ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ                                                                                                  

ГЛУШАКОВ ОЛЕКСАНДР ВІКТОРОВИЧ

УДК .839.3:612.822:615.015.44

АТФ_ІНДУКОВАНІ СТРУМИ В НЕЙРОНАХ ПІДСЛИЗОВОГО СПЛЕТІННЯ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА МОРСЬКОЇ СВИНКИ

03.00.02_біофизика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

КИЇВ _ 9

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Науковий керівник– академік НАН України, доктор біологічних наук, професор Скок Володимир Іванович, зав. відділом фізіології вегетативної нервової системи, Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти:

1. академік НАН України, доктор медичних наук, професор Шуба Михайло Федорович; зав. відділом нервово-м`язевої фізіології, Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

2. кандидат біологічних наук Войтенко Нана Володимирівна, ст. науковий співробітник Міжнародного Центру молекулярної фізіології.

Провідна установа:

Інститут фізіології при Національному університеті ім. Тараса Шевченка.

Захист відбудеться “  ”  червня   р. на засідані вченої ради Д_26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 252024 м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Автореферат розісланий “ 20 ”  квітня   р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Сучасні дослідження показують, що аденозин 5`_трифосфат (АТФ) приймає участь у міжклітинній сигналізації, що здійснюється в результаті активації специфічних Р2_пуринорецепторів, які за функціональними ознаками розділяють на дві основні групи_іонотропні (Р2Х), які безпосередньо зв’язані з іонним каналом і метаботропні (P2Y), біологічні ефекти яких здійснюються за участю ГТФ_зв`язуючих протеїнів (G_білків) (Abbracchio and Burnstock, 1994). Внаслідок активації постсинаптичних Р2_пуринорецепторів, АТФ може брати участь у “швидкій” синаптичній передачі, виступаючи в ролі збуджуючого передавача на багатьох об’єктах, у тому числі в міжнейрональних синапсах центральної (Edwards et al., 1992) та вегетативної нервової системи (Evans et al., 1992; Sylinsky et al., 1992; Galligan and Bertrand, 1994; LePard et al., 1997). Крім того, АТФ може впливати на функціонування інших синаптичних рецепторів, зокрема нікотинових холінорецепторів (НХР), при чому модуляторний ефект здійснюється, або в результаті безпосередньої взаємодії АТФ з НХР (Igusa, 1988; Mozrzymas and Ruzzier, 1992; Nakazawa and Igusa, 1993; Nakazawa, 1994a), або через систему вторинних посередників (Lu and Smith, 1991; Nakazawa, 1994b).

У нейронах інтрамуральних гангліїв кишечника достатньо добре вивчено роль НХР у швидкій збуджуючій синаптичній передачі. Дослідження останніх років дають вагомі підстави розглядати АТФ в якості швидкого збуджуючого нейропередавача в цих гангліях. Відомо, що АТФ може виділятися з ентеральних нейронів у фізіологічних умовах (White, 1982, 1988; White and Leslie, 1982; Burnstock 1972, 1981) і, з іншого боку, АТФ викликає вхідні трансмембранні струми в поодиноких нейронах у результаті активації неселективних іонних каналів, що керуються Р2_пуринорецепторами (Bertrand and Galligan, 1992; Barajas_Lopes et al., 1993, 1994, 1996; Zhou and Galligan, 1996). Детально вивчені Р2_пуринорецептори в нейронах міентерального сплетіння. Показано участь постсинаптичних Р2_пуринорецепторів у швидкій нехолінергічній синаптичній передачі між даними нейронами (Galligan and Bertrand, 1994; LePard et al., 1997). Пуринорецептори нейронів підслизового сплетіння (ПС) досліджені значно менше, і немає даних про вплив АТФ на НХР.

Мета роботи полягала у вивченні електрофізіологічних і фармакологічних властивостей пуринорецепторів нейронів ПС тонкого кишечника морської свинки, а також вивчення дії АТФ на струми НХР.

Головні завдання.

1. Дослідити механізми активації Р2_пуринорецепторів ПС з боку АТФ та вплив мембранного потенціалу та дози АТФ на АТФ_індуковані струми.

2. Дослідити дію селективних агоністів та антагоністів на Р2_пуринорецептори ПС.

3. Дослідити дію класичних блокаторів НХР на АТФ-індуковані струми ПС.

4. Вивчити вплив АТФ та інших агоністів пуринорецепторів на струми НХР.

Наукова новизна. У нейронах ПС методом фіксації потенціалу петч_клемп у конфігурації “ціла клітина” досліджені АТФ-індуковані струми. Вперше показано наявність у даних нейронах двох типів іонотропних Р2_пуринорецепторів— з швидкою та повільною десенситизацією. Вперше для даних нейронів методом петч_клемп зареєстровані повільні вхідні К+_струми, які виникають внаслідок активації Р2Y_пуринорецепторів, що зв`язані з G_білками. Вивчено дію на АТФ-індуковані струми блокаторів Р2_пуринорецепторів сураміну та реактиву синього 2, а також класичних блокаторів НХР триметафану, гексаметонію та d_тубокурарину. Вперше зареєстровано ефект пригнічення АХ-індукованих струмів (АХ-індукованих струмів) АТФ, який не пов’язаний із взаємодією АТФ безпосередньо НХР. Висунуто припущення, що пуринорецептори та НХР функціонують у взаємному зв’язку. Результати роботи дозволяють припустити, що АТФ може приймати участь у синаптичній передачі в якості швидкого збуджуючого нейропередавача в більшості нейронів ПС, а також у деяких нейронах може діяти як повільний гальмівний передавач.

Теоретичне та практичне значення роботи. Результати досліджень представляють інтерес для біофізиків, фізіологів та фармакологів, оскільки дають нову інформацію про фунціонування Р2_пуринорецепторів та НХР, що лежать в основі міжнейронної синаптичної передачі в ПС і можуть бути використані для дослідження механізмів дії фармакологічних препаратів, що використовуються для лікування захворювань шлунково_кишкового тракту.

Особистий внесок здобувача в розробку наукових результатів.:

1. Встановлено існування двох типів іонотропних Р2Х_пуринорецепторів, а також метаботропних Р2Y-пуринорецепторів в нейронах ПС і вивчено механізми активації Р2Х_пуринорецепторів з боку АТФ та їх електрофізіологічні і фармакологічні властивості.

2. Досліджено дію селективних агоністів та антагоністів АТФ і класичних блокаторів НХР на струми, викликані активацією Р2_пуринорецепторів та нікотинових холінорецепторів.

3. Описано зв`язок між Р2Х-пуринорецепторами та НХР.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку літератури з 200 найменувань. Робота викладенна 126 сторінках та містить 25 рисунків і 1 таблицю.

Апробація роботи. Результати досліджень, наведених в дисертаційній роботі, доповідались і обговорювались на семінарах відділу фізіології вегетативної нервової системи, загальноінститутських семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця, на Міжнародній робочій нараді “Внутрішньоклітинна сигналізація” ХХХIII Міжнародного конгресу фізіологічних наук (Київ, 1997) та I Загальноукраїнській конференції по нейронаукам (Київ, 1998). За матеріалами дисертації опубліковано 3 роботи.

Матеріали і методи.

Експерименти проводили на дисоційованих нейронах ПС тонкого кишечника морської свинки. Тварин незалежно від статі вагою 200_г вбивали зміщенням шийних хребців без анестезії і швидко обезкровлювали розрізанням головних шийних кровеносних судин. Сегмент (2_см в довжину) клубової кишки відрізали на відстані 15_см від ілео_цекального сфінктера, переносили в нормальний зовнішньклітинний розчин і розрізали уздовж осі. Видаляли слизову оболонку, а потім відділяли підслизову оболонку від прошарку повздовжніх м`язів. Ізольовану підслизову оболонку занурювали в розчин колагенази (2 мг/мл, Sigma, тип 1A) і трипсину (0.2 мг/мл, Boeringer Mannheim), приготованому на безкальцієвому і безмагнієвому зовнішньоклітинному розчині, і витримували при температурі 37C від 20 до 40 хв. при періодичному піпетуванні. Зовнішньоклітинний розчин мав слідуючий склад (в ммоль/л): NaCl, 164; KCl, 4; MgCl2, 1; CaCl2, 1; MOPS (3_морфоліно]пропансульфонова кислота), 5; глюкоза, 11 (значення pH 7.4 встановлювали за допомогою титрування NaOH).

Трансембранні струми реєстрували за допомогою методики петч_клемп у стандартній конфігурації “ціла клітина” і у модифікованій- “perforated”. Мікропіпетки для реєстрації, заповнені внутрішньоклітинним розчином, мали опір 3_Ом. Внутрішньоклітинний розчин мав слідуючий склад (в ммоль/л): К_глюконат, 144; CsF, 1; CaCl2, 1; MgCl2, 1; EGTA, 11; HEPES, 5 (значення pH 7.4 встановлювали за допомогою титрування КOH). В ряді експериментів для усуненя калієвих провідностей К_глюконат заміщували Сs_глутаматом або NaCl в еквімолярній концентрації. В частині експериментів у внутрішньоклітинні розчини добавляли Na2ATP (або МgАТФ) у концентрації 2 ммоль/л і Na2ГТФ (або Li4ГТФS) у концентрації 0.2 ммоль/л. Для проведення експериментів за допомогою методики “perforated” у внутрішньоклітинний розчин добавляли вихідний розчин ністатіну до кінцевої концентрації  мкг/мл.

Аплікації агоністів і антагоністів проводили за допомогою локальної швидко_струмінної системи з двох спарених трубочок. Кінчик подвійної трубочки був розміщений на відстані 30_ мкм від клітини. Нормальний зовнішньоклітинний розчин і розчин, що містив досліджувану речовину витікли з різних трубочок (діаметр кінчика близько  мкм). Клітина постійно знаходилась у потоці нормального розчину. Заміну розчинів проводили зміщуючи систему так, щоб клітина опинялась у потоці розчину, що містив досліджувану речовину. В ряді експериментів АТФ та ацетилхолін аплікували іонофоретично через скляні мікроелектроди, заповнені розчинами Na2АТФ (0.5 моль/л) та ацетилхолін_хлориду (0.5_ моль/л), а інші речовини аплікували через перфузійний розчин.

РЕЗУЛЬТАТИ

Дію екзогенного АТФ було досліджено на 146 нейронах ПС тонкого кишечника морської свинки у таких серіях експериментів.

Загальна характеристика струмів, викликаних аплікаціями АТФ.

При потенціалі на мембрані _мВ аплікація АТФ у концентрації 100 мкмоль/л через перфузуючий розчин викликала вхідний струм з амплітудою в декілька сотень пікоампер в 56 з 82 (68%) досліджених нейронів. При використанні швидкої аплікації АТФ під тиском або іонофоретичної аплікації майже всі досліджені нейрони (56 з 58 досліджених нейронів) відповідали появою вхідного струму з швидким наростанням. При таких способах аплікації в деяких нейронах спостерігались повільні вихідні струми.

У більшості нейронів спостерігались відповіді на аплікації як АТФ, так і ацетилхоліну (104 з 146 досліджених) , але траплялись нейрони, що відповідали тільки на ацетилхолін (30 з 146) або тільки на АТФ (8 з 146), або не відповідали на аплікації жодного із даних реагентів (4 з 146). АТФ_та АХ-індуковані струми спостерігались незалежно від того, були присутні чи ні у внутрішньоклітинному розчині АТФ (2 ммоль/л) та гуанозин 5`_трифосфат (ГТФ) (0.2 ммоль/л), або ГТФ був заміщений гуанозин 5`_О_тіотрифосфатом в еквімолярній концентрації) при застосуванні стандартної методики петч–клемп у конфігурації “ціла клітина”, або при застосуванні модифікованої методики “perforated patch”. У всіх випадках при аплікаціях тривалістю 1_ с з інтервалами 2_ хв. амплітуда АТФ_і АХ-індукованих струмів, залишалась на однакому рівні протягом 1_годин.

Два типи струмів, що швидко наростають. При використанні аплікації АТФ під тиском спостерігались два типи відповідей, які відрізнялись між собою кінетікою наростання струму та рівнем десенситизації залучених рецепторів (Рис.1А,Б). АТФ-індуковані струми виникали внаслідок підвищення провідності мембрани. Відповіді першого типу (Рис.1A) спостерігались у 29 з 32 досліджених нейронів. Затримка між включенням аплікації та початком струму складала не більш ніж 50 мс при аплікації під тиском і близько 30 мс при використанні іонофоретичної аплікації і була такою ж, як і для АХ-індукованих струмів (Рис.1В). При повторній аплікації струми такої ж амплітуди спостерігалісь через 20_ с від попередньої аплікації при тривалості аплікацій 2_10 с.

Відповіді другого типу (Рис.1Б) спостерігалісь у 3 з 32 досліджених нейронів. АТФ-індуковані струми мали таку ж затримку від моменту включення аплікації до початку активації струму, як і в попередньому випадку. Максимального значення АТФ-індукований струм набував через |

АТФ | АТФ

А | Б

В | Г

Рис.1 Два типи вхідних АТФ-індукованих струмів. (Пояснення в тексті).

менш ніж 100 мс від його початку, і цей час був менший, ніж для АХ-індукованих струмів (Рис.1Г). Десенситизація пуринорецепторів ніяк не впливала на АХ-індуковані струми . Аплікація ацетилхоліну (100 мкмоль/л) одразу після аплікації АТФ (50 мкмоль/л), при інтервалі між аплікаціями менше 20 с викликала струми такі ж, як і в контролі (струми, отримані перед і після аплікацій АТФ (50–100 мкмоль/л) з інтервалами між аплікаціями в кілька хв. ), у той час коли, у випадку парних аплікацій АТФ (50 мкмоль/л) тривалістю 1 с з таким же інтервалом між аплікаціями, друга аплікація не викликала появи струму. Для повного відновлення амплітуди АТФ-індукованого струму при парних аплікаціях тривалістю 1 с було потрібно не менше 3_ хв.

Повільні вихідні АТФ-індуковані струми . При іонофоретичних аплікаціях АТФ тривалістю декілька секунд і при використанні калієвого внутрішньоклітинного розчину, крім швидких деполяризуючих струмів у 3 нейронах з 26 досліджених спостерігались вихідні струми з повільною активацією та повільною інактивацією. Вихідний струм спостерігали через кілька секунд від початку аплікації АТФ (Рис.2А). У випадку парних аплікацій АТФ, коли друга аплікація відбувалася на фоні повільного вихідного струму, амплітуда сумарної відповіді дорівнювала алгебраїчній сумі значень вхідного і вихідного струмів (Рис.2Б). Вихідний струм, який виникав після другої аплікації, мав таку ж величину, як і після попередньої. Амплітуда повільних АТФ-індукованих струмів поступово зменшувалась під час реєстрації, тобто спостерігався так званий ефект “rundown”. Повільний вихідний струм повністю зникав через 40–50 хв. від моменту встановлення конфігурації ”ціла клітина”, і цей процес значно прискорювався, коли внутрішньоклітинний розчин не містив АТФ і ГТФ. У таких умовах генерація вихідного струму припинялась вже через 5–7 хв. від початку реєстрації.

Рис.2 Повільний вихідний АТФ_індукований струм.

А _запис струму, викликаного іонофоретичною аплікацією АТФ. Б _АТФ-індуковані струми, викликані парною аплікацією АТФ.

Концентраційна залежність вхідних АТФ-індукованих струмів. Концентраційну залежність вивчали шляхом аплікації АТФ у діапазоні концентрацій 1_ мкмоль/л до тієї ж самої клітини при потенціалі на мембрані _мВ. Аналіз концентраційної залежності показав, що доза, яка викликає напівмаксимальну відповідь (ЕС50), дорівнює 45.7±3.5 мкмоль/л (з графіка Лайнуівера_Берка). Коєфіцієнт Хілла складав в середньому (з графіка Хілла).

Потенціалозалежність вхідних АТФ-індукованих струмів. Залежність амплітуди АТФ-індукованого струму від потенціалу на мембрані визначали шляхом аплікацій АТФ тривалістю 1_ с у концентраціях 50 мкмоль/л та 1 ммоль/л при підтримуваних мембранних потенціалах необхідної величини; інтервали між аплікаціями становили 90 с. Для усунення активації калієвих провідностей при позитивних мембранних потенціалах у дослідах використовували внутрішньоклітинний розчин, основим катіоном в якому був Cs+. Потенціал реверсії АТФ-індукованого струму залежав від концентрації АТФ і мав значення відповідно 16.7±2.7) і 27.5±3.3) при концентраціях АТФ _50 мкмоль/л і 1 ммоль/л. В області позитивних потенціалів нахил графіків вольт_амперної залежності зменшувався, що нагадувало так званий ефект випрямлення, властивий нейрональним НХР. При позитивних потенціалах спостерігався незначний вихідний АТФ-індукований струм. Аплікації ацетилхоліну (50_ мкмоль/л) при позитивних потенціалах не викликали появи струму.

Ефект двовалентних катіонів. Вилучення із зовнішньоклітинного розчину двовалентних катіоннів Са2+ та Mg2+ призводило до збільшення АТФ-індукованого струмуу, і середня амплітуда струму в цьому випадку складала 117±6%) від контрольного значення. Той факт, що АТФ_індуковані струми спостерігаються, коли клітини знаходяться в розчині, де відсутні двовалентні катіони говорить про те, що дані струми виникають за рахунок взаємодії з рецептором АТФ у формі аніона, а не комплексу MgАТФ або СаАТФ.

Eфекти структурних аналогів АТФ.

Для визначення підтипу пуринорецепторів було проведено серію експериментів по вивченню дії селективних агоністів та структурних аналогів АТФ.

Аплікації аденозину (100_ мкмоль/л), _Ме_АТФ (100 мкмоль/л), _Ме_АТФ (100 мкмоль/л) і _імідо_АТФ (100_ мкмоль/л) не викликали появи трансмембранних струмів. При аплікації АТФ (100 мкмоль/л) у присутності _Ме_АТФ (100 мкмоль/л) амплітуда АТФ-індукованого струму складала близько 50% контрольного значення). Даний ефект був оборотним. Речовини _Ме_АТФ, _імідо_АТФ і аденозин у цьому аспекті були неактивними. Аплікація -Me-ATP до нейронів з відповідями на АТФ з швидким спадом також викликала вхідні струми. Амплітуда відповіді на -Me-ATФ (100 мкмоль/л) була такою ж, як і у випадку ATФ мкмоль/л). Приведені результати дозволяють висунути припущення, що струми з повільним і швидким спадом викликані в результаті активації різних P2X-пуринорецепторів.

Дія блокаторів Р2_пуринорецепторів.

Блокатор Р2_пуринорецепторів сурамін у концентрації 50_ мкмоль/л з преінкубацією протягом 1_ хв. не виявляв помітного впливу на струми, що були викликані аплікацією АТФ (100 мкмоль/л) через перфузію (Рис.3А), а також на АХ-індуковані струми . При апплікації АТФ під тиском у насичуючій концентрації (200 мкмоль/л) у присутності сураміну (100 мкмоль/л) спостерігався вплив на кінетику активації АТФ-індукованого струму, без помітного впливу на амплітуду струму (Рис.3Б). |

Рис. 3 Дія сураміну на АТФ_струми.

А_відсутність впливу сураміну на струм, викликаний аплікацією АТФ через перфузію; Б– фрагмент АТФ-індукованого струму в присутності та у відсутності сураміну (200 мкмоль/л) (позначення біля кривих відповідно “сурамін+” і “сурамін_”).

Блокатор Р2Y_пуринорецепторів реактив синій (30_ мкмоль/л) (Abbracchio and Burnstock, 1994), у випадку преінкубації до 4 хв. оборотно збільшував амплітуду АТФ-індукованого струму в порівнянні з контрольним значенням). Коли реактив синій аплікували одночасно з АТФ, амплітуда струму складала 110_% від контрольного значення. При аплікації реактиву синього у відсутності АТФ активації трансмембранного струму не спостерігалось. При довготривалій (понад 4 хв. ) преінкубації нейронів у розчині реактиву синього спостерігалось поступове зниження амплітуди АТФ-індукованого струму. Через 20 хв. амплітуда АТФ-індукованого струму складала близько 80% контрольного значення. Після відмивання протягом 10_ хв. амплітуда залишалась на такому ж рівні). Реактив синій у вищезгаданних концентраціях оборотно пригнічував ацетилхолінові струми. Амплітуда струму в присутності реактива синього (40 мкмоль/л) складала 61±3% і 58±5% від контрольного значення відповідно у вприсутності та у відсутності АТФ (1 ммоль/л) та ГТФ (0.2 ммоль/л) у внутрішньоклітинному розчині.

Вплив АТФ на АХ-індуковані струми .

При іонофоретичних аплікаціях ацетилхоліну під час аплікації АТФ через перфузію амплітуда сумарного струму (АТФ+АХ-індукованого струму) не перевищувала амплітуди струму, що був викликаний аплікацією тільки ацетилхоліну (Рис.4). |

Рис. 4 АХ-індуковані струми на фоні тривалих аплікацій АТФ в різних коцентраціях.

При аплікаціях ацетилхоліну під час АТФ-індукованого струму, і навпаки, амплітуда сумарного АТФ+АХ-індукованого струму не перевищувала контрольного значення АХ-індукованого струму або АТФ-індукованого струму, в залежності від того, яка величина струму була в момент аплікації другої речовини, інакше кажучи, спостерігалась “оклюзія” струмів. Пригнічення АХ-індукованих струмів АТФ спостерігалось тільки в нейронах, що відповідали на аплікацію АТФ появою струму. У нейронах, які не генерували АТФ-індукованих струмів, АХ-індукований струм у присутності АТФ (100_ мкмоль/л) був таким же, як і в контроліРис.5). У випадку вихідних струмів, що виникають в результаті активації мускаринових холінорецепторів ефекту “оклюзії” не спостерігалось.

Дія структурних аналогів АТФ на АХ-індуковані струми . АХ-індуковані струми , що були викликані аплікаціями ацетилхоліну в присутності _Ме_АТФ (100 мкмоль/л), _Ме_АТФ (100 мкмоль/л), _імідо_АТФ (100_ мкмоль/л), а також аденозину (100_ мкмоль/л), не відрізнялись від АХ-індукованих струмів у контролі, в той час, як при аплікації ацетилхоліну в присутності АТФ (100_ мкмоль/л) спостерігалась “оклюзія” АХ-індукованого струму. Відсутність впливу аденозину свідчить, що ефект “оклюзії” не є наслідком активації аденозинових рецепторів. |

Рис. 5 Відсутність впливу АТФ на АХ-індуковані струми в нейронах, які не генерують струмів у відповідь на аплікацію АТФ.

Залежність пригнічення АХ-індукованих струмів від концентрації АТФ та ацетилхоліну. Амплітуда АТФ+АХ-індукованого струму не залежала від концентрації АТФ і дорівнювала амплітуді АХ-індукованого струму в контролі. У випадку тривалих аплікацій АТФ спостерігалось поступове зменшення амплітуди АТФ-індукованого струму внаслідок десенситизації пуринорецепторів. При аплікаціях ацетилхоліну на фоні АТФ-індукованого струму амплітуда сумарного АТФ+АХ-індукованого струму залишалась на постійному рівні незалежно від амплітуди АТФ_в момент аплікації ацетилхоліну (Рис.4). При аплікації різних доз ацетилхоліну на фоні АТФ-індукованого струму амплітуда сумарних відповідей у всіх випадках не превищувала амлітуди АХ-індукованих струмів, які були викликані відповідними дозами ацетилхоліну у відсутності АТФ (Рис.6). |

Рис. 6 Вплив різних доз ацетилхоліну на пригнічення ацетилхолінового струму АТФ.

Доза ацетилхоліну виражена як величина іонофоретичного струму (показана в дужках в нА). Інтервали між кожними двома аплікаціями ацетилхоліну були приблизно однакові.

Залежність ефекту пригнічення АХ-індукованого струму від відносної величини АТФ_ та АХ-індукованих струмів . Результати, що були описані вище, стосуються випадків, коли амплітуда АТФ-індукованого струму в момент аплікації ацетилхоліну була нижча, ніж амплітуда АХ-індукованого струму в контролі. В таких умовах величина АХ-індукованого струму визначалась різницею між амплітудою АХ-індукованого струму в контролі і величиною АТФ-індукованого струму в момент аплікації ацетилхоліну в більшості нейронів (в деяких нейронах величина АХ-індукованого струму в присутності АТФ була дещо вищою).

У незначної кількості нейронів відповіді на аплікацію АТФ (50_ мкмоль/л) через перфузію перевищували за амплітудою відповіді на іонофоретичні аплікації ацетилхоліну. Такі відповіді спостерігались незалежно від того, який внутрішньоклітинний розчин застосовувався в експерименті: були чи не були присутні у внутрішньоклітинному розчині трифосфати (АТФ (2 ммоль/л) і ГТФ (0.2 ммоль/л)); а також від того, за допомогою якої методики була проведена реєстрація: стандартної методики петч_клемп в конфігурації “ціла клітина” або модифікованої методики “perforated patch”. У таких випадках аплікації ацетилхоліну на фоні АТФ-індукованого струму викликали відповіді, які були значно менші по величині, ніж відповіді в контролі, хоча сумарний АТФ+АХ-індукований струм був вищим, ніж амплітуда струмів, викликаних аплікаціями тільки АТФ або тільки ацетилхоліну.

При одночасній аплікації ацетилхоліну і АТФ під тиском, значення АТФ+АХ-індукованого струму дорівнювало значенню більшого струму, що спостерігався при аплікації тільки ацетилхоліну чи тільки АТФ при різних концентраціях даних речовин.

Вплив реактиву синього на ефект пригнічення АХ-індукованого струму АТФ. Реактив синій викликав підвищення амплітуди АТФ-індукованого струму і часткове пригнічення АХ-індукованого струму (розглянуто вище). При аплікаціях ацетилхоліну на фоні АТФ-індукованого струму в присутності реактиву синього спостерігалось зменшення амплітуди АХ-індукованого струму пропорціонально до величини АТФ-індукованого струму, за контрольне значення приймали амплітуду АХ-індукованого струму в розчині реактиву синього у відсутності АТФ. За величину АТФ-індукованого струму приймали значення струму в момент аплікації ацетилхоліну.

Дія форсколіну на АХ_та АТФ-індуковані струми . Відомо, що фізіологічні ефекти АТФ можуть бути опосередковані активацією або пригніченням аденілат циклази (Sato et al., 1992; Zimmerman, 1994). Було проведено серію експериментів по вивченню можливого впливу внутрішньоклітинного рівня цАМФ на АХ_та АТФ-індуковані струми. Було проведено серію експериментів по вивченню можливого впливу внутрішньоклітинного рівня цАМФ на АХ_і АТФ-індуковані струми. Підвищення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ викликали шляхом преінкубації нейронів протягом 5_ хв. у розчині форсколіну, акти-ватора аденілат циклази (10_ мкмоль/л). Форсколін у вищезазначених концентраціях не мав впливу на струми , що були викликані аплікаціями АТФ (3 нейрони) та ацетилхоліну (7 нейронів).

Дія блокаторів НХР на АТФ-індуковані струми . Оскільки при одночасній аплікації

ацетилхоліну і АТФ амтлітуда сумарного струму не перевищувала значення одного з двох (АХ_або АТФ_індукованих струмів), і не спостерігалось сумації струмів, була розглянута можливість того, що АТФ або безпосередньо активує НХР, або через активацію пуринорецепторів керує іонним каналом НХР. Для перевірки цієї гіпотезу були використані НХР. Триметафан (30 мкмоль/л, n=5)— конкурентний блокатор НХР (Asher et al., 1979; Меліщук, 1993) (Рис.7) та блокатори відкритого іонного каналу гексаметоній (50 мкмоль/л, n=6) (Vanner and Suprenant, 1990; Меліщук, 1993) та |

Рис. 7 Дія триметафану на АТФ_та АХ-індуковані струми.

d_тубокурарин (20_ мкмоль/л, n=4) (Меліщук, 1993) ніяк не впливали на АТФ-індуковані струми (50_ мкмоль/л). У той же час дані блокатори у вищезгаданих концентраціях повністю оборотно блокували АХ-індуковані струми у присутності і у відсутністі АТФ. Відсутність впливу блокаторів НХР на АТФ-індуковані струми показує, що дані струми, а також, “оклюзія” АХ-індукованого струму, не є наслідком активації НХР АТФ або відкрвання іонних каналів НХР в результаті активації пуринорецепторів.

ОБГОВОРЕННЯ.

Дія екзогенного АТФ на нейрони ПС.

Відповіді на аплікації АТФ можна розділити на дві групи – швидкі вхідні катіонні струми та повільні вихідні струми, при чому, у тому ж самому нейроні можуть бути представлені обидва типи відповідей.

Два типи вхідних АТФ-індукованих струмів, що швидко наростають. Відомо, що ацетилхолін є основним швидким збуджуючим передавачем у нейронах ентеральних гангліїв (Wood, 1989). Тому не виключалась можливість. що в нейронах ПС АТФ-індуковані струми виникають у результаті активації НХР. Але, як показали результати експериментів, АТФ-індуковані струми є результатом активації специфічних пуринорецепторів. Ці рецептори відмінні від НХР, тому що: а) АТФ-індуковані струми виникають у відповідь на аплікацію АТФ в умовах, коли НХР знаходяться в десенситизованому стані внаслідок тривалої аплікації ацетилхоліну; б) АТФ-індуковані струми не пригнічуються як конкурентними, так і неконкурентними блокаторами НХР; в) АТФ-індуковані струми і АХ-індуковані струми реверсують при різних потенціалах (в умовах, коли основним внутрішньоклітинним катіоном є Cs+, потенціал реверсії АТФ-індукованого струму складав 27.5±2.5 і 16.7±2.7 мВ в залежності від концентрації АТФ відповідно 50 мкмоль/л і 1 ммоль/л, коли для ацетилхолінового струму потенціал реверсії становив 2.8±1.1 мВ (Меліщук, 1993). г) канали НХР та пуринорецепторів мають різну проникність для катіонів, оскільки при позитивних мембранних потенціалах аплікація ацетилхоліну не викликала появи струму, в той час коли аплікація АТФ викликала вихідні струми амплітудою до 50% амплітуди вихідного АТФ-індукованого струму при мембранному потенціалі _мВ.

Швидка активація цих струмів і незначна затримка між початком аплікації та початком струму, яка була такою ж, як і для АХ-індукованих струмів, говорять про те, що пуринорецептори в нейронах ПС належать до родини йонотропних рецепторів. На користь цього висновку також свідчить стабільність протягом одної_двох годин вхідних АТФ-індукованих струмів, що швидко наростають, у дослідах, що були проведенні з використанням внутрішньоклітинних розчинів, які не містили трифосфатів (АТФ (2 ммоль/л) та ГТФ (0.2 ммоль/л.)) і у випадку заміщення ГТФ на ГТФS. Така стабільність відповідей на дію агоністів характерна для струмів, що виникають у результаті активації йонотропних рецепторів (Derkach et al., 1989).

Два типи вхідних струмів можуть свідчити про існування двох різних підтипів пуринорецепторів. Наші результати можна порівняти з даними, що були отримані на міентеральних нейронах, де також спостерігалось два типи відповідей на АТФ, що мали, як і в нашому випадку, різну десенситизацію, і які крім того, мали різний профіль активності агоністів (Zhou and Galligan, 1996). На основі цих даних більш вірогідним здається існування в нейронах ПС двох різних підтипів Р2X_пуринорецепторів, які є йонотропними рецепторами.

Повільні вихідні АТФ-індуковані струми . Той факт, що повільні вихідні АТФ-індуковані струми спостерігались, після виключення аплікації, коли АТФ був відсутній у зовнішньоклітинному середовищі, свідчить, що генерація даних струмів пов`язана з активністю внутрішньоклітинних вторинних посередників. Такі струми мали місце лише у випадку використання внутрішньоклітинного розчину на основі іонів К+, і їх стабільність у процесі реєстрації залежала від присутності у внутрішньоклітинному розчині АТФ та ГТФ. В експериментах із застосуванням внутрішньоклітинних досліджень в деяких нейронах аплікація АТФ викликала повільну гіперполяризацію внаслідок активації Са2+_залежних К+_каналів (Katayama and Morita, 1989; Barajas-Lopez et al., 1994), і відкривання цих каналів здійснюється за участю G_білків у результаті активації особливих Р2Y_пуринорецепторів Такі рецептори є у частини АН_нейронів ПС (Barajas-Lopez et al., 1994) та міентерального сплетіння (Katayama and Morita, 1989), і відмінні від іонотропних пуринорецепторів, які також присутні в даних нейронах. Порівнюючи результати, які були отримані в даній роботі, з даними, отриманими за допомогою внутрішньоклітинних відведень, можна припустити, що повільні вихідні струми виникають в результаті активації Р2Y_пуринорецепторів, які через активацію G_білків керують Са2+_залежною К+_провідністю. Той факт, що повільні вихідні струми спостерігались лише у незначної частини нейронів, узгоджується з відносно малою долею АН_нейронів у ганліях ПС1984a,b).

Концентраційна залежність АТФ-індукованих струмів

Пуринорицептори нейронів ПС мали чутливість до АТФ, близьку до чутливості пуринорецепторів деяких вегетативних гангліїв, наприклад, верхнього шийного ганглія щура. Пуринорецептори нейронів ПС були менш чутливі до АТФ ніж пуринорецептори нейронів гангліїв дорсальнних корінців (Robertson et al., 1996), симпатичних нейронів жаби_бика (Bean et al., 1990), нейронів вузловатого ганглія щура, сонячного сплетіння морської свинки (Khakh et al., 1995a), сенсорних нейронів щура та кішки (Krishtal et al., 1983) і нейронів спірального органа морської свинки (Nakagawa et al., 1990) ЕC50 для цих об’єктів складала від 2.7 до 12 мкмоль/л. Але пуринорецептори ПС були значно більш чутливі до АТФ, ніж пуринорецептори нейронів центральної нервової системи_трігемінального мезенцефального ядра (ЕС50=437 мкмоль/л).

Ефекти двовалентних катіонів

Підвищення амплітуди АТФ-індукованого струму після вилучення двовалентних катіонів спостерігалось і на інших об`єктах, але цей ефект був більш вагомим, ніж у представлених результатах. На культуральних нейронах інтракардіальних парасимпатичних гангліїв щура спостерігалось двократне збільщення амплітуди АТФ-індукованих струмів після вилучення Са2+ і Mg2+ із зовнішньоклітинного розчину (Fiber and Adams, 1991). Вхідні АТФ-індуковані струми в безкальцієвому зовнішньоклітинному розчині були вищими за струми в нормальному розчині і в зовнішніх волоскових клітинах спірального органа морської свинки (Raybould and Housley, 1997). Пригнічення АТФ-індукованого струму підвищенням зовнішньоклітинної концентрації іонів Са2+ в межах 0.3_ ммоль/л спостерігалось у клітинах, які експресували Р2Х2_пуринорецептори клітин РС12, у той же час, у клітинах які експресували Р2Х1_пуринорецептори міоцитів сечового міхура людини, такого ефекту зареєстровано не було (Evans et al., 1996). Рівень десенситизації пуринорецепторів в сенсорних нейронах, що були експресовані в ооцитах Xenopus laevis, залежав від присутності іонів Са2+ у зовнішньоклітинному розчині (King et al., 1997). Ефект зменшення амплітуди струму в присутності двовалентних катіонів характерний не тільки для пуринорецепторів, а і інших іонотропних рецепторів, зокрема, НХР смугастих м`язів. Цей ефект може бути пояснений більш повільним проходженням двовалентних катіонів у порівнянні з іонами Na+ через неселективний катіонний канал , і в момент проходження двовалентним катіоном канал закритий для проходження Na+, що приводить до зменшення середнього струму через іонний канал. Другий можливий механізм пригнічення струму може полягати в наявності ділянки зв`язування двовалентних катіонів Са2+ або Mg2+ в межах катіонного каналу (Hille, 1984).

Ефекти агоністів та структурних аналогів АТФ.

Той факт, що аплікація аденозину не викликала помітних відповідей, і у той час, аплікація АТФ обумовлювала генерацію трансмембранного струму, говорить про те, що АТФ-індуковані струми виникають у результаті активації пуринорецепторів Р2_підтипу. Відомі агоністи Р2Х_пуринорецепторів _Ме_АТФ та _Ме_АТФ (Khakh et al., 1995b) не викликали струму в концентрації 100 мкмоль/л. Відсутність ефекту (або дуже низька ефективність) при аплікації _Ме_АТФ та _Ме_АТФ характерна для більшості нейрональних пуринорецепторів (Khakh et al., 1995a, 1997; Fieber and Adams, 1991; Allen and Burnstock, 1990; Barajaset al., 1994, 1995; Ueno et al., 1992; Buell et al., 1995; Lewis et al., 1995; Seguela et al.,1996; Soto et al., 1996; Bo et al., 1995). Поясненням зменшення АТФ-індукованого струму в присутності _Ме_АТФ може бути десенситизація популяції пуринорецепторів (Khakh et al., 1995; Fieber and Adams, 1990; Аllen and Burnstock, 1991) або антагоністичний ефект _Ме_АТФ (Khakh et al., 1995).

Ефекти блокаторів Р2_пуринорецепторів.

Неселективний блокатор Р2_пуринорецепторів сурамін у даній роботі не справляв помітного впливу на величину АТФ-індукованих струмів, хоча і прискорював їх наростання. Відсутність блокуючої дії сураміну спостерігалась також і в нейронах міентерального сплетіння, де сурамін, навпаки, підсилював струми, що були викликані аплікацією АТФ (Barajas_Lopez et al., 1993; Barajaset al., 1996)

У нейронах обох ентеральних сплетінь, пiдслизового та мiентерального, дiя сурамiну на АТФндукованi струми вiдрiзнялась вiд його ефектiв на АТФ_керованi iоннi канали iнших об'єктів таких, як гладенькi м'язи (Dunn et al., 1988; Leff et al., 1990; Urbanek et al., 1990), клiтини PC12 (Inoue et al., 1991), нейрони симпатичних (Nakazawa, 1994a; Cloues et al., 1993; Evans et al., 1994; Khakh et al., 1995a) та сенсорних (Li et al., 1993; Li et al., 1997b) ганглiiв, нейронів центральної нервової системи (Inoue et al., 1992; Khakh et al., 1997), а також на рекомбiнантнi рецептори (Seguela et al., 1996).

Блокатор Р2Y_пуринорецепторів реактив синій 2 (Abbracchio and Burnstock, 1994) викликав незначне пригнічення АТФ-індукованого струму лише при тривалій преінкубації (до 20 хв. ) нейронів у розчині блокатора. Коли реактив синій добавляли в розчин разом з АТФ, або аплікацію АТФ проводили після короткотривалої преінкубації нейронів у розчині цього блокатора, спостерігалось помітне підсилення АТФ_відповіді. Подібний ефект реактив синій проявляв на культурі інтракардіальних нейронів морської свинки (Allen and Burnstock, 1991) і нейронах міентерального сплетіння (Barajaset al., 1996). На деяких інших об`єктах реактив синій проявляв блокуючий ефект на АТФ-індуковані струми. Наприклад, у нейронах гангліїв дорсальних корінців жаби_бика (Li et al.,1997) і у культурі нейронів верхнього шийного і вузловатого гангліїв щура та сонячного сплетіння морської свинки (Khakh et al., 1995a).

Сурамін та реактив синій потенціювали відповіді на аплікацію агоністів і в дослідах з експресованими Р2Х2_пуринорецепторами (Bo et al., 1995). Відсутність сильної блокуючої дії реактиву синього на АТФ-індуковані струми в наших експериментах свідчать, що пуринорецептори в нейронах ПС не належать до підтипу_Р2Y.

Пригнічення АХ-індукованих струмів АТФ.

Ефект “оклюзії” спостерігався тільки у випадку струмів, які були викликані в результаті активації НХР. При аплікації АТФ на фоні повільних вихідних струмів, які з`являлись у результаті активації мускаринових холінорецепторів або Р2Y_пуринорецепторів, величина сумарного струму визначалась алгебраїчною сумою цих струмів. Для пояснення “оклюзії” АТФ-індукованих струмів і АХ-індукованих струмів можна припустити або пряму взаємодію АТФ з НХР, або дію АТФ через активацію пуринорецепторів, тобто існує зв`язок між НХР і пуринорецепторами_безпосередній чи через систему вторинних посередників. На деяких об`єктах ефекти АТФ можна пояснити безпосередньою активацією НХР (Nakazawa, 1994a; Nakazawa and Inoue, 1993; Igusa, 1988).

Було проведено серію експериментів для перевірки прямої дії АТФ на НХР і, як показали результати цих досліджень, ефект пригнічення АХ-індукованого струму неможливо пояснити такою взаємодією, а також блокуванням АТФ _пізнаючого центра чи іонного каналу НХР. Доказами відсутності такої взаємодії є: а) відсутність дії болкаторів НХР, як конкурентного— триметафану так і неконкурентних— d_тубокурарину та гексометонію; б) залежність пригнічення АХ-індукованого струму від величини АТФ-індукованого струму в момент аплікації ацетилхоліну, а не від концентрації АТФ; в) відсутність впливу АТФ на АХ-індукований струм у нейронах, що не відповідали на АТФ і відсутність впливу на АХ-індуковані струми неактивних аналогів АТФ. З другого боку, цей ефект неможливо пояснити блокуванням пуринорецепторів ацетилхоліном, оскільки АТФ-індуковані струми в присутності ацетилхоліну, під час тривалих аплікацій, мали таке ж значення, як і в контролі, у той час, коли в результаті десенситизації НХР АХ-індуковані струми не спостерігались.

Не виключена можливість, що ефект пригнічення АХ-індукованого струму АТФ здійснюється у результаті залучення інших рецепторів, які активуються АТФ. В ентеральних нейронах, зокрема у нейронах міентерального сплетіння, присутні метаботропні Р2Y_пуринорецептори, яктивація яких призводить до підвищення внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+; ці рецептори чутливі до блокатора Р2Y_пуринорецепторів реактиву синього 2 (Christofi et al., 1997; Kimball et al., 1996). У нейронах обох ентеральних сплетіннь є аденозинові рецептори. Біологічний ефект активації цих рецепторів зійснюється шляхом активації аденілатциклази і, як наслідок, підвищення внутрішньоклітинного рівня цАМФ (Wood et al., 1985; Barajas1993; Xia et al., 1997). Для перевірки гіпотези про залучення вищезгаданих рецепторів було вивчено вплив реактиву синього на ефект пригнічення АХ-індукованого струму, а також дію аденозину на АХ-індуковані струми . Як показали результати експериментів, припущення про участь цих рецепторів не підтвердилось.

АТФ може здійснювати біологічні ефекти шляхом активації або пригнічення аденілатциклази (Sato et al.,1992). Влив АТФ на НХР за участю вторинних посередників спостерігався в клітинах скелетних м`язів (Lu and Smith, 1991). Для вивчення можливого впливу внутрішньоклітинного рівня цАМФ на швидкі АТФ_та АХ-індуковані струми , було дослідженно дію форсколіну, активатора аденілатциклази (Seamon and Daly, 1981; Kilmer and Garsen, 1984; Laurenza et al., 1989). У представлених результатах форсколін не впливав ні на АХні на АТФ-індуковані струми. Ці дані свідчать, що в регуляцію активності НХР та Р2_пуринорецепторів не включаються механізми за участю цАМФ.

“Оклюзію” АХ-індукованого струму неможливо пояснити дією вторинних посередників, оскільки ефект розвивається за дуже короткий час (менший ніж час наростання АТФ_чи АХ-індукованого струму до пікового значення). Для ефектів, які здійснюються за участю вторинних посередників, потрібний значно більший час. З другого боку, ефект пригнічення залишається незмінним (відсутній “rundown”) в процесі тривалої (1_год) реєстрації петч_клемп у конфігурації “ціла клітина” в умовах, коли у внутрішньоклітинному розчині відсутні АТФ і ГТФ, або присутній ГТФ--S.

Отже, найбільш вірогідним поясненням ефекту “оклюзії” є припущення про існування прямого зв`язку між НХР та Р2_пуринорецепторами. Активація одного рецептора, НХР або Р2_пуринорецептора, робить неактивним інший, або обумовлює закривання іонного каналу, що керується іншим рецептором.

Ефекти блокаторів НХР.

Відсутність дії гексаметонію на АТФ-індуковані струми узгоджується з результатами дослідів на культурі нейронів ПС, що були проведені методом внутрішньоклітинних відведень, де АТФ_індукована деполяризація була резистентною до дії даного блокатора (Barajas Lopez et al., 1994). Відсутність дії блокаторів НХР на АТФ-індуковані струми свідчить, що ці струми не є результатом дії АТФ на нікотинові холінорецептори. У протиположність цьому, на об`єктах, де АТФ безпосередньо активував НХР, АТФ-індуковані струми пригнічувались блокаторами НХР (Igusa, 1988)

Можлива фізіологічна роль пуринорецепторів у нейронах ПС

Припущення про можливу участь АТФ у синаптичній передачі між нейронами ПС підтверджує також той факт, що АТФ може виділятися із ентеральних нервів у фізіологічних умовах (Burnstock 1972, 1981; White, 1982, 1988; White and Leslie, 1982). Присутність іонотропних Р2_пуринорецепторів на мембрані соми нейронів ПС дозволяє припустити, що АТФ може приймати участь у швидкій збуджуючій нехолінергічній передачі в ролі нейропередавача в міжнейрональних синапсах гангліїв ПС. Існування нейронів, які містять пуринорецептори і не містять НХР, дає підстави вважати пуринергічну передачу в цих нейронах основною збуджуючою передачею. На основі отриманих результатів можна припустити, що АТФ також може виконувати роль повільного гальмівного нейропередавача в деяких нейронах (можливо АН_нейронах) гангліїв ПС тонкого кишечника морської свинки.

Порівняння пуринорецепторів нейронів ПС з пуринорецепторами інших об`єктів

Р2X_пуринорецептори, що швидко десенситизуються, по кінетичним характеристикам схожі на клоновані пуринорецептори Р2Х1_та Р2Х3_підтипів, а також на нативні пуринорецептори гладеньких м’язів та сенсорних нейронів (Krishtal et al., 1983; Bean et al., 1990; Bean, 1992), які десенситизуються протягом секунд