Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна

Гладковська Наталя Олександрівна

УДК 577.32

Спектрофотометричний аналіз зв'язування біологічно активних лігандів з молекулами ДНК

03.00.02. – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова

НАН України (м. Харків)

Науковий керівник:

доктор фізико-математичних наук, професор

Малєєв Володимир Якович, Інститут радіофізики та електроніки

ім. О.Я. Усикова НАН України, старший науковий співробітник

відділу біофізики

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор Сорокін Віктор Олександрович, Фізико-технічний інститут низьких температур

ім. Б.І. Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник

відділу молекулярної біофізики (м. Харків);

кандидат фізико-математичних наук, доцент Євстигнєєв Максим

Павлович, Севастопольський національний технічний університет,

доцент кафедри фізики.

Провідна установа:

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,

кафедра біофізики.

Захист відбудеться " 9 " 06 2006 року о 15 годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному

університеті ім. В.Н. Каразіна, 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна, 61077, м. Харків,

пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий " 6 " 05 2006 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Взаємодія малих молекул з ДНК активно вивчається останні десятиліття з метою з'ясування молекулярних механізмів і розвитку технологій синтезу нових ефективних лікарських препаратів. Багато малих молекул - лігандів, що в експериментах іn vіtro зв'язуються з ДНК, використовуються як лікарські препарати, не дивлячись на те, що механізми їхньої дії повністю не з'ясовані. В останні роки інтерес до цієї області досліджень зростає у зв'язку з розвитком біотехнологічної індустрії, що дозволяє використовувати відносно недорогі методи тестування будь-яких новосинтезованих лікарських препаратів на молекулярному рівні і прогнозувати їхню ефективність на рівні клітин. Дослідження іn vіtro комплексоутворення таких малих молекул з нуклеїновими кислотами (ДНК, РНК, олігонуклеотидами) є одним з основних напрямків в області створення нових протипухлинних препаратів. Розробка методик, що дозволяють швидко, якісно і без особливих витрат оцінювати термодинамічні параметри і механізми зв'язування біологічно активних речовин з НК, є на даний момент актуальною задачею.

У представленій дисертаційній роботі запропоновано новий комплексний підхід до аналізу спектрофотометричних даних у системах ДНК - біологічно активний ліганд. Ефективність запропонованого підходу була перевірена при вивченні комплексоутворення двох біологічно активних лігандів: актиноцинового похідного актиноцил-біс-(діметиламіноетил) аміна (Act ІІ) і нуклеозиду 6-азацитідіну (6AZC) з молекулами ДНК. Актиноцинове похідне Act ІІ є аналогом відомого протипухлинного антибіотика актиноміцину D, що використовується при лікуванні деяких типів захворювань, у тому числі й онкологічних. Біологічно активний нуклеозид 6AZC також використовується при лікуванні деяких типів онкологічних захворювань (лейкемія). Молекулярні принципи взаємодії Act ІІ і 6AZC з полінуклеотидними матрицями різні, тому що речовини, які досліджуються, мають різні потенційні можливості для зв'язування з молекулами ДНК. Можливості спектрофотометричного аналізу для характеристики комплексоутворення лігандів з ДНК вважаються досить обмеженими. Ми пропонуємо такий підхід, при якому поєднання спектрофотометричних вимірів і розрахункових методів дозволяють одержувати більш повну інформацію про спектральні і термодинамічні характеристики всіх комплексів, що утворюються, у системах ліганд - ДНК.

Зв'язок роботи з науковими програмами планами, темами.

Дослідження за темою дисертації проводилися згідно з планом науково-дослідницьких робіт відділу біофізики Інституту радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України в рамках фундаментальних держбюджетних НДР: "Фізичні механізми взаємодії новосинтезованих біологічно активних речовин з гідратованою ДНК" (Шифр "Ліганд", номер держреєстрації 0100U006336, постанова Бюро ВФА НАН України від 24.10.2000, протокол № 9, 2001-2003 рр.); "Дослідження взаємодії електромагнітних та акустичних полів, а також електронних пучків з твердотільними та біологічними структурами" (Шифр "Структура", номер держреєстрації 0102U003139, постанова Бюро ВФА НАН України від 19.02.02, протокол № 2, 2002-2006 рр.); " Дослідження енергетичних та гідратаційних характеристик взаємодії біологічно активних речовин з полінуклеотидними та колагеновими матрицями" (Шифр "Спіраль", номер держреєстрації 0103U002268, постанова Бюро ВФА НАН України від 27.11.2003, протокол № 11, 2004-2006 рр.).

Мета і задачі дослідження. Метою цієї роботи є розробка нових спектрофотометричних методик, що дозволяють аналізувати поглинання суміші ліганд - НК на основі розрахункових методів комп'ютерного моделювання. За допомогою цих методик можна одержати інформацію про особливості зв'язування лігандів з НК при різних іонних силах і температурах, а також розраховувати термодинамічні параметри зв'язування. У роботі на прикладі реальних систем ліганд - поліелектроліт показано практичне застосування розробленого нами підходу. У роботі були поставлені і вирішувались наступні задачі:

- Порівняти наявні теоретичні моделі, що дозволяють адекватно описувати спектрофотометричні концентраційні залежності в досліджуваних системах ліганд - ДНК, і вибрати для кожної розглянутої системи оптимальну модель.

- Розглянути ефективність використаного нами підходу у випадку, коли поглинання ліганду і поліелектролітної матриці не збігаються (Act ІІ і ДНК), і коли поглинання біологічно активної речовини і поліелектроліту дуже близькі (6AZC і ДНК).

- Провести спектрофотометричний аналіз комплексоутворення похідного актиноцина Act ІІ з матрицями поліфосфату і ДНК різного АТ-, ГЦ- складу в залежності від іонної сили і температури розчинів.

- Дослідити різницю в процесах зв'язування біологічно активного нуклеозиду 6AZC з нативной ДНК і з ДНК зі структурними ушкодженнями.

- Використовуючи обрані моделі зв'язування за допомогою розроблених нами алгоритмів і відповідних комп'ютерних програм оптимізації в системах ліганд - поліелектроліт розрахувати спектральні (молярні коефіцієнти екстинкції для всіх комплексів, що утворюються) і термодинамічні (величини констант і місць зв'язування) параметри при різних іонних силах і температурах.

- Використовуючи отримані температурні залежності констант зв'язування розрахувати термодинамічні параметри зв'язування ?G, ?H, ?S у сумішах Act ІІ - ДНК і 6AZC - ДНК.

- Порівняти величини зсуву температур плавлення ?Тm, які отримані з експериментальних кривих плавлення сумішей (Act ІІ - ДНК різного АТ-, ГЦ - складу і 6AZC - ДНК, яка виділена з опромінених тварин) з результатами теоретичних розрахунків.

Об'єктом досліджень є комплекси біологічно активних лігандів з поліаніонами, включаючи поліфосфат, ДНК різного АТ-, ГЦ - складу і ДНК з ушкодженнями в структурі.

Предмет дослідження: моделювання процесів комплексоутворення в сумішах ліганд - поліелектроліт на основі аналізу спектрофотометричних концентраційних залежностей.

Методи дослідження: спектрофотометричне титрування у видимій та ультрафіолетовій областях спектра, дослідження кривих плавлення полінуклеотидів в УФ-області спектра, чисельні методи комп'ютерного моделювання комплексоутворення в системах ліганд - поліелектроліт.

Наукове значення і новизна. У даній роботі розроблено новий підхід до аналізу спектрофотометричних концентраційних залежностей у сумішах ліганд - поліелектроліт. Використовуючи запропоновану методику, можна вибирати оптимальну модель комплексоутворення, одержувати детальну інформацію про типи комплексів і їх стехіометрію, обчислювати спектральні і термодинамічні параметри зв'язування лікарських препаратів з полінуклеотидними матрицями при різних іонних силах і температурах.

- Для кожної розглянутої суміші ліганд - ДНК, використовуючи програми оптимізації спектрофотометричних концентраційних залежностей, були розраховані величини констант і місць зв'язування;

- Для сумішей Act ІІ - ДНК розраховані спектри поглинання комплексів, що утворюються, у широкій області концентрацій при різних іонних силах і температурах. Отримані залежності констант зв'язування від іонної сили дозволили оцінити внесок поліелектролітних взаємодій (?Gpe) для кожного типу комплексів у загальну вільну енергію зв'язування;

- З аналізу температурних залежностей констант зв'язування в сумішах Act ІІ - ДНК і 6AZC - ДНК отримані величини термодинамічних параметрів ?G, ?H, ?S для кожного типу комплексів при різних концентраціях солі в розчині. Показано, що стабілізація комплексів Act ІІ з ДНК досягається в основному за рахунок енергії водневих зв'язків і конформаційних змін. Зв'язування 6AZC із ДНК відбувається за рахунок гідрофобних взаємодій;

- Отримано криві плавлення для всіх розглянутих зразків ДНК у відсутності та у присутності лігандів. Величини зсуву температур плавлення у всіх розглянутих системах ДНК - ліганд оцінено безпосередньо з експериментальних даних і порівняно з відповідними величинами, що отримані за допомогою розрахункових методів.

Практична цінність. Зв'язування лікарських препаратів із ДНК і полінуклеотидними матрицями відбувається різними способами (інтеркаляція, розміщення в малій і великій борозенках ДНК і ін.). Мультимодальність зв'язування в таких системах призводить до труднощів при визначенні спектральних характеристик різних типів комплексів, до неоднозначності при побудові ізотерм зв'язування в різних довжинах хвиль і при обчисленні термодинамічних параметрів комплексоутворення (констант і величин місць зв'язування). Розходження в молярних коефіцієнтах екстинкції зв'язаних з ДНК лігандів можуть спостерігатися при їхньому розміщенні на сусідніх і віддалених друг від друга місцях зв'язування: мономерно зв'язані й агреговані ліганди (кооперативне зв'язування). Крім того, деякі лікарські препарати можуть взаємодіяти з матрицею ДНК одночасно двома способами, шляхом інтеркаляції і розміщаючись у малій чи великій борозенках ДНК, виявляючи АТ- або GС- специфічність. У зв'язку з викладеним вище, важливо вміти обчислювати термодинамічні параметри зв'язування лігандів із ДНК з урахуванням розходжень у спектрах поглинання всіх комплексів, що утворюються.

Запропонована нами методика аналізу спектрофотометричних концентраційних залежностей сумішей ліганд - ДНК дозволяє досить швидко тестувати зв'язування будь-якого новосинтезованого препарату з НК, комбінуючи спектрофотометричні дослідження з чисельними методами комп'ютерного моделювання. Такий підхід дозволяє вибирати оптимальну модель зв'язування лікарських препаратів з полінуклеотидними матрицями, обчислювати спектральні і термодинамічні параметри комплексів, що утворюються, при різних іонних силах і температурах. Отримані оптимальні величини констант і місць зв'язування дозволяють розраховувати рівноважний склад сумішей ліганд - ДНК при будь-яких концентраціях реагуючих компонентів і вибирати такі співвідношення концентрацій лиганда і ДНК, у яких концентрація найбільш ефективно діючого комплексу (наприклад, інтеркаляція) максимальна. Додаткові дослідження сумішей ліганд - ДНК саме в цих концентраційних областях методами Раман- чи ІЧ- спектроскопії дозволяють визначити групи атомів лікарського препарату, що беруть участь в утворенні кожного типу комплексів.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих зі співавторами наукових працях особистий внесок здобувача складається: у роботах [1-3] участь у проведенні експериментальних досліджень по приготуванню і плавленню сумішей 6AZC - ДНК, обговоренні отриманих результатів по зв'язуванню біологічно активних нуклеозидів з матрицями ДНК різного ступеня деградації; у роботах [4-7] - у проведенні спектрофотометричного титрування сумішей Act ІІ - ДНК різного АТ-, ГЦ - складу при різних іонних силах і температурах, розрахунках по програмах оптимізації констант і величин місць зв'язування для різних типів комплексів, внеску поліелектролітних взаємодій і термодинамічних параметрів зв'язування ?G, ?H, ?S. У роботах [8-22] участь в експериментальних і розрахункових дослідженнях для всіх розглянутих систем, в аналізі літературних даних та разом зі співавторами в інтерпретації отриманих результатів.

Апробація роботи.

Основні результати дисертаційної роботи були представлені на:

· ІІ з'їзді Українського біофізичного товариства. Харків, 1998.

· XV Іnternatіonal School -Semіnar. Spectroscopy of Molecules and Crystals. Chernіhіv, 2001.

· Другій Харківській конференції молодих вчених. "Радіофізика і НВЧ електроніка". 2002.

· X Міжнародній конференції "Математика. Компьютер. Образование." Пущино. 2003 р.

· Третій Харківській конференції молодих учених. "Микроволновая электроника и радиолокация", Харків, Україна. Усна доповідь "Взаимодействие актиноциновых антибиотиков с молекулами ДНК разного АТ -, ГЦ – состава" відзначена дипломом І ступеня як краща доповідь у секції "Біофізика" (наказ № 2 від 16.01.2004)- 2004.

· 5th Іnternatіonal Conference on Bіologіcal Physіcs. ІSBP 2004, August 23-27, Gothenburg, Sweden.

· Четвертій Харківській конференції молодих вчених "Радиофизика и СВЧ электроника". Україна. Усна доповідь "Расчет термодинамических параметров связывания ?H, ?S, ?G для комплексов Act II – ДНКCl.perf. и Act II – ДНКM.lys. из спектрофотометрических данных " відзначена дипломом І ступеня як краща доповідь у секції "Біофізика" (наказ № 199/ОК від 15.12.2004)-2004.

· І Українській науковій конференції "Проблеми біологічної і медичної фізики". ПБМФ - 2004.Харків

· V Іnternatіonal Young Scіentіfіc Conference - SPO 2004. Problems of optіcs and hіgh technology materіal scіence. Kyіv. Ukraіne.

· Семінарах відділу біофізики ІРЕ НАН України.

· Семінарі харківського відділення Українського біофізичного товариства, Харків, 2006

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, шести розділів і висновків. Повний обсяг дисертації складає 140 сторінок, містить 59 рисунків, 11 таблиць, з них 1 рисунок розміщений на 1 окремому аркуші. Список використаних джерел містить 224 найменування на 22 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми дисертації, сформульовано мету і визначені задачі дослідження, відзначені наукова новизна і практичне значення роботи, приведені відомості про апробацію результатів.

У першому розділі представлено огляд літератури за темою дисертації. Розглянуто літературні дані, що на сучасному рівні висвітлюють комплексоутворення біологічно активних лігандів з молекулами ДНК. Висвітлено основні методи розрахунку параметрів зв’язування в системах ліганд – ДНК та вплив на них іонної сили та температури. Проаналізовано термодинамічні складові вільної енергії утворення різних типів комплексів лігандів з ДНК та наведено схеми ентальпійно-ентропійної компенсації.

У другому розділі коротко розглянуто фізичні основи використаних методів дослідження: спектрофотометрії у видимій та ультрафіолетовій областях; наведені характеристики вивчених препаратів.

Вимірювання спектрів поглинання сумішей ліганд – поліелектроліт при різних значеннях P/D, де P/D - відношення концентрації фосфатів поліелектролітів (Cp0) до концентрації ліганду (CD0), проводили в термостатованих кварцевих кюветах с довжиною оптичного путі 1, 2 та 10 мм на спектрофотометрі Specord M 40 у видимій та УФ областях спектру.

Поглинання сумішей ліганд – ДНК при любій довжині хвилі згідно закону Ламберта –Бера можливо представити у наступному вигляді:

, (1)

де Сi и ?i – концентрація та значення молярного коефіцієнту екстинкції кожної частинки в дослідженій системі, а l – довжина оптичного шляху.

Описано розрахунковий метод, що дозволяє на базі даних спектрофотометричних вимірювань за допомогою нелінійного метода найменших квадратів отримувати значення параметрів комплексоутворення в системах поліелектроліт – ліганд.

У розділі 3 наведено результати комплексоутворення в системі актиноцинове похідне Act II – поліфосфат (ПФ).

Рис. 1. Спектри поглинання сумішей Act II – ПФ у видимій області при постійній концентрації ліганду CActII= 4,6910-5 М та різних концентраціях поліфосфату при СNaCl=0,02 M (а); залежність поглинання суміші Act II – ПФ від концентрації поліфосфату (б).

З аналізу концентраційних залежностей спектрів поглинання сумішей Act II – ПФ, зроблено висновок, що в системі присутні декілька по-різному поглинаючих типів комплексів. Розрахунок рівноважного складу сумішей при заданих загальних концентраціях поліфосфату (СР0) і ліганду Act ІІ (СD0), а також концентраціях іонів натрію (СNa0), що додаються в систему, проводили по рівняннях (2.1)-(2.5) (програма оптимізації DALSPH). Рівняння (2.1)-(2.3) описують конкурентне зв'язування двох лігандів з матрицею ПФ із відповідними константами зв'язування К1 і К2 у припущенні, що один з лігандів це іон а+, а другий - Act ІІ. Величина місця зв'язування іонів а+ - n1=1, а величина місця зв'язування Act ІІ - n2, де n - число фосфатів, що зайняті зв'язаними лігандами на матриці ПФ. Рівняння (2.2) - (2.3) тотожні рівнянню МакГі і фон Хіппела для кооперативного зв'язування ліганду, а - фактор кооперативності, що характеризує утворення агрегатів на тих же місцях зв'язування. Рівняння (2.4) і (2.5) відбивають закон збереження загальних концентрацій іонів Na+ і лігандів.

(2.1)

(2.2)

(2.3)

(2.4)

(2.5)

У рівняннях (2.1)-(2.5): R1 і R2- долі зв'язаних іонів Na+ і Act ІІ, які дорівнюють частці від ділення відповідних рівноважних концентрацій на СP0; m1 і m2 - концентрації вільних іонів Na+ і мономера ліганду; КD - константа дімеризації Act ІІ. Величина характеризує імовірність розташування лігандів Act ІІ на сусідніх місцях зв'язування.

Розраховані по рівняннях (2.1)-(2.5) параметри зв’язування в системі Act - ПФ надано в таблиці 1. Видно, що термодинамічні параметри зв'язування Act із ПФ змінюються в залежності від P/D. Про це свідчать різні величини констант і місць зв'язування. З ростом P/D значення n і К збільшуються, що ми пов'язуємо з "розгортанням" ліганду щодо осі поліфосфату при утворенні комплексів по типу мономерного зв'язування.

Таблиця 1.

Параметри зв’язування лігандів Act з ПФ у трьох різних областях P/D, що були вичислені по моделі кооперативного зв’язування за допомогою програми оптимізації DALSPH. |

Act II - ПФ | P/DnK,M-10-3 | 10 | 2,6 | 1,010410-80 | 5 | 3,4 | 1,8105200-2000 | 3 | 4,2 | 3,2 105

Таким чином, спектрофотометричні дослідження комплексоутворення актиноцинового похідного Act ІІ з ПФ показали, що в процесі зовнішнього зв'язування цього ліганду на поліфосфаті з ростом P/D змінюються величини місць зв'язування і молярних коефіцієнтів екстинкції комплексів, що утворяться.

У четвертому розділі надано результати дослідження взаємодії актиноцинового похідного Act з двоспіральними молекулами ДНК.

Отримано концентраційні залежності спектрів поглинання сумішей Act ІІ - ДНК для зразків ДНК різного АТ-, ГЦ-складу в розчинах з різними іонними силами (рис.2).

Рис.2. Спектри поглинання сумішей Act - ДНК в залежності від концентрації ДНК в розчині 210-2M NaCl у видимій області спектру при постійній концентрації ліганда: Act II – ДНКM. lys., СD=4,1310-5 M (а); Act - ДНКthym, СD=4,4010-5 M (б), Act II – ДНКCl. perf. , СD=3,3510-5 M (в).

При аналізі процесів комплексоутворення в системі ліганд - ДНК і розрахунку параметрів зв'язування була використана програма оптимізації DALSMOD. У цій програмі для розрахунку рівноважного складу кожної суміші при заданих загальних концентраціях іонів Nа+ (CNa0), ліганду (CD0), фосфатів ДНК (Cp0) і пар основ (CN0) використовувалось шість рівнянь (3.1)-(3.6) із шістьма невідомими: m1, R1, m2, R2, , R3.

(3.1)

(3.2)

(3.3)

(3.4)

(3.5)

(3.6)

У рівняннях (3.1)-(3.6): К1- константа зв'язування іонів Nа+ з фосфатами ДНК на місці зв'язування n1 = 1; К2 - константа мономерно зв'язаного ліганду (комплекс 1) на місці зв'язування n2; ?- фактор кооперативності, що характеризує утворення агрегатів на тих же місцях зв'язування; К3 - константа зв'язування ліганду на місці зв'язування n3 (комплекс 2); R1 і R2- долі зв'язаних іонів Na+ і комплексу 1, що дорівнюють частці від ділення відповідних рівноважних концентрацій на Cp0; R3- доля комплексу 2, що дорівнює частці від ділення відповідної рівноважної концентрації на CN0; m1 та m2 - концентрації вільних іонів Nа+ і мономера ліганду; КD - константа дімеризації ліганду. Величина ? характеризує імовірність розташування лігандів на сусідніх місцях зв'язування і задається рівнянням (3.2)

З використанням різних моделей зв'язування (модель І та модель ІІ) були розраховані спектральні і термодинамічні параметри зв'язування Act ІІ з ДНК при різних іонних силах. модель І описує кооперативне зв’язування лігандів з ДНК (рівняння (3.1)-(3.3),3.5,3.6). модель ІІ враховує утворення комплексів на різних місцях зв’язування (рівняння (3.1)-(3.6)). Обрано оптимальну модель зв'язування, по якій Act ІІ утворює на всіх розглянутих матрицях ДНК, як у розчинах з низькими, так з високими іонними силами, три типи комплексів: агрегати, мономерно зв'язаний зовнішній тип комплексу та інтеркаляція (модель ІІ).

Порівняння зв'язування ліганду Act ІІ з АТ- та ГЦ- збагаченими зразками ДНК дозволили визначити, що як і для актиноміцину D, інтеркаляція Act ІІ відбувається переважно між двома поруч розташованими ГЦ - парами з константою зв'язування ((62)105 М-1) (таблиця 2). Величини місць зв'язування для комплексів по зовнішньому типу (n2) в сумішах Act ІІ з ДНК різного АТ-, ГЦ - складу практично однакові та дорівнюють n2=3, а величини констант зв'язування комплексів відрізняються для кожного з розглянутих зразків ДНК.

Таблиця 2.

Параметри зв’язування Act II з ДНК різного AT-, ГЦ-складу, що отримані при оптимізації спектрофотометричних концентраційних залежностей по програмі DALSMOD (модель II) при кімнатній температурі в розчинах з низькими та високими іонними силами. |

СNaCl |

n2 |

K2,M-1 |

n3

K3,M-1 |

Q |

Qlim

ДНКM.lys.-Act II |

0,02 |

30.1 |

4,9104 |

3,2 |

5,5105 |

0,01 |

0,03

0,11 |

3,00.2

2,1104 |

3,2 |

1,8105 |

0,01 |

0,03

ДНКthym.-Act II |

0,02 |

2,90.1 |

2,2105 |

6 |

8,0105 |

0,005 |

0,03

0,15 |

3,60.2 |

2,2104 |

6 |

2,2105 |

0,005 |

0,03

ДНКCl.perf-Act II |

0,02 |

2,90.1 |

2,4104

12 |

5,3105

0,009 |

0,03 |

0,11 |

3,60.2 |

1,8104 |

12 |

1,4105 |

0,009 |

0,03 |

Видно, що обчислені величини констант зв'язування Act ІІ з ДНК зменшуються з ростом іонної сили розчинів, а її вплив на величину місць зв'язування значно слабкіший.

Отримані залежності констант зв'язування для розглянутих сумішей Act ІІ з ДНК від іонної сили розчинів дозволили розрахувати величини поліелектролітних внесків (Gpe) у загальну вільну енергію зв'язування для кожного типу комплексів.

Таблиця 3.

Ефективні величини зарядів ліганду Act II - Z2, Z3 та поліелектролітний внесок Gpe2, Gpe3 при утворенні комплексів 1 и 2, відповідно, при зв’язуванні Act II з ДНК в розчинах с низькими та високими іонними силами. |

Z2 |

Z3 | Gpe2 | Gpe3 | 0,02

M NaCl | 0,11-0,16

M NaCl | 0,02

M NaCl0,11-0,16

M NaClДНКM.lys.-Act II

0,57 | 0,74 | -1,14-0,65 | -1,93 | -0,84

ДНКthym.-Act II | 1,29 | 0,77 | -2,60 | -1,27 | -1,55 | -0,76

ДНКCl.perf-Act II | 0,18 | 0,84 | -0,37 | -0,21 | -1,6 | -0,95

З таблиці 3 видно, що поліелектролітний внесок Gpe3 ліганду Act II при інтеркаляції в ДНК різного АТ-, ГЦ – складу приблизно однаковий для всіх трьох систем при низькій та при високій іонній силі. При утворенні зовнішнього типу комплексів найбільший внесок від електростатичних взаємодій отримано при зв’язуванні Act II з ДНКthуm. Було показано, що кількість кожного типу комплексів у системах Act ІІ - ДНК для широкого інтервалу значень P/D залежить від концентрації солі в розчинах.

У п'ятому розділі приведено термодинамічні параметри зв’язування H, S, G Act ІІ з ДНК та розраховані величини зміщень температур плавлення комплексів Act ІІ – ДНК відносно температури плавлення зразків ДНК у відсутності ліганду.

За допомогою програм оптимізації були отримані температурні залежності констант зв'язування Act ІІ з ДНК. Ці залежності лінійні в усьому інтервалі температур аж до початку плавлення ДНК, що дозволило по методу Вант Гоффа розрахувати величини H, S, G для зв'язування Act ІІ зі зразками ДНК різного АТ-, ГЦ - складу при низьких та високих іонних силах розчинів.

При низьких іонних силах комплексоутворення Act ІІ з Днкthym. відбувається в основному за рахунок енергії водневих зв'язків і гідрофобних взаємодій. Для цієї ж суміші Act ІІ -Днкthym. у розчині з високою іонною силою та для сумішей Act ІІ-ДНКМ.lys. та Act ІІ-днкCl.perf., як при низьких, так і при високих іонних силах, зв'язування обумовлене водневими зв'язками й енергією від конформаційних змін.

Таблиця 4.

Термодинамічні параметри зв’язування Act II з ДНКthym, з ДНКCl.perf, з ДНКM.lys при низькій та високій іонних силах (t=20oC).

СNaCl, M | ?H1

ккал/

моль л. | ?S1

э.е |

G1

ккал/

моль | ?H2

ккал/

моль

л. | ?S2

э.е |

G2

ккал/

моль | ?H

ккал/

моль п. о. | ?S

э.е

моль п.о. | G

ккал/ё

моль |

Act II-ДНКM.lys.0,02 | -7,87 | -5,2 | -6,35 | -5,18 | +8,75 | -7,7 | -6,8 | -0,8 | -6,56 | 0,11 | -18,2 | -41 | -6,2 | -11,4 | -15 | -7,01 | -15,7 | -31,7 | -6,35 |

Act II-ДНКthym. | 0,02 | -3.3 | +12.0 | -6,82 | -7,1 | +3.2 | -8,04 | -3.4 | +8.5 | -5,9 | 0,15 | -5.2 | +1.1 | -5,52 | -13.2 | -19.3 | -7,55 | -5,7 | -2.5 | -4,96 |

Act II-ДНКCl.perf. | 0,02 | -15-31 | -5,9 | -20,9 | -47 | -7,13 | -12 | -25,3 | -4,5 | 0,11 -8,42-8,06 | -6,06 | -9,1 | -5,8 | -7,4 | -5,71 | -5,22 | -4,2 |

Оцінка зміщень температур плавлення ?Тm для сумішей Act II - ДНКthym., Act II - ДНКМ. lys, Act II - ДНКCl. perf. при різних іонних силах та низьких значеннях P/D, де присутні в основному комплекси по типу зовнішнього зв’язування, була проведена на базі експериментальних даних та з використанням методів Франк-Каменецького та МакГі (таблиця 5).

Таблиця 5.

Температури плавлення (Tm0exp и Tm0 cal) та зміна ентальпії вільної ДНК (H0) при плавленні моля пар основ, ?Тm для сумішей Act II - ДНКthym., Act II - ДНКМ. lys, Act II - ДНКCl. perf. при різних іонних силах. |

СNaCl | ?H0a)

ккал/моль п.о. | Tm0 exp

0С | Tm0 cal

0С |

?Тm1) |

?Тm2) |

?Тm3)

Act II-ДНКM.lys. | 0,02 M | 8,8 | 86 | 86 | +2 | +5 | +1

0,11 M9,8 | - | 96 | -8 | -4 | -6 |

Act II-ДНКThym.0,02 M9 | 72 | 72 | +20 | - | - | 0,15 M9,4 | 85 | 83 | -3 | -7 | -1 |

Act II-ДНКCl.perf. | 0,02 M | 9,2 | 68 | 66 | +6 | +9 | +4 | 0,11 M10,1 | 80 | 77 | -4 | -9 | -3 | 1) з експериментальних кривих плавлення;

2) метод Франк-Каменецького;

3) метод МакГі;

а) дані роботи Rouzina J., Bloomfield V. Heat capacity effects on the melting of DNA. 1. General aspects// Biophys. J.- 1999.- V. 77.- P.3242–3251.

В розчинах з низькою іонною силою та низькими P/D Act II при зв’язуванні з ДНК зміщує температури плавлення ДНК в високотемпературну область. В розчинах з високими іонними силами та P/D5 Act II приводить до пониження ?Тm для всіх розглянутих зразків ДНК, тобто дестабілізує молекули ДНК.

У шостому розділі було отримано спектральні та термодинамічні параметри зв’язування в системі 6AZC – ДНК. Спектрофотометричним методом в УФ області було досліджено комплексоутворення і криві плавлення сумішей 6AZC з нативною ДНК і з ДНК зі структурними ушкодженнями, що виділена з клітин опромінених тварин у дозі (57сгр), а також з модельними зразками, які отримано в процесі денатурації - ренатурації у водяному безсольовому розчині.

Показано, що криві плавлення нативних зразків ДНК у відсутності 6AZC мало відрізняються від кривих плавлення сумішей ДНК із розглянутим нуклеозидом. Зміни профілів кривих плавлення сумішей ДНК - 6AZC у порівнянні з вільної ДНК для модельних зразків ДНК, подібні таким же, які спостерігали для зразків ДНК, виділеної з епідідімусу опромінених тварин. Так само, як і у випадку зразків ДНК з опромінених тварин, спостерігається зсув кривої плавлення сумішей ДНК- 6AZC в область більш високих температур у порівнянні з кривої плавлення вільної ДНК.

За допомогою програм оптимізації на основі спектрофотометричних кривих титрування в системах 6AZC - модельні зразки ДНК розраховані величини констант і місць зв'язування, а також величини молярних коефіцієнтів екстинкції комплексу, що утворюється.

Рис. 3. Спектри поглинання сумішей ДНКthym. - 6AZC для ДНК частково денатурованої в безсольовому водному розчині, а потім ренатурованої в сольовому розчині (СNaCl= 6?10-3 М).

Розрахунок констант зв'язування 6AZC з молекулами ДНК різного ступеня деградації був проведений за рівнянням:

, (4.1)

з константою зв’язування

. (4.2)

і з урахуванням двох рівнянь закону збереження загальних концентрацій для С6AZC та СДНК:

(4.3)

. (4.4)

Таблиця 6.

Величини констант зв’язування 6AZC з молекулами ДНК різного ступеня деградації (t=22oC). |

К, М-1n | Q | Qlim | 6AZC –ДНКthym. 1)500 | 1±0,1 | 0,0033 | 0,0166AZC – ДНКthym. 2) 2000 | 1±0,1 | 0,00330,0166AZC – ДНКthym. 3) 9 | 1±0,1 | 0,0120,0131) ДНКthym. нативна;

2)ДНКthym. частково денатурована в безсольовому водному розчині, а потім ренатурована в сольовому розчині;

3)ДНКthym. повністю денатурована в безсольовому водному розчині, а потім ренатурована в сольовому розчині.

Показано, що 6AZC не зв'язується з цілком денатурованою ДНК, але взаємодіє з нативною і частково денатурованою зразками ДНК. Використовуючи температурні залежності константи зв'язування 6AZC із ДНК, що виділена з епідідімуса опромінених тварин (57сгр), по методу Вант Гоффа розраховані термодинамічні параметри зв'язування ?G, ?H, ?S.

Таблиця 7.

Термодинамічні параметри зв’язування 6AZC з ДНК, що виділена з епідідімуса опромінених (в дозі 57 сГр) тварин (t=22?С). |

S

э. е.H

ккал/моль п.о. | G

ккал/моль п.о |

6AZC – ДНКepid

+24 |

+3 |

-4 | Показано, що процес зв'язування 6AZC із ДНК є ендотермічним (?H=+3 ккал/моль) і відбувається за рахунок енергії гідрофобних взаємодій.

Оцінка зміщення температури плавлення ?Тm проведена для суміші 6AZC - ДНКepid,, яка була виділена з опромінених тварин (57 сГр), з експериментальних кривих плавлення та з теоретичних розрахунків за методами Франк - Каменецького и МакГі представлена у таблиці 8.

Таблиця 8.

Зміщення температури плавлення ?Тm для сумішей 6AZC - ДНКepid,, яка була виділена з опромінених тварин (57 сГр), що отримано з експериментальних кривих плавлення та з теоретичних розрахунків за методами Франк-Каменецького и МакГі. |

СNaCl?Тm1)

?Тm2)

?Тm3)

6AZC-ДНК epid

(57 сГр) |

0,006 М |

+3 |

+1 |

+3 | 1) з експериментальних кривих плавлення;

2) метод Франк-Каменецького;

3) метод МакГі.

Показано, що 6AZC зміщує криву плавлення сумішей 6AZC - опромінена ДНК в область більш високих температур відносно до кривої плавлення вільної ДНК.

ВИСНОВКИ:

1. Розроблено нову методику аналізу спектрофотометричних концентраційних залежностей для систем біологічно активний ліганд - поліелектроліт, що дозволяє за допомогою розрахункових методів комп'ютерного моделювання визначати оптимальні моделі зв'язування, спектральні і термодинамічні параметри всіх комплексів, що утворюються в системах.

2. За допомогою цієї методики проаналізовано комплексоутворення потенційного протипухлинного препарату актиноцинового похідного Act ІІ і протилейкемійного препарату 6AZC із ДНК.

3. Показано, що використаний нами підхід може бути застосовано й у випадку, коли поглинання ліганду і поліелектролітної матриці знаходяться в різних областях (Act ІІ і ДНК), і коли області поглинань біологічно активної речовини і поліелектроліту збігаються (6AZC і ДНК).

4. Вперше показано, що в системах Act ІІ - ДНК для всіх досліджених зразків ДНК різного АТ-, ГЦ - складу утворюються три типи комплексів: агрегація, мономерно зв'язаний (зовнішній тип) і зв'язування по типу інтеркаляції.

5. Вперше розраховано поліелектролітний внесок (?Gpe) у загальну вільну енергію зв'язування Act ІІ з ДНК різного АТ-, ГЦ- складу для кожного типу комплексів.

6. За допомогою схеми энтальпійно - энтропійної компенсації визначено, що при низьких іонних силах розчинів зв'язування Act ІІ з Днкthym. відбувається в основному за рахунок енергії водневих зв'язків і гідрофобних взаємодій. Для сумішей Act ІІ з Днкthym. при високих іонних силах і для сумішей Act ІІ-ДНКМ.lys. і Act Іі-днкCl.perf. як при низьких, так і при високих іонних силах, зв'язування відбувається за рахунок утворення водневих зв'язків і внесків від конформаційних змін.

7. Уперше показано, що процес зв'язування 6AZC із ДНК, виділеної з опромінених тварин, є ендотермічним (?H=+3 ккал/моль) і відбувається за рахунок енергії гідрофобних взаємодій.

8. У розчинах з низькими іонними силами при зв'язуванні з ДНК 6AZC і Act ІІ зміщають температуру плавлення ДНК у високотемпературну область. При високих іонних силах при зв'язуванні з ДНК Act ІІ зміщає температуру плавлення НК у низькотемпературну область.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Круглова Е.Б., Крутько Н.А., Красницкая А.А., Карпенко Н.А., Малеев В.Я., Алесина М.Ю. Влияние структурных изменений в ДНК, выделенной из гонад облученных крыс, на связывание биологически активных нуклеозидов// Вісник Харківського Університету. - № 422. Біофізичний вісник.– 1998. - № 2. - C. 100-104.

2. Круглова Е., Довбешко Г., Гладковская Н., Пащук Е., Красницкая А., Карпенко Н., Алесина М. Исследование структурных повреждений в молекулах ДНК из -облученных крыс// Вісник Харківського Університету.- № 450. Біофізичний вісник. -1999. - № 4. - C. 92-95.

3. Круглова Е.Б., Гладковская Н.А., Спектрофотометрический анализ кривых плавления смесей биологически активных нуклеозидов с ДНК как метод изучения повреждений в ДНК// Вісник Харківського Університету. - № 450. Біофізичний вісник. – 1999. - № 5. - C. 103-107.

4. Е.Б. Круглова, Н. А. Гладковская, В.Я. Малеев. Моделирование процессов связывания актиноциновых антибиотиков с ДНК при разных ионных силах и температурах// Вісник Харківського Університету. - № 593. Біофізичний вісник.- 2003 - 1(12). - С. 53 – 63.

5. Круглова Е.Б., Гладковская Н.А. Влияние АТ-, ГЦ- состава на связывание актиноциновых производных с ДНК// Вісник Харківського Університету. -№ 637. Біофізичний вісник. – 2004. - 1-2 (14). - C. 43-47.

6. Е.Б. Круглова, Н.А. Гладковская, В.Я. Малеев Использование метода спектрофотометрического анализа для вычисления термодинамических параметров связывания в системах актиноциновые производные – ДНК// Биофизика. -2005. – T. 50. - в.2. - C. 253-264

7. Круглова Е.Б., Больбух Т.В., Гладковская Н.А., Близнюк Ю.Н.Связывание антибиотиков актиноцинового ряда с матрицей полифосфата// Биополимеры и клетка. - 2005. –T. 21. - в.4.- С. 358-364.

8. Круглова Е.Б., Крутько Н.А., Жмурко Л.В. Связывание терапевтически активных нуклеозидов с ДНК, выделенными из гонад облученных крыс//Тези доповідей з'їзду Українського біофізичного товариства. Харків. – 1998. - C.243.

9. Kruglova E.B. Gladkovskaya N.A. Spectrophotometric analysis of melting curves as method for the study of DNA lesions induced of -radiation// Proceeding of the XIV International School – Seminar "Spectroscopy of Molecules and Crystals". – Odessa. – 1999. - P.58.

10. Kruglova E., Gladkovskaya N., Krasnitskaya A., Аlesina M., Karpenko N. Therapeutically important nucleosides as markers of the level of DNA damages induced in sex cells of the rats by low doses -radiation// 8th European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules. -University of Twente, Netherlands.-1999. – P.303-304.

11. Kruglova E., Gladkovskaya N. The interaction of cytosine arabinoside with reference and damaged DNA molecules// Abstract in Interaction conference on DNA conformation, modification and recognition in biomedicine. - Brno, Czech Republic. – 2000. - P.102.

12. Kruglova E., Gladkovskaya N. The influence of the different lesions in the DNA molecules on the affinity of the therapeutically active nucleosides// European Biophysical Journal. – 2000. -V.29. - p.258.

13. Kruglova E., Gladkovskaya N. Comparison of the binding properties of the therapeutically active nucleosides to DNA molecules with the different level of lesions// Proceeding of the XV International School –Seminar "Spectroscopy of Molecules and Crystals". – Chernihiv. – 2001. - P.207.

14. E.B.Kruglova, N.А.Gladkovskaya. Comparison of the binding of the therapeutically active nucleosides to DNA molecules with different level of lesions// The International Society for Optical Engineering. Proceedings of SPIE. - 2002. - V 4938. - P. 241 – 245.

15. Круглова Е.Б., Гладковская Н.А. Анализ процессов комплексообразования в простых и сложных системах на основе спектрофотометрических измерений// Математика. Компьютер. Образование. – Пущино. – 2003. - C.212.

16. E.B. Kruglova, N.А.Gladkovskaya. Analysis of the complexation in system of actinocin antibiotic-DNA at different ionic strengths and temperatures// XVI International School – Seminar "Spectroscopy of Molecules and Crystals".- Sevastopol, Ukraine. - 2003. - P. 46.

17. Н.А. Гладковская, Е.Б. Круглова. Взаимодействие актиноциновых антибиотиков с молекулами ДНК разного АТ -, ГЦ – состава// Третья Харьковская конференция молодых ученых. "Микроволновая электроника и радиолокация". – Харьков, Украина. – 2004. – С. 25.

18. Kruglova E.B., Gladkovskaya N.А. Spectral and thermodynamic parameters for drug – DNA complexes: dependence on AT- and GC-content// 5th International Conference on Biological Physics. ISBP 2004. -Gothenburg, Sweden. -2004.- B05. - P. 180.

19. Круглова Е.Б. Гладковская Н.А. Особенности внешнего связывания актиноциновых производных с матрицами различной структуры// Проблеми біологічної і медичної фізики. ПБМФ – 2004.-Харків. - 2004. - С. 50.

20. Гладковская Н.А., Круглова Е.Б. Расчет термодинамических параметров связывания ?H, ?S, ?G для комплексов Act II – ДНКCl.perf. и Act II – ДНКM.lys. из спектрофотометрических данных// Четвертая Харьковская конференция молодых ученых. "Радиофизика и СВЧ электроника". - 2004. - С. 29.

21. N.A. Gladkovskaya, E.B. Kruglova. The binding of the some therapeutically active nuclesides to DNA molecules with the different types of structures damages//Abstracts of 8th Romanian biophysics conference "Advanced Biomaterials and Biophysical Techniques". – Iasi, Romania. -2005.- P.165-166.

22. Kruglova E.B, Gladkovskaya N.А.The shift of the melting temperature of DNA-ligand complexes compared with melting temperature of “pure” DNA// XVII International School-Seminar" Spectroscopy of Molecules and Crystals". - Beregove, Crimea, Ukraine. – 2005. - P.281.

АНОТАЦІЯ

Гладковська Н.О. Спектрофотометричний аналіз зв’язування біологічно активних лігандів з молекулами ДНК. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02  біофізика. – Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, м. Харків, 2006.

Дисертація