АКАДЕМІЯ медичних НАУК УКРАЇНИ

НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ

Голярник Наталія Анатоліївна

УДК: 577.112.6: 612.017: 616.831: 616–001.28

РОЛЬ ОПІОЇДНИХ ПЕПТИДІВ

В МОДУЛЯЦІЇ ІМУННОЇ ВІДПОВІДІ

ХВОРИХ НА ДИСЦИРКУЛЯТОРНУ ЕНЦЕФАЛОПАТІЮ

У ВІДДАЛЕНИЙ ПЕРІОД ПІСЛЯ ОПРОМІНЕННЯ

03.00.01 – радіобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті клінічної радіології

Наукового центру радіаційної медицини АМН України.

Науковий керівник |

доктор медичних наук, професор

Базика Дмитро Анатолійович,

Інститут клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України, завідувач відділу клінічної імунології.

Офіційні опоненти: |

доктор біологічних наук Чоботько Григорій Михайлович,

Інститут експериментальної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України, завідувач лабораторії радіаційної цитології;

заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Лісяний Микола Іванович, Інститут нейрохірургії ім. А.П. Ромоданова АМН України, завідувач відділу нейроімунології.

Провідна установа: |

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться “ 07 ” березня 2006 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.01 Наукового центру радіаційної медицини АМН України, 03115, м. Київ, просп. Перемоги, 119/121.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Наукового центру радіаційної медицини АМН України, 04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53.

Автореферат розісланий “ 07 ” лютого 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук _______________________ Л. О. Ляшенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед багатьох дискусійних проблем сучасної радіобіології невизначеними залишаються питання про характер змін в імунній системі (ІС), їх наслідки та значення для розвитку соматичної патології.

Факт високої радіочутливості імунокомпетентних клітин [Рябухин Ю.С., 2000; Иванов А.А. и др., 2001] значною мірою визначає активну участь ІС як у патогенезі пострадіаційного відновлення, так і у формуванні віддалених наслідків променевих уражень. Після аварії на Чорнобильській атомній електростанції (ЧАЕС) імунологічний моніторинг постраждалих контингентів показав наявність нестохастичних ефектів в ІС. Комбінований набутий імунодефіцит раннього поставарійного періоду, протягом 3–5 років, змінився періодом розвитку компенсації радіаційного ураження із формуванням радіаційноіндукованої соматичної та психоневрологічної патології [Нягу А.И., Логановский К.Н., 1998; Чумак А.А. и др., 2004]; однак повної нормалізації імунологічної реактивності, навіть майже через 20 років після аварії, не встановлено. У віддалений період після опромінення у значного контингенту потерпілих зберігається дисбаланс морфофункціонального стану ІС, у більшій мірі вираженого дефіцитом тимусзалежної ланки, що супроводжується змінами поверхневих структур, субпопуляційної організації, проліферації та функціональної активності Т–лімфоцитів [Баєва О.В. та ін., 2000; Bebeshko V. et al., 2000; Мельнов С.Б., 2004; Климова Е.М., Дроздова Л.А., 2005]. Більшість дослідників схильні пов’язувати виявлені зміни як провідний показник впливу радіації [Akiyama M. et al. 1991; Baranov A.E. et. al., 1995; Titov L.P. et al., 1995], інші припускають конкурентний вплив факторів нейроендокринної та психічної природи [Литвиненко Н.В., 2000; Нікольський І.С., 2000; Лісяний М. І., Любич Л.Д., 2001; Логановский К.Н., 2001].

Особливу увагу привертають контингенти із сформованою імунозалежною патологією центральної нервової системи (ЦНС), що розвинулась після опромінення. Передусім, це обумовлено високою поширеністю та тяжкістю перебігу психоневрологічних, зокрема, цереброваскулярних розладів, дисциркуляторної енцефалопатії (ДЕП) в учасників ліквідації наслідків аварії (УЛНА) на ЧАЕС [Литвиненко Н.В., 2000; Логановский К.Н., 2000; Грицай Н.М. та ін., 2002]. З іншого боку, зумовлено загальновизнаним уявленням про тісний, багатоланцюговий зв’язок між ЦНС та імунітетом, а також значенням гуморальних чинників в нейроімунній регуляції [Weigent D.A., Blalock J.E., 1995; Крыжановский Г.М., 1999; James D.E., Nijkamp F.P., 2000; Engelsma M.Y. et al., 2002; Степаненко І.В., 2004]. З огляду на це, вивчення регуляторних властивостей опіоїдних пептидів (ОП) може бути перспективним напрямком у вирішенні патогенезу змін імунологічного статусу та психоневрологічних розладів у віддалений період після опромінення.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є самостійним завершеним комплексним науковим дослідженням. Дисертацію виконано у відділі клінічної імунології Інституту клінічної радіології (ІКР) Наукового центру радіаційної медицини (НЦРМ) АМН України у структурі науково–дослідних робіт (НДР) відділу клінічної імунології ІКР НЦРМ АМН України. Дисертант був співвиконавцем наступних НДР:

1. 1999–2001 рр. НДР на замовлення Міністерства України з питань надзвичайних ситуацій у справах захисту населення від наслідків Чорнобильської катастрофи (МНС), договір № 17/11 Н–99., шифр №308 “Вивчення закономірностей виникнення, механізмів розвитку та особливостей перебігу найбільш розповсюджених захворювань у постраждалих, що віднесені до критичних груп. Розробка системи лікувально–реабілітаційних заходів, первинної і вторинної профілактики патологічних станів”, № держреєстрації 0199U003595; підтема “Вивчити імунологічні аспекти формування природного перебігу і реабілітації хворих на енцефалопатії у віддаленому поаварійному періоді”.

2. 2001р. НДР на замовлення МНС, договір № 17/3 В–2001., шифр №338 “Впровадження методів обстеження, діагностики та лікування осіб, які постраждали внаслідок Чорнобильської катастрофи”, № держреєстрації 0101U006644; підтема “Впровадити імунологічні критерії зв’язку дисциркуляторної енцефалопатії з впливом іонізуючого випромінювання у постраждалих внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС”.

3. 2001–2003 рр. НДР на замовлення АМН України, шифр № 328 “Вивчити механізми алергічного запалення при формуванні імунозалежної соматичної патології у учасників ліквідації наслідків Чорнобильської аварії”, № держреєстрації 0101U001451.

Мета дослідження. Встановити особливості регуляторного впливу б– та в–ендорфінів на субпопуляційну організацію та функціональну активність лімфоцитів у хворих на дисциркуляторну енцефалопатію у віддалений період після опромінення.

Завдання дослідження.

1. Дати характеристику імунної реактивності хворих на ДЕП у віддалений період після опромінення.

2. Визначити особливості спонтанної та мітоген–залежної активації лімфоцитів у хворих на ДЕП у віддалений період після променевого ураження залежно від дози опромінення.

3. Визначити in vitro особливості проліферативної активності імунокомпетентних клітин периферичної крові за розподіленням лімфоцитів по фазах клітинного циклу спонтанно та при мітогенній активації у хворих на ДЕП в залежності від дози опромінення.

4. Дослідити in vitro вплив б– та в–ендорфінів на субпопуляційну організацію лімфоцитів хворих на ДЕП в залежності від дози опромінення.

5. Дослідити in vitro вплив б– та в–ендорфінів на процеси спонтанної та мітоген–залежної активації лімфоцитів хворих на ДЕП у віддалений період після опромінення.

6. Дослідити in vitro блокуючий ефект антагоніста опіоїдних рецепторів (ОР) – налоксона на регуляцію ендорфінами субпопуляційної організації та процесів активації лімфоцитів у хворих на ДЕП в залежності від дози опромінення.

Об’єкт дослідження. УЛНА на ЧАЕС, опромінені в діапазоні доз 0,25 – 3,8 Зв, хворі на ДЕП.

Предмет дослідження. Реакції імунної системи на регуляторні стимули опіоїдних пептидів в УЛНА на ЧАЕС, хворих на ДЕП, у віддалений період після опромінення.

Методи дослідження. Цитофлуориметричні – визначення субпопуляційного складу імунокомпетентних клітин та експресії поверхневого фенотипу лімфоцитів у прямому імунофлуоресцентному тесті за допомогою панелі моноклональних антитіл серії Leu, Simultest ІМК Plus (Becton Dickinson, США); серологічні – визначення рівнів сироваткових імуноглобулінів основних класів (IgA, IgG, IgM); концентрації дрібно– та великодисперсних циркулюючих імунних комплексів (ЦІК); культуральні – мітоген–індукована активація та проліферація лімфоцитів; вплив ендорфінів на субпопуляційну організацію та процеси спонтанної і мітоген–залежної активації імунокомпетентних клітин у короткочасовій культурі лімфоцитів; статистичні – параметричні критерії; варіаційний та регресійно–кореляційний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено у віддаленому періоді після опромінення в інтервалі доз 0,25 – 3,8 Зв модулюючий вплив б– та в–ендорфінів на структурнофункціональний стан лімфоцитів людини. Доведено залежність від дози опромінення змін імунологічних показників субпопуляції Т–лімфоцитів при імунологічній недостатності у хворих на ДЕП. Із збільшенням дози опромінення виявлено зниження числа CD3+, CD4+ клітин та коефіцієнту CD4+/CD8+, що призводить до ускладнення імунопатологічного стану та розвитку дефіциту Т–ланки ІС.

Встановлено, що у віддалений період після опромінення зберігаються дозозалежні зміни експресії активаційних антигенів імунокомпетентних клітин та розподілу лімфоцитів по фазах клітинного циклу. У хворих на цереброваскулярну патологію після опромінення в дозах 0,25 – 0,9 Зв встановлено накопичення лімфоцитів у G1–фазі із блокуванням виходу клітин у S–фазу синтезу ДНК та прояви ендогенної активації за підвищенням кількості Т–клітин з високою спонтанною експресією CD25 антигенів. У опромінених дозами понад 1 Зв поряд із збільшенням кількості лімфоцитів з пошкодженою ДНК встановлено зниження експресії маркерів HLA–DR, CD25, CD71 та кількості активованих Т–лімфоцитів, що після стимуляції мітогеном змінюється надмірним виходом клітин у мітотичний цикл.

Вперше у хворих на ДЕП реконвалесцентів гострої променевої хвороби (ГПХ) встановлено зниження відповіді Т–лімфоцитів на ендорфіни з інвертованою реакцією на всіх стадіях активаційного процесу та зменшенням експресії активаційних молекул. Визначені особливості комбінованої дії мітогену та ендорфінів в умовах застосування блокатору ОР налоксону.

На підставі аналізу та узагальнення отриманих результатів комплексного клініко–імунологічного дослідження підтверджено дані щодо пошкодження Т–ланки ІС у віддалений період після опромінення. Набула подальшого розвитку концепція про формування імунопатологічних станів у хворих ДЕП, що розвинулась після опромінення [Литвиненко Н.В, 2000; Лісяний М.І., Любич Л.Д. 2001; Грицай Н.М. та ін., 2002; Степаненко І.В, 2004].

Встановлено кількісні параметри змін імунологічної реактивності у хворих на ДЕП незалежно від дози опромінення.

Практичне значення отриманих результатів. Визначені закономірності реактивності імунокомпетентних клітин та опіоїдної регуляції функцій ІС мають суттєве значення у розумінні розвитку імунодефіцитних станів у віддалений період після опромінення.

Факт зниження відповіді на ОП після опромінення дещо пояснює патогенез і патоморфоз ДЕП, що розвинулась після променевих уражень, а також зловживання психоактивними речовинами (швидке зниження толерантності, формування залежності до алкоголю і бензодіазепінів), можливо – аферентних розладів і шизофренії. Одержані результати сприятимуть удосконаленню патогенетичної терапії даних розладів не лише у клініці радіаційної медицини, але і у психіатрії.

Розроблені в дисертаційній роботі імунологічні підходи до вивчення стану ІС увійшли до складу методології імунологічного дослідження осіб, які зазнали впливу радіації внаслідок аварії на ЧАЕС, і впроваджені в практику роботи відділу клінічної імунології ІКР НЦРМ АМН України. Результати, одержані при виконанні роботи, включено до доповнень, надісланих НЦРМ АМН України до розділу 13 “Immunological Effects on Health” звіту Чорнобильського форуму експертної групи “Здоров’я” ООН “Health Effects of the Chernobyl Accident and Special Health Care Programmes”, матеріалів НЦРМ АМН України до Парламентських слухань у Верховній Раді України “Вісімнадцята річниця Чорнобильської катастрофи. Погляд у майбутнє”.

Запропоновано практичні рекомендації імунологічного обстеження хворих на ДЕП з включенням параметрів клініко–імунологічного скринінгу, лабораторної діагностики, визначення специфічних клітинних реакцій на ОП, що дозволить оцінити імунологічне розпізнавання, активацію, проліферацію, а також диференціацію імунокомпетентних клітин та підвищить ефективність лікування цереброваскулярних розладів. Розроблено новий спосіб діагностики стану імунної системи: пат. 74321 А Україна, МПК 7 G01N33/53 Д.А. Базика, Н.В. Бєляєва, Н.А. Голярник; НЦРМ АМН України.– № 2003119896; Заявл. 04.11.03; Опубл. 15.11.05, Бюл. №11.– 4.3 с.

Особистий внесок здобувача. Автором здійснено аналіз попередніх наукових літературних даних, обґрунтована актуальність і необхідність дослідження, його мета і задачі, сформовано групи спостереження. Особисто розроблено програму дослідження, обґрунтовано і відібрано методи дослідження, розроблено протокол для фіксації результатів та структуру бази даних. Самостійно проведено імунологічне обстеження відібраних контингентів, культуральні та цитофлуориметричні дослідження: імунофлуоресцентний аналіз субпопуляційного складу імунокомпетентних клітин; процесів спонтанної та мітоген–залежної активації лімфоцитів; регуляторних впливів ОП. Заповнена база даних, проведений статистичний аналіз та інтерпретація отриманих результатів.

Особисто виконано інформаційний пошук, написання всіх розділів, створення ілюстрацій та формування висновків.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації викладені у доповідях на національних і міжнародних науково–практичних конференціях та конгресах: Міжнар. конф. “Медичні наслідки Чорнобильської катастрофи: підсумки 15–річних досліджень” (Київ, 2001); Міжнар. конф. “П’ятнадцять років Чорнобильської катастрофи. Досвід подолання” (Київ, 2001); Науково–практ. конф. молодих вчених ІКР НЦРМ АМН України, присвяченій 15–ти річчю Чорнобильської катастрофи (Київ, 2001); Науково–практ. конф. з нагоди 15–ти річчя створення відділу клінічної імунології НЦРМ АМН України (Київ, 2002); ІІІ–му з’їзді з радіаційних досліджень України (Київ, 2003); Школі–семінарі ІКР НЦРМ АМН України “Актуальные вопросы проточной цитометрии” (Київ, 2003); European Respiratory Society Congress (Glasgow, Scotland, 2004); Науково–практ. конф. молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми радіаційної медицини та радіобіології” НЦРМ АМН України (Київ, 2005); VII Укр. науково–практ. конф. з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації (Київ, 2005).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 16 наукових праць; із них: 5 статей у фахових виданнях (у тому числі – 1 за кордоном), 1 – розділ, складова частини монографії (англійською мовою), 1 – деклараційний патент на винахід, 9 тез доповідей (у тому числі – 2 за кордоном).

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 6 розділів основної частини (аналітичний огляд літератури, матеріал та методи, три розділи результатів власних досліджень, аналіз і узагальнення результатів досліджень) висновків, практичних рекомендацій та списку використаних літературних джерел. Робота ілюстрована 39 таблицями і 42 рисунками. Повний обсяг дисертації – 183 сторінки, із них 157 сторінок складає основна частина. Список літератури викладений на 26 сторінках та містить 245 джерел (119 кирилицею, 126 латиницею).

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. В дисертації узагальнено результати дослідження хворих на ДЕП (МКХ–10 167.8; F07.3). Обстежено 186 осіб чоловічої статі; із них 103 УЛНА на ЧАЕС, опромінених в діапазоні доз від 0,25 до 3,80 Зв; 53 хворих на ДЕП, доза опромінення яких не перевищувала межі природного фону, та 30 практично здорових осіб. Хворі перебували на лікуванні у клінічних відділеннях НЦРМ АМН України. Клінічний діагноз та стадію захворювання ДЕП встановлено у відділі радіаційної психоневрології ІКР НЦРМ АМН України. Аналіз клінічних проявів ДЕП, органічного ураження головного мозку проводили з використанням діагностичних критеріїв та класифікацій, які застосовують у відділі радіаційної психоневрології ІКР НЦРМ АМН України та викладено у методичних рекомендаціях [Нягу А.И. и др., 1998; Логановський К.М. та ін., 2005].

В залежності від індивідуальної дози опромінення, наведеної у офіційних документах, досліджувані були розподілені на три групи:

1. Хворі на ДЕП, опромінені в межах природного фону – нозологічний контроль. Вік обстежених складав у середньому 47,9 ± 0,84 р.

2. Хворі на ДЕП УЛНА на ЧАЕС, які знаходились у 30–ти кілометровій зоні ЧАЕС з квітня по грудень 1986 р. Вік обстежених 46,5 ± 0,78 р. Дози опромінення в межах 0,25 – 0,9 Зв та у середньому складали 0,5 ± 0,32 Зв. У період відновлення після опромінення жоден з обстежених не мав гематологічних ознак кістково–мозкового синдрому.

3. УЛНА на ЧАЕС, які у 1986 році перенесли ГПХ I–III ступеню тяжкості, хворі на післярадіаційну енцефалопатію [Нягу А.И. и др., 1998]. Вік обстежених 51,6 ± 1,41 р. Дози опромінення, за даними визначення хромосомних аберацій, становили 1,0 – 3,8 Зв та у середньому 1,7 ± 0,12 Зв. Умови опромінення, питання перебігу та лікування кістково–мозкового синдрому детально описані в оглядах [Гуськова А.К и др. 1987; Киндзельский А.С. и др., 2002].

4. Практично здорові особи без функціональних і органічних порушень ЦНС – контрольна група. Вік обстежених у середньому складав 41,7 ± 1,07 р. Пацієнти не піддавались впливу іонізуючого випромінювання, що перевищує значення природного радіаційного фону.

Клініко–імунологічне дослідження проводили як складову частину комплексного обстеження хворих, що використовують в ІКР НЦРМ АМН України. Обстеження проведене у період 2000–2004 рр.

Більшість обстежених до аварії на ЧАЕС були практично здорові. Спектр хронічної соматичної і психоневрологічної патології в УЛНА на ЧАЕС був сформованим в перші 6 років після аварії. Хронічну патологію органів дихання (хронічний бронхіт) реєстрували у 29% осіб з ГПХ в анамнезі; у групі досліджуваних, дози опромінення яких не перевищували 1 Зв – у 22% осіб; у першій групі хронічний бронхіт виявили у 32% осіб. Захворювання системи травлення у реконвалесцентів ГПХ виявили у 60% осіб, у другій групі дану патологію спостерігали у 32% обстежених, у групі нозологічного контролю – у 26% осіб. Серцево–судинну патологію (гіпертонічна хвороба, ішемічна хвороба серця) – виявили у 51% обстежених. Аналіз даних загальноклінічного обстеження хворих не виявив суттєвих відмінностей у частоті вказаних патологічних станів між групами. Таким чином, вплив параметрів загального стану та супутньої патології на ІС в усіх групах можна вважати рівноцінним.

Дослідження імунного статусу проводили за рекомендаціями по обстеженню осіб, які постраждали від дії іонізуючої радіації [Чумак А.А. та ін., 1991, 1998]. Концентрацію імуноглобулінів основних класів у сироватці крові визначали за методом Manchini G. et al. (1965). Визначення рівнів ЦІК проводили методом селективної преципітації у градієнті поліетиленгліколю з фотометричним визначенням щільності преципітату [Гашкова В. и др., 1987]. Субпопуляційний склад лейкоцитів та експресію поверхневих антигенів визначали методом протічної цитофлуориметрії у прямому імунофлуоресцентному тесті за допомогою панелі моноклональних антитіл (МКАТ) серії Leu фірми Becton Dickinson (BD) методом дво– та трьохкольорового аналізу. Використовували комбінації МКАТ з метою визначення антигенів CD45/CD14 – диференціювання лімфоцитів, моноцитів та гранулоцитів; CD3/CD19 – визначення загальної кількості Т– та В–клітин; CD4/CD8 – оцінки регуляторних субпопуляцій Т–лімфоцитів; CD3/HLA–DR – виявлення стабільних Т–клітин та активних Т– і В–клітин; CD3/CD16CD56 – оцінки цитотоксичних Т–лімфоцитів (ЦТЛ) та природних кілерів (ПК). Контролем були мікросфери “CaliBRITE” (BD), помічені відповідно флуоресцеїну ізотіоціанатом (FITC) чи фікоеретрином (РЕ), та МКАТ до імуноглобулінів миші IgG1 – FITC / IgG2a – PE.

Кров відбирали з ліктьової вени у пробірки, що містили гепарин в концентрації 20 од/мл. На дно пластикової пробірки вносили 10 мкл МКАТ та 50 мкл цільної периферичної крові. Змішували протягом 3 с на вортексі та інкубували при температурі 27?С, 20–30 хв у темряві. Для лізису еритроцитів використовували Lysing Solution (BD).

Цитофлуориметричний аналіз проводили у лінійному режимі підсилення для показників прямого (FSC) і бокового (SSC) світлорозсіювання та у логарифмічному для показників флуоресценції FITC (FL–1) та РЕ (FL–2). Коефіцієнти електронної компенсації спектрів флуоресценції складали 0,9% для FL–1 та 17,2% для FL–2. Дослідження здійснювали на лазерному протічному цитофлуориметрі FACScan (BD) з аргоновим лазером (довжина хвилі 488 нм). Математичну обробку первинних даних проводили у програмі LYSYS II.

Активацію лімфоцитів оцінювали за кількістю клітин, що експресують маркери активації (МА) – рецептори до ІЛ–2 (CD25), рецептори до трансферину (CD71) та антигени гістосумісності ІІ класу (HLA–DR). Досліджували спонтанну експресію МА, здатність лімфоцитів in vitro відповідати на мітоген (за підвищенням вмісту клітин, що експресують МА) та вплив ОП на процес мітоген–залежної активації. Коефіцієнти активації (КА) обчислювали окремо для кожного МА як відношення відсотку клітин, що експресують МА після інкубації з мітогеном, до відсотку клітин, що експресують МА спонтанно. Для індукції активації та проліферації лімфоцитів використовували класичний мітоген – Конканавалін А (Кон А) у концентрації 5 мкг/мл [Ярилин А.А., 1999; Lazda V., Baram P., 1974].

Мононуклеари виділяли з периферичної крові в одноступеневому градієнті фікол–верографіну (d = 1,076–1,078 г/мл). Суспензію мононуклеарів периферичної крові (МПК) готували у концентрації 5 х 106 клітин/мл у повному живильному середовищі на основі RPMI–1640 (“SIGMA”, США), L–глутаміну – 300 мкл/мл, гентаміцину – 60 мкг/мл (“PHARMACHIM”, Болгарія), HEPES (“SIGMA”, США). В об’ємі 200 мкл МПК інкубували 24 год з Кон А при 37?С в присутності СО2 .

З метою визначення впливу фізіологічних концентрацій ОП на лімфоцити та процеси мітоген–індукованої активації МПК до суспензії клітин додавали б–ендорфін М 10–6 та в–ендорфін М 10–8 (“SIGMA”, США); паралельно проводили інкубацію МПК з ендорфінами та налоксоном М 10–6 (“SIGMA”, США). МПК центрифугували (200g) 5 хв у 2 мл забуференого фосфатами фізіологічного розчину (ЗФР), відбирали супернатант, ресуспендували у 20 мкл ЗФР та кон’югували з МКАТ до кластерів диференціації – CD3, CD4, CD25, CD71– FITC і CD19, CD8, CD16, CD56, HLA–DR – РЕ.

Для оцінки проліферативної активності лімфоцитів використовували метод розподілення клітин за фазами клітинного циклу [Пинегин Б.В., 2001]. Пермеабілізацію клітинної мембрани МПК проводили з використанням Permeabilizing Solution за рекомендаціями фірми виробника (BD). Зафарбовували пропідій йодидом в концентрації 5 мкг/мл, інкубували 20 хв у темряві. При цитофлуориметрії реєстрували червоний спектр флуоресценції (FL–2) пропідій йодиду для 50 клітин, визначали процент диплоїдних клітин (фази G0/G1), процент клітин у S– та G2+M–фазах.

Статистичний аналіз проводили за рекомендаціями [Бююль А. и др., 2002; Лапач С.Н. и др., 2002; Сигел Э., 2004]. Обробку та презентацію статистичних даних за параметричними критеріями, варіаційний та регресійно–кореляційний аналіз здійснювали в електронних таблицях SPSS V. 10.05 у середовищі Microsoft Windows.

Аналіз і узагальнення результатів досліджень. Проведені в УЛНА на ЧАЕС дослідження субпопуляційного складу лімфоцитів та показників гуморального імунітету дозволили охарактеризувати стан імунної реактивності хворих на ДЕП та виявити типові порушення в ІС у віддалений період після опромінення.

Аналіз показників загальної популяції Т–лімфоцитів у хворих на ДЕП опромінених у дозах понад 1 Зв, показав наявність Т–клітинного дефіциту. Встановлено зниження середньогрупових значень процентного вмісту і абсолютної кількості СD3+ клітин (p ? 0,01, p ? 0,05). У 58% хворих на ДЕП, які потерпіли від ГПХ, виявлено зниження експресії CD3 рецептору, що може служити доказом прихованого дефекту Т–ланки ІС. Встановлено негативну кореляцію дози опромінення та відсотку СD3+ (r = –0,270; p < 0,01). З підвищенням дози опромінення знижується вміст Т–лімфоцитів (рис. 1).

У контрольній групі визначено реципрокну залежність вмісту стабільних CD3+HLA–DR– та активованих Т–клітин. У групах хворих на ДЕП з дозами опромінення, меншими за 1 Зв, та з ГПХ в анамнезі, спостерігали зворотній ефект з вірогідно більшою частиною HLA–DR– „стабільних” Т–клітин відносно до загальної популяції, а у порівнянні з популяцією CD3+ відповідних груп даний показник практично не змінюється.

У опромінених осіб виявлені достовірні зміни активованих CD3+HLA–DR+ Т–клітин; на рівні середньогрупових значень даний показник знижений (p ? 0,05). Частотний аналіз вмісту CD3+HLA–DR+ клітин показав зниження активації Т–лімфоцитів. Зменшення кількості CD3+HLA–DR+ активованих клітин більш виражене у групі з дозою опромінення, меншою за 1 Зв (46%, по відношенню до 39% у групі з дозою опромінення понад 1 Зв та 36% серед хворих на ДЕП з групи порівняння). Зниження пропорції активованих Т–клітин у хворих на ДЕП можна вважати проявом зростаючої декомпенсації ІС.

CD3, %

Доза, Зв

Рис. 1. Крива вмісту СD3+19– Т–лімфоцитів у хворих на ДЕП в залежності від дози опромінення.

У пацієнтів, які зазнали опромінення виявлено дисбаланс імунорегуляторних субпопуляцій. На фоні зниження кількості CD4+8– клітин визначено підвищення CD8+4– клітин; даний показник наближається до верхньої межі нормальних значень і характеризує наявність в організмі імуносупресії. Достовірно (р ?0,01) зниженим є коефіцієнт CD4+/CD8+ (табл. 1).

Наявність дисбалансу імунорегуляторних субпопуляцій лімфоцитів встановлено у значної кількості хворих на ДЕП. Всього серед обстежених виявлено 49,3% осіб зі зміненим коефіцієнтом CD4+/CD8+. Зниження імунорегуляторного коефіцієнту (<1,2) реєстрували у 43,8%, а підвищення даного показника (>2,2) визначено у 5,5%. Частотний аналіз показав превалювання зниженого імунорегуляторного коефіцієнту (<1,2) у опромінених. У хворих на ДЕП з дозою опромінення 0,25 – 0,9 Зв зниження CD4+/CD8+ встановлено у 48% хворих на ДЕП; у реконвалесцентів ГПХ, опромінених дозою понад 1 Зв, у 53% обстежених. У групі нозологічного контролю зниження даного коефіцієнту виявили у 20% обстежених, що не вплинуло на середньогрупові показники. Встановлено негативну кореляцію дози опромінення та CD4+8– субпопуляції Т–хелперів (r = –0,254; p<0,01), а також перерозподілу імунорегуляторних популяцій CD4+/CD8+ (r = –0,207; p < 0,05). Із збільшенням дози опромінення відмічено зниження даних показників. Це дозволяє припустити, що зниження CD3+4+ клітин обумовлене дією іонізуючого випромінювання і відповідає експериментальним даним про пізній Т–хелперний дефіцит з ураженням радіочутливих камбіальних елементів епітеліального ретікулуму вилочкової залози та розвитком дефекту тимічного мікрооточення [Савина Н.П., 1999; Ярилин А.А., 1997]. Такі зміни тимусу і ефекти, що їх супроводжують, ідентичні тим, що відбуваються при фізіологічному старінні.

Таблиця 1

Вміст CD4+ та CD8+ субпопуляцій периферичної крові у хворих на ДЕП

Показники |

Вміст клітин

в залежності від поглинутої дози

Контрольна

група

(n=30)

M±SD | ДЕП

(n=53)

M±SD | ДЕП < 1 Зв

(n=53)

M±SD | ДЕП > 1 Зв

(n=50)

M±SD

CD4+8–

Т–хелпери | % | 42,7±1,16 | 41,6±1,11 | 38,5±1,03** | 38,1±1,12**

Г/л | 0,8±0,03 | 0,9±0,04 | 0,8±0,05* | 0,7±0,04**

CD8+4–

Т–супресори | % | 29,3±0,90 | 28,1±1,01 | 33,1±1,25** | 31,3±0,87**

Г/л | 0,6±0,02 | 0,6±0,03 | 0,7±0,03 | 0,6±0,03**

CD4+/CD8+ | 1,5±0,08 | 1,6±0,09 | 1,3±0,07** | 1,3±0,06**

Примітка.

*, ** – вірогідність розбіжностей з показниками контрольної групи p < 0,05, p < 0,01 відповідно.

Дослідження кількісного складу ПК та ЦТЛ показало достовірне збільшення середніх значень абсолютного числа цитотоксичних CD3+16+56+ лімфоцитів та зниження відсотку CD3–16+56+ у групі нозологічного контролю (р ? 0,05). У опромінених пацієнтів, хворих на ДЕП, визначено підвищення як абсолютного, так і процентного вмісту клітин з фенотипом ЦТЛ (р ? 0,05).

Характерним для хворих на ДЕП є підвищення концентрації ЦІК, даний показник виходить за межі нормальних значень (>30). У групі нозологічного контролю концентрація ЦІК 4,16% достовірно відрізняється від такої у контрольній групі (р ? 0,05). У більшості випадків це пов’язано з наявністю хронічної патології, що сприяє утворенню ЦІК, які з урахуванням механізмів рециркуляції можуть призвести до формування імунокомплексного синдрому та обтяжити перебіг захворювання.

Аналіз спонтанної та мітогенної активації лімфоцитів виявив, що у хворих на ДЕП, розвиток патології супроводжується зниженням CD4–25+ Т–супресорів (p < 0,01). У групі нозологічного контролю відповідь на мітоген проявляється зниженням проліферативної активності на ранніх стадіях клітинного циклу. Встановлено гальмування активаційних процесів на стадії розпізнавання антигену у комплексі з HLA–DR молекулами та зниження експресії HLA–DR рецептору на CD3+ лімфоцитах. Зниження проліферації CD3+HLA–DR+ клітин може пояснюватись як недостатністю синтезу ІЛ–1, так і зміною рецепторного апарату клітин–акцепторів і, як наслідок, можливе сповільнення процесів диференціації та індукції антитілоутворювання.

У хворих на ДЕП, опромінених в діапазоні доз 0,25 – 0,9 Зв, виявлено надмірну спонтанну активацію Т–клітин. Визначено збільшення числа лімфоцитів у G1–фазі та підвищення кількості активованих CD3+ клітин з експресією CD25 антигенів (p < 0,05). Високу інтенсивність флуоресценції ІЛ–2 рецептора виявлено на CD3+4+ клітинах одночасно з достовірним підвищенням вмісту CD3+25+ клітин відносно CD3+HLA–DR+ лімфоцитів. Підвищена спонтанна проліферативна активність лімфоцитів свідчить, що у даній групі обстежених має місце ендогенна активація. А це, поряд із зниженням кількості Т–клітин і збільшенням ЦІК, може мати особливе значення у плані розвитку аутоімунної патології. На етапі відновлення субпопуляційного складу клітин ІС у віддалений період після опромінення такий стан можна пояснити як напруження, або стимуляцією імунної відповіді, що можливо, є наслідком дії опромінення у малих дозах. Реакція на мітоген характеризується накопиченням лімфоцитів у G1–фазі. Стимуляція Кон А призводить до зниження вмісту CD3+ клітин, тоді як кількість CD3+HLA–DR+ лімфоцитів не змінюється. Більш пізні етапи активації супроводжуються блокуванням виходу клітин у S–фазу синтезу ДНК та зниженням проліферації CD25+ клітин. Це може пояснюватись дефіцитом синтезу ІЛ–2, свідчити про зниження функціональних властивостей Т–клітин і виснаження резервів попередників Т–лімфоцитів внаслідок неспецифічної активації малими дозами радіації. Зниження кількості клітин у S–, G2–M– фазах клітинного циклу також може бути доказом змін компенсаторних можливостей лімфоцитів. У даній групі можуть переважати механізми гуморальної імунної відповіді.

За даними спонтанної експресії МА, у хворих на ДЕП реконвалесцентів ГПХ, виявлено зниження флуоресценції рецепторів активації HLA–DR, рецепторів до ІЛ–2 та трансферину (p < 0,05). Поряд із зниженням проліферативних властивостей лімфоцитів відбувається зниження вмісту активованих Т–клітин. У більшості реконвалесцентів ГПХ виявлено достовірне збільшення вмісту клітин з пошкодженою ДНК. Поряд з цим, у відповідь на Кон А на всіх етапах клітинного циклу визначено збільшення кількості проліферуючих клітин. Надмірну проліферацію Т–лімфоцитів відмічено на всіх стадіях активації, а достовірних змін середньогрупових значень вмісту активованих HLA–DR+ Т–клітин не виявлено. Підвищення щільності CD25 рецептору більш виражене на мембрані CD8+ клітин. У процесі імунної відповіді така надмірна активація Т–супресорів може викликати імуносупресію антигенспецифічних лімфоцитів із подальшим пригніченням імунної реактивності на антиген в цілому. Така ситуація може призвести до неконтрольованого виходу клонів імунокомпетентних клітин і спричинити розвиток лімфопроліферативних захворювань. Кількість фрагментів ядер з виходом низькомолекулярної ДНК, незважаючи на підсилення проліферативних властивостей лімфоцитів, майже не змінюється у відповідь на Кон А. Це може свідчити про певну незалежність процесів активації та альтруїстичної загибелі клітин шляхом апоптозу.

Аналіз результатів дослідження вказує на зміни в організації та функціонуванні лімфоцитів, пов’язаних як з поглинутою дозою, так і з наявністю соматичної або функціональної патології ЦНС у віддалений період після опромінення. Так, ДЕП сприяє розвитку клітинноопосередкованій цитотоксичності, про що говорить збільшення популяції ЦТЛ з фенотипом CD3+16+56+, здатних до лізису клітин–мішеней у відсутності специфічних антитіл та комплементу. Індукція ЦТЛ, у даному випадку, можлива при сенсибілізації організму антигенами головного мозку, нейроспецифічними білками (НСБ) – основним білком мієліну (ОБМ), білком S–100, нейроспецифічною енолозою (НСЕ) та ін. Факт підвищення концентрації антигенів мозку та рівню антитілоутворення до НСБ у периферичній крові УЛНА на ЧАЕС хворих на ДЕП описано у роботах [Лісяний М.І., Любич Л.Д., 2001; Степаненко В.І., 2004]. Поряд з цим, у хворих на ДЕП встановлено тенденцію до зниження популяції CD3–16+56+ ПК, активних головним чином до вірусінфікованих та пухлинних клітин. Зміни у кількісному складі, а саме – зменшення CD3–16+56+ клітин–ефекторів корелює з послабленням контролю за ростом пухлин. Надлишок преципітатів ЦІК, що відмічається у хворих на ДЕП, може викликати феномен імунної блокади цитопатогенної дії кілерної активності та призводити до загострення запального процесу.

Встановлено внесок радіаційного фактору у процес формування імунологічної реактивності при ДЕП. Серед УЛНА за показниками середніх та абсолютних значень реєстрували зниження відсотку CD4+8– клітин Т–хелперів та підвищення рівню CD8+4– клітин Т–супресорів. Відношення регуляторних субпопуляцій знаходиться на нижній межі норми і є достовірно зниженим у порівнянні з контрольною групою (p ? 0,01). У реконвалесцентів ГПХ реєстрували зменшення пулу загальної популяції Т–лімфоцитів до 51,1% та помітне зниження експресії CD3 рецептору. У цій групі виявлено найбільшу кількість осіб із зниженням активації Т–лімфоцитів, хоча зменшення кількості CD3+HLA–DR+ активованих клітин відмічається у всіх групах спостереження з ДЕП. Зниження активації Т–лімфоцитів встановлено як у хворих на ДЕП з дозами опромінення до 1 Зв, так і у осіб, які не зазнали радіаційного впливу, але у останніх такий стан реєструється у меншої кількості хворих. У опромінених осіб хворих на ДЕП, як і у групі нозологічного контролю, також має місце факт можливої сенсибілізації організму, на що вказує збільшення кількості ЦТЛ. Відмічається підвищення як процентного так і абсолютного вмісту клітин з фенотипом CD3+16+56+; в осіб з дозами опромінення до 1 Зв даний показник виходить за межі нормальних значень.

Наведені дані вказують на те, що у хворих на ДЕП, які перенесли ГПХ або були опромінені у дозах близьких до тих, що викликають ГПХ, а також у значної кількості осіб, опромінених в межах малих доз, у віддалений період після опромінення зберігається пригнічення Т–хелперної ланки ІС на тлі підвищення пропорції ЦТЛ. Встановлене зниження функціональної активності із зменшенням відповіді лімфоцитів на дію специфічних та неспецифічних стимуляторів, що може супроводжуватись різноспрямованими порушеннями ІС – імунодефіцитними станами, аутоімунними процесами. Така динаміка вивчених показників відображає низькі резервні можливості пулу клітин та ІС в цілому і може розцінюватись як комбінований тип імунологічних змін. Радіаційний фактор, у даному випадку, сприяє загостренню імунопатологічного стану та нейроімунного конфлікту. У ряді випадків такі пострадіаційні ефекти в ІС класифікують як вторинну імунологічну недостатність [Чумак А.А. и др., 1994]. Разом з тим, аналіз трендів змін параметрів ІС свідчить про те, що істотне значення для динаміки взаємодії нервової та імунної систем має не характер неврологічних відхилень, а сам факт їх наявності. Можливим поясненням може бути спільність патогенетичних механізмів аналізованих патологічних змін, проникнення НСБ, ОБМ, S–100 у периферію [Базика Д.А. та ін., 2000; Лісяний М.І., Любич Л.Д., 2001; Степаненко В.І., 2004], порушення метаболізму і рецепції біологічноактивних речовин, які мають імунотропну активність, в тому числі ендогенних ОП.

Проведено дослідження опіоїд–імунних взаємодій у хворих на ДЕП, що дозволило охарактеризувати вплив ендорфінів на структурнофункціональну організацію імунокомпетентних клітин та визначити особливості опіоїдної регуляції імунної відповіді і процесів активації лімфоцитів.

У хворих на ДЕП – та –ендорфіни in vitro впливають на основні популяції лімфоцитів. Ефект ендорфінів опосередкований переважно за рахунок зв’язування їх із класичними ОР лімфоцитів.

Ендорфінам властива позитивна імуномодуляція субпопуляційної організації лімфоцитів. Встановлено відновлення вмісту CD3+ клітин при імунологічній недостатності віддаленого періоду після опромінення (рис. 2).

У хворих на ДЕП із зниженим вмістом CD3+ лімфоцитів ( 55%) під впливом фізіологічних концентрацій ОП виявлено достовірне збільшення CD3+ клітин (р 0,01). Різниці між впливом – та –ендорфінів не спостерігали. Налоксон, антагоніст ОР, відміняє дію ендорфінів. Змін експресії CD3 рецептору після інкубації з ендорфінами не визначено.

ОП здійснюють суттєвий модулюючий ефект на регуляторні субпопуляції Т–лімфоцитів. За середньогруповими показниками у здорових осіб, хворих на ДЕП та у пацієнтів, опромінених в діапазоні доз від 0,25 – 0,9 Зв, встановлено достовірне підвищення вмісту Т–хелперів та збільшення експресії CD4 антигену (р 0,05). Кількість Т–супресорів достовірно знижена лише у контрольній групі; у хворих на ДЕП відмічено тенденцію до зниження даного показника (табл. 2).

Інтенсивність експресії CD8 молекул на лімфоцитах не змінюється відносно контрольних значень в усіх обстежених. Попередня інкубація з налоксоном відміняє регуляторні впливи ОП. За рахунок підвищення експресії CD4 антигену та збільшення кількості Т–хелперів ендорфіни підвищують CD4+/CD8+ співвідношення.

Аналіз результатів впливу ОП на ЦТЛ та ПК показав зміни переважно у кількісному складі CD3+16+56+ клітин (р 0,05). У хворих на ДЕП із зниженим вмістом ЦТЛ ( 3%) – та –ендорфіни in vitro стимулюють утворення CD3+16+56+ клітин, а у випадку коли даний показник перевищує норму (> 8%) виявлено достовірне його зниження. Налоксон відміняє регуляторний вплив –ендорфіну. А–ендорфін достовірно (р 0,05) підвищує вихід ПК у здорових осіб на 38,7%. У групі нозологічного контролю, у хворих з нормальним вмістом CD3–16+56+ клітин, б–ендорфін збільшує кількість ПК на 46,7%. Поряд із цим, у опромінених з нормальним вмістом CD3–16+56+ клітин б–ендорфін знижує відсоток ПК, при ДЕП з дозою опромінення, менше 1 Зв на 32% та, відповідно, при ДЕП з дозою понад 1 Зв на 20,6%. У хворих на ДЕП із зміненими показниками ПК ( 8%; 13%), незалежно від дози опромінення, ОП не впливають на кількість CD3–16+56+ клітин. Флуоресценція специфічних антитіл рецептору ПК після інкубації з ендорфінами також достовірно не змінюється.

Таблиця 2

Вплив in vitro – та –ендорфінів та налоксону на популяції CD4+ і CD8+

лімфоцитів у хворих на ДЕП в залежності від дози опромінення

Дослід | Попу

ляція | Вміст клітин (%)

Контрольна

група

(n=30)

M±SD | ДЕП

(n=53)

M±SD | ДЕП 1 Зв

(n=53)

M±SD | ДЕП 1 Зв

(n=50)

M±SD

контроль | CD4+ | 41,82,5 | 39,73,6 | 35,03,5 | 45,63,0

CD8+ | 32,73,6 | 30,13,7 | 34,13,6 | 31,11,1–

ендорфін | CD4+ | 53,72,9* | 51,03,1* | 44,33,1* | 34,13,0*

CD8+ | 19,53,3* | 29,23,1 | 28,93,1 | 31,71,5

налоксон +–

ендорфін | CD4+ | 44,42,4 | 39,83,5 | 35,73,6 | 35,73,0*

CD8+ | 32,83,0 | 30,03,5 | 34,33,5 | 32,31,6–

ендорфін | CD4+ | 55,12,8* | 52,63,3* | 46,33,4* | 30,22,8*

CD8+ | 21,72,4* | 28,33,0 | 29,22,7 | 31,61,6

налоксон +–

ендорфін | CD4+ | 45,63,4 | 41,93,0 | 34,93,4 | 34,82,8*

CD8+ | 30,53,1 | 30,43,7 | 34,33,5 | 32,42,0

Примітка.

* – вірогідність розбіжностей з контролем p < 0,05.

Виявлено регуляторні впливи ОП на В–лімфоцити. Виражений модулюючий ефект ендорфінів на субпопуляцію В–клітин встановили в осіб із зниженим вмістом CD3–19+ ( 8%). У групі нозологічного контролю та в опромінених дозами, понад 1 Зв – та –ендорфіни в однаковій мірі нормалізують вміст В–лімфоцитів та достовірно збільшують кількість CD3–19+ на 70%. Налоксон відміняє дію ОП. Поряд з цим, у опромінених в межах 0,25 – 0,9 Зв із зниженим вмістом В–клітин ендорфіни не змінюють даний