НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

ГОЛУБ

НАТАЛІЯ ЯРОСЛАВІВНА

УДК 595.773.4:575ґ113ґ224.4:591.139

МУТАЦІЇ, ІНДУКОВАНІ РЕНТГЕНІВСЬКИМ ОПРОМІНЕННЯМ ТА ДЕЯКИМИ ХІМІЧНИМИ РЕАГЕНТАМИ, ЩО ЗМІНЮЮТЬ ТРИВАЛІСТЬ ЖИТТЯ

DROSOPHILA MELANOGASTER

03.00.15 – Генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Черник Ярослава Іванівна,

Львівський національний університет імені Івана Франка

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Лукаш Любов Леонідівна,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Ларченко Катерина Андріївна,

Інститут фізіології рослин та генетики НАН України,

провідний науковий співробітник відділу експериментального мутагенезу

Провідна установа: Інститут агроекології та біотехнології УААН, м. Київ

Захист відбудеться “16“ березня 2006 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ, вул. Васильківська 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ, вул. Васильківська 31/17.

Автореферат розіслано “8“ лютого 2006 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук |

Мордерер Є.Ю. |

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. В реальних умовах живі організми зазнають впливу чинників довкілля та хімічної природи, які при поєднанні з радіацією можуть призводити до нових неочікуваних біологічних ефектів. В результаті аварії на Чорнобильській АЕС значні території України зазнали радіоактивного забруднення, склалася несприятлива екологічна ситуація, жива природа виявилася під впливом опромінення в малих дозах. Дослідження ефектів дії малих доз радіації та факторів нерадіаційної природи на генетичні структури біологічних об’єктів і розробка методів прогнозування віддалених наслідків таких впливів є однією з актуальних проблем сучасної біології. Хорошою тест-системою для обліку мутацій і виявлення характеру мутаційних змін є Drosophila melanogaster. В ряді робіт показано, що радіоіндукована відповідь дрозофіли залежить від стадії розвитку, фізіологічної зрілості і статі імаго [Ватти, Джапаридзе, 1980; Giess, 1980; Моссэ и др., 1989; Измайлов и др., 1990; Зайнуллин, Москалев, 2001; Вайсерман и др., 2003] Одним з ефектів впливу рентгенівського опромінення (РО) на клітину є індукція генетичної нестабільності, яка може зумовлювати як стимуляцію, так і пригнічення життєво важливих функцій клітини чи організму [Eeken, Sobels, 1986; Lints et al., 1989; Измайлов и др., 1990; ,Иващенко и др., 1990; Balter et al., 1992; Черник, Бобак, 1993; Anault, Dufournel, 1994; Забанов и др., 1995; Handler, Gomez, 1997; Шапошников, Зайнуллин, 2001; Lyng et al., 2002; Krishnaja, Sharma, 2004]. Механізми появи такої нестабільності досконало ще не вивчені, проте відомо, що важливою причиною дестабілізації генетичного апарату можуть бути переміщення мобільних генетичних елементів (МГЕ) [Sermovaa, Rytomaa, 1995; Васильева и др., 1997; Зайнуллин, 1998; Harms-Ringdahl, 1998]. Разом з тим, дані про мінливість молекулярних структур геному D. melanogaster з проходженням транспозиційних процесів за дії радіації та комплексного впливу опромінення і хімічних реагентів є поодинокими та фрагментарними [Eeken, Sobels, 1986; Забанов и др., 1995; Шапошников, 2000, Москалев, 2004]. Транспозиції МГЕ зумовлюють появу широкого спектра генетичних подій, оскільки при вбудовуванні - вирізанні в певні області геному мобільні елементи можуть змінювати експресію генів і впливати на прояв різних ознак, в тому числі і на тривалість життя. Отримано низку суперечливих даних, які свідчать як про збільшення, так і про зменшення тривалості життя при дії малих доз опромінення [Lints et al., 1989; Измайлов и др., 1990; Crompton; 1997; Зайнуллин, Москалев, 2004], проте причини такої варіабельності цього показника до кінця не з’ясовані.

Серед великої кількості теорій старіння [Szilard, 1959; Hayflick, Moorhead, 1961; Frolkis, 1968; Strechler et al., 1971; Spector, 1974; Rothstein, 1977; Makinodan, Kay, 1980; Gutteridge et al., 1986; Miquel, 1991; Harman, 1992; Broccoli, Cooke, 1993; Martin et al., 1993; Mecocci, 1993; Hayashi et al., 1994; Гилберт, 1996; Bodnar et al., 1998; Vaziri, Benchimol, 1998] однією з найбільш обгрунтованих є теорія про зміни у функціонуванні нервової системи [Джекопи, Оппенгаймер, 2001]. Нейродегенеративні захворювання проявляються, як правило, в людей старшого віку, супроводжуються змінами в руховій та емоційній сферах, порушеннями координації і пам’яті, що, в свою чергу, пов’язане з прогресуванням дегенеративних процесів у структурних компонентах нервової системи. Багато спадкових деменцій приводять до пришвидшеного старіння і вкорочення тривалості життя. Тому важливими є дослідження, спрямовані на виявлення генів, які відповідають за формування структур нервової системи та їх функціонування. Вирішенню даної проблеми сприяють дослідження на модельних еукаріотичних об’єктах, у яких можна отримувати і аналізувати мутантів зі змінами структур головного мозку. Зручною для таких експериментів є Drosophila melanogaster, у якої процеси диференціації і дегенерації нервової системи є дуже подібними з хребетними, а гени, які контролюють ці процеси, на 70% гомологічними [Goodman, Doe, 1993].

Таким чином, дослідження індукованого РО і хімічними реагентами мутагенезу, його впливу на життєздатність і тривалість життя організмів є актуальною проблемою сучасної біології.

Мета і основні завдання наукового дослідження. Метою даної роботи було з’ясувати вплив мутацій, індукованих рентгенівським опроміненням і деякими хімічними реагентами (нітрозоетилсечовиною (НЕС), кофеїном), на тривалість життя Drosophila melanogaster.

В зв’язку з цим були поставлені наступні завдання:

1. Дослідити вплив різних доз РО, хімічних сполук та їх комплексну дію на:

а) частоту мутантів по Х-хромосомі у природних популяціях з зони ЧАЕС;

б) появу та спектр видимих мутацій в Х-хромосомі у лінії y2wa4;

в) виживання та частоту домінантних летальних мутацій (ДЛМ) у лінії y2wa4.

2. Побудувати криві виживання (КВ) і проаналізувати показники тривалості життя у мутантів, отриманих в різних серіях дослідів за впливу РО.

3. Дослідити у мутантних ліній природу мутаційних змін в локусах white та cut методом блот-гібридизації за Саузерном.

4. Отримати нейродегенеративних мутантів, індукованих НЕС, і проаналізувати у них динаміку появи змін у структурах головного мозку, параметри тривалості життя та життєздатність.

Об’єкт дослідження. Індукція мутацій екзогенними факторами; молекулярна природа мутацій; нейродегенеративні зміни; тривалість життя у індукованих мутантів.

Предмет дослідження. Мутації, індуковані рентгенівським опроміненням та деякими хімічними чинниками, які впливають на тривалість життя Drosophila melanogaster.

Методи дослідження. Гібридологічний аналіз, метод побудови кривих виживання, методи виявлення МГЕ (гібридизація in situ, блот-гібридизації за Саузерном), метод виготовлення та фарбування препаратів зрізів головного мозку, методи математичного аналізу отриманих результатів.

Наукова новизна роботи. Вивчено спонтанний рівень мутування та мутаційне навантаження при дії рентгенівського опромінення у природних популяцій з зони ЧАЕС. Відмічено нестабільність популяцій та адаптивну реакцію у них на додаткові дози опромінення; виявлено значний вплив на мутабільність генів Х-хромосоми генетичних елементів аутосом.

Встановлено вплив різних доз РО, а також сумісну дію РО та хімічних сполук – НЕС, кофеїну та б-токоферолу на частоту появи ДЛМ та мутування генів Х-хромосоми впродовж ряду поколінь (F1 – F5) у лабораторної лінії y2wa4. Відмічено збільшення (в 1,7 – 4,9 рази) показника ДЛМ при поодиноких впливах і різке зростання (в 10, 3 – 11,1 рази), особливо ранньої загибелі, при спільних діях. Зафіксовано високу частоту появи мутантів по локусах Х-хромосоми як в F1. так і в F2 у стабільної лінії y2wa4. Показана можливість знешкодження пролонгованого негативного ефекту дії радіації при дії б-токоферолу. При сумісних діях відмічена висока локусоспецифічність мутаційних подій – мутації, як правило, відбувалися в нестабільних локусах Х-хромосоми white та cut. Тому в роботі вперше запропоновано використовувати ці гени як генетичні маркери дії малих доз радіації. Отримано колекцію індукованих РО мутантів. Всі вони характеризувалися зменшеними параметрами середньої тривалості життя. З використанням методу блот-гібридизації за Саузерном показано, що причиною зниженої життєздатності і скороченої тривалості життя у цих мутантів є інсерційно-ексцизійні процеси в локусах white та cut.

Вперше показано, що НЕС з високою частотою індукує появу нейродегенеративних мутантів лінії Oregon, у яких знижена життєздатність і скорочені показники тривалості життя корелюють з часом появи змін в структурах головного мозку.

Науково-практична цінність роботи. Робота, головно, присвячена вирішенню фундаментальних проблем експериментального мутагенезу. Вивчення закономірностей спонтанного та індукованого рентгенівським опроміненням мутагенезу, а також вияснення природи змін в структурі геному у такого модельного об’єкта як дрозофіла допомагають правильно інтерпретувати мутаційні процеси у інших еукаріотичних організмів. Одержані в роботі результати свідчать про те, що маркерами при дослідженні впливу малих доз радіації можуть служити нестабільні локуси. Дані, отримані в результаті вивчення впливу рентгенівського опромінення, а також його спільної з НЕС і кофеїном розширюють сучасні уявлення про механізми роздільного і сумісного впливу факторів радіаційної та хімічної природи; їх можна використовувати при аналізі генетичних процесів в природних популяціях як дрозофіли, так і інших еукаріотичних об’єктів. Той факт, що індуковані мутації в генеративних клітинах виникають з високою частотою впродовж ряду поколінь, сприяє удосконаленню експериментальної роботи по аналізу віддалених наслідків дії радіації на геном.

Апробація роботи. Основні наукові результати дисертаційної роботи доповідались на студентських наукових конференціях (1994, 1995, 1996 рр.) та звітних наукових конференціях викладачів та співробітників (1997, 1998, 2005 рр.), наукових семінарах кафедри генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка (1999, 2004). Матеріали роботи були представлені на ІІІ з’їзді з радіаційних досліджень “Радиобиология. Радиоэкология. Радиационная безопасность” (Москва, 1997), Міжнародній конференції “Проблемы радиационой генетики на рубеже веков” (Москва, 2000), Міжнародній конференції “Биорад-2001” (Сыктывкар, 2001), на 42-й (Вашингтон, 2001), 43-й (Сан Дієго, 2002), 45-й (Вашингтон, 2004) та 46-й (Сан Дієго, 2005) щорічних наукових конференціях з досліджень на дрозофілі, Всеукраїнській науково-практичній конференції психіатрів з міжнародною участю “Нова психофармакологія і прогрес в психіатрії” (Львів, 2004), І Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), Всеросійській конференції молодих вчених “ Физиология и медицина” (Санкт-Петербург, 2005), IV з’їзді геронтологів і геріатрів України (Київ, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових праць, з них 7 статей у провідних фахових виданнях.

Структура і об’єм роботи. Дисертаційна робота викладена на 111 сторінках, включаючи 16 таблиць, 25 рисунків і фотографій і складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, експериментальної частини з обговоренням одержаних результатів, висновків, а також списку літератури, який включає 304 джерела.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто опрацьовано значний об’єм вітчизняної та іноземної літератури по темі виконуваних наукових експериментів. Самостійними є вибір методів дослідження, проведення експериментів. Спільно з науковим керівником проведено аналіз одержаних результатів та їх інтерпретацію. Підготовлені матеріали для друку у фахових наукових журналах.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури аналізуються сучасні уявлення про механізми мутагенного впливу рентгенівського опромінення на геноми живих організмів; особлива увага як об’єкту радіобіології приділена Drosophila melanogaster. Окремий розділ присвячений питанню генетичного контролю тривалості життя і молекулярних маркерів старіння у різних організмів і, зокрема, у дрозофіли.

Матеріали і методи досліджень. Матеріалом досліджень були природні популяції Drosophila melanogaster, зібрані в зоні ЧАЕС, високоінбредні лінії: дикого типу Oregon, y2wa4 - з морфологічними маркерами по Х-хромосомі, лабораторні лінії. Опромінення проводили на апараті РУМ-17 потужністю дози 10 Р/сек; сумарні дози становили 258 мКл/кг (1000Р) та 774 мКл/кг (3000Р). Хімічні реагенти вносили в середовище для личинкового згодовування, в концентраціях, близьких до LD50.

Для врахування спонтанних та індукованих РО мутацій в Х-хромосомі використовували самок зі зчепленими Х-хромосомами C(1)DX, yf/Y [Медведев, 1968]. Аналізували потомків 1-5 поколінь. Для ідентифікації отриманих мутантів використовували комплементаційний тест. Частоту виникнення домінантних летальних мутацій визначали за співвідношенням кількості яєць з ранніми та пізніми ембріональними леталями до загальної кількості запліднених яєць [Ватти, Джапаридзе, 1980]. На основі аналізу кривих виживання визначали показники середньої (СТЖ) та максимальної тривалості життя (МТЖ) [ Lints et al., 1979].

Молекулярно-генетичні дослідження природи отриманих мутацій проводили методами гібридизації in situ на політенних хромосомах із міченою 3H-ДНК МГЕ [Pardue, 1986] та блот-гібридизації за Саузерном з 32P-ДНК рекомбінантних плазмід, які містили фрагменти локусів white та cut [Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989].

Виготовлення препаратів зрізів головного мозку проводили згідно Хейзенберга і Боля [Heisenberg, Bohl, 1979]. Ядерне і дифузне фарбування гістологічних препаратів здійснювали відповідно методиці [Heisenberg, Bohl, 1979]. Для ядерного фарбування продовж 8-10 хв використовували розчин Haemalaum, який містив 0,25 гр гематоксиліну, для дифузного – 0,1% розчин еозину (5 хв). Отримані препарати аналізували під мікроскопом Loboval 3 Carl 2 Zeiss-Jena при збільшенні 12х40.

Статистичну обробку отриманих даних проводили з використанням програми Statgraphics 5.0.

Результати та їх обговорення. Особливості мутагенезу, індукованого рентгенівським опроміненням та деякими хімічними чинниками, у лабораторних ліній D.melanogaster. В літературі є відомості про вплив на стабільність геному дрозофіли низки хімічних сполук [Lim, 1981; Александров, Гершензон, 1985; Ким, Беляева, 1991; Максимів і ін., 1995], дисгенних схрещувань [Герасимова, 1984; Blackman, 1989; Engels, 1996; Гвоздев, 1998] і теплового шоку [Ратнер и др., 1992; Васильева, Ратнер, 2000]. Однак дані про мінливість молекулярних структур геному дрозофіли при індукції рентгенівським опроміненням в малих дозах є поодинокими і фрагментарними [Ким, Беляева, 1991; Забанов и др., 1995; Шапошников, 2000; Москалев, 2004]. З метою дослідження рівня мутабільності конкретних локусів D.melanogaster при дії РО, а також для виявлення природи індукованих радіацією мутаційних змін нами була вибрана лінія y2wa4, у якої відома локалізація певних МГЕ в локусах Х-хромосоми. Частота спонтанного мутування цієї лінії становила 8,9х10-5, що свідчило про стабільність лінії y2wа4. Опромінення самців лінії y2wa4 дозою 258 мКл/кг приводило до появи мутантів з підвищеною частотою лише в F1; починаючи з F2, цей показник знизився на порядок і залишався на такому рівні впродовж наступних поколінь (табл. 1). Отже, РО в сумарній дозі 258 мКл/кг не спричиняло пролонгованої дестабілізації генів Х-хромосоми. Аналіз потомків при дії РО дозою 774 мКл/кг проводився впродовж 2-х поколінь; частота виникнення індукованих мутантів була високою як в F1 (1,6х10-3), так і в F2 (2,1х10-3) (табл. 1). При повторному проведенні експерименту з використанням індивідуальних схрещувань за методом брудів частота мутантів в другому поколінні також в декілька разів була вищою порівняно з першим поколінням (табл.1).

Таблиця 1

Частота мутантів у лінії y2wa4, індукованих РО дозами 258 мКл/кг та 774 мКл/кг

Вид досліду | Покоління | Кількість | Частота мутантів | t, контр. | t, між покол.

проаналізов.

самців | мутантів

Контроль | 6354 | 1 | 1,6х10-5

Опромінення, 258 мКл/кг | F12153 | 7 | 3,2х10-35,50*

F25120 | 4 | 7,8х10-42,35* | 2,47*

F32653 | 1 | 3,7х10-41,12 | 0,67

F42114 | 1 | 4,7х10-4 | 1,32 | 0,16

F52747–––––– | 0,50 | 1,14

Контроль | 11222 | 1 | 8,5х10-5

Опромінення, 774 мКл/кг | F12447 | 4 | 1,6х10-33,62* | 0,43

F22295 | 5 | 2,1х10-34,43

F1 1 бруду | 873–––––– | 0,28 | 2,31*

F2 1 бруду | 822 | 5 | 6,1x10-3 | 7,43*

F1 2 бруду | 626 | 1 | 1,6x10-3 | 2,83* | 1,10

F2 2 бруду | 1005 | 5 | 5,0x10-3 | 5,26*

* - достовірні зміни, p?0,95

В даний час особливий інтерес викликають роботи, в яких аналізуються мутаційні події, індуковані комплексним впливом РО і хімічних реагентів. Ми дослідили спільну дію РО в дозі 774 мКл/кг із хімічними реагентами – нітрозоетилсечовиною (НЕС, 0,5 мкг/мл) та кофеїном (2,5 мкг/мл) на частоту виникнення видимих мутантів по Х-хромосомі та домінантних летальних мутацій у лінії y2wa4. Частота появи мутантів по Х-хромосомі при впливі НЕС в F1 становила 2,7х10-4. В другому поколінні спостерігалося тенденція до зростання цього показника - 4,3х10-4. При вивченні комплексної дії РО (774 мКл/кг) та НЕС аналіз мутабільності локусів Х-хромосоми проводився впродовж 4-х поколінь за методом брудів (табл. 2). Найвища частота появи мутантів (1,4х10-3) за даними трьох брудів спостерігалася в F2, однак вона не перевищувала цього показника при поодинокій дії РО (2,1х10-3). Аналіз спільної дії РО (774 мКл/кг) та кофеїну впродовж 5-ти поколінь показав (табл.2), що в F1 частота мутування була на порядок нижчою порівняно з поодинокою дією радіації; в F2 мутантів виявлено не було, а в F3 – F5 рівень мутування збільшився і практично не відрізнявся від цього показника, отриманого при впливі РО. Отже, кофеїн підтримував пролонгований ефект дії радіації. Таким чином, як при дії РО, так і його впливі в комплексі з хімічними реагентами НЕС і кофеїном, спостерігалася висока частота мутантів (достовірно вища, ніж в контролі) впродовж ряду поколінь. При комплексному впливі б-токоферолу і РО підвищена частота мутантів спостерігалася лише в F1 (3,3х10-3), починаючи з F2, цей показник знизився на порядок і утримувався на такому рівні (3,1х10-4 – 5,9х10-4), впродовж наступних поколінь (F3 – F5), що свідчило про антимутагенну дію б-токоферолу.

В результаті проведених експериментів було отримано колекцію індукованих мутантів: R1 R10 – при поодинокій дії опромінення, N1 – N6 –при впливі НЕС, RN1 – RN21 – при комплексному впливі РО і НЕС, RK1 – RK11 – при спільній дії опромінення і кофеїну, Rб1 – Rб12 – при впливі опромінення і б-токоферолу. Отримані мутації, в основному, характеризувалися алельними переходами по генах white і cut. Виявлені також мутанти по генах Bar та prune і подвійні мутанти по генах white та singed. При проведенні досліджень з використанням методу ДЛМ, який дає змогу враховувати значні хромосомні перебудови і чутливість до ряду факторів на стадії раннього ембріогенезу показано, що зростання показника ДЛМ зафіксовано при всіх впливах (рис. 1).

Рис.1. Частота ДЛМ у лінії y2wa4 при дії РО та хімічних сполук

Таблиця 2

Частота мутантів у лінії y2wa4, індукованих комплексною дією РО (774 мКл/кг)

та НЕС (0,5 мкг/мл), РО та кофеїном (2,5 мкг/мл)

Вид досліду | Покоління | Бруд | Кількіcть проаналіз. самців | Кількість мутантів | Частота мутантів | Частота мутантів (за даними 3-х брудів) | t, контр 1 | t,

контр. 2 | t, між поколін

Контроль 1 | 11222 | 1 | 8.9х10-5

РО + НЕС | F1 | І

ІІ

ІІІ | 4464

4640

4690 | 3

1

1 | 6,7х10-4

2,1х10-4

2,1х10-4 |

3,6х10-4 |

1, 39

F2 | І

ІІ

ІІІ | 3021

3051

3133 | 4

5

4 | 1,3х10-3

1,6х10-3

1,3х10-3 |

1,4х10-3 | 3,43* | 2,57*

F3 | І

ІІ

ІІІ | 2411

3907

3183 | 1

2 |

4,1х10-4

5,1х10-4–– |

3,1х10-4 | 1,17 | 2,39*

F4 | І

ІІ

ІІІ | 3471

3726

2195 | 3

2–– |

8,6х10-4

5,3х10-4––– |

5,3х10-4 | 2,13* | 1,02

Контроль 2 | 5269––––

РО + кофеїн | F1 | 3019 | 3 | 3.3 x 10-4 | 7,62*

F2 | 5606–––– | 0,82 | 6,25*

F3 | 3289 | 7 | 2.1 x 10-3 | 6,02* | 5,34*

F4 | 2218 | 2 | 0.9 x 10-3 | 4,33* | 0,73

F5 | 2600 | 3 | 1.2 x 10-3 | 5,12* | 0,56

* - достовірні зміни, p? 0,95

Так, при поодиноких впливах опромінення і хімічних сполук частота ДЛМ збільшувалася в 1,7 – 4,9 рази порівняно з контролем (від 6,9% до 19,46% проти 3,97% контролю). Однак особливо різке зростання відбувалося при комплексних впливах – більше, ніж в 11 разів (до 41,11% - 44,03%) і було зумовлене, в основному, збільшенням показника ранньої ембріональної загибелі, що є свідченням того, що найбільш чутливими до різних ушкоджуючих впливів є ранні стадії ембріогенезу дрозофіли.

Виживання та тривалість життя в індукованих мутантів дрозофіли, отриманих при дії рентгенівського опромінення та деяких хімічних сполук. При побудові кривих виживання особлива увага приділяється плато на кривій, наявність якого вважається характерною ознакою нормального старіння, а закінчення плато і перегин КВ свідчать про інтенсивне відмирання особин. Особливо важливими є показники СТЖ, високі значення яких свідчать про підтримання періоду активної життєздатності за рахунок певних адаптивних механізмів, спрямованих проти процесу старіння [Lints, 1979]. В проведених нами експериментах в якості контролю використано криву виживання вихідної лінії y2wa4. Перегин кривої виживання цієї лінії відбувався після 15-ї доби життя імаго, показник СТЖ S50 становив 43 доби, а МТЖ була 54 доби (рис. 2а). У мутантних ліній, отриманих при впливі РО (258 мКл/кг та 774 мКл/Кг) спад кривих виживання відбувався на 13-15 добу життя імаго, проте показники СТЖ та МТЖ були дещо нижчими порівняно з вихідною лінією (рис. 2а). На основі аналізу кривих виживання десяти мутантних ліній, отриманих в дослідах з комплексною дією РО (774 мКл/кг) та НЕС (0,5 мкг/мл) показано, що у них спостерігалося швидке відмирання особин, перегин кривих відбувався не пізніше 8-10 доби життя імаго, всі криві ішли пучком і характеризувалися різко зниженими показниками середньої тривалості життя (рис. 2б, 2в).

У мутантних ліній, отриманих при комплексній дії РО та кофеїну, перегин кривих виживання спостерігався вже на 6-8 добу життя імаго (рис. 2г). Зниженими були показники як середньої, так і максимальної тривалості життя.

Рис.2. Криві виживання мутантних ліній, отриманих при впливі: а) РО; б) і в) НЕС та РО;

г) кофеїну і РО

Таким чином, у переважній більшості мутантних ліній, отриманих при спільному впливі РО і хімічних чинників, відбувалося швидке відмирання особин і зниження показників ТЖ порівняно з вихідною лінією y2wa4.

Пошук вікових дегенеративних змін у структурах головного мозку мутантів дрозофіли, отриманих в серіях дослідів по вивченню впливу рентгенівського опромінення. Аналіз мутантів зі змінами структур головного мозку, індукованих нітрозоетилсечовиною. Оскільки відомо, що однією з причин зниженої життєздатності і скороченої тривалості життя є нейродегенеративні зміни, нами було досліджено структури головного мозку мутантів, отриманих в різних серіях дослідів по впливу РО. На основі аналізу гістологічних препаратів зрізів мозку молодих (2-3 денних) та старих (30-денних) імаго змін у мозкових структурах як вихідної лінії, так і всіх проаналізованих мутантів не було виявлено. Це дало підстави вважати, що причиною зниженої життєздатності і скороченої тривалості життя радіоіндукованих мутантів не є мутації в генах, які зумовлюють появу нейродегенерацій.

Методом личинкового згодовування НЕС (0,4 мкг/мл) у лінії Oregon з високою частотою (4,0х10-2) отримано мутантів зі змінами в структурах головного мозку, які умовно були розділені на декілька фенотипових груп за характером розташування і розміром вакуоль, що виникли у мозковій тканині. Було досліджено динаміку появи нейрональних змін у імаго мутантних ліній (табл. 3). Так, у однієї групи ліній (5.1.1, 17.1.1, 102.3.4) зони дегенерації починали утворюватися вже на 5-у добу після вильоту мух (рання дегенерація). З віком кількість і розмір вакуоль збільшувалися, експресія мутантного фенотипу зростала і максимальний мутантний прояв спостерігався у старих особин (рис. 3). У іншої групи ліній (4.1.1, 9.1.1, 45.1.1) поодинокі вакуолі починали виникати у 10-денних мух, надалі прогресуючи з віком. У ліній 33.1.1, 50.1.1, 60.1.1, 58.3.4 структурні зміни головного мозку з’являлися лише на пізніх стадіях онтогенезу (на 20–ту добу, пізня дегенерація). Всі нейродегенеративні мутанти характеризувалися швидким відмиранням особин порівняно з лінією дикого типу Oregon та низькими параметрами як середньої, так і максимальної тривалості життя. При цьому спостерігалася закономірність: чим швидше виникали зміни в структурах головного мозку, тим швидше відбувався перегин кривих виживання і відмирання особин.

Таблиця 3

Динаміка виникнення змін у структурах головного мозку нейродегенеративних мутантів Drosophila melanogaster

Код лінії | Фенотипова група | Вік імаго

1-добові | 5-добові | 10-добові | 20-добові | 30-добові

4.1.1 | І | N | N | + | ++ | +++

5.1.1 | І | N | + | + | ++ | +++

9.1.1 | І | N | N | + | + | ++

33.1.1 | І | N | N | N | + | +

50.1.1 | І | N | N | N | + | ++

17.1.1 | ІІ | N | + | + | ++ | +++

45.1.1 | ІІ | N | N | + | + | ++

60.1.1 | ІІ | N | N | N | + | ++

31.3.2 | ІІІ | N | + | + | + | +

58.3.4 | ІІІ | N | N | N | +. | ++

102.3.4 | ІІІ | N | + | + | ++ | +++

N – нормальна структура мозку

+ - зміни в структурі мозку

+++ - максимальний мутантний фенотип

Рис. 3. Структура мозку у мутантної лінії 102.3.4 на: а) 5-ту добу; б) 30-ту добу

Природа мутацій в локусах white і cut D.melanogaster, індукованих рентгенівським опроміненням та нітрозоетилсечовиною. Методом блот-гібридизації за Саузерном була досліджена природа мутацій в локусах white та cut, індукованих РО та комплексним впливом РО та НЕС.

При дослідженні молекулярних змін в локусі white було використано рекомбінантні 32P-плазміди pw+/B-R (+1.7/+9,5), і pw+/B-S (-0,5/+1,7), які містили певні послідовності локусу white лінії дикого типу Oregon і охоплювали район початку транскрипції гена white (рис. 4А). Розщеплення ДНК здійснювали ендонуклеазами рестрикції BamH1, EcoR1 та Xba1 (рис. 4А). В досліджуваній ділянці локусу лінія y2wa4 містить МЕ BEL вбудований в тіло МЕ copia, а також неідентифіковану вставку (НВ) розміром ~ 11,5 тнп, (в положенні +4,7 тнп) (рис.4Б). Ми дослідили мутанта з лимонними очима y2w* (RN11) та двох мутантів з білими очима y2wsn (R7 і RN18). Результати блот-гібридизації представлені на рис. 5а-в. У випадку гібридизації з плазмідою pw+/B-R після розщеплення BamHI i EcoRI лінія Oregon характеризувалася наявністю двох гібридизаційних смуг величиною 3 і 5 тнп (рис. 5а). Лінія y2wa4 мала фрагменти з молекулярною масою 7 і 10 тнп, що може свідчити про вбудовування фрагмента величиною 10 тнп з одним сайтом рестрикції для однієї з використаних нами рестриктаз (рис. 5а). У обидвох мутантів з білими очима утворювалися гібридизаційні смуги, що не співпадали ні зі смугами лінії y2wa4, ні зі смугами лінії Oregon (рис. 4в, 5а). Можна припустити, що відбулося вирізання неідентифікованої вставки з вбудуванням ділянки ДНК розміром не меншим, ніж 6,2 тнп, яка характеризується сайтами розщеплення для ендонуклеаз BamH1 (або EcoR1) та Xba1. При гібридизації з плазмідою pw+/B-S показано, що фрагменти у обидвох мутантів з білими очима R7 та RN18 є ідентичними та співпадають зі смугою у лінії Oregon, що можна пояснити делецією елементів BEL та copia в дистальній ділянці локусу white (рис. 4В). У мутанта з лимонними очима RN11 при гібридизації з плазмідою pw+/B-S жодних змін порівняно з вихідною лінією не виявлено, проявилися такі ж дві гібридизаційні смуги (рис. 5б). Як показав аналіз довжин рестрикційних фрагментів після гібридизації з pw+(B-R)-плазмідою, зміна кольору очей у RN11-мутанта (перехід wa4>w*) зумовлена неточним вирізанням неідентифікованої вставки (рис. 4Г, 5а), при цьому розмір делеції співпадав з розміром неідентифікованого фрагмента - приблизно 11,5 тнп. Характерно, що аналогічні події при алельному переході wa4>w* в структурі локусу white були виявлені ще у двох мутантів з лимонними очима R6 (y2w*1) і RN5 (y2w*2).

Рис. 4. Природа мутацій в локусі white, а) транскрипційна і рестрикційна карта локусу white лінії Oregon [Levis et al., 1982; Zachar, Bingham, 1982] та використаних в роботі плазмід; б) рестрикційна карта локусу у лінії y2wa4; в) структура локусу в білооких мутантів; г) структура локусу у мутанта з лимонними очима. Трикутники - місця інсерції мобільних елементів BEL, copia та неідентифікованої вставки (НВ). Сайти рестрикції: B-Bam HI, R-EcoRI, H-Hind III, X-Xba I. 1. Oregon; 2. y2wa4; 3. y2wsnex (R7); 4. y2wsn (RN18); 5. y2w* (RN11).

Рис. 5. Результати блот-гібридизації за Саузерном локусу white досліджуваних ліній. а) гібридизація геномних ДНК, оброблених ендонуклеазами Bam HI і Eco RI, з рекомбінантною плазмідою pw+(B-R); б) гібридизація геномних ДНК, оброблених Bam HI і Eco RI, з рекомбінантною плазмідою pw+(B-S); в) гібридизація геномних ДНК, оброблених XbaI з рекомбінантною плазмідою pw+(B-R).

1. Oregon; 2. y2wa4; 3. y2wsnex (R7); 4. y2wsn (RN18); 5. y2w* (RN11).

Рестрикцію геномної ДНК при дослідженні природа мутацій, які виникли в локусі cut у мутантів RN20 та RN21 проводили ендонуклеазами EcoR1 i BamH1 з використанням рекомбінантної плазміди р8,3 (рис. 6в). При BamH1-розщепленні у контрольної лінії Oregon в результаті гібридизації виявлено дві смуги величиною 4,2 тнп і 9,4 тнп (рис. 6а); при розщепленні EcoR1 - лише один фрагмент величиною 8,3 тнп (рис. 6б). Аналогічна картина при дії цих ендонуклеаз спостерігалася і у вихідної лінії y2wа4 (рис. 6а, б). У обидвох cut-мутантів гібридизаційні смуги були ідентичними, але відрізнялися від контрольної і вихідної лінії. При BamH1-розщепленні утворювалися два фрагменти: один такий, як у лінії y2wа4 (9,4 тнп), а другий - більш рухливий (2,3 тнп) (рис. 6а). При EcoR1-розщепленні виявлявся один фрагмент, як і у вихідної лінії, але з меншою величиною – 6,4 тнп (рис. 6б). На основі одержаних результатів встановлено, що у індукованих РО і НЕС cut-мутантів відбулася делеція величиною 1,9 тнп в групі комплементації cut wing (рис. 6в).

Рис. 6. Природа мутацій в локусі cut: а) результати блот-гібридизації за Саузерном геномної ДНК, обробленої ендонуклеазою Bam H1 з плазмідою р8,3; б) блот-гібридизація ДНК сut-мутантів, оброблених ендонуклеазою Eco R1; в) рестрикційна карта локусу cut в координатах Чурікова М.А. [Чуриков и др., 1987], р8,3-плазміда, використана для гібридизації в а) і б). Трикутником позначено сайт інсерції мобільного елемента gypsy в мутанта ct6; г) структура локусу cut в отриманих мутантів. Штриховою лінією позначена делеція.

1. Oregon; 2. y2wa4; 3. RN20 ; 4. RN21

Таким чином, у радіоіндукованих мутантів внутрішньогенні делеції, вбудовування фрагментів ДНК, вирізання неповнорозмірних копій МГЕ з місць їх розташування спричиняють алельні переходи в нестабільних локусах і можуть бути однією з причин дестабілізації геному та скорочення тривалості життя.

ВИСНОВКИ

1. На основі аналізу частоти появи мутантів у природних популяцій D.melanogaster з зони ЧАЕС показано, що популяції є нестабільними і характеризуються високими показниками спонтанного мутування (2,49 - 7,92х10-3). Додаткове опромінення дозою 774 мКл/кг не приводило до достовірного зростання числа мутаційних подій у локусах Х-хромосоми. Після заміни у самців аутосом рівень як спонтанної, так і індукованої рентгенівським опроміненням частоти мутантів знизився на порядок.

2. Досліджено дію РО в сумарних дозах 258 мКл/кг та 774 мКл/кг на мутабільність локусів Х-хромосоми у лінії y2wa4. Показано, що вплив радіації в дозі 258 мКл/кг приводив до підвищеної частоти мутантів лише в F1, в той час як при опроміненні дозою 774 мКл/кг спостерігався високий рівень мутування як в першому, так і в другому поколіннях.

3. Проаналізовано спільну дію РО з хімічними реагентами - НЕС, кофеїном та б-токоферолом на частоту появи мутантів по Х-хромосомі впродовж 4-5 поколінь у лінії y2wa4. Виявлено локусоспецифічність мутаційних подій; найчастіше алельні переходи спостерігалися в нестабільних локусах white та cut. Встановлено, що:

O при комплексному впливі РО та НЕС найвища частота появи мутантів (1,4х10-3) була в другому поколінні;

O кофеїн підтримував пролонгований ефект дії радіації зі збереженням високого рівня мутування до п’ятого покоління;

O при спільній дії РО та б-токоферолу висока частота мутантів (3,3х10-3 ) виявлена лише в F1; в F2 – F5 цей показник був зниженим на порядок.

4. Відмічено зростання частоти ДЛМ у лінії y2wa4 (головним чином, за рахунок РЕЗ) при впливі РО (у 3,4 рази порівняно з контролем), НЕС (в 4,9 рази), кофеїну (в 1,7 рази); особливо різке збільшення відбувалося при комплексних діях РО та хімічних чинників (у 10,4 – 11 разів).

5. На основі аналізу кривих виживання мутантних ліній, отриманих в серіях дослідів по впливу РО, показано, що у переважної більшості ліній були зниженими параметри як середньої (на 7 – 40 %), так і максимальної (на 1 - 35 %) тривалості життя.

6. В результаті індукції НЕС на базі лінії дикого типу Oregon отримано колекцію нейродегенеративних мутантів, які характеризувалися швидким відмиранням особин і зниженою життєздатністю. Виявлено кореляцію між часом появи змін у структурах головного мозку і показниками середньої тривалості життя.

7. Методом блот-гібридизації за Саузерном досліджена природа мутацій в локусах white та cut, індукованих РО та комплексним впливом РО і НЕС. Показано, що:

O причиною алельного переходу wa4 > w було вирізання МГЕ BEL, copia та неідентифікованої вставки з одночасним вбудовуванням фрагмента ДНК розміром 6,2 тнп; поява мутації w* зумовлена неточним вирізанням неідентифікованої вставки розміром 11,5 тнп;

O cut-мутанти виникли в результаті делеції ділянки ДНК розміром 1,9 тнп в групі комплементації cut wing.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кімак (Голуб) Н.Я., Черник Я.І. Індукція домінантних летальних мутацій у Drosophila melanogaster внаслідок дії рентгенівського опромінення в комплексі з деякими хімічними реагентами // Вісник Львів. ун-ту. Сер. біол. – 2000. - Вип. 25. - С. 61-66. (Дисертант особисто брала участь у підготовці культури і аналізі частоти появи домінантних летальних мутацій у лабораторної лінії y2wa4 при різних впливах).

2. Кімак (Голуб) Н.Я. Пошук вікових дегенеративних змін у структурах головного мозку мутантів дрозофіли, індукованих рентгенівським опроміненням // Вісник Львів. ун-ту. Сер. біол. – 2000. - Вип. 26. - С. 54-59. (Дисертант виготовила і проаналізувала гістологічні препарати зрізів головного мозку радіоіндукованих мутантів, написала та оформила статтю).

3. Белоконь О.М., Бобак Я.П., Бондар Л.С., Кімак (Голуб) Н.Я., Максимів Д.В., Черник Я.І., Щербата Г.Р. Вікові зміни експресії генів у Drosophila melanogaster // Глава в монографії: Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть: В 4 т. / Київ: Логос, 2001. – Т.1. - С. 232 – 237. (Дисертант брала участь у побудові кривих виживання досліджуваних ліній, опрацюванні літературних даних, написанні огляду).

4. Кімак (Голуб) Н.Я., Бобак Я.П., Щербата Г.Р., Черник Я.І. Вплив рентгенівського опромінення на геномну мінливість Drosophila melanogaster // Глава в монографії: Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть: В 4 т. / Київ: Логос, 2001. – Т.1. - С. 242 – 249. (Дисертант брала участь у проведенні аналізу частоти появи мутантів, отриманих при поодинокому впливі опромінення і його спільній дії з деякими хімічними реагентами у природної популяції і лабораторної лінії y2wa4)).

5. Бобак Я.П., Кімак (Голуб) Н.Я., Максимів Д.В., Черник Я.І., Щербата Г.Р. Аналіз морфологічних змін мозку, індукованих етилметансульфонатом, у Drosophila melanogaster // Цитология и генетика. – 2001. – Т. 35, №6. – С. 34-37. (Дисертант під впливом етилметансульфонату отримала культури з ізогенізованою 2-ю хромосомою, виготовила і проаналізувала гістологічні препарати зрізів головного мозку одержаних культур).

6. Кімак-Голуб Н., Смик М., Черник Я. Роль антиоксидантів у індукованому рентгенівським опроміненням мутагенезі Drosophila melanogaster // Вісник Львів. ун-ту. Сер. біол. – 2002. - Вип. 27. - С. 114-120. (Дисертант провела аналіз частоти появи домінантних летальних мутацій і брала участь у пошукувидимих мутантів по Х-хромосомі у лінії y2wa4 при впливі антиоксидантів).

7. Голуб Н., Козаревська І, Черник Я. Індукція нітрозоетилсечовиною домінантних летальних мутацій та Х-зчеплених видимих мутацій у Drosophila melanogaster // Вісник Львів. ун-ту. Сер. біол. – 2002. - Вип. 29. - С. 52-61. (Дисертант брала участь у аналізі частоти появи домінантних летальних мутацій і видимих мутантів по Х-хромосомі у лінії y2wa4 при впливі нітрозоетилсечовини, особисто проаналізувала гістологічні препарати зрізів головного мозку культур, отриманих при дії нітрозоетилсечовини).

8. Бобак Я.П., Шоханов С.О., Кімак (Голуб) Н.Я., Черник Я.І. Індукована рентгенівським опроміненням генетична нестабільність по локусах Х-хромосоми у лабораторних ліній Drosophila melanogaster // Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії і сільського господарства: Книга наук. ст.: Книга 2. – Львів: Віче, 1996. – С. 78 – 84. (Дисертант брала участь у проведенні