і лейкоцити до продукування медіаторів, які сприяють згортанню крові (Серов В.В., Пауков В.С., 1995). Зважаючи на це, метою наших досліджень було вивчити вплив таблеток „Апівен” на розвиток та перебіг запального процесу на моделі травматичного пошкодження лапи щурів. Апівен досліджували у дозі – 0,3 мг/мл.

Отримані результати показують, що в умовах травматичного запального набряку таблетки „Апівен” в дозі 0,3 мг/мл проявляють антиексудативну дію та на 5-ту добу перевищують препарат порівняння – гепаринову мазь (34% та 42% відповідно). В порівнянні з препаратом гелем диклофенаку як таблетки “Апівен” так і мазь гепаринова на ранніх етапах запалення поступаються за виразністю антиексудативної дії, але вже на 7-му добу таблетки „Апівен” (77%) були за ефективністю на рівні гелю диклофенаку (73%) та перевищували гепаринову мазь (44%). Антипроліферативний ефект препаратів оцінювали за їх здатністю зменшувати кількість грануляційної тканини навколо імплантованої ватної кульки стосовно нелікованого контролю. У тварин на тлі лікування таблетками „Апівен” в дозі 0,3 мг/мл спостерігали достовірне зменшення розростання грануляційної тканини стосовно нелікованого контролю на 46,4 %. За антипроліферативним ефектом таблетки “Апівен” достовірно (р0,05) перевищували референс-препарати – гепаринову мазь (29,2 %) і диклофенак гель (32,2 %).

Вивчення антикоагулянтної дії таблеток “Апівен” (розділ 4). Подальше дослідження на приладі “Коагулограф Н334” проводили з метою перевірки впливу таблеток “Апівен” на процес згортання крові здорових тварин.

Таблетки “Апівен” в дозі ЕД50 0,3 мг/мл при застосуванні протягом 14 діб значно відволікають час початку та кінця згортання крові, збільшуючи при цьому період згортання крові в порівнянні з контрольними тваринами. При дослідженні процесів ретракції та фібринолізу утворених згустків дані свідчать про те, що таблетки “Апівен” значно зменшують щільність згустку та стимулюють процес фібринолізу в порівнянні з групою тварин інтактного контролю та перевершують за ефективністю препарат порівняння – гепаринову мазь.

Виходячи з даних попередніх дослідів, таблетки “Апівен” проявляють виражену антикоагулянтну та протизапальну дію і можуть бути застосовані для лікування тромбофлебітів, в основі розвитку яких лежать як процеси прискорення згортання крові, так і запальні процеси (Кириенко А.И., Золотухин И.А., 1999). Тому метою подальших досліджень було встановлення лікувального впливу таблеток “Апівен” на перебіг експериментального тромбофлебіту.

На тлі тромбофлебіту виникає застій крові, що є одним з факторів виникнення тромбозу (Кириенко А.И., Золотухин И.А., 1999). У зоні тромбоутворення внаслідок сповільнення руху крові виникає її турбулентний потік, який сповільнює рух факторів коагуляції та сприяє їх накопиченню, зростанню кількості тромбоцитів, призводить до гіпоксії ендотеліальних клітин. Внаслідок гіпоксії ендотеліальні клітини починають виділяти медіатори запалення, які індукують адгезію та агрегацію тромбоцитів, внаслідок чого підвищується тромбогенність (Chauveau M., 1994.; Frick R.W., 2000, Никульников П.И. и соавт., 2004). Поряд з цим виникають також запальні процеси в прилеглих до тромбованої вени тканинах, які характеризуються ексудацією внаслідок збільшення проникності судин, гіперемією, болем, наявністю ущільнень не тільки вен, але й підшкірної клітковини. Вплив розчину Люголя викликає зміну фізико-хімічних властивостей крові, що є додатковим фактором тромбоутворення, а також викликає місцеву запальну реакцію.

Спираючись на отримані дані, бачимо, що патологія мала важкий та системний перебіг. Змінювалися показники згортаючої системи в бік тромбогенезу, відбувався істотний патологічний зсув в бік активації системи ПОЛ та пригнічення активності АОС. На гістологічному зрізі відзначалося руйнування стінки судини, обтурація судин тромбом та наявність продуктивного запалення прилеглих тканин (рис. 2).

Таблетки “Апівен” вже на 4-ту добу зменшували площу гіперемії на 63% (таблиця 1) в порівнянні з вихідними даними, в той час як гепаринова мазь зменшувала площу гіперемії на 44%, а в групі тварин контрольної патології спонтанне зменшення гіперемії відбувалося лише на 12%.

Таблиця 1.

Динаміка довжини тромбу та площі гіперемії на моделі експериментального тромбофлебіту у кролів під впливом таблеток „Апівен” та мазі гепаринової

Група, доза | Зменшення довжини тромбу в % щодо вихідних даних

4 доба | 7 доба | 10 доба

Контрольна патологія | 12,3 | 21,0 | 35,5

Апівен 0,3 мг/мл | 16,2 | 63,0 | 94,0

Гепаринова мазь 100 МО в 1 г | 14,4 | 43,0 | 87,0

Група, доза | Зменшення площі гіперемії в % щодо вихідних даних

4 доба | 7 доба | 10 доба

Контрольна патологія | 12,0 | 23,0 | 32,0

Апівен 0,3 мг/мл | 63,0 | 100,0 | 100,0

Гепаринова мазь 100 МО в 1 г | 44,0 | 89,0 | 100,0

На 7-му добу у групи тварин, лікованих таблетками „Апівен”, частково відновлювався кровообіг у судині, про що свідчило зникнення запалення (100%) та істотне зменшення довжини тромбу у вені більш ніж в 2 рази в порівнянні з вихідними даними. В групі тварин, лікованих гепариновою маззю, ці показники зменшувалися лише на 89% та в 1,7 рази відповідно. До 10 доби в групі тварин, лікованих таблетками „Апівен”, повністю відновлювався кровообіг: спостерігали зменшення довжини тромбу на 94 % в порівнянні з вихідними даними та повну відсутність гіперемії, в той час як у тварин, яких лікували гепариновою маззю, відбувалося менш виразне відновлення кровообігу, на що вказує зменшення довжини тромбу на 87 % в порівнянні з вихідними даними. Гепаринова мазь, як і виучуваний препарат, повністю знімала запалення прилеглих тканин. Протягом експерименту в групі тварин контрольної патології довжина тромбу та площа гіперемії змінювалися не суттєво і до десятої доби зменшилися на 35,5% та 32 % відповідно. Виходячи з отриманих результатів, можна зробити висновок, що аплікації розчину таблеток „Апівен” за впливом на перебіг тромбофлебіту перевищують референс-препарат – гепаринову мазь.

Проведені гістологічні дослідження тканин вуха кролів різних груп з тромбофлебітом встановили, що у групи тварин контрольної патології спостерігали розширені та повнокровні артеріальні судини та венули, оточені пухкою сполучною тканиною. Відмічалася обтурація просвіту вен тромбом. Стінка судин мала пухку будову. Поблизу судин та на відстані від них знайдений вихід плазми та формених елементів крові в оточуючу пухку сполучну тканину, що супроводжувалося формуванням запальних інфільтратів лімфоїдно-макрофагального типу (рис. 2).

Рис. 2. Контрольна патологія. Тромб у венулі. Запальні інфільтрати лімфоїдно-макрофагального типу. Гематоксилін та еозин. Зб. 60.

Рис. 3. Тромбофлебіт. Лікування таблетками “Апівен”. Поодинокі еритроцити в просвіті венули. Запальні інфільтрати не виявлені. Гематоксилін та еозин. Зб. 60.

У групі тварин, лікованих таблетками „Апівен”, структура стінки вени відповідала нормі, проникність судин не була порушена, про що свідчить відсутність еритроцитів поблизу судин, у вені не було ознак наявності тромбу, запальні інфільтрати не відмічені (рис. 3). В той час як в групі тварин, лікованих гепариновою маззю, у пухкій сполучній тканині поблизу судин знайдені скупчення еритроцитів, що свідчить про тривале затримання току крові, ознаки набряку та невеликі, поодинокі лімфоїдно-макрофагальні інфільтрати (рис. 4). В окремих судинах артеріального типу в просвіті судини знайдені еритроцити. Просвіт вен був чистим.

Рис. 4. Тромбофлебіт. Лікування гепариновою маззю. Судина артеріального типу з еритроцитами в просвіті. Венули з чистими просвітами. Скупчення еритроцитів та макрофагів в пухкій з’єднувальній тканині. Гематоксилін та еозин. Зб. 60.

Таким чином, дані світлової мікроскопії свідчать про антитромботичну, антикоагулянтну, протизапальну, антиексудативну, судинозміцнюючу, регенеруючу дію таблеток “Апівен”, які за вказаними ефектами перевищують препарат порівняння – гепаринову мазь.

Протягом лікування таблетками “Апівен” у тварин спостерігали достовірне (р0,05) зменшення показників МДА, ДК, АлАТ та АсАТ та збільшення показника ВГ щодо групи тварин контрольної патології. Зміна показників під дією таблеток була на рівні динаміки під впливом референс-препарата – гепаринової мазі, що спостерігали на кінець експерименту (10 доба).

Вивчення деяких сторін механізму дії таблеток “Апівен” (Розділ 5). Наступним кроком в дослідженні антикоагулянтної активності таблеток “Апівен” було дослідження деяких сторін їх механізму дії. Першим етапом цього дослідження було встановлення впливу таблеток “Апівен” у дозі 0,3 мг/мл на тромбоцитарну ланку гемостазу. Доцільність вивчення агрегації тромбоцитів була в першу чергу обумовлена тим, що в процесі агрегації кров’яні пластинки екскретують більшу кількість агресивних речовин ніж в звичайних умовах. Так, наприклад, взаємодія фактора фон Вілебранда з тромбоцитами призводить до збільшення в них вмісту йонів Са2+ і активує синтез тромбоксану А-2 (Kermod J.C., Zheng Q., Milner E.P., 1999), який є не тільки потужним тромботичним фактором, але й одним з найсильніших вазоконстрикторів (Chevalier D. at al, 2001). Для вивчення впливу таблеток „Апівен” на агрегацію тромбоцитів була обрана модель АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів за макроскопічним методом за Caen J. та співавт. (1968). Даний підхід до вивчення агрегації кров’яних пластинок був обумовлений тим, що саме АДФ є універсальним ініціатором процесів агрегації тромбоцитів (Foster C.J. at al., 2001).

Таблетки “Апівен” в дозі 0,3 мг/мл достовірно (р0,05) щодо інтактного контролю пригнічували АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів, гальмуючи процес їх “злипання”, та не поступалися за антитромботичною дією гепариновій мазі. Це свідчить про вплив таблеток “Апівен” на тромбоцитарну ланку системи гемостазу, активовану АДФ.

Дослідження впливу таблеток “Апівен” на плазменну ланку системи гемостазу вивчали за показниками протизгортаючої системи плазми та за активністю деяких факторів згортання крові при одноразовому застосуванні та через 10 діб застосування.

При одноразовому застосуванні (через 1 годину після застосування) таблетки “Апівен” достовірно (р0,05) подовжують час рекальціфікації плазми крові щодо інтактного контролю. Це свідчить про вплив таблеток на плазменні фактори коагуляції, а саме на стадію утворення протромбінази (порушується І фаза згортання крові) (Голота В.Я. и соавт., 1998).

Як відомо, існують два шляхи згортання крові “зовнішній” та “внутрішній”. “Зовнішній” шлях фізіологічно більш важливий (Зубаиров Д.М., 1997; Зубаиров Д.М., 1978). Протромбін стимулює в пробірці роботу “зовнішнього” шляху згортання, у відповідності з чим при рекальціфікації тромбопластин, виконуючи роль тканьового фактора, активує фактор VII, а при додаванні до нього Са2+ активується фактор Х. Потім за участю факторів X і V протромбін (фактор II) активується в тромбін, який коагулює фібриноген (Кинах М.В., Захария Е.А., Романишин Я.Н., 1998). При дослідженні динаміки протромбінового часу під впливом таблеток “Апівен” спостерігали достовірне (р0,05) збільшення показника в порівнянні з контрольним вже через 1 годину після застосування. Застосування виучуваного препарату протягом 10 діб збільшувало протромбіновий час в 1,7 рази в порівнянні з контрольним показником. Встановлена активність свідчить про вплив таблеток “Апівен” на один або кілька факторів “зовнішнього” шляху згортання крові.

Для оцінки кінцевого етапу згортання крові – перетворення фібриногену в фібрин під впливом активованого протромбіну (без участі інших факторів згортання) – досліджували тромбіновий час та кількість фібриногену в крові. Фібриноген є єдиним субстратом, з якого під дією тромбіну утворюється волокниста сітка фібрину – матеріальна основа згустку крові (Зубаиров Д.М., 1997). Аналізуючи вплив таблеток “Апівен” на кількість фібриногену та тромбіновий час, встановлено, що тромбіновий час достовірно (р0,05) збільшувався в порівнянні з контрольним показником протягом експерименту, а кількість фібриногену залишалася в межах фізіологічної норми. Виходячи з отриманих даних можна зробити висновок, що таблетки “Апівен”, як і гепаринова мазь можуть проявляти себе в якості інгібітора активності тромбіну.

Достовірним маркером процесу вивільнення вмісту тромбоцитарних гранул може стати активований ХІІІ фактор згортання крові (фібриназа), так як його активація здійснюється тромбоспоніном, що вивільняється з органел кров’яних пластинок (Bale M.D., Mosher D.F., 1985). Утворений при цьому фактор ХІІІа (ХІІІ активований) приймає саму активну участь в процесах полімеризації фібрин-мономерів, розчинного фібрину та бета-фібриногену. Нитки фібрину, які утворилися шляхом полімеризації на заключному етапі, укріплюються завдяки утворенню під дією фактора ХІІІа ковалентних зв’язків між одиницями фібрину при участі йонів кальцію, в результаті чого утворюється щільна нерозчинна фібринова сітка. Відомо, що фактор ХІІІа є єдиним серед усіх інших ферментів, який каталізує не розщеплення ковалентних зв’язків, а їх утворення. Тромби, що утворилися в присутності фактора ХІІІа дуже повільно піддаються лізису. А при зменшенні активності вказаного фактора утворюється тромб, який швидко розпадається (Зубаиров Д.М., 1997; Дюбанова Г.А. и соавт., 1990). Оскільки зясований вплив таблеток “Апівен” на тромбоцитарну ланку системи гемостазу, доцільним було дослідити їхній вплив на активність фактору ХІІІ. В результаті проведених досліджень встановлено, що таблетки “Апівен” в дозі 0,3 мг/мл достовірно (р0,05) зменшують активність фактору ХІІІ, достовірно (р0,05) виразніше ніж гепаринова мазь, внаслідок чого найімовірніше зменшується щільність згустку крові, що і було доведено в дослідах на коагулографі.

В реалізації “зовнішнього” механізму згортання крові приймають активну участь проакцелерин (фактор V) та іони кальцію. В лабораторних умовах цей шлях імітується протромбіновим тестом (Третьякова О., 2004). Враховуючи той факт, що таблетки „Апівен” чинять вплив на протромбіновий комплекс, подовжуючи протромбіновий час, було доцільним вивчити їх вплив на властивості фактора V, а саме його взаємодію з активованим протеїном С, який є природним антикоагулянтом. Встановлено, що під дією таблеток “Апівен” підвищується чутливість фактора V до активованого протеїну С, що проявляється достовірним подовженням часу згортання крові. Отримані дані свідчать про гальмівний вплив таблеток “Апівен” на “зовнішній” механізм згортання крові.

Дослідити вплив таблеток “Апівен” на “внутрішній” механізм згортання крові було вирішено за активністю антигемофільного глобуліну (фактор VІІІ), так як в літературних джерелах ми не зустріли інформації про вплив бджолиної отрути на цей фактор, що бере участь у “внутрішньому механізмі” коагуляції (ХІ, ІХ, VІІІ та ІV (іони кальцію)). Комплекс вказаних факторів активує фактор Х, який стимулює утворення необхідної кількості протромбінази (Третьякова О., 2004).

Аналіз отриманих даних свідчить про достовірну тенденцію до зменшення (р0,05) активності фактору VIII під впливом таблеток “Апівен” та гепаринової мазі по відношенню до інтактного контролю. Тобто, таблетки “Апівен”, впливаючи на активність фактору VIII, гальмують “внутрішній механізм” згортання крові (Баркаган З.С., Момот А.П., 2001).

Виходячи з отриманих даних можна зробити висновок, що механізм антикоагулянтної дії таблеток “Апівен” включає пригнічення агрегації тромбоцитів, гальмування процесу утворення протромбінази як за “зовнішнім”, так і за “внутрішнім” механізмами та зменшення активності тромбіну.

Вивчення токсичних властивостей таблеток “Апівен”. (Розділ 6). Обов'язковою характеристикою дослідження препарату є вивчення його нешкідливості, що зумовило вивчення гострої токсичності таблеток “Апівен” з визначенням показника ЛД50. Отримані результати свідчать про те, що ЛД50 для мишей при внутрішньошлунковому введенні склала 17,4 (11,5-23,2) мг/кг, для щурів – 14,9 (9,1-20,7) мг/кг. Виходячи з цього, можна зробити висновок, що таблетки “Апівен” при внутрішньошлунковому застосуванні за класифікацією Сидорова К.К. (1973) відносяться до “високотоксичних” сполук (ЛД50 – 2-50 мг/кг).

Так як таблетки “Апівен” призначені для зовнішнього застосування, було вивчено їх можливий токсичний вплив при нанесенні на шкіру. Досліди поставлені на двох видах тварин (миші, щури) при однократному нашкірному нанесенні. Аналіз отриманих даних свідчить, що відповідно до класифікації речовин за ступенем токсичності (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001) таблетки “Апівен” відносяться до “практично нетоксичних” речовин (ЛД50>2900 мг/кг) при однократному нашкірному нанесенні щурам і мишам.

Оскільки таблетки “Апівен” при внутрішньошлунковому застосуванні відносяться до “високотоксичних” сполук, явилося доцільним вивчення їхнього впливу на організм при тривалому застосуванні. З метою виявлення можливої загальнотоксичної дії, а також побічних ефектів таблетки “Апівен” застосовували зовнішньо в дозах ЕД50 (0,3 мг/мл) та 10 ЕД50 (3 мг/мл) у щурів та в дозі ЕД50 (0,3 мг/мл) у кролів. У звязку з тим, що таблетки рекомендуються до застосування в клініці протягом 10-14 днів, їх токсичний вплив вивчали згідно з Методичними рекомендаціями (2001) протягом 1 місяця.

Встановлено, що тривале застосування таблеток “Апівен” зовнішньо не чинить негативного впливу на органи та системи щурів та кролів. Після застосування таблеток протягом 1 місяця у дозі 0,3 мг/мл у кролів спостерігали достовірне (р0,05) збільшення часу згортання крові та протромбінового часу в порівнянні з інтактним контролем. Це можна пояснити специфічною антикоагулянтною дією таблеток “Апівен”.

Гістологічні дослідження показали, що при застосуванні аплікацій розчину таблеток “Апівен” в дозах 0,3 мг/мл та 3 мг/мл змін у структурній організації внутрішніх органів тварин не виявлено. Характерними були зміни в місці нанесення аплікацій розчину таблеток „Апівен” в дозі 3 мг/мл у щурів, що мали переважно продуктивний запальний характер. Така місцево-подразнююча дія притаманна препаратам, які мають у своєму складі бджолину отруту (Писарєв О.А., Сопіна І.Л., 1998).

Дослідження можливої алергізуючої дії виявило у таблеток “Апівен” здатність до слабкої сенсибілізуючої дії у тесті “кон’юнктивальна проба” та відсутність алергічних проявів в реакціях гіперчутливості сповільненого типу, непрямої дегрануляції тучних клітин та на моделі активної шкірної анафілаксії.

Таким чином, проведені дослідження показали, що антикоагулянтний препарат на основі бджолиної отрути “Апівен” не виявив істотного токсичного впливу і може бути рекомендований до використання в медичній практиці для лікування тромбозів та тромбофлебітів, як лікарська форма для зовнішнього застосування.

ВИСНОВКИ

У дисертації теоретично та експериментально обгрунтовано перспективність пошуку та створення нових антикоагулянтних засобів і запропоновано нове вирішення цього завдання, яке полягає в фармакологічному дослідженні препарату на основі бджолиної отрути – таблеток „Апівен”, які проявляють антикоагулянтну та протизапальну дію. Ефективність та нетоксичність таблеток “Апівен” дозволяє рекомендувати їх для клінічного застосування при лікуванні тромбозів та тромбофлебітів.

1. Скринінгові дослідження в тесті визначення впливу таблеток „Апівен” на згортання крові показали, що антикоагулянтний ефект таблеток „Апівен” зростає прямопропорційно дозі бджолиної отрути. За виразністю антикоагулянтної дії таблетки „Апівен” перевищують референс-препарат – гепаринову мазь.

2. Встановлена ЕД50 таблеток „Апівен” за антикоагулянтною дією в тесті визначення активності процесу згортання крові, яка розрахована на мл водного розчину та становить 0,3 (0,22 0,38) мг/мл.

3. Експериментально доведена протизапальна ефективність таблеток „Апівен” в дозі 0,3 мг/мл. Таблетки “Апівен” проявляють як антиексудативну дію, що показано на моделі транссудативного набряку стопи щурів, так і антипроліферативну дію, що доведено на моделі „ватної гранульоми”.

4. Розроблена нами модель експериментального тромбофлебіту периферичних судин вуха кроля характеризувалася важким системним перебігом, про що свідчив зсув показників згортаючої системи в бік тромбогенезу, істотний патологічний зсув в бік активації системи ПОЛ і пригнічення активності АОС та результати гістологічних досліджень.

5. Вплив таблеток “Апівен” на перебіг експериментального тромбофлебіту у кролів свідчить про ефективну антикоагулянтну, протизапальну, антиоксидантну та судинозміцнюючу дії, за якими Апівен перевершує активність референс-препарату – гепаринової мазі.

6. Коагулографічно доведено, що таблетки “Апівен” чинять вплив на І та ІІ стадії згортання крові. Вивчення механізмів впливу таблеток “Апівен” на процес агрегації тромбоцитів та на І стадію згортання крові показало, що виучуваний препарат зменшує агрегаційні властивості тромбоцитів, чинить вплив на І фазу гемокоагуляції шляхом гальмування утворення протромбінази як за “зовнішнім”, так і за “внутрішнім” механізмами.

7. Експериментально встановлена нешкідливість таблеток “Апівен” при тривалому зовнішньому застосуванні тваринам у дозах 0,3 мг/мл (ЕД50) та 3 мг/мл (10ЕД50) та відсутність істотних алергічних проявів.

ПЕРЕЛІК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Малоштан Л.М. Калініченко Т.В., Циган О.В. Фармакологічне вичення таблеток на основі бджолиної отрути “Апівен”// Вісник фармації, 1998. - № 1(17). – С. 121-122. (Особистий внесок здобувача: теоретичне обґрунтування досліджень; проведення частини експерименту; аналіз отриманих результатів).

2. Малоштан Л.М., Должикова О.В. Токсикологічне вивчення антикоагулянтного препарату “Апівен” // Фізіологічно активні речовини, 2000. – № 2(30). – С. 68-71. (Особистий внесок здобувача: теоретичне обґрунтування досліджень; проведення експерименту; аналіз отриманих результатів).

3. Малоштан Л.М., Должикова О.В. Дослідження нового препарату для корекції порушень зсідання крові // Вісник фармації, 2001. – № 3(27). – С. 163 (Особистий внесок здобувача: теоретичне обґрунтування досліджень; проведення експерименту; аналіз отриманих результатів).

4. Малоштан Л.М., Должикова О.В. Дослідження антикоагулянтного препарату “Апiвен” на моделі тромбофлебіту периферичних судин // Клiнiчна фармацiя 2004. – Т.8. - №4. – С. 59-63. (Особистий внесок здобувача: теоретичне обґрунтування досліджень; проведення експерименту; аналіз отриманих результатів)

5. Должикова О.В., Малоштан Л.М. Вплив таблеток „Апівен” на систему ПОЛ-АОС на моделі тромбофлебіту периферичних судин у кроликів // Ліки України (додаток), 2005. – № 9. – С. 90-93. (Особистий внесок здобувача: теоретичне обґрунтування досліджень; проведення експерименту; аналіз отриманих результатів)

6. Малоштан Л.Н., Должикова Е.В. Влияние таблеток пчелиного яда “Апивен” на свертываемость крови в опытах in vivo и in vitro // Сб. матеріалів міжнародної конференції, присвяченої 75-річчю з дня народження ректора ХФІ (1970-1980 рр.), д.фарм.н., проф. Сала Дмитра Павловича: “Теорія і практика створення лікарських препаратів”, 1998. – С. 162-166. (Особистий внесок здобувача: теоретичне обґрунтування досліджень; проведення експерименту; аналіз отриманих результатів).

7. Малоштан Л.М., Должикова О.В. Специфическое действие антикоагулянтного препарата апивен на модели периферического тромбообразования // “Лекарства-человеку”, 2001. – Т. XVI. – № 1-2. – С. 348-351. (Особистий внесок