ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ІВАНА ФРАНКА

Гринчишин Ірина Володимирівна

УДК 544.653:547.55

СИНТЕЗ ТА ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ПОЛІЛЮМІНОЛУ

02.00.04 ? фізична хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Львів ? 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка

Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: | доктор хімічних наук, професор

Ковальчук Євген Прокопович,

завідувач кафедри фізичної та колоїдної хімії

Львівського національного університету імені Івана Франка. |

Офіційні опоненти: | доктор хімічних наук, доцент

Медведевських Юрій Григорович,

головний науковий співробітник

Відділення фізико-хімії горючих копалин Інституту фізико-органічної хімії і вуглехімії ім. Л.М. Литвиненка НАН України;

доктор хімічних наук, професор

Никипанчук Михайло Васильович,

професор кафедри загальної хімії

Національного університету „Львівська політехніка” |

Провідна установа: | Чернівецький національний університет ім. Ю.Федьковича

Міністерства освіти і науки України, м. Чернівці.

Захист відбудеться “_24_” січня 2007 р. о _16_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .051.10 у Львівському національному університеті ім. І. Франка за адресою:

79005, м. Львів, вул. Кирила і Мефодія, 6, хімічний факультет, ауд. № 2.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Львівського національного університету ім. І. Франка (79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 5).

Автореферат розісланий “__15__” _грудня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 35.051.10 Яремко З.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сучасному етапі розвитку хімічної науки досить велика увага приділяється провідним полімерам зі спряженою системою подвійних зв’язків. Нова генерація полімерів з власною електронною провідністю поєднує електричні та оптичні властивості металів і напівпровідників. Поєднання цих фізико-хімічних властивостей дає можливість використовувати їх в мікроелектроніці, хімічних джерелах струму, в системах запису та зберігання інформації, хімічних сенсорах, електричних дисплеях тощо. У зв’язку з цим актуальним є пошук нових і досконале вивчення властивостей відомих сполук, а також створення на їх основі матриць для сенсорних пристроїв.

Одним з найпоширеніших реагентів, що використовується в практиці аналітичних визначень з середини ХІХ–го століття є 5–аміно–2,3–дигідро–1,4–фталазіндіон (люмінол), який при окисненні інтенсивно випромінює світло. Незважаючи на величезне число досліджень пов’язаних з люмінолом, особливості хімічної активності і механізм перетворень з його участю залишаються нез’ясованими.

Усі без винятку дослідники вважають, що процес окиснення люмінолу відбувається по місцю амідної групи, в наслідок чого утворюється люмінофор – амінофталева кислота у збудженому стані, променева дезактивація якої приводить до випромінювання світла. Однак роль амінної групи в процесі випромінювання при цьому не зрозуміла. З’ясування функції амінної групи в люмінолі вимагає детального дослідження електрохімічного і хімічного окиснення люмінолу та дослідження продуктів, що утворюються в результаті окиснення. З метою реалізації цих завдань необхідно дослідити можливості полімеризації люмінолу і вивчити фізико–хімічні властивості продуктів поліконденсації.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана на кафедрі фізичної та колоїдної хімії Львівського національного університету імені Івана Франка згідно державних науково-технічних програм Міністерства освіти і науки України і є частиною держбюджетних тем ХФ–160Ф “Синтез і фізико-хімічні властивості електроактивних полімерів на основі ароматичних амінів”, номер державної реєстрації 0103U001886 та ХФ–68Ф “Дизайн наноструктурованих платформ для хемо– і біосенсорики” номер державної реєстрації 0106U001307. Автор дисертаційної роботи приймала участь у проведені експериментальних досліджень за тематикою цих тем.

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи є розробка фізико–хімічних основ окиснювальної поліконденсації люмінолу, дослідити структуру продуктів поліконденсації і вивчити їх фізико–хімічні властивості, встановити найбільш ймовірний механізм поліконденсації, дослідити діазотування люмінолу і вивчити структуру продукту діазотування та здійснити іммобілізацію ферментів в полілюмінольних матрицях і створити на їх основі платформи для хемо – та біосенсорів.

Для досягнення мети було необхідно:

· провести електрохімічне та хімічне окиснення люмінолу в кислому середовищі;

· встановити структуру полімерного аддукту методом ІЧ спектроскопії;

· дослідити термічну стійкість і особливості термолізу аддуктів динамічною дериватографією з ІЧ-спектрометричним аналізом газоподібних продуктів;

· дослідити люмінесценцію при електрохімічному відновленні діазотованого люмінолу.

Об’єкт дослідження: хімічний та електрохімічний синтез полілюмінолу і фізико-хімічні властивості продукту поліконденсації.

Предмет дослідження: полілюмінол, продукти діазотування та аддукти окиснення, а також модифіковані полілюмінолом електроди як платформи для біосенсорів.

Методи дослідження: циклічна вольтамперометріяЦВА) – для електрохімічного окиснення мономеру та дослідження його електрохімічної активності і отримання плівок полімеру на поверхні електрода; елементний і спектральний аналіз – для підтвердження структури поліконденсатів та продуктів їх термічного розпаду; термогравіметричний – для визначення термічної стійкості поліконденсатів; електрохемілюмінесцентний – для дослідження інтенсивності випромінювання.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше здійснена окиснювальна конденсація 5–аміно–2,3–дигідро–1,4–фталазіндіону (люмінолу) дією пероксидисульфату амонію (NH4)2S2O8 та йодиду калію KIO3 у змішаних водно–органічних розчинниках. На підставі досліджень хімічного складу термічної стійкості та структури синтезованих аддуктів запропоновано вірогідний механізм окиснення люмінолу. Показано можливість діазотування по місцю аміногрупи люмінолу. Відмічено хемілюмінесцентне свічення в процесі окиснення люмінолу, інтенсивність якого найбільша при окисненні сумішшю пероксидисульфату та пероксиду водню у змішаному водно–2–метил–піролідононовому розчиннику. Досліджено інкорпорацію глюкозопероксидази, уреази та алкогольоксидаз в структуру електрохімічно синтезованого полілюмінолу і сконструйовані ензимні електроди придатні для аналітичного визначення глюкози, карбаміду та аліфатичних спиртів. Показано електрохімічну поведінку біосенсорів та оцінено операційну стабільність ферментних електродів.

Практичне значення одержаних результатів. Досліджено умови синтезу полілюмінолу хімічним окисненням пероксидисульфатом амонію та йодидом калію, обґрунтовано необхідність використання змішаних водно–диметилсульфоксидних і водно–метилпіролідононових розчинників та співвідношення компонентів у вихідній реакційній суміші, що забезпечують оптимальний вихід кінцевого продукту. Розроблено простий і зручний спосіб модифікації платинового і склографітового електродів електрохімічною полімеризацією люмінолу, придатних платформ для іммобілізації глюкозопероксидази, уреази та алкогольоксидаз. Виготовлені ензимні електроди використано для розпізнавання і кількісного визначення карбаміду, глюкози та аліфатичних спиртів в аналітах. Виявлено, що амперометричний глюкозний сенсор характеризується найвищою межею визначення (до 20 мМ глюкози ), а найбільш стабільним є біферментний електрод (протягом 4-х діб).

Особистий внесок автора. Більша частина експерименту виконано автором особисто, а саме: синтез полімерів, діазотування люмінолу, вивчення електрохімічної активності методом ЦВА, конструювання і дослідження амперометричних біосенсорів. Електрохемілюмінесцентні дослідження були проведені за допомогою доц., к.х.н. О.В. Решетняка. Аналіз даних елементного та термогравіметричного аналізу, ІЧ- та КР-спектри, а також дериватографічні вимірювання з ІЧ–спектроскопічним аналізом газоподібних продуктів термолізу були виконані спільно з проф. Є. Блажейовським. Аналіз і обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником проф. Ковальчуком Є.П. Співавторами опублікованих праць по темі дисертації були: проф., д.х.н. Є.П. Ковальчук  науковий керівник; проф., д.х.н. Є. Блажейовський; доц., к.х.н. О.В. Решетняк.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертаційної роботи доповідались на конференціях: 1) VІІ міжнародній науково-практичній конференції “Наука і освіта ”2004” 10-25 лютого 2004р., м. Дніпропетровськ; 2) ІХ науковій конференції “Львівські хімічні читання - 2003” 21-23 травня 2003р., м. Львів; 3) міжнародній конференції “Сучасні проблеми фізичної хімії” 30 серпня –2 вересня 2004р., м. Донецьк; 4) Х науковій конференції “Львівські хімічні читання - 2005” 25-27 травня 2005р., м. Львів та звітних наукових конференціях Львівського національного університету ім. Івана Франка (Львів 2005,2006).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 9 наукових праць, в тому числі 5 статей у фахових наукових журналах і 4 тез наукових конференцій різного рівня, в т.ч. 2 – міжнародних.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота складається із вступу, 5 розділів, висновків, списку використаних джерел (132). Робота викладена на 130 сторінках машинописного тексту, містить 35 рисунків і 8 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність теми досліджень, поставлено мету, визначено завдання досліджень, зазначено новизну та практичне значення отриманих результатів.

В першому розділі представлено огляд літературних даних по хемі– та електрохемілюмінесценції 5-аміно-2,3-дигідро-1,4-фталазіндіону (люмінол) і електрохімічному синтезі люмінолу. Розглянуто властивості полілюмінолу і його практичне застосування в ролі амперометричних біосеносрів. Приділена також увага солям діазонію та механізму діазотування.

У другому розділі зазначені характеристики об’єктів дослідження, методики експеримен-тів та квантово-хімічного розрахунку.

Окиснювальною поліконденсацією у водно-органічному середовищі із застосуванням пероксидисульфату амонію та йодиду калію, як окиснювачів, синтезовано полілюмінол при різному співвідношенні окиснювач/мономер. Структуру полімерних сполук підтверджували за даними елементного аналізу, ІЧ- та КР-спектрами полімерних зразків та продуктів їх термодеструкції.

Елементним аналізом, проведеним на елементному аналізаторі GA 1108 (Carbo Erbo, Italy) в атмосфері аргону (Гданський університет, Польща), визначили відсотковий вміст атомів Карбону, Гідрогену, Нітрогену у структурі поліконденсатів. Відсутність на ІЧ-спектрах досліджуваних сполук смуг поглинання С=N зв’язків свідчить про відсутність хіноїдного типу структур, утворення яких можливе внаслідок окиснення полілюмінолу. Також за результатами ІЧ-спектроскопії можна підвердити наявність у структурі полімерів NH-зв’язків первинних і вторинних амінів.

При електрохімічній окиснювальній поліконденсації люмінолу на поверхні платинового електроду отримано полімерні плівки і досліджено їх електрохімічну активність у водно-огранічному середовищі методом циклічної вольтамперометрії. Термічну стійкість поліконденсатів визначили за результатами термогравіметричного аналізу, який проводили на приладі NETZSCH (модель TG 29) в атмосфері аргону в інтервалі температур 293-873 К (Гданський університет, Польща). Квантово-хімічні розрахунки електронно-просторової будови вихідних сполук, радикальних частинок, продуктів окиснення, поліконденсації, а також їх термодинамічних величин здійснили в рамках напівемпіричного методу PM3, реалізованого в програмному пакеті HYPERCHEM – 7,01.

Сконструйовані амперометричні біосенсори з різною архітектурою досліджувались на стабільність і було оцінено вплив кожного компонента поверхневого шару електрода на його електрохімічну активність.

Третій розділ присвячено дослідженню шляхів хімічної та електрохімічної окиснювальних поліконденсацій люмінолу в водно-органічному середовищі. Запропоновано і обґрунтовано перебіг електрохімічних перетворень у плівках поліконденсатів. Вивчалась також термічна стабільність полілюмінолів синтезованих у різних умовах у співставленні з вихідним люмінолом, аналізувалась природа і швидкість виділення газоподібних продуктів термолізу.

Відомо, що при низьких значеннях електродного потенціалу люмінол зазнає окиснення по місцю фталімідних груп, а при високих – по місцю аміногрупи. Для хімічного синтезу обрано два окисники (NH4)2S2O8 із стандартним значенням редокс-потенціалу 2,05 В і КІО3, стандартний потенціал якого в два рази менший 1,085 В. Внаслідок малої розчинності неорганічних окисників в органічних розчинниках, в яких досить добре розчинний люмінол, використовували змішані водно-органічні розчинники, в яких органічним компонентом були ДМСО, ДМФА, і NMП. Було знайдено, що оптимальне співвідношення компонентів у змішаному розчиннику органічний компонент:вода рівне 9:1 (табл. 1).

Таблиця 1

Залежність виходу люмінолу від природи і кількості компонентів у змішаних водно-органічних розчинах. Співвідношення вода:органічний компонент = 1:9. Температура реакційної суміші 20? С. Тривалість реакції – 24год.

№ п/п | Розчинник | Концентрація люмінолу, моль/л | Концентрація окисника, моль/л | Вихід полілюмінолу, % | (NH4)2S2O81 | N-метилпіролідонон | 0,22 | 0,11 | 26,5 | 2 | ДМФА | 0,22 | 0,11 | 26,9 | 3 | ДМСО | 0,22 | 0,11 | 26,9 | 4 | ДМСO | 0,22 | 0,22 | 27,5 | 5 | ДМСО | 0,22 | 0,33 | 27,8 | 6 | ДМCО | 0,44 | 0,22 | 41,6 | 7 | ДМСО | 0,55 | 0,22 | 42,5 | КІО38 | ДМСО | 0,22 | 0,11 | 5,7 | Вихід продукту поліконденсації люмінолу не залежить від природи розчинника, а визначається співвідношенням мономер:розчинник і пов’язаний з ймовірністю рекомбінації інтермедіатів.

Механізм поліконденсації і структура продукту у двох випадках різні. Структура полі-конденсатів підтверджується за даними елементного аналізу та спектральними дослідженнями (ІЧ, раманівська спектроскопія). Зокрема, найбільш суттєві зміни спостерігаються у високочастотній області ( 2900 – 3500 см-1), де наявні смуги аміногрупи (рис. 1). Для полілюмінолу, синтезованого окисненням (NH4)2S2O8 в ДМСО наявні дві смуги при 3332 і |

Рис. 1. ІЧ спектри люмінолу (а), полілюмінолів одержаних при окисненні (NH4)2S2O8 у Н2О:ДМФА (б), у Н2О:NMП (в) та продукту окиснення люмінолу КІО3 у Н2О:ДМСО (г). Зразки запресовані в КBr. |

3472 см-1, синтезованому за тих же умов у N-метилпіролідононі при 3333 і 3473 см-1. Очевидно, що смуга при 3420 см-1 у люмінолі відповідає коливанню зв'язків N-H в аміногрупі NН2, яка зазнає окиснення (NH4)2S2O8 і в полімері не присутня. Наявні смуги деформаційних коливань NH2-групи при 1628 см-1 і торзійних коливань при 492 см-1 також у полімері відсутні, що теж підтверджує факт окиснення люмінолу по місцю аміногрупи. Заміна окиснювача (NH4)2S2O8 на КІО3 приводить до зміни механізму окиснення, а отже структури продукту, що відображається на ІЧ спектрі полілюмінолу утвореного при цих умовах. Характерно, що вміст вуглецю, азоту і водню мало відрізняється для люмінолів одержаних окисненням (NH4)2S2O8, тоді як у випадку окиснювача КІО3 елементний склад відмінний (табл. 2).

Таблиця 2

Дані елементного аналізу

Зразок | Вміст елементів, % | С | Н | N | О | Люмінол | 54,2354 | 3,9385 | 23,6088 | 18,2173 | Розрахований | 54,2372 | 3,9648 | 23,7342 | 18,0791 | Полілюмінол (8)* | 54,2454 | 3,8816 | 23,6648 | 18,2038 | Полілюмінол (4) | 53,7976 | 3,8398 | 23,3987 | 18,9639 | Полілюмінол (3) | 54,1705 | 3,8258 | 23,4825 | 17,9842 | Полілюмінол (1) | 47,3914 | 3,0773 | 18,3376 | 31,1937 | )*- цифри в дужках означають номери зразків таблиці 1

Трактування цих відмінностей хімічного складу можливе на основі різних механізмів окиснення у цих двох випадках. Окиснення люмінолу КІО3 відбувається по місцю амідних груп, які легше піддаються окисненню. З того, що вміст азоту на 5% менший, можна постулювати втрату атома азоту кожною мономерною ланкою. Правдоподібно прийняти, що в результаті окиснення КІО3 утворюється димер (структура 1). Розрахунок елементного складу для цієї струк–

(1)

(2) | тури дає наступні результати: С – 59,6227; N – 17,3913; Н – 3,1005; О – 19,8757 %. За азотом і воднем спостерігається добре узгодження із результатами аналізу, а вміст вуглецю перевищує на 12%. Редокс потенціал КІО3 очевидно не досяжний для окиснення карбоксильної групи до СО2, оскільки для цього потрібен потенціал вище 2 В. Однак продуктами відновлення КІО3 можуть бути атоми йоду, то вони можуть входити до складу продукту окиснення люмінолу (структура 2). Елементний склад для структури 2 близький до експериментально знайденого (табл. 2). На користь цієї структури вказує наявність смуг поглинання в ІЧ спектрах 567 см-1, 526 і 581 см-1 у спектрах комбінаційного розсіювання. | Окиснення люмінолу (NH4)2S2O8 відбувається по місцю аміногрупи люмінолу і структура утвореного поліконденсату містить мономерні ланки, які майже не відрізняються від структури вихідного люмінолу. На користь цього свідчать дані елементного аналізу, ІЧ і раманівські спектри продуктів окиснення. Окиснення амідних груп люмінолу у присутності (NH4)2S2O8 не відбувається і формула полімеру має наступний вигляд:

При електрохімічній окиснювальній поліконденсації люмінолу у водно-органічному середовищі на поверхні платинового електроду отримані плівки полілюмінолу. Полілюмінол окиснюється при потенціалах 0,92-1,04 В відносно насиченого хлорсрібного електроду, за схемою:

Спочатку утворюється катіон-радикал, ізомеризація якого у хіноїдного типу радикал і рекомбінація з первинним катіон-радикалом приводить до утворення димеру типу “голова до хвоста”. Дальше окиснення димеру по місцю аміногрупи в кінцевому результаті може привести до поліконденсату.

Кожне наступне сканування потенціалу приводить до депресії струмів окиснення внаслідок екранування поверхні електрода шаром утвореного на його поверхні нерозчинного продукту. Висота максимумів струму зростає із збільшенням швидкості розгортки потенціалу, що було визначено для 0,05 М розчину люмінолу (рис. 2).

Рис. 2. Циклічні вольтамперограми (3-й цикл) 0,05 М розчину люмінолу при різних швидкостях розгортки 10 мВ/с (1), 30 мВ/с (2), 50 мВ/с (3), 100 мВ/с (4).

Така ж картина спостерігається для інших концентрацій люмінолу. Це справедливо для випадків, коли електрохімічне перенесення електрона лімітується швидкістю дифузії частинок електроактивної речовини. З електрохімічних вимірювань також можна зробити висновок, що утворена плівка полілюмінолу є малопровідною.

Термогравіметричні дослідження показують, що найменшою термічною стійкістю характеризується мономерний люмінол, термічний розклад, якого починається при Тd= 256,5 ?С, найбільш термічно стійкий – полілюмінол синтезований в N-метил-2-піролідононі (Тd= 334,2 ?С), а полілюмінол синтезований в ДМСО Тd= 280,2 ?С. Для полілюмінолу синтезованого окисненням КІО3 термоліз починається при 62,8 ?С. Методом FTIR аналізувалась природа і швидкість виділення газоподібних продуктів термолізу.

Система люмінол (0,22 моль/л) – (NH4)2S2O8 (0,11 моль/л) аналізувалась на предмет люмінесценції. Незначне свічення було зафіксовано лише в N-метил-2-піролідононі, яке спадало з часом і досягало величини фонового сигналу.

Свічення не було зафіксовано у водно–диметилсульфоксидному і водно-диметилформамідному розчинах. Це добре пояснюється з огляду на вихід продуктів полімеризації (табл. 1). Якщо вихід малий (~ 26 %), то значить окиснення йде по N-N зв’язку з діазотуванням і, відповідно, спостерігається ХЛ. Якщо ж вихід великий (~ 40 %), то утворюється N=N зв’язок і полімер, а ХЛ, відповідно, не простежується. Додавання до суміші окрім (NH4)2S2O8 пероксиду водню приводить до підсилення свічення в N-метил-2-піролідононі (рис. 3) і до появи у середовищі ДМСО і ДМФА (рис. 4).

Рис. 3. Зміна інтенсивності хемілюмінесценції у системах NMП+люмінол (0,22 моль/л) + Н2О2 (0,22 моль/л) (а); NMП+люмінол (0,22 моль/л) +(NH4)2S2O8 (0,11 моль/л) +Н2О + Н2О2 (0,22 моль/л) (б);. NMП+люмінол (0,22 моль/л) +(NH4)2S2O8 (0,11 моль/л) +Н2О (в); NMП (г). |

Рис. 4. Зміна інтенсивності хемілюмінесценції з часом у системах ДМСО+люмінол (0,22 моль/л) +(NH4)2S2O8 (0,11 моль/л) + Н2О2 (0,22 моль/л) (а); ДМФА+люмінол (0,22 моль/л) +(NH4)2S2O8 (0,11 моль/л) +Н2О2 (0,22 моль/л) (б); інтенсивность фону (водно–органічний розчинник (9:1)) (в).

З цього можна зробити висновок, що продуктами окиснення люмінолу у змішаних водно-органічних розчинниках не є 3-амінофталат, утворення якого зумовлює інтенсивне свічення. Утворена в присутності (NH4)2S2O8 діазосполука окиснюється до 3-амінофталату в збудженому стані, променева дезактивація якого приводить до емісії світла при л=425 нм (схема 5).

Дослідження електрохімічної активності, елементного аналізу, та ІЧ-спектроскопії полілюмінолу, дозволить прослідкувати вплив розчинника на шлях окиснювальної поліконденсації і пояснити властивості поліконденсатів, зумовлені особливостями їх структури. Власне аналіз результатів електрохімічних досліджень дозволяє вибрати оптимальні умови для проведення окиснювальної поліконденсації сполук з утворенням електроактивних продуктів. Суттєвий вплив на шлях поліконденсації люмінолу має мольне співвідношення між окисником (потенціалом електроду) та мономером.

У четвертому розділі синтезовані полімерні сполуки апробовані як платформи для конструювання амперметричних біосенсорів. На поверхню синтезованої плівки полілюмінолу іммобілізовано алкогольоксидазу, глюкозооксидозу, уреазу та біферментну систему (алкогольоксидаза+пероксидаза). В присутності РОх покращується передача електрона до поверхні електрода та в біферментній системі спостерігається зростання струмів миттєвих відкликів.

Попередньо нами була зроблена спроба оцінити вплив кожного компонента поверхневого шару електрода на його електрохімічну активність. Для цього було сконструйовано ряд біосенсорів з різною архітектурою, а саме: PL+Gox+глутаровий альдегід+плівка; PL+Gox+глутаровий альдегід; PL+Gox+плівка; PL+Gox; PL (рис. 5).

Слід відмітити, що у відсутності ензиму сенсор не реагує на додані кількості субстрату, оскільки не відбувається ніякої ферментативної реакції. У випадку відсутності глутарового альдегіду і діалізної плівки сенсор реагує на додані кількості відповідного субстрату, але через добу він вже є нечутливим оскільки відбувається вимивання ензиму буферним розчином. У присутності глутарового альдегіду і діалізної плівки стабільність ензимного електрода в часі різко збільшується, що свідчить про доцільність використання глутарового альдегіду і діалізної плівки при конструюванні біосенсорів.

Рис. 5. Амперометричний відклик біосенсора на глюкозу (20 мМ) наступної конфігурції: 1 – PL+GОx+ глутаровий альдегід+плівка; 2 – PL+GОx + глутаровий альдегід; 3 – PL+GОx + плівка; 4 – PL; 5 – PL+GОx.

Проведено порівняння електрохімічних та аналітичних характеристик ферментних електродів на відповідній платформі. Власне ключовою проблемою при використанні електропровідних полімерів для створення амперометричних біосенсорів є стабільна іммобілізація макромолекулярних ферментів на провідній мікропористій поверхні із повним збереженням їхніх біологічних властивостей.

Фермент в режимі амперометричного біосенсора проявляє електрокаталітичну активність, тобто прискорює процес обміну електронами між субстратом і електродом. Перенос електронів протікає за допомогою дифузійно-рухливого проміжного низькомолекулярного переносника електронів – медіатора. Визначувана речовина дифундує через напівпроникну мембрану в тонкий шар біокаталізатора в якому і протікає відповідна ферментативна реакція. Для електрода з іммобілізованою глюкозооксидозою спостерігається лінійність до 10 мМ, на відміну, від уреазного біосенсора, де лінійність спостерігається до 5 мМ як для визначення карбаміду, так і для визначення хлориду амонію. Виходячи з експериментальних даних слід зазначити, що амперометричний глюкозний сенсор на полілюмінольній платформі є найбільш чутливим до мінімальних кількостей субстрату (глюкози).

Щодо операційної стабільності, то одержані результати свідчать про найкращу стабільність біферментного електрода порівняно з іншими сконструйованими нами біосенсорами. Найнижчою операційною стабільністю характеризується уреазний біосенсор, а також для нього властива низька межа виявлення субстрату в аналіті, що свідчить про його низьку операційну чутливість (рис. 6).

Операційна стабільність відповідних електродів покращується після циклювання електрода, очевидно, це пов’язано з додатковою інкорпорацією фермента в полілюмінольну плівку, інших навпаки дещо зменшується порівняно із первинним відкликом, що може зумовлюватись складними іонообмінними, електростатичними та окисно-відновними взаємодіями в системі електропровідний полімер – функціональні групи макромолекул фермента, оскільки, згідно із літературними даними, електрохімічні властивості полімеру не залежать від наявності Н2О2, який є основним електроактивним продуктом даної ферментативної реакції.

а б в

Рис. 6. Гістограми операційної стабільності ферментних електродів: а – глюкозооксидазний сенсор; б – алкогольпероксидазний сенсор; в – уреазний сенсор.

1 – первиний відклик, 2 – відклик через добу, 3 – через 2 доби, 4 – через 3 доби, 5 –через 4 доби.

Обговорено вплив природи електропровідного полімеру, електрохімічно осадженого на поверхні платинового електрода на його здатність адсорбувати на своїй поверхні ферменти глюкозооксидазу, алкогольоксидазу, або біферментну систему алкогольоксидаза+пероксидаза (АО+ПО). Показано вплив природи модифікуючого полімера на швидкість досліджуваних ферментно-каталітичних реакцій; розраховані величини констант Міхаеліса-Ментен, які змінюються при адсорбції ферментів на поверхні електропровідного полімера.

В п’ятому розділі синтезовано та досліджено електрохімічне відновлення діазотованого люмінолу в ацетонітрильному середовищі на поверхнях різних металів, запропоновано механізм електрохімічного відновлення діазотованого люмінолу, представлено дані елементного аналізу та та ІЧ – спектроскопічних досліджень.

Синтез гідразид 3-амінофталатдіазоній тетрафторборату проводили в кислому середовищі при охолодженні. Величина електродного потенціала визначає природу продуктів відновлення, що важливе для постулювання механізму електронного перенесення. Відновлення арендіазонієвого катіона починається вже в додатній області потенціалів, про що свідчить збільшення величини катодного струму. Величини максимумів струму залежать від концентрації ДАС і змінюються від –32,5 до –27,5 мкА для 2,0·10-2 і 2,5·10–2 М розчинів, відповідно (рис. 7).

Рис. 7. ЦВА платинового електрода в ацетонітрилі в присутності 0,1 М LiClO4 при концентраціях ДАС: 2·10-2 М (а), 2,5·10-2 М (б). Швидкість розгортки потенціалу 50 мВ/с.

Відновлення катіонів арендіазонію протікає за одноелектронним механізмом. В результаті приєднання електрону утворюється відповідний азорадикал, який може легко диспропорціонувати з відщепленням молекули азоту (схема 6), або протонуватись за схемою 7: |

Утворений катіон-радикал може ізомеризуватись у катіон-радикал, в якому заряд і вільна валентність локалізовані на одному атомі азоту. Наступне приєднання електрона призводить до утворення гідразид 3–гідразофталату, що є відносно стійкою проміжною речовиною процесу відновлення. Далі відбувається ступінчасте приєднання електронів і протонів з утворенням стійкого продукту – заміщеного гідразину:

Утворені в результаті електрохімічного відновлення вільнорадикальні інтермедіати І, ІІ, ІІІ і ІV можуть рекомбінувати між собою прямо або перехресно. Отже при електрохімічному відновленні діазотованого люмінолу в результаті приєднання першого електрона згідно з схемою (6) утворюється азорадикал, який після диспропорціонування рекомбінує з собі подібним, даючи наступний димерний продукт (V):

У випадку мідного і в меншій мірі залізного електрода появляються великі анодні струми при E= 0 – 0,3 В. Спостережувані великі анодні струми ми пов’язуємо із розчиненням – іонізацією мідного електрода:

Оскільки ДАС іонізовані в розчині, то ЦВА можна одержувати у відсутності фонового електроліта, що елімінує можливий вплив на це фонового електроліта. Наявність на ЦВА великих анодних струмів у випадку мідного електрода і відповідні їм процеси розчинення – іонізації електродів вказує на електрокаталітичний характер відновлення ДАС.

ІЧ-спектроскопічно було досліджено продукти діазотування люмінолу. Очевидно, що смуга при 3420 см-1 у люмінолі відповідає коливанню зв'язків N-H в аміногрупі NН2, яка піддається діазотуванню і в продукті діазотування не присутня. Наявні смуги деформаційних коливань NH2-групи при 1628 см-1 і торзійних коливань при 492 см-1 також у продукті відсутні, що теж підтверджує факт діазотування люмінолу по місцю аміногрупи.

Нами досліджувалась також електрохемілюмінесценція 0,05 та 0,1 М розчинів ДАС при катодній поляризації мідного електрода. Свічення з’являється одразу ж після включення струму і триває протягом 300 секунд. Коли розглядати залежність інтенсивності свічення від потенціалу та сили струму, то можна бачити, що свічення величиною 60 імпульсів/сек спостерігається при – 0,7 В (рис. 8). Це малоінтенсивне свічення можна пояснити утворенням азорадикала. |

Рис. 8. Залежність інтенсивності ЕХЛ діазотованого люмінолу (С=0,05 моль/л) на Сu електроді, від величини потенціалу. | Рис. 9. Залежність інтенсивності ЕХЛ діазотованого люмінолу (С=0,1 моль/л) на Cu електроді від величини потенціалу. |

Розглядаючи залежність інтенсивності свічення від потенціалу та сили струму для 0,1 М розчину ДАС в ацетонітрилі, спостерігаємо дещо кращу картину. Із збільшенням концентрації ДАС інтенсивність свічення та його тривалість збільшується. Можна бачити, що максимальне свічення величиною порядку 325 імпульсів/сек спостерігається при - 1,7 В для 50 мВ/с і навпаки при малому значенні струму 0,5 мА/с. Із зменшенням швидкості розгортки свічення зменшується. Малоінтенсивне свічення проявляється при 5 мВ/с (рис. 9).

Отже, при малих значеннях потенціалу утворюються продукти люмінесцентно активні і, навпаки, при більших потенціалах – люмінесцентно неактивні, про що свідчать додаткові піки. Наймовірнішим джерелом люмінесценції є вільнорадикальні інтермедіати розкладання ДАС.

Методом квантово-хімічних розрахунків детально проаналізували електронно–просторову структуру люмінолу, діазо–радикалу та діазолюмінолу, щоб визначити найімовірніший шлях діазотування. З огляду на енергії граничних орбіталей, перенесення електрону в процесі відновлення відбувається на НВМО.

Таблиця 3

Параметри електронної структури частинок

частинка | Еbin, ккал/моль | ?Нf, ккал/моль | ЕВЗМО,

еВ | ЕНВМО,

еВ | Еq | заряди на атомах | N1 | N2 | люмінол | -2217,43 | -27,485 | -8,946 | -1,025 | 7,921 | 0,057 | _ | діазорадикал | -2168,11 | 30,635 | -9,174 | -1,440 | 7,734 | 0,236 | -0,183 | діазолюмінол | -1993,21 | 205,538 | -13,239 | -6,484 | 6,755 | 0,665 | 0,077 | Результати розрахунку електронної структури люмінолу, діазо – радикалу та діазолюмінолу (табл. 3) вказують на те, що найбільш легко мав би відновлюватись діазолюмінол, оскільки в ньому є найбільш позитивний заряд на атомі N1 і найнижче значення величини енергії НВМО. З точки зору термодинаміки відновлення діазорадикалу має відбуватися ваще, оскільки енергія НВМО для нього нижча порівняно з діазолюмінолом.

Важливим тут є те, що діазотування відбувається по місцю аміногрупи і тому дослідження структури електрохімічного відновлення та люмінесценції продуктів діазотування дозволило глибше вникнути в суть процесів з участю люмінолу і його похідних.

ВИСНОВКИ

1. Досліджено електрохімічну поліконденсацію люмінолу на платиновому електроді в середовищі водно-органічного розчинника, а також механізм перебігу електрохімічного окиснення люмінолу та одержаних продуктів поліконденсації. Окиснення люмінолу являє собою необоротний процес в межах потенціалів 0,92 – 1,04 В відносно насиченого хлорсрібного електрода. Продуктом спряжених хімічних перетворень катіон-радикалів та ізомеризованих радикалів в кінцевому результаті може бути полімер (полілюмінол).

2. Цілеспрямованим вибором природи і складу водно-органічного розчинника, окиснювача, було вперше здійснено хімічну окиснювальну поліконденсацію люмінолу і знайдені оптимальні умови проведення реакції, а саме: співвідношення вода:органічний компонент = 1:9.

3. Запропоновано, виходячи з елементного аналізу, даних ІЧ і раманівської спектроскопії, ймовірні формули продуктів окиснювальної поліконденсації при окисненні люмінолу (NH4)2S2O8 і КІО3.

4. Досліджено електрохімічну поведінку біосенсорів у присутності відповідних субстратів (етанолу, глюкози, карбаміду, іонів амонію). Оцінено стабільність ензимних електродів. Найкращою стабільністю характеризується біферментний електрод (стабільність протягом 4-х діб), а найнижчою уреазний біосенсор (протягом 2-х діб), а також він характеризується низькою (до 5 мМ) межею виявлення субстрату в аналіті, що свідчить про його низьку чутливість.

5. Аналіз люмінесцентних даних показує, по-перше, що люмінесценція там де вона проявляється – слабо інтенсивна, і, по-друге, окиснення люмінолу в люмінесценції і синтезі полілюмінолу цілковито відмінні. Згідно із загальноприйнятою схемою люмінесценція походить із променевої дезактивації 3-амінофталату, тоді як в умовах синтезу полілюмінолу він не утворюється, або ж утворюється в дуже малих кількостях.

6. Синтезовано та досліджено електрохімічні властивості гідразид 3–амінофталатдіазоній тетрафторборату. Вивчено вплив концентрації, швидкості розгортки потенціалу та природи матеріала електрода (Pt, Fe, Cu) на потенціал відновлення ДАС. По-перше, для мідного електрода наявний великий анодний струм, по-друге, при менших концентраціях ДАС спостерігаються більші струми та чіткіші піки.

7. За результатами електрохімічних досліджень та даними квантово-хімічних розрахунків у наближенні РМ3 запропоновано механізм каталітичного відновлення гідразид 3–амінофталатдіазоній тетрафторборату через проміжну стадію утворення нітренієвих радикалів. З точки зору термодинаміки найбільш схильний до відновлення і найменш стійким виявився діазолюмінол.

8. Досліджено електрохемілюмінесценцію в процесі електрохімічного відновлення ДАС на мідному електроді. Знайдено, що максимальна інтенсивність свічення (~ 325 імп/с) має місце при потенціалі – 1,5 В для 0,1 М розчину ДАС.

Основний зміст роботи викладено в наступних публікаціях

1. Ковальчук Є.П., Гринчишин І.В. Хімічне окиснення люмінолу пероксидисульфатом амонію // Вісн. Львів. у-ту. Сер. хім. – 2004. – Вип. 44. – С. 202 - 208.

Особистий внесок здобувача: Гринчишин І.В – хімічне окиснення люмінолу, участь в обговоренні результатів і підготовці статті до друку; Ковальчук Є.П – отримання ІЧ-спектрів, обговорення результатів.

2. Koval’chuk E.P., Hrynchyshyn I.V., Reshetnyak O.V., Bіaїejowski J. Oxidative condensation and chemiluminescence of 5 amino-2,3-dihydro-1,4-phtalazinedione // Eur. Polym. J. – 2005. – Vol. 41. – P. 1315 - 1325.

Особистий внесок здобувача: Гринчишин І.В – проведення вольтамперометричних досліджень, синтез полілюмінолу, Ковальчук Є.П – отримання ІЧ-спектрів полімерних продуктів та продуктів термодеструкції, обговорення результатів; Решетняк О.В – хемілюмінесцентні дослідження, підготовка статті до друку; Блажейовський Є – проведення елементного та термогравіметричного аналізів.

3. Ковальчук Є.П., Гринчишин І.В., Максимчук В.С., Блажейовський Є. Амперометричний глюкозний сенсор на полілюмінольній платформі // Укр. хім. журн. – 2005. – T. 71, №7 – C. 46 – 50.

Особистий внесок здобувача: Гринчишин І.В – конструювання біосенсорів на полілюмінольній платформі, обговорення результатів; Ковальчук Є.П – обговорення результатів та підготовка статті до друку; Максимчук В.С – виготовленя робочих розчинів і допомога при конструюванні біосенсорів; Блажейовський Є – отримання ІЧ-спектрів.

4. Гринчишин І.В., Ковальчук Є.П., Ковальчук О. Діазотування 5-аміно-2,3-дигідро-1,4-фталазіндіона (люмінол) та його електрохімічне відновлення // Вісн. Львів. у-ту. Сер. хім. – 2005. – Вип. 46. – C. 229 – 233.

Особистий внесок здобувача: Гринчишин І.В – діазотування люмінолу, проведення вольтамперометричних досліджень, обговорення результатів; Ковальчук О. – отримання ІЧ-спектрів; Ковальчук Є.П. – обговорення результатів та допомога у підготовці статті до друку.

5. Гринчишин І.В., Ковальчук Є.П., Максимчук В.С. Електрохімічний карбамідний біосенсор на основі полілюмінолу // Вісн. Львів. у-ту. Сер. хім. – 2006. – Вип. 47. – C. 244 – 248.

Особистий внесок здобувача: Гринчишин І.В – конструювання карбамідного біосенсора, обговорення результатів; Ковальчук Є.П – обговорення результатів та підготовка статті до друку; Максимчук В.С – виготовлення робочих розчинів.

6. Гринчишин І.В., Ковальчук Є.П. Електрохімічне окиснення люмінолу // VІІ міжнародної наук.-практ. конф. “Наука і освіта ”2004” / Тези, 10-25 лютого 2004 р. – Дніпропетровськ, – Т. 52. – С. 3 – 4.

7. Ковальчук Є.П., Гринчишин І.В. Окиснення люмінолу калій йодатом // міжнар. конф. “Сучасні проблеми фізичної хімії” / Тези, 30 серпня –2 вересня 2004 р. – Донецьк. – С. 173

8. Гринчишин І.В., Ковальчук Є.П., Максимчук В.С. Визначення карбаміду використовуючи електрохімічний біосенсор // Десята наук. конф. ”Львівські хімічні читання – 2005” / Тези, 25-27 травня 2005 р. – Львів, С. Ф59.

9. Гринчишин І.В. Окиснення люмінолу пероксидисульфатом амонію // Дев’ята наук. конф. ”Львівські хімічні читання – 2003” / Тези, 21-23 травня 2003 р. – Львів, С. Ф24.

АНОТАЦІЯ

Гринчишин І.В. Синтез та фізико-хімічні властивості полілюмінолу. ? Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.04 ? фізична хімія. Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів, 2006.

Дисертаційна робота містить аналіз результатів експериментального дослідження та квантово-хімічного розрахунку шляхів хімічного і електрохімічного синтезів люмінолу у водно-органічному середовищі, а також дані про фізико-хімічні властивості синтезованих полімерних сполук. Окиснювальна поліконденсація люмінолу, як показують квантово-хімічні розрахунки та дані ІЧ спектроскопічних досліджень приводить до утворення катіон-радикала, ізомеризація якого у хіноїдного типу радикал і рекомбінація з первинним катіон-радикалом приводить до утворення димеру типу “голова до хвоста”.

Дослідженнo вплив природи полілюмінолу, електрохімічно осадженого на поверхні платинового електрода, на його здатність адсорбувати на своїй поверхні ферменти глюкозооксидазу, уреазу, алкогольоксидазу, або біферментну систему алкогольоксидаза+пероксидаза. Іммобілізація ферментів на поверхні електродів, модифікованих електропровідними полімерами дозволяє застосувати одержані ферментні електроди в ролі амперометричних біосенсорів. Показано вплив природи модифікуючого полімера на швидкість досліджуваних ферментно-каталітичних реакцій, розраховані величини констант Міхаеліса-Ментена.

Ключові слова: полілюмінол, окиснювальна поліконденсація, катіон-радикал, фермент, іммобілізація.

АННОТАЦИЯ

Гринчишин И.В. Синтез и физико-химические свойства полилюминола. ? Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата химических наук по специальности 02.00.04 ? физическая химия. Львовский национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2006.

Диссертационная работа содержит анализ результатов экспериментального исследования и квантово-химического расчета механизмов химического и электрохимического синтеза люминола в водно-органической среде, а также данные о физико-химических свойствах синтезированных полимерных соединений. Изучена взаимосвязь между свойствами поли-конденсатов, их структурой и строением исходных соединений, способом и условиями проведения окислительной поликонденсации.

Значительное влияние на способ поликонденсации люминола имеет мольное соотношение между окислителем (потенциалом электрода) и мономером. При этом изменяеться не только количество продукта, но и структура поликонденсата. Окислительная поликонденсация люминола, как показывают квантово-химические расчеты и ИК-спектроскопические исследования, приводит к образованию катион-радикала изомеризация которого в хиноидного типа радикал и рекомбинация с первичным катион-радикалом приводит к образованию димера по механизму „голова к хвосту.

Исследовано влияние природы полилюминола, электрохимически синтезированого на поверхности платинового электрода, на его возможность адсорбировать на поверхности ферменты глюкозооксидазу, уреазу, алкогольоксидазу, или биферментную систему алкогольоксидаза+пероксидаза. Иммобилизация ферментов на поверхности электродов, модифицированых электропроводными полимерами разрешает применить полученные ферментные электроды в качестве амперометрических биосенсоров. Показано влияние природы модифицированого полимера на скорость исследуемых ферментно-каталитических реакций, рассчитанны величины констант Михаэлиса-Ментен. Операционная стабильность некоторых электродов улучшается после циклирования электрода, по-видимому, это обусловливаеться с дополнительной инкорпорацией фермента в полилюминольный шар, других же наоборот, кое-что уменьшается сравнительно с первичным откликом, что может обусловливаться сложными ионообменными, электростатическими и окислительно-обновленными взаимодействиями в системе электропроводный полимер – функциональные группы макромолекул фермента.

Значительная электрофильность солей арендиазония способствует их легкому электрохимическому восстановлению. При электрохимическом восстановление диазотированого люминола в результате присоединения первого электрона образовываеться азорадикал, который после диспропорцирования рекомбинирует с образованием димера. Значительным есть то, что диазотирование происходит по месту аминогруппы и поэтому исследование структуры электрохимического восстановления и люминесценции продуктов диазотирования разрешит понять механизм процесса с участием люминола и его производных.

Ключевые слова: полилюминол, окислительная поликонденсация, поликонденсат, катион-радикал, фермент, иммобилизация, биосенсор.

SUMMARY

Hrynchyshyn I.V. Synthesis and physico-chemical properties of polyluminol. ? Manuscript.

Thesis for a Candidate of Sciences (Chemistry) degree by speciality 02.00.04 – Physical chemistry. – Ivan Franko National University of L’viv, 2006.

Thesis contains the analysis of results experimental investigation and quantum-chemical calculation of ways of chemical and electrochemical synthesis of luminol in water-organic medium and also data about physico-chemical properties of synthesized polymeric compounds. The oxidative polycondensation of luminol, as demonstrate quantum-chemical calculations and IR-spectroscopy ivestigations, results in formation of cation radical which is isomerized in radical quinoid type and capable to recombine with primary cation radical with formation of dimer on the type “head to head”.

The influence character of polyluminol which electrochemical precipitation on the platinum electrode, its capable adsorbtion on the surface of electrode the different ferments were investigation. The different ferments were immobilized on the electrode surface modified by polyluminol and these electrodes as platform for amperometric biosensors were used. The effect character of modified by polyluminol electrode on the rapidly of ferment reaction were research. The Michaelis-Menten constants were calculations too.

Keywords: polyluminol, oxidative polycondensation, cation-radical, ferment, immobilization.