АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ

Іванушко Яна Григорівна

УДК: 599.23:616.36-06: 612.014.48]: 621.375.826

РАДІАЦІЙНО ІНДУКОВАНІ ЗМІНИ У ПЕЧІНЦІ ЩУРІВ ТА ЇХ КОРЕКЦІЯ ЛАЗЕРНИМ ВИПРОМІНЕННЯМ

03.00.01 – радіобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Інституті експериментальної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України, м. Київ

Науковий керівник: доктор біологічних наук,

Чоботько Григорій Михайлович,
Інститут експериментальної радіології
Наукового центру радіаційної медицини
АМН України,
завідувач лабораторії радіаційної цитології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Серкіз Ярослав Іванович

Інститут експериментальної радіології
Наукового центру радіаційної медицини
АМН України,

провідний науковий співробітник
лабораторії радіаційної біохімії

кандидат медичних наук

Радіонова Наталія Костянтинівна

Інститут експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є Кавецького НАН України
старший науковий співробітник
відділу радіобіології

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченко

Захист дисертації відбудеться 10.10.2006 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.01 при Науковому центрі радіаційної медицини АМН України (03115, м. Київ, проспект Перемоги, 119/121).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Наукового центру радіаційної медицини АМН України (04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53)

Автореферат розісланий 08.09.2006 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук Л.О. Ляшенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У зв’язку зі збільшенням радіаційних навантажень антропогенного походження на довкілля, широким застосуванням джерел іонізуючих випромінень у медицині із діагностичною та лікувальною метою та у наукових дослідженнях і народному господарстві залишається гострою проблема впливу радіації в широкому діапазоні доз на організм людини і тварин.

Важливою біохімічною детермінантою розвитку післярадіаційних змін в органах і системах ссавців є вільнорадикальні процеси. Відомо, що іонізуюча радіація ініціює окисно-відновні реакції у живих системах [Бурлакова Е.Б., 1976 – 2004; Зенков Н.К., Меншикова Е.Б., 1993; Абанькин В.П., 1986; Владимиров Ю.А., 1987 – 2004; Тимочко М.Ф., Кобилінська Л.І., 1999; Олійник С.А., 1995; Fridovich I.,1986]. Найбільш чутливою до дії радіаційного фактора є система пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) [Серкіз Я.І., 1992, 2003; Мойсеєнко М.І., 1997; Чаяло П.П., Чоботько Г.М. 1997, 1999, 2001; Барабой В.А та ін., 1997; Шевченко О.Г., 2001, Устинова А.А., 2003]. Для клітин процеси окиснення є фізіологічно необхідними, але, вийшовши з-під контролю регулюючих їх систем вони викликають ушкоджуючі ефекти. Активні форми кисню можуть викликати окиснювальне руйнування і модифікацію ліпідів, білків та нуклеїнових кислот [Арчаков А.И., Мохосоев И.М., 1989; Львов К.М., Искаков А.А., 1993; Мещишен І.Ф, 1999, Каримов И.З., 2004]. Механізми окиснювальної модифікації білків (ОМБ) в органах і тканинах людини та тварин при окиснювальному стресі за дії іонізуючої радіації та лазерного випромінення практично не вивчені. Особливо це стосується печінки, яка, згідно із сучасними уявленнями, належить до радіочутливих органів [Воробьев А.И. и др., 1973; Любченко П.Н. и др., 1994; Пинчук В.Г. та ін. 1991; Горчакова Л.А., 1997]. Запускати механізми таких порушень можуть різноманітні чинники, в тому числі ендогенні зміни, що зумовлені порушенням фізіологічного стану інших радіочутливих органів, які функціонально пов’язані із печінкою. Продукти цитолізу від їх дії активізують в печінці низку метаболічних процесів, спрямованих на підтримку гомеостазу. Водночас у віддалені післярадіаційні терміни цей орган може набувати більшої радіочутливості і брати участь у формуванні віддалених наслідків опромінення, молекулярні механізми якого вивчені недостатньо.

Одним із фундаментальних і практичних досягнень ХХ століття є винахід і використання лазерного випромінення. Воно широко впроваджене у практику лікування різних захворювань в тому числі органів гепато-біліарної системи [Гамалея Н.Ф. и др., 1988; Мансуров Х.Х. и др., 1990; Крейман М.З. и др., 1992; Исаков В.Л., 1996; Рапопорт С.И. и др., 1999;Ушенко О.Г. та ін., 2000; Lavi R. et al., 2003;]. Показана його позитивна дія на стан мікроциркуляторного кров’яного русла, метаболічні та окисно-відновні процеси в тканинах [Гончарова Л.Л. та ін. 1994; Бородинский В.А. и др., 1999; Владимиров Ю.А. и др., 2004; Гурбич Е.А, Литвинова Е.В., 2004; Ефимова Е.Г. та ін., 2003; Stenhausler F. еt al., 1980]. Проте стосовно впливу лазерного випромінення у дослідників не має однозначної думки. Комбінований вплив іонізуючої радіації та лазерного випромінення на стан печінки як під час експозиції, так і в післярадіаційний період не досліджувався, зокрема, в динаміці розвитку змін.

У зв'язку із вищевикладеним актуальним та важливим є з'ясування окремого впливу цих факторів та особливостей їх комбінованої дії на показники стану печінки, а також визначення умов, за яких лазерне випромінення може проявляти корегуючий ефект.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в межах держбюджетних тем кафедри біохімії та експериментальної екології Чернівецького національного університету ім. Ю. Федьковича № 51.88 “Дослідження післядії радіаційного та хімічного забруднення на життєздатність живих організмів” (1994-1996 рр.), № держреєстрації 0194U028027 та № 51.82 “Дослідження захисних систем організмів в нормі та вражених карциномою Герена при дії опромінення та різних видів хімічних агентів” (1996-1999 рр.), № держреєстрації 0197U014415 а також НДР № 390 “Клініко-експериментальні дослідження мітохондріальної дисфункції в умовах впливу іонізуючого випромінювання” (2004-2006 рр.), № держреєстрації 0104U003643 яка виконувалась у лабораторії радіаційної цитології Інституту експериментальної радіології НЦРМ АМН України.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягає в з’ясуванні особливостей радіогенних змін у печінці щурів та можливість їх корекції лазерним випроміненням.

Для досягнення поставленої мети було сформульовано наступні завдання:

1. Дослідити вплив фракціонованого рентгенівського та лазерного випромінень і їх комбіновану дію на:

а) оксидантну та прооксидантну системи в печінці щурів;

б) фібринолітичну та протеолітичну системи в печінці щурів;

в) окиснювальну модифікацію білків у печінці щурів;

г) морфологічний стан печінки щурів.

2. Визначити особливості модифікуючого впливу лазерного випромінення на радіогенні зміни у печінці щурів.

3. Визначити можливість корекції радіогенних змін у печінці щурів лазерним випроміненням.

Об’єкт дослідження – радіогенні зміни у печінці щурів, опромінених іонізуючим та лазерним випроміненнями.

Предмет дослідження – оксидантна та прооксидантна системи, окиснювальна модифікація білків, фібринолітична та протеолітична системи та морфологічні зміни в печінці щурів за дії іонізуючого та неіонізуючого випромінень і їх комбінованої дії.

Методи дослідження – біохімічні, морфологічні, гістохімічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено активізуючий вплив фракціонованого рентгенівського випромінення в дозах 0,3; 0,6; 0,9 та 1,2 Гр та лазерного випромінення на протеолітичну систему печінки щурів. Відзначено, що фракціоноване рентгенівське та лазерне випромінення призводять до зниження фібринолітичної активності печінки щурів у віддалені терміни (через 20 і 30 діб) після опромінення.

Виявлено суттєвий вплив фракціонованого рентгенівського та лазерного випромінень на накопичення продуктів окиснювальної модифікації білків в ранні (1-а доба) і у віддалені (до 30-ї доби) терміни після опромінення. Вказані зміни спостерігаються на тлі порушення проокисно-антиоксидантного гомеостазу, викликаного дією як рентгенівського, так і лазерного випромінення.

Показано, що лазерне випромінення модифікує радіогенні зміни, викликані дією рентгенівського, зменшуючи інтенсивність змін по відношенню до показників, що вивчались за попереднього рентгенівського опромінення. Адитивність спостерігалась для ОМБ, СОД, протеолітичної активності, стосовно інших досліджуваних показників простежувався антагонізм. Дія попереднього лазерного випромінення проявлялась як адитивна для ОМБ і антагоністична стосовно всіх інших показників, що вивчались.

Доведено, що лазерне випромінення корегує радіогенні зміни, індуковані у печінці щурів в ранні терміни (1-а доба) після опромінення, стосовно фібринолітичної, протеолітичної активностей, антиоксидантного захисту. У більшому ступені виражена радіопротекторна дія лазерного опромінення.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані експериментальні дані окремої і сумісної дій рентгенівського та лазерного випромінень є важливими для розробки науково обгрунтованих оцінок впливу зазначених чинників на печінку.

Результати проведених досліджень доповнюють і поглиблюють уявлення про механізми впливу лазерного та рентгенівського випромінень та комбінованої їх дії на організм.

Викладені в роботі результати досліджень і наукові положення можуть бути включені до навчальних програм вузів, де викладаються курси „Радіобіологія”, „Радіаційна медицина” тощо.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проаналізовано наукову літературу за темою роботи, самостійно виконано експериментальні дослідження, проведено статистичну їх обробку та аналіз результатів, підготовлено матеріали для публікацій. За участю наукового керівника проведено планування експериментів, роботи в цілому та інтерпретацію результатів досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи викладено та обговорено на: III зґїзді з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія) (Київ, 2003); конференції “Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты” (Санкт-Петербург, 2004); Міжнародній науково-практичній конференції “Науковий потенціал світу 2004” (Дніпропетровськ, 2004); щорічних конференціях Інституту ядерних досліджень НАН України (Київ, 2004, 2005); Міжнародній конференції “Радіобіологічні ефекти: ризики, мінімізація, прогноз” (Київ, 2005); Всеукраїнській науково-практичній конференції “Наука і життя: Українські тенденції, інтеграція у світову наукову думку” (Київ, 2005); Міжнародних науково-практичних конференціях “Динаміка наукових досліджень – 2005” (Дніпропетровськ, 2005); “Наукові дослідження – теорія та експеримент 2005” (Полтава, 2005); Міжнародній конференції “Двадцять років Чорнобильської катастрофи. Погляд у майбутнє” (Київ, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 6 статей у фахових наукових виданнях та 9 тез доповідей.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду наукової літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів власних досліджень та їх обговорення, заключення, висновків, списку використаної літератури, що нараховує 300 посилань.

Робота викладена на 171 сторінці машинопису, проілюстрована 49 рисунками та 17 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлюються та аналізуються особливості впливу іонізуючого і лазерного випромінень на організм людини та тварин в цілому й печінку зокрема.

Матеріали і методи дослідження

Експериментальні дослідження виконано на білих нелінійних щурах-самцях масою 120 – 150 г., які утримувались за стандартних умов віварію.

Фракціоноване тотальне опромінення тварин рентгенівськими променями здійснювали впродовж 30 діб з інтервалом 24 години на рентгенівській діагностичній установці 12 П6. Потужність експозиційної дози становила 0,258 мКл/с, напруга 90 кВ, сила струму 40 мА при алюмінієвому фільтрі та шкірно-фокусній відстані 48 см у щодобовій дозі 0,258 мКл/кг (1 сГр), 0,516 мКл/кг (2 сГр), 0,774 мКл/кг (3 сГр) і 1,032 мКл/кг (4 сГр). Сумарні дози були 7,74 мКл/кг (0,3 Гр) (група 1), 15,48 мКл/кг (0,6 Гр) (група 2), 23,3 мКл/кг (0,9 Гр) (група 3) та 30,96 мКл/кг (1,2 Гр) (група 4) відповідно. Лазерне опромінення проводили через попередньо поголену шкіру на ділянку печінки по 60 с щодобово впродовж 10 діб (група 5), 20 діб (група 6) і 30 діб (група 7) на апараті ЛГН-207-А ( л= 632,8 нм), діаметр променя 0,3 см. Комбіновану дію здійснювали лазерним опроміненням впродовж 10 діб з подальшим впливом рентгенівського випромінення за вищенаведеної схеми в сумарній дозі 23,3 мКл/кг (0,9 Гр) (група 8) і дія рентгенівського випромінення в сумарній дозі 23,3 мКл/кг (0,9 Гр) з наступним лазерним опроміненням в останні 10 діб 30-добового курсу фракціонованого тотального опромінення рентгенівськими променями (група 9), контроль (група 10).

Після завершення експерименту тварин декапітували під легким ефірним наркозом через 1-ну, 10, 20 і 30-ть діб по закінченні експозиції. При проведенні досліджень дотримувались вимог Європейської конвенції щодо захисту хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей (Страсбург, 1985).

У гомогенаті печінки визначали ферментативну активність супероксиддисмутази (СОД) [1.15.1.11] [Чевари С. и др., 1985], каталази [1.11.1.6] [Королюк М.А. и др., 1988], глутатіонпероксидази [1.11.1.6] (ГПО) [Мещишен И.Ф., 1991], вміст дієнових кон'югатів (ДК) [Гаврилов В.Б. и др., 1983], малонового діальдегіду (МДА) [Стальная И.Д. и др, 1977], глутатіону відновленого (ВГ) [Мещишен И.Ф. и др., 1993], загального білка [Lowry O.H. et al., 1951]. Визначали фібринолітичну [Кухарчук О.Л., 1996], протеолітичну [Магаляс В.М. та ін., 2001] активності печінки та окиснювальну модифікацію білків [Дубинина Е.Е. и др., 1995].

З гістологічних та гістохімічних методів використовували: забарвлення гематоксиліном та еозином, РАS-реакцію на наявність нейтральних глікозамінгліканів [Пирс Э., 1962]; забарвлення сполучної тканини за методом Слінченка Н.З. [1983]. З метою морфологічної ідентифікації ушкоджень в печінці використовували гістоензимохімічні методи виявлення лужної, кислої фосфатаз і сукцинатдегідрогенази [Бернстон М., 1982; Лойд З. и др., 1982].

Отримані данні опрацьовували статистично [Стентон Гланц, 1999]. Різницю між показниками у тварин різних груп вважали вірогідною за р < 0,05.

Результати дослідження та їх обговорення

Вплив рентгенівського випромінення. 30-добове фракціоноване опромінення тварин рентгенівськими променями за сумарних доз 0,3 Гр, 0,9 Гр та 1,2 Гр викликало зниження вмісту продуктів ПОЛ – малонового діальдегіду та дієнових конґюгатів у печінці щурів. На 30-ту добу після опромінення вміст ДК зростав в усіх дослідних групах (1 – 4 групи) і становив 125, 116. 124 і 105 % відповідно. Максимальний вміст вторинних продуктів ПОЛ у печінці в 1-й і 3-й дослідних групах (0,3 Гр та 0,9 Гр) спостерігався через 30 діб – 124 і 113 % відповідно.

Багато дослідників спостерігали зменшення вмісту продуктів ПОЛ у печінці тварин, що знаходились на забрудненій території [Расіна Л.Н. і Орехович Н.А., 2003], а також у людей і тварин за тривалої дії іонізуючої радіації [Чаяло П.П., Чоботько Г.М., 2001; Хижняк С.В. и др., 2001; Липська А.І. та ін., 2006].

У детоксикації ендогенних токсинів, радіотоксинів, інактивації утворених вільних радикалів істотне значення відіграє печінка. Дія токсичних агентів супроводжується ушкодженням молекулярної організації мембран гепатоцитів і функціонуванням мембранозв’язаних ферментів [Нікітченко Ю.В. та ін., 2001]. За дії радіації спостерігаються порушення збалансованості антиоксидантної системи (АОС). По закінченні опромінення (1-а доба) супероксиддисмутазна, каталазна та глутатіонпероксидазна активності гомогенату печінки зменшувались у всіх дослідних групах тварин (0,3 – 1,2 Гр). У подальшому суперкосиддисмутазна активність зростала і досягала максимальних значень в усіх групах через 20 діб (160, 128, 124 і 142 %). Через 20 і 30 діб каталазна активність майже не відрізнялась від контролю, крім 1-ї групи (0,3 Гр), де спостерігалось зростання на 12 %. Глутатіонпенроксидазна активність у віддалений період (30-а доба) зростала. Збільшення активності ГПО відмічали в 1-й групі (111 %), а в інших групах її активність наближалась до контрольних значень.

Подібні зміни активності СОД, каталази та ГПО за опромінення щодобовою дозою 0,01 Гр впродовж 30 діб спостерігали Клевета Г.Я. із співавторами [2002]. Зниження активності глутатіонзалежної системи і каталази спостерігалось за тривалого опромінення гризунів за доз більших 1 сГр/добу [Рева А.Д. и др., 1993].

На 1-шу добу по закінченні експозиції спостерігались різноспрямовані зміни вмісту відновленого глутатіону в досліджуваних групах тварин. Так опромінення в дозі 0,3 і 0,6 Гр (групи 1 і 2) не призвело до змін вмісту відновленого глутатіону в печінці щурів, в 3-й групі відмічали

а) б)

Рис. 1. Динаміка рівня альдегідо- та кетонопохідних динітрофенілгідразонів нейтрального (а) і основного (б) характеру у печінці після закінчення 30-добового фракціонованого рентгенівського опромінення щурів у різних сумарних дозах 0,3 Гр (група 1), 0,6 Гр (група 2), 0,9 Гр (група 3) та 1,2 Гр (група 4) (% до контролю); * - вірогідна різниця відносно контролю (p < 0,05).

зниження, а в 4-й – збільшення на 30 %. В подальшому у всіх групах спостерігали збільшення вмісту відновленого глутатіону в печінці з досягненням максимального його вмісту на 30-ту добу (156, 187, 174 і 174 % відповідно).

Результати досліджень рівня окиснювально модифікованих білків (рис. 1) свідчать про їх зростання в усіх групах, більш виражене в 4-й групі. Через 30 діб по закінченні курсу опромінення спостерігався підвищений рівень (майже однаковий) в 1, 2 і 3-й дослідних групах, а в 4-й групі показники наближались до контрольних. Рівень модифікованих білків віддзеркалює стан рівноваги між рівнем окиснених білків і швидкістю їх розпаду. Більшість модифікованих білків зазнають протеолітичного розпаду в 50 разів швидше, ніж незмінені білки [Мещишен І.Ф, Польовий В.П., 1999]. В свою чергу, протеази проявляють селективність до цих білків [Davies K.J.A. et al., 1987]. Накопичення продуктів ОМБ залежить від багатьох факторів, що керують синтезом і окисненням білків, з одного боку, та активністю різних протеаз – з другого.

Зміни рівнів продуктів ОМБ за використаних нами доз опромінення в динаміці мають певну відмінність. Відомо, що серед білків найбільш чутливими до оксидативних пошкоджень є ферменти, особливо ті, що містять іони металів [Арчаков А.И., Мохосоев И.М., 1989; Oliver C.N. et al., 1987]. Деякі з внутрішньоклітинних протеаз, що селективно деградують модифіковані білки, теж інактивуються реакційно-здатними формами кисню, що може бути причиною зменшення темпів деградації і призвести до накопичення в клітинах модифікованих білків [Stadman E.R., Oliver C.N., 1991], як це показано в наших дослідах [Іванушко Я.Г. та ін., 2005].

Через добу по закінченні курсу рентгенівського опромінення впродовж 30-и діб спостерігались зміни фібринолітичної активності печінки щурів. Виявлено незначне зменшення сумарної фібринолітичної активності (СФА) в усіх дослідних групах. Найнижчий рівень активності відмічався за дії рентгенівського випромінення в сумарній дозі 0,3 Гр, за рахунок зниження неферментативної фібринолітичної активності (НФА) на 22 %. В 3-й і 4-й дослідних групах сумарна фібринолітична активність знижувалась в більшому ступені за рахунок ферментативного фібринолізу На 30-ту добу фібринолітична активність нормалізувалась тільки в 1-й і 2-й групах. В 3-й і 4-й групах зниженою залишалась сумарна, неферментативна і ферментативна фібринолітичні активності.

Протеоліз – це ферментативний розрив пептидних зв’язків у білках. За деяких патологічних станів відбувається надмірна його активізація, що є важливим патогенетичним ланцюгом у розвитку деструктивних, запальних, алергічних реакцій, порушенні процесів гемостазу [Веремеенко К.Н. и др., 1998], що набуває особливого значення за хронічної дії радіації.

Нами встановлені суттєві зміни показників протеолітичної активності печінки щурів за умов впливу рентгенівського випромінення (табл. 1). На 1-шу добу після опромінення збільшується кількість продуктів деградації азоальбуміну, азоказеїну та азоколагену в усіх дослідних групах, що свідчить про підвищену деградацію високо- і низькомолекулярних білків та колагену. Більшої деградації зазнали низькомолекулярні білки, на що вказує збільшення кількості продуктів деградації азоальбуміну та колагену. Слід зазначити, що альбумін є важливим позаклітинним антиоксидантом, бо в більшому ступені піддається модифікації за оксидативного стресу, а, відповідно, і протеолізу [Зенков Н.К. и др., 2001; Halliwell B., 1988]. На 30-ту добу по закінченні курсу опромінення спостерігали нормалізацію протеолітичної активності, яка в 3-й і 4-й групах залишалась високою (123 та 110 % відповідно).

Таблиця 1.

Показники протеолітичної активності печінки щурів
за дії рентгенівського випромінення

(M ± m, n = 8)

Дози |

Азоальбумін | Азоказеїн | Азоколаген | Азоальбумін | Азоказеїн | Азоколаген

Е440/год x г тканини | Е440/год x г тканини

1-а доба після опромінення | 10-а доба після опромінення

Контроль | 48,07±3,31 | 45,41±1,93 | 5,79±0,76 | 48,07±3,31 | 45,41±1,93 | 5,79±0,76

0,3 Гр | 65,38±2,38* | 60,40±4,06* | 8,67±1,19 | 50,22±5,53 | 50,48±4,77 | 8,30±1,19

0,6 Гр | 63,69±2,23* | 56,57±1,28* | 8,80±1,33 | 69,59±5,79* | 60,34±1,68* | 12,11±2,12*

0,9 Гр | 58,14±1,05* | 52,45±4,97 | 9,95±2,55 | 67,29±1,64* | 61,96±1,74* | 12,43±1,28*

1,2 ГР | 68,79±4,80* | 59,62±3,49* | 13,11±3,71 | 73,70±1,58* | 64,13±0,71* | 13,02±1,43*

20-а доба після опромінення | 30-а доба після опромінення

Контроль | 63,70±2,34 | 55,32±2,05 | 10,77±1,39 | 63,70±2,34 | 55,32±2,05 | 10,77±1,39

0,3 Гр | 66,93±1,75 | 56,58±1,64 | 11,83±1,32 | 65,65±1,93 | 54,18±2,07 | 11,85±1,17

0,6 Гр | 65,93±2,08 | 56,80±2,67 | 13,40±0,81 | 65,47±3,89 | 57,11±2,08 | 11,47±1,74

0,9 Гр | 57,69±1,77 | 51,29±0,94 | 11,62±0,99 | 66,63±2,45 | 58,66±1,82 | 13,26±1,67

1,2 Гр | 56,30±1,69* | 47,77±0,87* | 8,38±1,40 | 60,67±1,68 | 55,66±1,34 | 11,87±1,20

Примітка. * - вірогідна різниця відносно контролю (р < 0,05)

Опромінення тварин рентгенівськими променями у дозі 0,9 Гр (3-я група) по закінченні курсу експозиції (1-а доба) призводило до незначних неспецифічних змін гепатоцитів у вигляді панлобулярної зернистої дистрофії, розширення просторів Діссе, зменшення кількості клітин Купфера, збільшення кількості глікогену. В гепатоцитах спостерігали збільшення активності кислої та лужної фосфатаз, осередки підсилення та послаблення активності сукцинатдегідрогенази. Через 30 діб повної нормалізації морфологічної картини не відмічалась.

Підвищення активності ферментів може вказувати на збільшення проникності мембран, активізацію окисно-відновних процесів в гепатоцитах і посилення регенераторних процесів [Гупало Е.Е., 1968].

Вплив лазерного опромінення. Зміни вмісту ДК в динаміці спостережень мали коливальний характер. Так, вміст ДК в печінці через добу по закінченні лазерного опромінення щурів суттєво не відрізнявся від контролю в 5-й і 6-й дослідних групах, а в 7-й групі він зростав на 27 %. Зниження вмісту ДК відмічалось через 20 діб в усіх дослідних групах (72, 71 і 77 % відповідно). Не простежувалося лінійної дозової залежності його вмісту за використаних режимів опромінення.

У групі тварин, що отримували 10-добовий курс лазерного опромінення, виявлено зменшення вмісту МДА на 1-шу добу та збільшення у віддалений період (30-а доба) після курсу опромінення. Після 20- і 30-добового курсу опромінення лазером вміст МДА на 1-шу добу збільшувався з наступним його зменшенням у віддалений період (20, 30-а доби) після курсу опромінення.

Виявлено зниження супероксиддисмутазної активності у всіх дослідних групах тварин на 1-шу добу після курсу лазерного опромінення. У віддалений період (30-а доба) активність СОД печінки щурів 6-ї і 7-ї груп тварин залишалась вірогідно нижчою в порівнянні з контрольною групою. За умов 10-добового курсу опромінення (5-а група) активність досліджуваного ферменту були близькою до контрольної.

Каталазна активність печінки щурів на 1-шу добу після 10-добового курсу лазерного опромінення (5-а група) знижувалась, а за 20- і 30- добового (6 і 7-а групи) вона зростала. У віддалений період (30-а доба) після курсу лазерного опромінення значення величин каталазної активності були прямо протилежними в порівнянні з показниками її активності на 1-шу добу.

Лазерне опромінення в 5-й групі тварин викликало зниження активності ГПО (1-а доба) з поступовим зростанням до 30-ї доби. В 6-й і 7-й дослідних групах вона залишалась на рівні контрольних показників після курсу опромінення (1-а і 20-а доба), а через 30 діб активність ГПО в цих групах знижувалась на 17 і 22 % відповідно. Дозозалежний характер змін активності ГПО спостерігався через 20 діб по закінченні курсу опромінення – мінімальна активність в 5-й і максимальна – в 7-й дослідних групах. Через 30 діб досліджувана залежність мала протилежний характер – максимальна активність в 5-й і мінімальна – в 7-й дослідних групах.

10-добовий курс лазерного опромінення (група 5) викликав збільшення вмісту ВГ з максимальними значеннями через 10 діб після опромінення. В подальшому вміст відновленого глутатіону достовірно зменшувався до 30-ї доби (82 %). В 6-й і 7-й дослідних групах він зменшувався через 1-ну, 10-ту і 30-ту добу після опромінення.

Під впливом лазерного випромінення відбуваються зміни просторової структури молекул, що веде до порушень функцій, зміни властивостей білкових молекул [Мостовников В.А. и др., 1989, Элькина Б.И. и др., 1989]. 10-добовий курс лазерного опромінення (5-а група ) призводив до збільшення рівня окисно модифікованих білків на 1-шу добу після опромінення з подальшим зниженням його рівня до контрольних значень на 30-ту добу. 20-добовий курс (6-а група) викликав зниження рівня продуктів ОМБ, який до 30-ї доби залишався нижче (р < 0,05) контрольних показників. За 30-добового лазерного опромінення (7-а група) рівень продуктів окиснювальної модифікації білків не відрізнявся від контрольних значень після курсу опромінення (1-а доба). Через 20 і 30 діб спостерігалось збільшення його рівня. Таким чином, вплив гелій-неонового лазера в застосованих режимах на окиснювальну модифікацію білків залежить від часу опромінення і є менш вираженим, ніж за дії рентгенівського випромінення.

Таблиця 2.

Показники фібринолітичної активності печінки щурів

за дії лазерного випромінення
(M ±m, n = 8)

Групи | СФА | НФА | ФФА | СФА | НФА | ФФА

Е440/год x г тканини | Е440/год x г тканини

1-а доба після опромінення | 10-а доба після опромінення

Контроль | 34,53 ±1,38 | 18,09 ±1,07 | 17,56 ±0,71 | 34,53±1,38 | 18,09±1,07 | 17,56±0,71

10 діб | 42,48±2,38 | 22,25±1,83 | 21,59±2,69 | 36,26±0,51 | 15,38±1,26 | 22,13±1,14*

20 діб | 32,10±0,89 | 16,33±1,35 | 15,77±0,79 | 30,89±3,01 | 15,20±1,96 | 15,96±1,48

30 діб | 36,47±1,27 | 19,33±1,39 | 17,13±1,16 | 32,99±1,63 | 17,49±1,27 | 15,28±0,75*

20-а доба після опромінення | 30-а доба після опромінення

Контроль | 39,38±1,04 | 20,18±1,66 | 18,17±1,47 | 39,38±1,04 | 20,18±1,66 | 18,17±1,47

10 діб | 31,11±1,91* | 17,15±0,89 | 13,08±1,92 | 44,89±1,26* | 21,99±1,11 | 19,81±0,96

20 діб | 35,89±1,37 | 19,13±1,38 | 16,42±0,61 | 37,29±1,39 | 19,43±1,69 | 17,50±0,71

30 діб | 33,17±1,18* | 17,49±1,98 | 15,43±0,79 | 32,43±1,44* | 16,43±1,22 | 16,34±0,95

Примітка. * - вірогідна різниця відносно контролю (р < 0,05)

Курс лазерного опромінення викликав зростання ферментативної, неферментативної та сумарної фібринолітичної активностей на 23 % в печінці щурів на 1-шу добу в 5-й групі (табл. 2). В 6-й групі сумарна, неферментативна і ферментативна фібринолітична активності знижувались, а в 7-й групі показники не відрізнялись від контролю. Мінімальний рівень фібринолітичної активності спостерігався через 20 діб в усіх дослідних групах. У більшій мірі знижувалась ферментативна фібринолітична активність.

Через 30 діб по закінченні курсу лазерного опромінення сумарна фібринолітична активность нормалізувалась в 6-й групі. В 7-й групі вона залишалась зниженою (на 18 %) переважно за рахунок неферментативної фібринолітичної активності (на 19 %), а в 5-й групі – підвищеною на 14 % за рахунок неферментативної і ферментативної фібринолітичної активностей.

10-добовий курс лазерного опромінення (1-а доба) викликав активізацію системи протеолізу, що проявилось у збільшенні продуктів деградації азоальбуміну, азоказеїну і азоколагену. На відміну від дії рентгенівського, 10-добовий курс лазерного випромінення спричинив більшу деградацію високомолекулярних білків і колагену. 20- і 30-добовий курси лазерного опромінення мало вплинули на велико- і низькомолекулярні білки. Суттєвим був вплив цих режимів опромінення на деградацію колагену – збільшення продуктів деградації азоколагену на 93 і 57 % для 6-ї і 7-ї груп відповідно.

Вважають, що опромінення гелій-неоновим лазером призводить до змін зарядів білків, їх конформаційної будови [Генкин В.М. и др., 1989; Чичук Т.В. и др., 1999]. За взаємодії лазерного випромінення з молекулами білків може відбуватись комбінаційне розсіювання випромінення або резонансне поглинання енергії білком [Попов В.Д. и др., 1997]. Руйнування сольватних оболонок, зменшення електростатичного відштовхування зумовлюють збільшення флуктуації білків, їх коагуляцію [Попов В.Д. и др., 1997].

Через 30 діб протеолітична активність в 5-й групі знижувалась до контрольних значень щодо велико- і низькомолекулярних білків і достовірно зростала щодо колагену (148 %). В 6-й і 7-й групах збільшувався вміст продуктів деградації азоальбуміну (на 19 і 39 %), азоказеїну (на 15 і 121 %) та азоколагену (на 74 і 127 %).

Опромінення тварин лазером впродовж десяти діб (1-а доба) призводило до явищ зернистої дистрофії печінкових клітин переважно центру часточок. В гепатоцитах периферії, а також частини гепатоцитів центру часточок відмічалась гідропічна дистрофія, некроз окремих гепатоцитів. Спостерігалось розширення просторів Діссе, повнокров'я венозних портальних трактів, лімфоцитарна інфільтрація строми портальних трактів, проліферація клітин Купфера, жирова дистрофія окремих гепатоцитів. Визначалось підвищення активності сукцинатдегідрогенази та кислої фосфатази в гепатоцитах.

Через 20 діб після опромінення тварин гелій-неоновим лазером зникало повнокров'я, зменшувались явища дистрофії. Відмічався набряк сполучної тканини портальних трактів навколо тріад, зберігалась лімфоцитарна інфільтрація та розширення просторів Діссе. Спостерігалось відкладання згустків фібрину в синусоїдах. Зберігалась висока активність кислої фосфатази. Активність сукцинатдегідрогенази та лужної фосфатази не відрізнялась від контролю.

Посилення PAS-реакції в області тріад може бути свідченням активізації синтетичних процесів, імовірно стимуляції фібробластів, що співпадає з літературними даними [Hubaиek J. et al., 1985]. Ініціювання вільними радикалами реакцій ПОЛ відіграє значну роль у прогресуванні фіброгенезу в печінці, оскільки основний продукт ПОЛ мембран – малоновий діальдегід – активізує купферовські клітини, що призводить до надлишку продукції колагену, а також „перетворює” ліпоцити у колаген синтезуючі [Швайко О.А., 2004].

Вплив рентгенівського та лазерного випромінення. Низькоінтенсивне лазерне випромінення за певних доз і режимів впливу діє позитивно при лікуванні різних патологічних змін в органах і тканинах [Гамалея Н.Ф. и др., 1988; Ушенко О.Г. та ін., 2000; Lavi R. et al., 2003], що дає можливість активно розробляти лазерні методи реабілітації в різних галузях медицини. Деякі результати експериментальних досліджень комбінованої дії іонізуючого і неіонізуючого випромінень показали, що при дослідженні різних систем організму і за різних умов експерименту спостерігається як антагоністичний, так і адитивний характер реакцій [Руднев М.И. и др., 1994]. Одним із факторів, що суттєво впливає на характер реакцій, є час застосування неіонізуючого випромінення – до або після іонізуючого.

Комбінована дія двох фізичних факторів викликала збільшення вмісту ДК по закінченні курсу опромінення (1-а доба). В наступні терміни спостереження вміст ДК в печінці знижувався порівняно з контролем на 30-ту добу (78 %) в групі з попереднім лазерним опроміненням. Через 30 діб по закінченні опромінення, за комбінованої дії двох фізичних факторів із попереднім рентгенівським опроміненням тварин, вміст ДК зростав до 113 % у порівнянні з контролем.

Комбінована дія рентгенівського і лазерного випромінень (8-а і 9-а групи) мало впливала на вміст МДА після курсу опромінення. Збільшення вмісту МДА спостерігалось через 30 діб, більш виражено в групі з попереднім рентгенівським опроміненням.

Супероксиддисмутазна активність гомогенату печінки (рис. 2а) на 1-шу добу після курсу опромінення у 8-й групі не відрізнялась від контролю, а за попереднього застосування рентгенівського випромінення вона достовірно знижувалась (67 %). Через 30 діб по закінченні курсів опромінення активність СОД залишалась нижче контрольних цифр.

Каталазна активність (рис. 2б) зростала в обох дослідних групах після курсів (на 1-шу добу) і в подальшому (10, 20 і 30-та доби) була близькою до контрольних значень.

а) б)

в) г)

Рис. 2. Стан складових антиоксидантної системи: а) – СОД; б) – каталаза; в) – ГПО; г) – глутатіон відновлений за комбінованої дії рентгенівського та лазерного випромінень (% до контролю); * - вірогідна різниця відносно контролю (p < 0,05).

Зміни активності глутатіонпероксидази (рис. 2в) по закінченні опромінення (1-а доба) мали коливальний характер. Найнижчий рівень активності ГПО спостерігався через 10 діб по закінчені курсу опромінення. У наступні терміни активність ГПО практично не відрізнялась від контрольних показників.

Комбінована дія лазерного і рентгенівського випромінень (8-а група) викликала зменшення вмісту глутатіону відновленого на 77 % після курсу опромінення (1-а доба) (рис. 2г).

Через 10, 20 і 30 діб вміст ВГ мало відрізнявся від контрольних показників. Зменшення його вмісту спостерігалось в 9-й групі через 30 діб по закінченні курсу опромінення на 11 % (рис. 2г). З наведених даних видно, що лазерне опромінення модифікувало зміни, викликані рентгенівським опроміненням в системі антиоксидантного захисту, зменшуючи їх інтенсивність.

Комбінована дія рентгенівського та лазерного випромінень викликала зростання продуктів ОМБ в 8-й і 9-й дослідних групах по закінченні курсів опромінення (1-а доба) і через 10 діб (рис. 3). Незначно переважав приріст похідних основного характеру. Інтенсивність змін була значно меншою, ніж за дії рентгенівського випромінення. Характер змін мало відрізнявся в залежності від

а) б)

Рис. 3. Динаміка рівня альдегідо- та кетонопохідних динітрофенілгідразонів нейтрального (а) і основного (б) характеру у печінці щурів за комбінованої дії рентгенівського та лазерного випромінень (% до контролю); * - вірогідна різниця відносно контролю (p < 0,05).

черговості застосування лазерного випромінення (до або після рентгенівського). На 30-ту добу комбінованої дії рентгенівського та лазерного випромінень рівень альдегідо- і кетонопохідних динітрофенілгідразонів наближався до контрольних показників. За попереднього застосування лазерного випромінення знижений рівень продуктів ОМБ спостерігався до 30-ї доби. Таким чином, лазерне випромінення модифікує дію рентгенівського, зменшуючи рівень окисно модифікованих білків в печінці щурів.

Нагромадження окисненого білка може бути раннім критерієм ушкодження тканин активними формами кисню і за деяких патологічних станів досягає 50-70 % всього клітинного білка [Мещишен І.Ф., Польовий В.П., 1999]. В залежності від природи оксидативного стресу і пускових механізмів окиснювальної модифікації білків може бути різний характер і кількість продуктів ОМБ [Schild L. et al., 1997; Shaster Em., 2000].

Комбінована дія рентгенівського та лазерного випромінень (група 9) призводила до змін фібринолітичної активності у печінці щурів. Через одну добу СФА зростала (10 %), переважно за рахунок ФФА. Неферментативний фібриноліз забезпечується комплексними сполуками гепарину, спрямованими на розчинення згортків нестабілізованого фібрину. Підвищення проникності мембран тучних клітин веде до вивільнення гепарину, що сприяє утворенню гормон-гепаринових комплексів [Кудряшев Б.А., Ляпина Л.А., 1982] з наступною активізацією неферментативного фібринолізу.

Розчинення і видалення фібрину здійснює система фібринолізу. Накопичення лімфоцитів в стромі портальних трактів, посилення PAS-реакції в області тріад [Іванушко Я.Г., 2000]може бути свідченням посилення синтетичних процесів, імовірно стимуляції фібробластів [Андреенко Г.В., 1982;]. Репаративні процеси супроводжуються активізацією фібринолітичної
системи [Андреенко Г.В., 1979]. Через 30 діб після комбінованої дії рентгенівського та лазерного випромінень спостерігалась нормалізація фібринолітичної активності. Суттєвих відмінностей в часі застосування лазерного випромінення ( до або після рентгенівського) на фібринолітичну систему не було.

Комбінована дія двох фізичних факторів викликала активізацію необмеженого протеолізу через добу по закінченні їх впливу. Характер змін відрізнявся в залежності від послідовності застосування лазерного опромінення – до або після рентгенівського. В 8-й групі (попереднє опромінення ГНЛ) спостерігалась незначна активізація протеолізу щодо великомолекулярних білків (збільшення продуктів деградації азоальбуміну на 7 %) через добу, в подальшому (10 діб) – зниження протеолітичної активності із досягненням через 20 діб її нормалізації, щодо вмісту продуктів деградації азоальбуміну і азоказеїну. Відмічався хвилеподібний характер змін протеолітичної активності щодо колагену: по закінченні курсу опромінення вона зменшувалась на 13 % з досягненням максимальних значень показників на 10-ту добу. Через 30 діб спостерігалось зниження протеолітичної активності щодо велико-, низькомолекулярних білків і колагену. Інший характер змін відмічався в групі 9 – значно зростала кількість азоальбуміну (181 %), азоказеїну (229 %), азоколагену (221 %) через одну добу. Деградації в більшій мірі піддавались великомолекулярні білки і колаген. У подальшому протеолітична активність поступово знижувалась до 20-ї доби, з нормалізацією показників на 30-ту добу. Протеолітична активність щодо колагену знижувалась (20 діб) і не досягала значень контролю через 30 діб. Зниження кількості продуктів розпаду азоколагену свідчить про зниження деградації колагену.

За комбінованої дії рентгенівського та лазерного випромінень відмічалась зерниста, гідропічна дистрофія. Простори Діссе були розширеними. По периферії часточки спостерігалась гіпертрофія ядер гепатоцитів. Через 30 діб повної нормалізації морфологічної картини печінки не спостерігалось.

ВИСНОВКИ

1. В дисертаційній роботі наведено нове вирішення наукової задачі щодо оцінки модифікуючого впливу гелій-неонового лазерного випромінення на радіогенні зміни у печінці в динаміці за умов фракціонованого рентгенівського опромінення щурів .

2. Фракціоноване рентгенівське випромінення за доз 0,3; 0,6; 0,9 та 1,2 Гр призводило до радіогенних змін в печінці щурів, що заключалось у зниженні активності ферментативної ланки антиоксидантного захисту та сумарної фібринолітичної активності, з одночасним зростанням протеолітичної активності печінки, збільшенням вмісту відновленого глутатіону і рівня продуктів окиснювально модифікованих білків, переважно альдегідо- та кетонопохідних динітрофенілгідразонів основного характеру. Динаміка цих змін залежала від величини дози опромінення та терміну спостереження. Морфологічні порушення характеризувались дистрофічними процесами, що мають неспецифічний характер.

3. Встановлено, що 10- добове лазерне опромінення призводило до зростання фібринолітичної і протеолітичної активностей печінки щурів та збільшення рівня продуктів окисної модифікації білків на фоні зниження активності ферментативної ланки антиоксидантного захисту. Встановлено, що за 20- і 30-добового лазерного опромінення зміни досліджуваних показників були менш виражені, ніж при 10-ти добовому. На 30-ту добу після опромінень повної нормалізації досліджуваних показників не наступало. У печінці мали місце морфологічні порушення неспецифічного характеру.

4. Комбінований вплив рентгенівського з наступною дією лазерного випромінення в ранній термін (1-а доба) призводив до нормалізації активності