НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМЕНІ О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

Досенко Віктор Євгенович

УДК 616.12:575.113.2+577.152.1

РОЛЬ АЛЕЛЬНОГО ПОЛІМОРФІЗМУ ГЕНІВ ЕНДОТЕЛІАЛЬНОЇ NO-СИНТАЗИ ТА ПРОТЕАСОМИ В ПАТОГЕНЕЗІ СЕРЦЕВО-СУДИННИХ ЗАХВОРЮВАНЬ: МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНІ АСПЕКТИ

14.03.04 - патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі експериментальної кардіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України (м. Київ)

Науковий консультант: |

доктор медичних наук, професор, академік НАН України

Мойбенко Олексій Олексійович,

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,

завідувач відділу експериментальної кардіології;

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АМН України

Горовенко Наталія Григорівна,

Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупіка, завідувач кафедри медичної генетики;

доктор медичних наук, професор,

Французова Стела Борисівна,

Науково-дослідний лабораторний центр Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця,

головний науковий співробітник лабораторії патофізіології та експериментальної фармакології;

доктор медичних наук, професор

Братусь Віктор Васильович,

Інститут кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України,

головний науковий співробітник відділу патофізіології

Провідна установа - | Інститут ендокринології та обміну речовин

ім. В.П.Комісаренка АМН України

Захист відбудеться "26" вересня 2006 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Автореферат розіслано "23"серпня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук

З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Одним із найважливіших факторів ендогенної кардіопротекції є ендотеліальна NO-синтаза (eNOS) – фермент, що каталізує утворення оксиду азоту (NO) з аргініну. Вивченню NO в останні роки присвячено тисячі досліджень, результатом яких стало зґясування ролі цієї молекули в нормальному функціонуванні практично усіх систем та органів, а також у патогенезі ряду захворювань Мойбенко О.О. та ін., 1997, 2004; Сагач В.Ф. та ін., 1997; Alderton W.P. et al., 2001; Furchgott R.F. et al., 1983; Knowles R.G. and Moncada S., 1994. Особливе значення NO має у розвитку серцево-судинних захворювань, які є визначальною причиною смертності в усіх цивілізованих країнах світу Доповідь ВООЗ, 2003. Доведено, що монооксид азоту приймає безпосередню участь в регуляції судинного тонусу, попередженні адгезії тромбоцитів та інших процесах, порушення яких призводить до ініціації та прогресування атеросклерозу Братусь В.В. та ін., 2005; Napoli C. et al., 2006; Moncada S. et al., 1991; Schulz R. et al., 2005.

Алельний поліморфізм гена eNOS, за даними багатьох досліджень, має велике значення у формуванні спадкової схильності до атеросклерозу, ішемічної хвороби серця (ІХС), артеріальної гіпертензії тощо Agema W.R.P. et al., 2004; Casas J.P. et al., 2004; Nakayama M. et al., 2005; Wang X.L., Wang J., 2000. Серед 15-ти алельних варіантів цього гена виділено три варіанти поліморфізму, що найчастіше зустрічаються у хворих на серцево-судинні захворювання, і вважаються вагомими факторами-ризику останніх. Це трансверсія Т-786>С у промоторі гена eNOS, трансверсія G894>T в 7-му екзоні, що призводить до заміни глутаміну на аспарагін у 298 положенні білка eNOS та тандемні повтори варіабельної кількості 4-го інтрону (4b/4a) Сolombo M.G., 2002; Hibi K. et al., 1998; Tanus-Santos J.E. et al., 2005; Wang X.L. et al., 2000. Слід зазначити, що частота різних варіантів гена eNOS в українській популяції раніше не досліджувалася, а про значення алельного поліморфізму цього гена в патогенезі різних клінічних варіантів ішемічної хвороби серця, зокрема такого небезпечного як гострий коронарний синдром (ГКС), майже нічого не відомо.

З іншого боку, роль протеасомного протеолізу в патогенезі серцево-судинних захворювань також активно вивчається останніми роками Goldberg А.L. et al., 2005; Herrmann J. et al., 2004; Kukan M., 2004. Встановлено, що протеасомне розщеплення внутрішньоклітинних білків має суттєве значення в регуляції обміну ліпопротеїдів, експресії молекул клітинної адгезії, апоптозі гладеньком’язевих та ендотеліальних клітин, тобто у процесах, які мають принципове значення в атерогенезі Drexler H.C. et al., 2000; Dupre D.J. et al., 2003; Kikuchi J. et al., 2000; Viera O. et al., 2000. Отримані дані про можливість застосування інгібіторів протеасоми для попередження формування неоінтими після денудації артерії, рестенозу артеріальних судин після балонної дилятації, ішемічно-реперфузійних ушкоджень та інсультів Herrmann J. et al., 2004; Meiners S. et al., 2002; Okamoto H. et al., 1998; Wojcik C. and di Napoli M., 2004. У генах, що кодують каталітичні субодиниці імунопротеасоми (LMP2 та LMP7) описано полиморфізм поодиноких нуклеотидів (SNP) і тривають спроби встановити вплив алельного поліморфізму вказаних генів на ймовірність розвитку тих чи інших захворювань Deng G.Y., 1995; Kawaguchi Y. et al., 2005; Maksymowych W.P. et al., 1994. Даних про роль алельного поліморфізму генів LMP2 и LMP7 в патогенезі серцево-судинних захворювань немає.

Вивчення механізмів фенотипової реалізації алельних варіантів різних генів при поліморфізмі поодиноких нуклеотидів є однією з найактуальніших задач медичної генетики та патофізіології. Слід підкреслити, що це питання не вирішено як стосовно гена NO-синтази, так і генів імунопротеасоми. Найважливішими факторами, що визначають ефективність роботи NO-синтази в клітині, є рівень транскрипції гена, інтенсивність пострансляційної модифікації та швидкість протеолітичної деградації цього ферменту. Строк напівжиття білка NOS досить короткий (15-20 годин), він може фосфорилюватися (за тирозиновим, сериновим залишкам або за залишком треоніна) і цей фермент може окислюватися під дією як монооксиду азоту (який він сам синтезує), так і інших окисників (супероксиданіон радикалу, перекису водню) Alderton W.P. et al., 2001. Отже, є усі підстави вважати, що протеасомний протеоліз грає важливу роль в регуляції активності продукції оксиду азоту, а вивчення звґязку між убіквітин-залежним протеолізом та активністю NO-синтаз у клітині є вельми актуальним.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках наукової тематики відділу експериментальної кардіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: “Дослідження ролі нових ендогенних біорегуляторів в розвитку патологічних процесів в серцево-судинній системі; розробка та впровадження нових методів лікування гострого інфаркту міокарда” (№ держреєстрації 0199U004033), “Дослідження механізмів розвитку та попередження порушень діяльності серцево-судинної системи при ішемічно-реперфузійному синдромі; розробка методів їх корекції” (№ держреєстрації 0102U000827), “Дослідження ендогенних механізмів кардіопротекції при захворюваннях серця” (№ держреєстрації 0105U003233) та наукової програми НАН України “Дослідження молекулярних механізмів – проявів функціонування геному, що зумовлюють специфічність діяльності фізіологічних систем організму в нормі та патології” (№ держреєстрації 0102U002472).

Метою дослідження було визначення ролі алельного поліморфізму гена ендотеліальної NO-синтази і генів імунопротеасоми в патогенезі серцево-судинних захворювань та доведення участі протеасомного протеолізу в регуляції активності NO-синтази.

Задачі дослідження:

1. Дослідити частоту алельного поліморфізму промотору (Т-786>С), 7-го екзону (G894>T) та 4-го інтрону (4а/4b) гена ендотеліальної NO-синтази та генів, що кодують субодиниці протеасоми (LMP2 та LMP7), у хворих на серцево-судинні захворювання та у практично здорових індивідуумів.

2. Розробити метод визначення функціонального значення алельного поліморфізму гену ендотеліальної NO-синтази та генів, що кодують субодиниці імунопротеасоми.

3. Оцінити інтенсивність експресії гена ендотеліальної NO-синтази за рівнем матричної РНК в тромбоцитах, ізольованих від генотипованих за промотором, 7-м екзоном та 4-м інтроном осіб.

3. Визначити активність продукції NO тромбоцитами людей з певними генетичними варіантами ендотеліальної NO-синтази для доведення патогенетичного зв’язку між алельним поліморфізмом та функціональними властивостями ендотеліальної NO-синтази.

4. Оцінити експресію генів LMP2 та LMP7 за рівнем матричної РНК в лейкоцитах, ізольованих від генотипованих за цими генами осіб.

5. Визначити хімотрипсиноподібну та трипсиноподібну активність протеасоми в лейкоцитах людей з певними генетичними варіантами імунопротеасоми.

6. Вивчити вплив протеасоми та її інгібіторів на активність рекомбінантної ендотеліальної NO-синтази та активність цього ферменту в ізольованих тромбоцитах.

7. Розробити метод визначення РНК-азної активності протеасоми та дослідити протеасомну деградацію матричної РНК різних ізоформ NO-синтази.

8. Вивчити механізми кардіопротекторної дії кверцетину та його водорозчинного аналогу “Корвітину”, що реалізуються через вплив на активність протеасомного протеолізу.

Об’єкт дослідження – алельний поліморфізм генів ендотеліальної NO-синтази, субодиниць імунопротеасоми та їх функціональне значення.

Предмет дослідження – ДНК та РНК, виділені з венозної крові хворих на гострий коронарний синдром, артеріальну гіпертезію та крові практично здорових осіб, неонатальні кардіоміоцити щурів, ізольовані тромбоцити та лейкоцити людей та кролів.

Методи дослідження: виділення ДНК та РНК з клітин крові, полімеразна ланцюгова реакція із наступним аналізом довжини рестрикційних фрагментів, зворотна транскрипція із полімеразною ланцюговою реакцією, ізоляція клітин крові, виділення та культивування кардіоміоцитів, визначення активності ендотеліальної NO-синтази та протеасоми за розробленою методикою, визначення різних видів клітинної смерті із застосуванням флуоресцентних барвників.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на сучасному методичному рівні отримано інформацію про розподіл різних алельних варіантів промотору, 7-го екзону та 4-го інтрону гена ендотеліальної NO-синтази у хворих на гострий коронарний синдром та артеріальну гіпертензію в українській популяції. Встановлено, що поліморфізм промотору вказаного гена має найбільше значення порівняно з іншими варіантами поліморфізму у формуванні схильності до розвитку гострого коронарного синдрому. Поліморфізм 7-го екзону при цьому значно частіше визначається у підлітків хворих на артеріальну гіпертензію. Вперше досліджено частоту алельного поліморфізму генів, що кодують субодиниці імунопротеасоми, у хворих на серцево-судинні захворювання.

Із застосуванням розробленого методу встановлено функціональне значення алельного поліморфізму різних варіантів генів ендотеліальної NO-синтази та субодиниць імунопротеасоми.

Вперше доведено звґязок між активністю ендотеліальної NO-синтази та протеасомним протеолізом, що реалізується за рахунок протеасомної деградації ендогенного інгібітору ендотеліальної NO-синтази в ізольованих тромбоцитах, рекомбінантної еNOS за умов in vitro та здатності протеасоми руйнувати РНК різних ізоформ NO-синтаз.

Описано нові молекулярні механізми кардіопротекторної дії кверцетину та його водорозчинного аналогу “Корвітину”, що реалізуються за рахунок пригнічення протеасомної активності в культивованих кардіоміоцитах та у лейкоцитах крові за умов in vivo. При цьому біофлавоноїди попереджуть некротичну та апоптотичну загибель кардіоміоцитів при моделюванні аноксії-реоксигенації.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження були спрямовані на з’ясування значення алельного поліморфізму генів, що кодують ендотеліальну NO-синтазу та субодиниці імунопротеасоми, в патогенезі серцево-судинних захворювань. Встановлені факти дозволяють оцінювати ризик виникнення гострого коронарного синдрому та артеріальної гіпертензії, диференційовано підходити до терапії цих захворювань з урахуванням генотипу певного хворого та проводити запобіжні заходи для попередження виникнення важких ускладнень зазначених захворювань. Генотипування людей за алельними варіантами гена ендотеліальної NO-синтази може бути використано для скринінгу хворих на серцево-судинні захворювання та їх ранньої діагностики.

Встановлене функціональне значення певних алельних варіантів гена ендотеліальної NO-синтази дозволяє зробити висновок про виняткове значення поліморфізму промотору гена ендотеліальної NO-синтази у недостатності продукції монооксиду азоту в організмі людини, що є важливим фактором патогенезу найбільш поширених серцево-судинних захворювань.

Здатність кверцетину та його водорозчинного аналогу “Корвітину”, який вже впроваджено у клінічну практику, пригнічувати активність протеасоми дозволяє краще зрозуміти механізми кардіопротекторної дії біофлавоноїдів та рекомендувати їх для застосування в якості інгібіторів протеасоми.

Особистий внесок здобувача. Автором проведено аналіз літературних джерел, поставлено задачі дослідження, налагоджено та розроблено нові функціонально-генетичні методи, виконано необхідні експериментальні дослідження, статистично оброблено, проаналізовано та узагальнено отримані результати. Деякі експерименти були проведені разом із співробітниками Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, які є співавторами опублікованих робіт.

Діагностика захворювань та відбір хворих для генотипування було проведено у відділенні реанімації та інтенсивної терапії Інституту кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України під керівництвом професора О.М. Пархоменка та в клініці кафедри педіатрії №4 Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця під керівництвом д.м.н. М.В.Хайтовича.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи було представлено на семінарах cектору нейрофізіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця (2004, 2005), Конгресі товариства патофізіологів України (м. Чернівці, 2004 р.); спільному засіданні Київського обласного товариства патофізіологів та сектору вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця (26 січня 2006 р.); IV Міжнародному конгресі патофізіологів (м. Будапешт, June 29 - July 5, 2002 р.); V Міжнародному конгресі патофізіологів (м. Пекін, June 29 - July 5, 2006 р.); 59 Harden конференції європейського товариства молекулярної біології “The ubiquitin proteasome system in health and disease”, (Cirencester, 6-10 Sept., 2004); конференціях Міжнародного товариства по вивченню серця (Dresden, 2004; Tromso, 2005; Manchester, 2006); конференції Скандинавського товариства з досліджень у кардіоторакальній хірургії (10-12 лютого 2005 р.); Європейських конференціях по апоптозу (Chania, 17-20 Sept. 2004 та Budapest, 1-4 Oct., 2005), науковій конференції “Міжнародне наукове співробітництво – в імґя миру та розвитку” (10 листопада 2005 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 40 робіт, у тому числі 27 статей у наукових журналах.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень, аналізу й узагальнення результатів, висновків та списку використаних літературних джерел із 514 найменувань. Робота викладена на 310 сторінках, містить 19 таблиць та проілюстрована 59 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

У дослідження було залучено 265 хворих на гострий коронарний синдром віком від 40 до 83 років (середній вік 58.5 0.7 роки), яких було госпіталізовано у відділення реанімації та інтенсивної терапії Інституту кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України; 84 підлітка з первинною артеріальною гіпертензією, що проходили лікування в клініці кафедри педіатрії №4 Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця та 104 практично здорових донори (Київський міський центр крові), в яких відсутність серцево-судинної патології підтверджували шляхом збору анамнестичних даних, електрокардіографічного дослідження та вимірювання артеріального тиску. Контрольна група та група хворих на гострий коронарний синдром не відрізнялися за віком і співвідношенням чоловіків та жінок (P>0.05 за 2-критерієм). Також проведено досліди на 35 статевозрілих кролях породи шиншила (маса - 2580.0 95.0 г) віком від 4 до 8 місяців та кардіоміоцитах, виділених із шлуночків 40 щурів лінії Віcтар (маса - 51.0 ?4.4 г) віком від 2 до 3 діб.

Генетичні методи визначення алельного поліморфізму. Венозну кров набирали в стерильних умовах у моновети об’ємом 2,7 мл з калієвою сіллю етилендіамінтетраоцтової кислоти (11.7 мМ) в якості антикоагулянту (“Sarstedt”, Німеччина), заморожували та зберігали при температурі -20С. ДНК виділяли з цільної крові із використанням наборів DIAtom DNA Prep (“Isogene”, Росія). Т-786С поліморфізм промотору визначали методом полімеразної ланцюгової реакції з наступним аналізом довжини рестрикційних фрагментів (PCR-RFLP) за Ghilardi G. et al. (2002) із модифікаціями. Для цього ампліфікували ділянку промотору гена eNOS за допомогою пари специфічних праймерів: прямий – 5`-CAC CTG CAT TCT GGG AAC TGTA-3` та зворотній - 5`-GCC GCA GTA GCA GAG AGAC-3`. Праймери синтезовано фірмою “Синтол” (Росія). Для ампліфікації брали 30-50 нг ДНК і додавали до суміші, що містила 5 мкл 5-кратного РСR-буферу, 1,5 мМ сульфату магнію, 200 мкМ суміші чотирьох нуклеотидтрифосфатів, по 20 пМ кожного з праймерів і 0.5 ОД Taq-полімерази (“АмпліСенс”, Росія), об’єм доводили до 25 мкл деіонізованою водою. PCR проводили в термоциклері “Applied Biosystems 2700” (“PerkinElmer”, США). Ампліфікація фрагменту промотору складалася з 35 циклів: денатурація - 94С (1 хв), гібридизація праймерів - 63С (50 cек) та елонгація - 74С (1 хв). У подальшому 6 мкл продукту ампліфікації інкубували при 37С протягом 18 годин з 5 ОД рестриктази PdiI (“Ферментас”, Литва) в буфері Y+/Tango. За наявності в –786 положенні промотору тимідину рестрикція не відбувається, а при заміні на цитозин PdiI розщеплює ампліфіковану ділянку промотору (розмір 125 пар основ) на два фрагменти – 95 та 30 пар основ (рис. 1). Ампліфікати після рестрикції розділяли в 2,5 % агарозному гелі, що містив 10 мкг/мл бромистого етидію. Візуалізація ДНК після горизонтального електрофорезу (160 V протягом 40 хв) проводилася за допомогою трансілюмінатору (“Біоком”, Росія) та відеосистеми ViTran (Росія). |

Рис. 1. Фотографія гелю після електрофорезу фрагменту промотору гена eNOS при рестрикції PdiI. M – маркер молекулярної маси (п.о. - пари нуклеїнових основ), смужки 1 - 4, 7, 8, 10 відповідають Т/С-генотипу, 5, 6 – С/С-генотипу, 9 та 11 – Т/Т-генотипу

Алельний поліморфізм 7-го екзону гена eNOS (G894T поліморфізм) також визначали із використанням методу PCR-RFLP Hibi K. et al., 1998. Послідовність нуклеотидів у специфічних для гена eNOS праймерах була наступною: прямий – 5`-TCC CTG AGG AGG GCA GGC – 3` і зворотній - 5`-TGA GGG TCA CAC AGG TTC CT-3`. Ампліфікація фрагменту 7-го екзону складалася з 35 циклів: денатурація - 94С, 1 хв, гібридизація праймерів - 64С, 1 хв і елонгація - 74С, 1 хв. |

Рис. 2. Фотографія гелю після електрофорезу фрагменту 7-го екзону гена eNOS при використанні рестриктази Eco24I. M – маркер молекулярної маси (п.о. - пари нуклеїнових основ), доріжки 2, 3, 6 - 8 відповідають G/T-генотипу, 5 – T/T-генотипу, 1 та 4 –G/G-генотипу.

Для визначення поліморфізму поодиноких нуклеотидів 7-го екзону 6-10 мкл продукту ампліфікації інкубували при 37С протягом 20 годин з 8 ОД рестриктази Ecо24I (“Ферментас”, Литва) в буфері Y+/Tango; або 5 ОД рестриктази MboI в буфері R+. Якщо в 894 положенні гена eNOS знаходився гуанідин, то ампліфікат, що складався з 457 пар основ, розщеплювався рестриктазою Ecо24I на два фрагменти – 137 і 320 пар основ. У разі заміни G894T сайт рестрикції для Ecо24I втрачається, а для рестриктази MboI, навпаки, з’являється і утворюється два фрагменти вказаного розміру (рис. 2).

Для визначення поліморфізму 4-го інтрону гена eNOS використовували пару специфічних праймерів: прямий – 5`-AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT-3` і зворотній - 5`-TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC-3` Wang J. et al., 2002. Програма ампліфікації була наступною: денатурація - 94С (1 хв), гібридизація праймерів - 60С (1 хв) та елонгація - 74С (1 хв), разом 35 циклів. Після цього проводився горизонтальний електрофорез (150 V протягом 50 хв) та візуалізація ДНК (рис. 3). |

Рис. 3. Фотографія гелю після електрофорезу фрагменту 4-го інтрону гена eNOS. M – маркер молекулярної маси (п.о. - пари нуклеїнових основ), смужки 2, 4-6, 8, 9, 11 відповідають 4b/4b-генотипу, 1, 3, 10 – 4b/4a-генотипу, 7 – 4a/4a-генотипу.

Методика PCR-RFLP дозволила визначити і Arg60His поліморфізм гена LMP2 Vinasco J. et al., 1998 із модифікаціями. Для цього ампліфікували ділянку вказаного гена за допомогою пари специфічних праймерів: прямий - 5`-CTT GAA CCA GGG AGG CGA AGT TTG-3` і зворотній - 5`-CAG CTG AAC CAG AGA GTG CAT AGT-3`. Ампліфікація фрагменту гена LMP2 складалася з 35 циклів: денатурація - 94С (1 хв), гібридизація праймерів - 63С (30 cек) и елонгація - 74С (1 хв). |

Рис. 4. Фотографія гелю після електрофорезу фрагменту гена LMP2 при рестрикції Hin6I. M – маркер молекулярної маси (п.о. - пари нуклеїнових основ), доріжки 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11 відповідають Arg/Arg-генотипу, 3, 5 – Arg/His -генотипу, 7 и 10 – His/His -генотипу.

Далі 6 мкл продукту ампліфікації фрагменту гена інкубували при 37С протягом 18 годин з 2 ОД рестриктази Hin6I (“Ферментас”, Литва) в буфері Y+ або з 2 ОД рестриктази Alw21I в буфері О+ (Ферментас”, Литва). Якщо в гені LMP2 знаходився гуанідин, то ампліфікат, який складався з 228 пар основ, розщеплювався рестриктазою Hin6I на два фрагменти – 199 и 29 пар основ. У разі заміни гуанідину на аденін сайт рестрикції для Hin6I втрачається, а для рестриктази Alw21I – з’являється і утворюється два фрагменти вказаного розміру (рис. 4), що візуалізувалися після горизонтального електрофорезу (160 V протягом 40 хв).

Алельний поліморфізм гена LMP7 (Lys145Gln поліморфізм) також визначали шляхом ампліфікації фрагменту із наступною рестрикцією Vinasco J. et al., 1998 із модифікаціями. Послідовність нуклеотидів у специфічних праймерах була такою: прямий (sense) – 5`-СGG ACA GAT CTC TGG GTG CT-3` і зворотній (antisense) - 5`-CTT CCC TAC TGC CCC AAG CT-3`. Ампліфікація фрагменту гена LMP7 складалася з 38 циклів: денатурація - 94С, 1 хв, гібридизація праймерів - 63С, 35 c та елонгація - 74С, 1 хв. |

Рис. 5. Фотографія гелю після електрофорезу фрагменту гена LMP7 при застосуванні рестриктази Mva1269I. M – маркер молекулярної маси (bp - пари нуклеїнових основ), доріжки 1, 2, 4 - 9 відповідають Lys/Lys-генотипу, 3 – Lys/Gln –генотипу.

Для визначення SNP гена LMP7 6 мкл продукту ампліфікації інкубували при 37С протягом 20 годин із 5 ОД рестриктази HindIII (“СибЭнзим”, Росія) або з 2 ОД рестриктази Mva1269I в буфері R+. Більш розповсюджений алельний варіант гена LMP7 с цитозином (розмір ампліфікату - 193 пар основ) розщеплювався рестриктазою HindIII на два фрагменти – 179 та 14 пар основ. У разі заміни цитозину на аденін ампліфікат розрізався рестриктазою Mva1269I на два фрагменти вказаного розміру (рис. 5).

Для визначення інерційно-делеційного поліморфізму 16-го інтрону гена ангіотензин-пертворюючого ферменту використовували пару специфічних праймерів: прямий - 5`-СTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3` та зворотній - 5`-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3`. Програма ампліфікації була наступною: денатурація - 94С (1 хв), гібридизація праймерів - 58С (1 хв) та елонгація - 74С (1 хв), разом 30 циклів Alvarez R. et al., 2001. Отримані ампліфікати розділяли в 1,5 % агарозному гелі (175 V протягом 15 хвилин) в присутності бромистого етидію. За наявності 287 пар основ в 16-му інтроні вказаного гену утворюється ампліфікат більшої молекулярної маси, що повільніше рухається в електричному полі, а при делеції зазначеної кількості пар нуклеїнових основ – утворюється продукт полімеразної ланцюгової реакції меншої молекулярної маси. Якщо в геномі є обидва алелі (І та D) візуалізується дві смужки, що відповідають ампліфікатам фрагментів інтрону гена АПФ у гетерозиготному стані.

Методика сепарації окремих видів клітин крові. Для виділення тромбоцитів венозну кров набирали в стерильних умовах у моновети об’ємом 2,7 мл з калієвою сіллю етилендіамінтетраоцтової кислоти (11.7 мМ) в якості антикоагулянту (“Sarstedt”, Німеччина), а для попередження адгезії та агрегації тромбоцитів використовували апіразу (1 ОД/мл). Після трьох циклів центрифугування тромбоцити ресуспензували в буфері Тіроде наступного складу (137 мМоль NaCl, 12 мМоль NaHCO3, 2 мМоль KCl, 0.34 мМоль Na2HPO4, 1 мМоль MgCl2, 5.5 мМоль глюкози, 5 мМоль HEPES (N-2-гідроксиетилпіперазин-N`-2-етансульфонова кислота), pH 7.3), що містив 0.35% сироваткового альбуміну бика Oury C. et al., 2002. Підрахунок кількості тромбоцитів проводили в камері Горяєва.

Для виділення моноцитів, лімфоцитів та нейтрофільних гранулоцитів стабілізовану венозну кров розводили 0.9% розчином хлористого натрію в співвідношенні 1:1, після чого нашаровували на заздалегідь підготовлений градієнтний розчин перкола, який складався з 4 шарів з відносною густиною 72%, 63%, 54%, 45%. Відмивання клітин від перкола проводилося шляхом центрифугування протягом 5 хв при 800 g (моноцити і лімфоцити) і 850 g (нейтрофільні гранулоцити) з подальшим відбором осаду і його ресуспензуванням в розчині Хенкса. Підрахунок кількості лейкоцитів проводили в камері Горяєва.

Зворотна транскрипція та полімеразна ланцюгова реакція (RT-PCR). Виділення РНК із тромбоцитів та моноцитів проводили із використанням набору Trizol RNA-prep (Isogen, Росія) для виділення тотальної РНК. Для оцінки експресії гена eNOS в тромбоцитах проводили зворотну транскрипцію із використанням RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва), застосовуючи 500 нг загальної РНК та олігомерний (dT)18 праймер. Отриману одноланцюгову ДНК використовували як матрицю для полімеразної ланцюгової реакції із застосуванням наступної пари праймерів: прямий - 5`-TCC CTG AGG AGG GCA GGC-3` та зворотній - 5`-TGA GGG TCA CAC AGG TTC CT-3`. Ампліфікація фрагменту 7-го екзону гена eNOS складалася з 35 циклів: денатурація - 94С, 1 хв, приєднання праймерів - 64С, 1 хв і елонгація - 74С, 1 хв. Для контролю за якістю виділення РНК та порівняння інтенсивності експресії гену еNOS паралельно ампліфікували фрагмент гену -актину – одного із house-keeping генів Шsterbш R. et al., 2003.

Для оцінки експресії генів LMP2 та LMP7 в моноцитах також проводили зворотну транскрипцію проводили із використанням RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва), застосовуючи 300 нг загальної РНК та олігомерний (dT)18 праймер. Отриману одноланцюгову ДНК використовували для полімеразної ланцюгової реакції (PCR) із застосуванням наступних пар праймерів: 5'-CTT GAA CCA GGG AGG CGA AGT TTG-3' і - 5'-CAG CTG AAC CAG AGA GTG CAT AGT-3' (для оцінки експресії LMP2) та 5'-СGG ACA GAT CTC TGG GTG CT-3' і 5'-CTT CCC TAC TGC CCC AAG CT-3' (для оцінки експресії LMP7). Ампліфікація фрагментів генів складалася з 38 циклів: денатурація - 94С, 1 хв, приєднання праймерів - 63С, 1 хв і елонгація - 74С, 1 хв. Для контролю за якістю виділення РНК та порівняння інтенсивності експресії генів імунопротеасоми паралельно ампліфікували фрагмент гену -актину.

Біохімічні дослідження. Для визначення активності eNOS використовували флуориметричну детекційну систему (FCANOS-1, Sigma), в основу якої покладено принцип флуоресценції триазолофлуоресцеїна, що утворюється після взаємодії NO з 4,5-діамінофлуоресцеїном, який, в свою чергу, утворюється з 4,5-діамінофлуоресцеїна діацетату (DAF-2А) під дією внутрішньоклітинних естераз. Довжина хвиль збудження/поглинання становила 492/515 нм. Інгібітор NOS діфеніленйодоній хлорид (100 мкМоль) пригнічував реакцію, що підтверджувало специфічність вимірювання активності NOS. Активність ферменту виражали в одиницях флуоресценції (UF) за хв на 106 клітин.

Протеолітичну активність протеасоми (хімотрипсиноподібну, трипсиноподібну та пептидилглютамил пептидгідролазну) в клітинах крові визначали за інтенсивністю гідролізу специфічних флуорогенних субстратів - сукциніл-лейцин-лейцин-валін-тирозин-7-амідо-4-метилкумарину (LLVT-AMC), бoк-лейцин-серин-треонін-аргінін-7-амідо-4-метилкумарину (LSTA-AMC) та CBZ-Leu-Leu-Glu-7-амідо-4-метилкумарин (LLG-AMC) відповідно (спектрофлуориметр Hіtachі-4000). Довжина хвилі збудження/емісії (Ex/Em) становила 360/440. При визначенні активності протеасоми в моноцитах після преінкубації із субстратом протягом 1 хвилини при температурі 37°С до проби (300 мкл) додавали 3 мкл сапоніну (10 мг/мл) для пермеабілізації клітинних мембран. Гідроліз субстрату спостерігався тільки після додавання сапоніну. Реакційний буфер (0.025 М Трис HCl, pН 7.5) для визначення протеолітичної активності протеасоми містив у кінцевій концентрації 6 мкМ LLVT-AMC, або LSTA-AMC, або LLG-AMC. Для підтвердження специфічності протеасомного гідролізу використовували селективний інгібітор протеасоми - класто-лактацистин бета-лактон у концентрації 5 мкМ. Відсоток пригнічення активності гідролізу відповідних субстратів під дією зазначених інгібіторів трактували як активність протеасоми і виражали в нМ 7-аміно-4-метилкумарину на 106 клітин за 1 хв. Активність протеасоми в ізольованих кардіоміоцитах щура визначалася наступним чином: клітини диспергували за допомогою скребка та озвучували з максимальною інтенсивністю протягом трьох хвилин за використання ультразвукового диспергатору УЗДН А. Нелізовані клітини та ядра клітин видалялися центрифугуванням при 3000 g протягом 10 хв. Супернатант інкубували в буфері наступного складу: 25 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 1 мМ дитіотреїтола и 6 мкМ відповідного флуорогенного субстрату. Через 30 хв (для трипсиноподібної активності) або за 60 хв (для інших типів активності) інкубації з 6 мкМ відповідних флуорогенних субстратів проводилася реєстрація флуоресценції продуктів гідролізу (довжина хвилі збудження/еміссії - 360/440) з використанням вільного 7-аміно-4-метилкумарину як стандарту.

Для визначення РНК-азної активності протеасоми виділяли РНК з міокарда лівого шлуночка мишей та щурів за допомогою набору Trizol RNA-Prep (“Isogene”, Росія). 150-200 нг тотальної РНК змішували з протеасомною фракцією ІІ (PF II) в концентрації – 0.25 мг/мл або з комбінацією двох рибонуклеаз (RNase A/T1 Mix, “Fermentas”, Литва). Концентрація рибонуклеази А в пробі становила 0.12 мг/мл, а рибонуклеази Т1 – 1.5 ОД. Специфічний інгібітор протеасоми класто-лактацистин -лактон (4 мкМ) додавали або безпосередньо перед інкубацією, або за 2 години до додавання РНК. В окремих дослідах для попередження деградації РНК додавали в проби олігонуклеотид 5`-GTG CCT TTG GGC TCC TCC AAG GTG-3` (концентрація - 0.26 мкг/мкл), що відповідає послідовності нуклеотидів в РНК індуцибельної NO-синтази (iNOS). Об’єм проб доводили до 5 мкл деіонізованою водою.

Таблиця 1.

Послідовність нуклеотидів у праймерах, температура їх гібридизації, та розмір ампліфікатів генів (в парах нуклеїнових основ) специфічних для серця миші актину, легких ланцюгів міозину та генів різних ізоформ NO-синтази щура . et al., 2001; Rudnicki M.A. et al., 1990.

Ген | Праймери | TєC гібриди-зації | Розмір ампліфікату, пар основ

Актин | прямий - 5`-tgt tac gtc gcc ttg gat ttt gag-3`,

зворотній - 5`-aag aga gag aca tat cag aag c-3` | 63єC | 300 п.о.

Легкі ланцюги міозину | прямий - 5`-gcc aag aag cgg ata gaa g-3`,

зворотній - 5`-ctg tgg ttc agg gct cag tc-3` | 63єC | 300 п.о.

iNOS | прямий – 5`-gga gga cca cct cta tca gga ag -3`

зворотній -5`-gtg cct ttg ggc tcc tcc aag gtg-3` | 58.5єC | 361 п.о.

eNOS | прямий – 5`-gct gcg gcg cct gga aag aa-3`

зворотній - 5`-gcc cat gca cgg aca gca gca caat-3` | 58.5єC | 437 п.о.

nNOS | прямий - 5`-gaa ctg gga ggg gag agg att ctg-3`

зворотній-5`-cac gag gtc ctc gtg gtt gcc gg -3` | 58.5єC | 398 п.о.

У подальшому усі проби інкубували протягом 60 хв при 36С, а після цього проводили зворотну транскрипцію за використання RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (“Fermentas”, Литва) із застосуванням випадкового гексамерного (random hexamer) праймера. В окремих дослідах для виключення можливості протеасомної деградації зворотної транскриптази PF II додавали безпосередньо перед проведенням зворотної транскрипції. Отриману одноланцюгову ДНК використовували як матрицю у полімеразній ланцюговій реакції (PCR) для ампліфікації фрагментів генів, що кодують специфічні для сердця миші актин і легкі ланцюги міозину, а також генів, що кодують NO-синтази щура - ендотеліальну, індуцибельну та нейрональну (nNOS). Гени актину та легких ланцюгів міозину було обрано з огляду на високий рівень їх експресії в клітинах серця. Інформацію про послідовність нуклеотидів в праймерах, температуру їх гібридизації та розмір ампліфікатів в парах основ (п.о.) наведено в табл. 1.

Для визначення впливу протеасомного протеолізу на активність еNOS в ізольованих тромбоцитах застосовували протеасомну фракцію ІІ (PF II) з ретикулоцитів кроля (Sigma). Вказана фракція містить ферменти, що беруть участь в убіквітинізації (Е1, Е2), 20S і 26S протеасому. Таким чином, за наявності убіквітину і АТФ будь-який білок кроля, який може підлягати убіквітин-залежному протеасомному протеолізу, після взаємодії з PF II повинен руйнуватися за участі протеасоми. Тромбоцити (7 – 7,5 х 106) виділяли як вказано вище, озвучували з максимальною інтенсивністю протягом трьох хвилин за допомогою ультразвукового диспергатору УЗДН А та інкубували з PF II (концентрація – 0,5 мг/мл) при 36єС протягом 60 хв. В окремих дослідах інтактні тромбоцити піддавали впливу Н2О2 (1 мМ) протягом 30 хв, після чого клітини осаджували центрифугуванням (900 g), видаляли супернатант і ресуспензували в буфері Тіроде. Далі проводили інкубацію з PF II аналогічно до описаного вище. Для вивчення специфічності дії PF II використовували метильований убіквітин (8 мкМ), який приєднуючись до білка, попереджує утворення поліубіквітинового ланцюжка, та інгібітор протеасоми – класто-лактацистин -лактон (20 мкМ). Також проводилися експерименти з визначення впливу різних концентрацій (10 та 20 мкМ) класто-лактацистин -лактону, MG132 (20 мкМ) та кверцетину (20 мкМ) на активність еNOS у неозвучених тромбоцитах. Тривалість інкубації становила 60 хв при 36С, після чого визначалася активність еNOS як вказано вище. В контрольні проби додавали відповідний обґєм диметилсульфоксиду – речовини, у якій були розчинені як інгібітори протеасоми, так і кверцетин.

Для дослідження впливу біофлавоноїду кверцетину на пурифіковану 20S протеасому та 26S протеасому з протеасомної фракції ІІ за умов in vitro використовували пурифіковану 20S протеасому (ICN, США) та протеасомну фракцію II (PF II) з ретикулоцитів кроля (Sigma, США). 20S протеасому (2.5 мкг) інкубували протягом 30 хв при 36С з різними концентраціями (5, 10 та 20 мкМ) класто-лактоцистина -лактона або кверцетину, а потім додавали специфічні флуорогенні субстрати для визначення трьох видів активності протеасоми. PF II (2,5 мкг) піддавали впливу вказаних речовин у тій самій концентрації за аналогічних умов з наступним визначенням інтенсивності гідролізу флуорогенних субстратів.

Дослідження впливу протеасомної фракції ІІ на активність рекомбінантної еNOS. Для визначення можливості руйнування протеасомою ендотеліальної NOS було проведено експерименти in vitro із використанням рекомбінантної еNOS бика (Sigma, США) та протеасомної фракції II (Sigma, США). Визначення активності еNOS проводили із використанням 4,5-діамінофлуоресцеїна діацетату (DAF-2А) (Sigma, США) в 50 мМ HEPES буфері (pH 7.4), що містив наступні компоненти: оксигемоглобін (5 мкМ), хлорид кальцію (1 мМ), кальмодулін (20 мкг/мл), НАДФН (0.1 мМ), L-аргінін (50 мкМ), тетрагідробіоптерин (12 мкМ) та дітіотреїтол (170 мкМ). Перед визначенням активності еNOS фермент (0.5 ОД) піддавали протягом 20 хвилин дії протеасомної фракції II (концентрація – 0,5 мг/мл) в 50 мМ HEPES буфері (pH 7.4) із додаванням дітіотреїтолу (170 мкМ). Після цього визначали активність рекомбінантної еNOS бика за інтенсивністю флуоресценції через 10 хвилин після додавання DAF-2А (8 мкМ). Довжина хвиль збудження/поглинання становила 492/515 нм. Активність ферменту виражали в одиницях флуоресценції (UF) за 1 хв. Інгібітор NOS діфеніленйодоній хлорид (50 мкМоль) пригнічував реакцію, що підтверджувало специфічність вимірювання активності NOS. Для вивчення залежності деградації еNOS від формування поліубіквитінового ланцюжка використовували метильований убіквітин (8 мкМ), а для доведення ролі активної протеасоми в цьому процесі застосовували інгібітор протеасоми – MG132 (10 мкМ).

Методика виділення та культивування неонатальних кардіоміоцитів щура. Неонатальні кардіоміоцити отримували з міокарду шлуночків дводенних щурів шляхом ферментативного гідролізу за Reinecke H. et al. (1999) із модифікаціями. Шлуночки відокремлювалися від передсердь, механічно подрібнювалися ножицями, а отримані шматочки міокарда розміром 1-2 мм3 переносили у буферний сольовий розчин (рН 7.4) наступного складу: HEPES - 20 мM/л, KCl - 5.4 мM/л, NaCl - 116.4 мM/л, глюкоза - 5.5 мM/л, Na2HPO4 - 0.4 мM/л та K2HPO4 - 0.4 мM/л, що містив колагеназу ІІ типу (95 ОД/мл) та панкреатин (0.6 мг/мл). Розчин попередньо оксигенувався карбогеном. Кількість живих та загиблих клітин визначалася за допомогою методу виключення 0.2 % розчину трипанового синього і становила 85-95 % та 5-15 % відповідно. Клітини розміщували на скельця із щільністю 120 000 на 1 см2. Культивування проводилося при 37С у газовому середовищі - 5% СО2 та 95% атмосферного повітря протягом 1 - 2 діб. Живильне середовище складалося з наступних інгредієнтів: середовище Ігла в модифікації Дюльбекко (DMEM), середовище 199 (співвідношення DMEM/199 - 4 : 1), теляча сироватка - 15%, Na2СО3 - 4.2 мМ/л, HEPES - 15 мМ/л та антибіотики (стрептоміцин – 100 мкг/мл, гентаміцин – 0.05 мг/мл, пеніцилін – 100 ОД/мл).

Моделювання аноксії-реоксигенації в культурі неонатальних кардіоміоцитів щура. Аноксія-реоксигенація моделювалася шляхом подачі до клітин безкисневої газової суміші 5% СО2 та 95% Ar протягом 30 хвилин із наступною заміною живильного середовища та культивуванням клітин за вихідних умов (5% СО2 та 95% атмосферного повітря) протягом 60 хвилин. Аргон використовувався як інертний газ для виключення можливості біологічного впливу азоту на культуру клітин.

Визначення різних видів клітинної смерті кардіоміоцитів при моделюванні аноксії-реоксигенації неонатальних кардіоміоцитів. Кількість живих, некротичних та апоптотичних клітин оцінювали цитологічно за допомогою забарвлення кардіоміоцитів біс-бензимідом (Hoeсhst 33342) та пропідіум йодидом в однаковій концентрації 8.75 мкМ/л. Перший з них проникає через непошкоджену мембрану клітин і забарвлює ядерний хроматин, візуалізуючи таким чином, живі та апоптотичні клітини (останні мають фрагментовані та пікнотичні ядра). Пропідіум йодид не здатен проникати через плазматичну мембрану і забарвлює лише ядра клітин з пошкодженою плазмолемою, тобто некротичних. Для виявлення аутофагічних вакуолей застосовували специфічний барвник – монодансилкадаверин в концентрації 50 мкМ (прижиттєве забарвлення клітин). Специфічність забарвлення підтверджували із застосуванням інгібітору аутофагії – N-3-метиладеніну (100 мМ). Дані флуоресцентної мікроскопії по визначенню різних видів клітинної смерті кардіоміоцитів також підтверджували із використанням електронної мікроскопії.

Дослідження впливу інгібіторів протеасоми та біофлавоноїдів на співвідношення живих, некротичних, апоптотичних та аутофагічних кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації. Інтактні кардіоміоцити піддавали впливу різних концентрацій