ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ

УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК

КРУТИЛО ДМИТРО ВАЛЕРІЙОВИЧ

ДК 579.26:631.847.211:633.34

ПОШИРЕННЯ ТА ЕКОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ БУЛЬБОЧКОВИХ

БАКТЕРІЙ СОЇ В РІЗНИХ РЕГІОНАХ УКРАЇНИ

03. 00. 16 - екологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії біологічного азоту Інституту сільськогосподарської мiкробiологiї Української академії аграрних наук

Науковий керівник: | кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник, КОВАЛЕВСЬКА Тамара Михайлівна, Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН, провідний науковий співробітник лабораторії біологічного азоту

Офiцiйнi опоненти: | доктор біологічних наук, ПОПОВА Елеонора Михайлівна, Інститут агроекології УААН, головний науковий співробітник

кандидат біологічних наук, ПОСТОЄНКО Олена Михайлівна, Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, молодший науковий співробітник

Провідна установа: | Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “  “ березня р. о 1100 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .371.01 Інституту агроекології УААН за адресою: 03143, м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології УААН за адресою: 03143, м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

Автореферат розісланий “ 28 “  січня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради,

кандидат хімічних наук Моклячук Л.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Зв’язування атмосферного азоту мікроорганізмами – це єдиний шлях забезпечення рослин азотом, який не веде до порушення екологічної рівноваги в біогеоценозах через забруднення грунтів, водоймищ та атмосфери. Симбіотичні системи бульбочкових бактерій з бобовими рослинами можуть залучати в кругообіг до 90 млн. тон азоту повітря за рік (Тихонович и др., 2002).

Слід підкреслити, що накопичення біологічного азоту бобовими культурами відбувається лише за наявності в грунті симбіотично активних бульбочкових бактерій. Відсутність мікросимбіонтів приводить до зміни екологічної функції бобових: вони з культур, які акумулюють фіксований азот атмосфери, перетворюються в культури, які використовують азот грунту. Особливу увагу на цю здатність бобових рослин необхідно звертати при їх інтродукції в нові регіони.

Сьогодні в Україні активно впроваджується одна з найбільш перспективних зернобобових культур – соя. Причому вирощувати цю культуру намагаються не лише в сприятливих для неї регіонах, а і в тих районах, де сою раніше не висівали (Бабич, 1993, Січкар, 2005). Дикої сої (Glycine soja) в природних фітоценозах країни не зустрічається. Для успішної інтродукції цієї рослини необхідно дослідити її біоценотичні зв’язки з іншими компонентами агроценозу, зокрема зі специфічними бульбочковими бактеріями.

Основною рисою бульбочкових бактерій сої, яка визначає їх місце в мікробному ценозі, є здатність до симбіотрофного та сапрофітного типів живлення. Рослина-живитель, з якою вони просторово й трофічно зв'язані, створює сприятливі умови для розвитку ризобій у грунті. З іншого боку, їх самостійне сапрофітне існування може істотно обмежуватися факторами навколишнього середо-вища (Доросинский, 1974, Антипчук, 1994).

Систематичних даних щодо розповсюдження мікросимбіонтів сої – бактерій виду Bradyrhizobium japonicum в грунтах України немає. Не приділялося достатньої уваги й вивченню розмірів популяцій бульбочкових бактерій сої та екологічним особливостям їх окремих представників. Такі дослідження дуже важливі для оцінки сучасного стану популяцій ризобій сої в різних екотопах та для розуміння процесів, які відбуваються в мікробних ценозах грунту при інтродукції нового виду рослин.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлену роботу виконували у відповідності з науково-технічною програмою УААН “Наукові основи сталих агроекосистем”; підпрограмою “Сільсько-господарська мікробіоло-гія”; завданням “Здійснити моніторинг мікробіологічного стану грунтів в залежності від застосування біологічних препаратів” (0101U004702); завданням “Вивчити взаємодію мікро- і макросимбіонтів при ефективному функціонуванні системи: азотфіксуючі мікроорганізми – рослина” (0101U003749).

Мета та завдання досліджень. Мета роботи – вивчити поширення і екологічні особливості бульбочкових бактерій сої в різних ґрунтово-кліматичних зонах України та виділити нові активні штами B. japonicum.

Відповідно до поставленої мети вирішувалися такі завдання:

· ивчити поширення виду B. japonicum в грунтах України;

· дослідити особливості формування популяцій ризобій сої в різних ґрунтово-кліматичних зонах;

· визначити розміри фіксації молекулярного азоту бульбочковими бактеріями в симбіозі з соєю;

· вивчити можливі шляхи розповсюдження бактерій виду B. на нові території;

· вивчити вплив місцевих популяцій ризобій сої на інтродукований штам B. 634б;

· дослідити морфолого-культуральні та симбіотичні властивості бульбочкових бактерій сої, вилучених з різних екотопів;

· цінити ефективність симбіозу виділених штамів B. з соєю в різних ґрунтово-кліматичних умовах.

Об’єкт досліджень: формування популяцій бульбочкових бактерій сої в грунтах України, взаємодія макро- і мікроорганізмів у симбіотичній системі Glycine max (L.) Merr. – Bradyrhizobium japonicum.

Предмет досліджень: популяції бульбочкових бактерій сої в грунтах різних регіонів України, штами B. japonicum, рослини та насіння сої різних сортів.

Методи досліджень: ) лабораторні: мікробіологічні – для визначення щільності популяцій бульбочкових бактерій сої в ґрунті, виділення нових штамів та вивчення їх біологічних особливостей; електронномікроскопічні – для вивчення морфології клітин різних штамів ризобій сої; газохроматографічний метод – для визначення активності симбіотичної азотфіксації; метод інфрачервоної спектроскопії – для визначення загального й білкового азоту в зерні; 2) вегетаційні і польові – для дослідження симбіотичних властивостей штамів ризобій сої; 3) математично-статистичні – для оцінки вірогідності отриманих результатів і визначення кореляційних зв’язків.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено системне вивчення популяцій виду B. japonicum в п'яти ґрунтово-кліматичних зонах України. Встановлено, що в грунтах досліджених регіонів вид B. japonicum поширений нерівномірно. Він представлений окремими популяціями, щільність яких коливається від 101-102 до 103-104 клітин/г ґрунту.

Вперше виявлено, що, незалежно від ґрунтово-кліматичних умов, розміщення численних популяцій бульбочкових бактерій сої є локальним і тісно пов'язаним з наявністю рослини-живителя. Подібний розподіл характерний як для нових, так і традиційних районів вирощування сої.

Встановлено, що вид B. japonicum не займає домінуючого положення в мікробних ценозах кореневої зони сої. Для грунтів, де сою вирощують тривалий час, коефіцієнт рясності виду становить 0,01-0,1%, а для грунтів, де цю культуру тільки починають висівати – 0,0004-0,002%.

Виявлено, що за рівнем симбіотичної азотфіксації нечисленні популяції ризобій сої з нових районів соєсіяння, не поступаються численним, давно сформованим популяціям. Збільшення щільності популяцій супроводжується зростанням в них частки малоактивних штамів.

Показано, що досліджені популяції бульбочкових бактерій сої є гетерогенними й включають особини, які суттєво розрізняються за морфолого-культуральними, фізіологічними та симбіотичними властивостями. Серед мікросимбіонтів сої вперше виявлені штами з інтенсивним ростом, які складають 34% від загального числа досліджених штамів (140 штамів).

Виявлено, що лише 5% виділених штамів утворюють високопродуктивний симбіоз із соєю. Ці штами є представниками популяцій ризобій сої чорноземних грунтів з високим вмістом гумусу.

Практичне значення роботи. Проведено оцінку ґрунтів України щодо наявності в них бульбочкових бактерій сої. Розроблені пропозиції по раціональному застосуванню ризобофіту в різних ґрунтово-кліматичних зонах із врахуванням насиченості грунтів бульбочковими бактеріями.

З популяції бульбочкових бактерій сої чорноземного грунту північного Лісостепу (Носівська селекційна дослідна станція) виділено новий високо-ефективний штам бульбочкових бактерій сої B. КН10, який в різних ґрунтово-кліматичних зонах покращує азотне живлення рослин та забезпечує підвищення врожаю зерна сої на 2-4 ц/га порівняно до виробничого штаму B. 634б. Штам захищено патентом України №  А, С  F /08. – 2004 та запропоновано для виробництва біопрепарату під сою.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто виконано весь обсяг експериментальної частини роботи, лабораторних та польових досліджень, проведено статистичне опрацювання результатів. Електронномікроскопічні дослідження проведені за допомогою співробітників відділу фітовірусології і біотехнології Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН, за що ми висловлюємо щиру вдячність. За участю наукового керівника проведено аналіз, інтерпретацію та узагальнення одержаних результатів.

Апробація роботи. Матеріали роботи були представлені на Міжнародній науковій конференції "Екологія і біогеохімічна діяльність мікроорганізмів" (Одеса, 2001); на Всеукраїнській конференції молодих вчених “Засади сталого розвитку аграрної галузі” (Київ, 2002); на Міжнародній науковій конференції “Сталий розвиток агроекосистем” (Вінниця, 2002); на Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів з проблем виробництва зерна в Україні (Дніпропетровськ, 2002); на науковій конференції “Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні” (Київ, 2002); на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників – учасників конференції “Сільськогосподарська мікробіологія: здобутки і проблеми” (Чернігів, 2002, 2003); на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2002, 2005); на Міжнародній науковій конференції “Біологічні науки і проблеми рослинництва” (Умань, 2003); на Міжнародній науково-практичній конференції “Шляхи підвищення ефективності землеробства та родючості грунтів” (Одеса, 2004); на ІІІ (Х) з’їзді ТМУ (Одеса, 2004); на звітних сесіях Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН (Чернігів, 2001-2004 рр.); на ІХ конференції молодих дослідників, присвяченої 100-річчю від дня народження академіка АН УРСР і ВАСГНІЛ П.А. Власюка (Київ, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 робіт, у тому числі 8 статей (7 – у фахових виданнях), 4 тези доповідей, 2 інформаційні листки та 1 патент України.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, об’єктів і методів досліджень, чотирьох розділів експериментальної частини, обговорення результатів, висновків, пропозицій виробництву та списку використаної літератури, який містить 270 першоджерел (з них 133 – англійською мовою).

Загальний обсяг роботи становить 175 сторінок машинописного тексту. Дисертація ілюстрована 34 таблицями, 16 рисунками та 3 додатками.

ЗМІСТ РОБОТИ

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В розділі наведено сучасні погляди вітчизняних та зарубіжних дослідників з питань екології бульбочкових бактерій сої, а також особливостей формування, розвитку та функціонування бобово-ризобіального симбіозу. Висвітлено вплив факторів навколишнього середовища на взаємовідносини макро- і мікросимбіонтів та роль бульбочкових бактерій в підвищенні продуктивності агроценозів бобових рослин.

На основі аналізу наукової літератури обґрунтовано необхідність проведення досліджень по темі дисертації.

РОЗДІЛ 2. ОБ’ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Досліджували популяції бульбочкових бактерій сої в грунтах різних регіонів України; біологічні особливості штамів B. різних екотопів; епіфітну та ендофітну мікрофлору насіння сої різних сортів.

У вегетаційних та польових дослідах використовували насіння районованих сортів сої: Устя, Феміда, Подільська 416 та безбульбочкової сої (ізолінія Т-181). Штамом-еталоном слугував штам бульбочкових бактерій сої B. japonicum 634б, одержаний з колекції корисних ґрунтових мікроорганізмів Інституту сільсько-господарської мікробіології УААН.

Дослідження проводили протягом трьох років в 5-ти ґрунтово-кліматичних зонах України: в традиційних районах соєсіяння (сою вирощують в сівозмінах більше 20-30 років) – північному Лісостепу (Інститут землеробства УААН, Києво-Святошинський район, смт. Чабани), центральному Лісостепу (Інститут кормів УААН, м. Вінниця), південному Степу (Південний філіал Інституту с.-г. мікробіології УААН, АР Крим, смт. Гвардійське) і нових районах вирощування сої (сою починають впроваджувати) – східному Лісостепу (Сумський інститут АПВ, с. Сад), Поліссі (Чернігівський інститут АПВ, смт. Чемер), північному Лісостепу (Носівська селекційна дослідна станція, с. Дослідне).

Ступінь інфікування сої бульбочковими бактеріями визначали за наявністю бульбочок на коренях рослин згідно методики ВНДІ с.-г. мікробіології (Новикова и др., 1975). Активність симбіотичної азотфіксації визначали ацетиленовим методом (Hardy et al., 1968) на газовому хроматографі “Chrom-4” з полум’яно-іонізаційним детектором (колонка з в-вґоксидіпропіонітрилом). Температура термостату 500С. Витрата газів: водню – 30 мл/хв., азоту – 100 мл/хв., повітря – 500 мл/хв.

Зразки ґрунту відбирали в природних біогеоценозах і агроценозах (Доспехов, ). Чисельність бульбочкових бактерій сої у грунті визначали методом граничних розведень за результатами утворення бульбочок на коренях рослин в стерильних ємностях (Красильников и др., 1940, Тильба, 1971, Толкачев, 1990). Загальну чисельність мікроорганізмів в зразках грунту визначали за допомогою методу граничних розведень з висівом на м'ясо-пептонний агар (МПА).

Для визначення частки бульбочкових бактерій сої в складі ґрунтової мікробіоти використовували показник “рясності” (щільності) видів (Возняковская, 1982).

Кількість мікроорганізмів на поверхні (епіфітна мікрофлора) та в глибоких шарах насіння (ендофітна мікрофлора) сої визначали за допомогою методу граничних розведень з висівом на тверде бобове середовище.

Виділення бульбочкових бактерій сої з бульбочок рослин сої проводили згідно методичних рекомендацій (Берестецкий, 1979). Морфолого-культуральні та фізіологічні властивості вилучених штамів бульбочкових бактерій досліджували за загальноприйнятими методиками (Берестецкий, 1979, Селибер, 1962).

Електронно-мікроскопічні дослідження клітин бульбочкових бактерій проводили методом негативного контрастування. Клітини різних штамів бульбочкових бактерій проглядали на електронному мікроскопі В-S540 “Tesla” при 75 кВ та робочому збільшенні на екрані х .

Здатність штамів бульбочкових бактерій сої використовувати різні джерела вуглецю визначали за їх ростом на синтетичному середовищі з додаванням вуглеводів (1,0%) (Егоров, 1983).

Використання ризобіями сполук азоту вивчали на твердому живильному середовищі (Егоров, 1983) з додаванням КNO3, NaNO3, (NH4)2SO4 та (NH4)2HPO4. Вивчення осмотичної стійкості штамів проводили на твердому бобовому середовищі, концентрація NaCl в якому становила 0, 0,29, 5,8, 11,7-23,4 г/л або 0-0,4 моль (Тильба, 1998). Чутливість виділених штамів до антибіотиків вивчали за допомогою методу паперових дисків (Селибер, 1962).

Розрахунки параметрів росту досліджуваних штамів проводили за загально-прийнятими методами (Перт, 1978). Будували графік залежності логарифму біомаси від тривалості культивування. Визначали показники, за якими розраховували питому швидкість росту (µ), число поколінь (n) та час подвоєння чисельності мікроорганізмів (g). Здатність бульбочкових бактерій сої продукувати полісахариди визначали за реакцією з фенолом та сірчаною кислотою (Захарова и др., 1982).

Симбіотичні властивості виділених штамів бульбочкових бактерій сої вивчали в умовах вегетаційних, польових та виробничих дослідів. У вегетаційних дослідах, при вивченні функціонального стану місцевих популяцій ризобій сої, використовували зразки ґрунту, які були відібрані в різних регіонах України в агроценозах сої.

Польові досліди проводили згідно методики проведення дослідів по кормовиробництву (Бабич, 1994) в умовах Полісся (дослідна ділянка Інституту с.-г. мікробіології УААН, м. Чернігів) на дерново-підзолистому супіщаному грунті (рН – 6,47; вміст гумусу 0,8-1,1%; азоту, що легко гідролізується (за Тюріним і Кононовою) – 56,0-57,0 мг; Р2О5 – 160,0-170,0 мг і К2О (за Кірсановим) – 100,0-110,0 мг на 1 кг грунту). Повторність в дослідах - чотириразова. Площа облікових ділянок - 5 м2. Розміщення ділянок рендомізоване.

Виробничі досліди проводили в центральному Лісостепу (поля дослідного господарства “Бохоницьке” Інституту кормів УААН, м. Вінниця) на сірому лісовому грунті (рН сольове – 5,2-5,4; вміст гумусу (за Тюріним) – 1,8-2,1%; азоту, що легко гідролізується (за Корнфільдом) – 72,0-78,0 мг; Р2О5 – 98,0-102,0 мг і К2О (за Чириковим) – 126,0-136,0 мг на 1 кг грунту).

Вміст протеїну, жиру, Р2О5, та К2О в зерні сої визначали методом інфрачервоної спектроскопії на інфрачервоному аналізаторі NIR Systems 4500.

Обробку експериментальних даних проводили, користуючись методами математичної статистики (Доспехов, 1985), та використовували комп’ютерну програму Statistica 6.0.

РОЗДІЛ 3. ПОШИРЕННЯ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ СОЇ В РІЗНИХ ГРУНТОВО-КЛІМАТИЧНИХ ЗОНАХ УКРАЇНИ

Розповсюдження та симбіотична активність ризобій сої в різних ґрунтово-кліматичних зонах України. В результаті проведених досліджень встановлено, що вид бактерій B. зустрічається в усіх обстежених регіонах. Однак популяції цих мікроорганізмів на досліджених територіях розміщені нерівномірно, а їх розміри варіюють в досить широких межах – від десятків до десятків тисяч бактеріальних клітин/г грунту (табл. ). В жодному з регіонів не виявлено суцільного поширення бульбочкових бактерій сої.

Встановлені особливості формування популяцій ризобій сої в грунтах України. Так, в природних біогеоценозах і на полях, де сою ніколи не вирощували, бульбочкові бактерії відсутні. Поодинокі особини даного виду мікроорганізмів (2-13 клітин/г грунту) трапляються в грунтах полів, суміжних з посівами сої.

У 83% полів, на яких сою висівали вперше без інокуляції, ризобій сої нами також не виявлено. Внесення бульбочкових бактерій сої з біопрепаратом в перший же рік вирощування культури приводило до формування різних за щільністю популяцій ризобій – від 20 клітин/г грунту в дерново-підзолистому грунті Полісся (Чернігівський інститут АПВ) до 3500 клітин/г грунту в чорноземному грунті північного Лісостепу (Носівська селекційна дослідна станція). Великі за розмірами популяції виявлені в грунтах полів, де сою вирощують регулярно та періодично використовують ризобофіт.

Порівняльний аналіз щільності популяцій свідчить, що найбільш чисельні стабільні популяції сформувалися при тривалому вирощуванні сої в сірому лісовому грунті центрального Лісостепу (Інститут кормів), дещо менші – в чорноземах північного Лісостепу та південного Степу (Інститут землеробства та Південний філіал Інституту сільськогосподарської мікробіології).

Слід зазначити, що бульбочкові бактерії сої не займають домінуючого положення в мікробних ценозах кореневої зони сої, а входять до складу так званої мікрофлори розсіювання. Для грунтів, на яких сою вирощують тривалий час, коефіцієнт рясності виду B. становить 0,01-0,1%, а для ґрунтів, де цю культуру тільки починають висівати – 0,0004-0,002%.

Зважаючи на те, що бактерії виду B. можуть займати дві екологічні ніши – існувати в грунті у вільному стані і вступати в ендосимбіотичні відносини з соєю, особливу увагу ми приділяли вивченню просторового розміщення популяцій бульбочкових бактерій.

Нами вперше встановлено, що розміщення популяцій бульбочкових бактерій сої в грунтах як традиційних, так і нових районів вирощування сої є локальним (рис. ). В межах одного господарства трапляються ділянки з різною щільністю місцевої популяції ризобій, а також поля, де бульбочкові бактерії сої взагалі відсутні. Кожна популяція має досить чіткі межі і за тривалий час вирощування сої в сівозмінах не відбувається масового розселення бульбочкових бактерій сої на нові території.

Таблиця 1

Чисельність бульбочкових бактерій сої в грунтах різних регіонів України

Регіон України

(установа) | Тип грунту | Соя в

сівозміні | Кількість бульбочкових бактерій, клітин/г грунту

Інокуляція в рік відбору зразків

+–

Природні біогеоценози

(12 ділянок з різних регіонів) | 0

І Північний

Лісостеп

(Інститут землеробства УААН) | лучно-чорноземний | регулярно | 1300±260

3000±500 | 400±29

2500±289

темно-сірий | 1 рік | 100±12 | 0

темно-сірий | не вирощували | 0

ІІ Центральний

Лісостеп

(Інститут

кормів УААН) | сірий

лісовий | регулярно | 3500±577

17000±1732 | 8000±289

25000±2887

сірий

лісовий | 1 рік | 20±0

2000±513 | 0 .

8±1

сірий

лісовий | не вирощували | 0 .

2±0

ІІІ Південний Степ

(Південний

філіал

Інституту с.-г. мікробіології) | чорнозем південний | регулярно | 4500±866 | 2000±866

чорнозем південний | 1 рік | 200±58 | 0

чорнозем південний | не вирощували | 0

лучно-чорноземний | 1 рік | 60±6 | 0

IV Східний

Лісостеп

(Сумський

інститут АПВ) | чорнозем глибокий | 1 рік | 200±20 | 0 .

80±3

чорнозем глибокий | не вирощували | 0 .

11±2

V Полісся

(Чернігівський інститут АПВ) | дерново-підзолистий | 1 рік | 20±0 | 0

дерново-підзолистий | не вирощували | 0

VI Північний

Лісостеп

(Носівська

дослідна станція) | чорнозем вилугуваний | 1 рік | 3500±500 | 0 .

20±0

чорнозем вилугуваний | не вирощували | 0 .

13±0

Примітки: 1. у чисельнику – min значення показника,

2. у знаменнику – max значення показника.

Таким чином, локальне розміщення бактерій виду B. на території України тісно пов’язане з наявністю рослини-живителя, яка виступає в ролі екологічного фактору, що сприяє накопиченню їх у грунті.

ункціональну активність популяцій бульбочкових бактерій сої визначали за їх участю у формуванні симбіозу з рослиною-живителем.

В польових умовах найвищий ступінь інфікування кореневої системи сої (від 18 до 73 бульбочок на рослину) спостерігався в регіонах, де виявлені великі за розмірами популяції ризобій. Значно менша кількість бульбочок (5-11 одиниць/рослину) утворювалася на коренях рослин за наявності у грунті нечисленних місцевих популяцій бульбочкових бактерій сої.

Центральний Лісостеп (Інститут кормів УААН)

Соя

1 рік інокуляція

2000 ± 513

Соя

1 рік

0ч8 ± 1

Ячмінь

0

Соя

регулярно

17000 ± 1732

Соя

регулярно

3500 ± 577

Пшениця

Ячмінь

0ч2 ± 0

Соя

регулярно

25000 ± 2887

Соя 1 рік інокуляція

20 ± 0

Соя

регулярно

8000 ± 289

Східний Лісостеп (Сумський інститут АПВ)

Соя

1 рік

0

Соя

1 рік інокуляція

200 ± 20

Сильфія

0

Гречка

0

Соя

1 рік

0

Соя

1 рік

80 ± 3

Соняшник

11 ± 2

ис. . Поширення бульбочкових бактерій сої в грунтах різних регіонів України (клітин/г грунту). –

межа між суміжними полями

Незалежно від ґрунтово-кліматичних умов, рівень симбіотичної азотфіксації в агроценозах сої коливався в досить широких межах. Нами не виявлено тісної залежності між розмірами популяцій бульбочкових бактерій сої та активністю симбіотичної азотфіксації. В цілому, молоді популяції, що формуються, за рівнем азотфіксації не поступались численним, давно сформованим популяціям. Високий рівень азотфіксації відмічено в північному Лісостепу в посівах сої Інституту землеробства (96,59 мкгрослину за годину) і Носівської селекційної дослідної станції (178,50 мкгрослину за годину) та південному Степу (Південний філіал ІСГМ) (98,33 мкгрослину за годину), найнижчий – в східному Лісостепу на полях Сумського інституту АПВ (1,24 мкгрослину за годину) та Поліссі на полях Чернігівського інституту АПВ (4,75 мкгрослину за годину). В середньому за вегетаційний період соя в симбіозі з ризобіями накопичувала до 84-90 кг/га азоту, що підтверджує значний вклад цих мікроорганізмів в процес кругообігу азоту в біосфері.

На сьогодні недостатньо вивчені шляхи розповсюдження бульбочкових бактерій сої на нові території. Вважається, що вони можуть переноситися з насінням, пилом, дощем та ін.

Дослідження, проведені в польових умовах, свідчать, що незважаючи на ряд факторів, які можуть сприяти поширенню ризобій, в грунтах суміжних із соєю полів бульбочкові бактерії, як правило, відсутні. В центральному Лісостепу на полях Інституту кормів відмічено їх перенесення з часточками грунту на незначні відстані – до 50 м (рис. ). При вирощуванні на суміжному полі неінокульованої сої, кількість бульбочок на коренях рослин поступово зменшувалася по мірі віддалення від “джерела інфікування” (7,3>2,0>0,0 одиниць/рослину).

Соя

регулярно

(з інокуляцією)

38,3±1,8

3500±577

Соя 1 рік

(без інокуляції)

> 20 м | > 40 м | > 50 м

7,3±0,4

60±13 | 2,0±0,3

11±2 | 0

0

ПОЛЕ 1 ПОЛЕ 2

ис. 2 Кількість бульбочок (одиниць/рослину) на коренях рослин сої та чисельність B. (клітин/г грунту) у грунті на двох суміжних полях з різною тривалістю вирощування даної культури.

- межа між суміжними полями

Наведений приклад добре ілюструє, що механічне перенесення бульбочкових бактерій сої досить обмежене у просторі і не може сприяти активному поширенню їх на нові території.

Наявність B. в складі мікрофлори насіння сої та їх участь в інфікуванні рослини-живителя. Нами не виявлено бактерій виду B. japonicum в складі епіфітної та ендофітної мікрофлори насіння сої різних сортів. Крім того, при вирощуванні сої на стерильному (вермикуліт) та нестерильному (грунт, в якому відсутні бульбочкові бактерії сої) субстратах бульбочки, як правило, не утворювалися. Лише, коли нестерильне насіння сої сорту Устя висівали в грунт, на коренях 2 з 203 рослин спостерігали утворення бульбочок (табл. ). Нами не встановлено, що слугувало джерелом бактерій, які інфікували ці рослини.

Таким чином, ми вважаємо, що інфікування рослин сої бульбочковими бактеріями з насіння не відбувається або ж воно має місце лише в рідкісних випадках за сприятливих умов. Крім того, механічне перенесення бактерій на нові ділянки не приводить до формування численних популяцій мікросимбіонта.

Таблиця 2

Наявність бульбочкових бактерій сої в складі епіфітної та ендофітної

мікрофлори насіння сої

Варіант досліду | Субстрат,

на якому висівали насіння | Сорт сої | Загальна кількість насінин, од. | Кількість рослин з бульбочками на коренях, од.

Епіфітна мікрофлора

Нестерильне насіння | Вермикуліт | Артеміда | 50 | 0

Романтика | 25 | 0

Устя | 50 | 0

Київська 27 | 25 | 0

Київська 91 | 50 | 0

Побужанка | 25 | 0

Мрія | 50 | 0

Чернятка | 50 | 0

Грунт | Устя | 203 | 2

Ендофітна мікрофлора

Стерильне насіння | Вермикуліт | Устя | 225 | 0

РОЗДІЛ 4. ВПЛИВ МІСЦЕВИХ ПОПУЛЯЦІЙ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM НА ІНТРОДУКЦІЮ ВИРОБНИЧОГО ШТАМУ

Оскільки польові дослідження проводилися нами в різних ґрунтово-кліматичних зонах, де на бульбочкові бактерії впливали різні екологічні фактори, функціональний стан популяцій порівнювали у вегетаційних дослідах в строго контрольованих умовах вологості, освітлення та температури. Вивчали активність тих же популяцій ризобій сої, що і в польових умовах.

Встановлено, що численні популяції бульбочкових бактерій сої традиційних районів соєсіяння сприяли формуванню значної кількості бульбочок, нітрогеназна активність яких була відносно невисокою (2,27-8,73 мкгрослину за годину). Як за даними польових спостережень, так і вегетаційних дослідів за азотфіксуючим потенціалом (15,35 мкгрослину за годину) виділяється популяція ризобій сої чорноземного грунту північного Лісостепу (Носівська дослідна станція).

Проведені дослідження показали, що місцеві популяції бульбочкових бактерій сої впливають на симбіотичну активність виробничого штаму. Так, за наявності в грунті численної місцевої популяції ризобій, інтродукція штаму-еталону B.634б не приводить до збільшення числа бульбочок на коренях сої. Їх кількість залишається незмінною або зменшується порівняно з контролем. Однією з причин цього може бути конкуренція між місцевою ризобіальною мікробіотою та виробничим штамом, яка приводить до зниження колонізації кореня. Також не відбувається суттєвого зростання маси бульбочок та їх нітрогеназної активності.

Популяції бульбочкових бактерій сої, які знаходяться на початкових етапах становлення, не спроможні витримувати конкуренцію із стандартним штамом. Інокуляція сої виробничим штамом 634б сприяє збільшенню кількості бульбочок в 1,3-10,0 разів, зростанню маси бульбочок в 1,4-3,0 раза та їх нітрогеназної активності в 1,3-2,7 раза в порівнянні з рослинами, інфікованими місцевими бульбочковими бактеріями.

Як приклад, в табл. наведені дані впливу місцевих популяцій ризобій сої з різною щільністю на активність штаму B.634б. За наявності в грунті численних популяцій ризобій сої, кількість бульбочок при інокуляції залишалася майже незмінною (44-42 бульбочки на рослину), а нітрогеназна активність підвищувалася в 1,3 раза. Внесення виробничого штаму за умов нечисленних попу-ляцій бульбочкових бактерій у грунті сприяло збільшенню кількості бульбочок в 10,0 разів та підвищенню рівня симбіотичної азотфіксації в 2,7 раза.

Таблиця 3

плив місцевих популяцій бульбочкових бактерій сої на симбіотичну

активність інтродукованого штаму B.634б (вегетаційні досліди*).

Соя в сівозміні | Кількість бульбочок,

одиниць/ рослину | Азотфіксуюча активність,

мкг N/ росли-ну за годину | Кількість бульбочок,

одиниць/ рослину | Азотфіксуюча активність,

мкг N/ росли-ну за годину

Без інокуляції | Інокуляція B. japonicum 634б

Регулярно | 42,40±4,45 | 7,69±0,15 | 44,25±4,10 | 10,21±1,51

17,17±0,42 | 8,73±0,39 | 14,25±1,07 | 7,45±1,24

1 рік | 0,84±0,16 | 3,08±0,54 | 8,42±1,72 | 8,42±1,58

0 | 0 | 9,17±1,58 | 1,50±1,03

Примітка. * - зразки грунту з полів Інституту землеробства.

РОЗДІЛ 5. БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ СОЇ РІЗНОГО ЕКОЛОГО-ГЕОГРАФІЧНОГО ПОХОДЖЕННЯ

Морфолого-культуральні та фізіологічні властивості штамів B.. З популяцій ризобій сої різних екотопів виділено 140 штамів мікросимбіонтів сої та вивчені їх біологічні особливості. Всі вони не ростуть на м'ясо-пептонному агарі та змінюють реакцію лакмусового молока на лужну. За інтенсивністю росту на твердому бобовому середовищі всі досліджувані штами об’єднані нами в дві групи. До першої групи віднесені штами з інтенсивним ростом (34% штамів), які утворюють великі (2-4 мм) напівпрозорі колонії з матовим відтінком, що візуально фіксуються на 5 добу після посіву, а до другої групи – штами з помірним ростом (66% штамів), які накопичують бактеріальну масу на 8-10 добу та утворюють дрібні колонії білого кольору.

Різниця між штамами спостерігається і у морфології клітин, про що свідчать електронномікроскопічні дослідження. Ширина клітин штамів з інтенсивним ростом становить 0,6-0,7 мкм, а довжина – 2,7-3,6 мкм, в той час як помірнорослі штами мають розмір клітин – 0,7-0,8 мкм на 1,5-1,9 мкм. Клітини останніх майже не відрізняються за морфологією від клітин референтного штаму 634б.

Порівняльний аналіз морфолого-культуральних та фізіологічних властивос-тей 25 виділених штамів показав існування певної залежності між інтенсивністю росту культур та здатністю використовувати вуглеводи. Так, штами з інтенсивним ростом, на відміну від помірнорослих, здатні засвоювати сорбіт та сахарозу.

Нами не виявлено залежності між інтенсивністю росту досліджуваних штамів та їх осмотичною стійкістю і здатністю використовувати різні форми азоту.

Досліджувані штами також істотно розрізняються за чутливістю до антибіотиків. Штами з інтенсивним ростом чутливі до гентаміцину, норфлок-сацину, еритроміцину, ципрофлоксацину, левоміцетину, канаміцину та цефотак-симу. За цією ознакою вони нагадують швидкорослі бульбочкові бактерії, в той час як помірнорослі штами резистентні до більшості антибіотиків.

В результаті вивчення динаміки росту штамів – типових представників двох груп, встановлено, що в стаціонарну фазу росту штам з інтенсивним ростом (КВ1-1) накопичує приблизно в 3 рази більше біомаси у порівнянні з помірнорослим штамом (КС2-3) (рис. , А). Це пояснюється підвищеною питомою швидкістю росту, внаслідок зростання швидкості поділу клітин та збільшення числа поколінь за добу (табл. ).

При порівняльному вивченні динаміки накопичення екзополісахаридів встановлено, що штам з інтенсивним ростом продукує значно більшу кількість позаклітинних вуглеводів (рис. , Б). Це може мати важливе значення для вижи-вання бульбочкових бактерій в ґрунтах різних екотопів та встановлення симбіотичних зв’язків з рослиною-живителем.

доба |

доба

Рис. . Накопичення біомаси (А) та полісахаридів (Б) різними штамами бульбочкових бактерій сої (1- штам КВ1-1 з інтенсивним ростом, 2- штам КС2-3 з помірним ростом).

Отже, досліджені штами істотно розрізняються за морфолого-культураль-ними та фізіологічними властивостями. Штами з інтенсивним ростом трапляються в популяціях ризобій трьох з п’яти досліджених регіонів. Домінуюче положення вони займають в чорноземному грунті північного Лісостепу (поля Інституту землеробства). Помірнорослими штамами представлені популяції B. japonicum в

Таблиця 

Характеристика росту різних штамів бульбочкових бактерій сої

Варіант | Питома швидкість росту (µ),

доба ?1 | Тривалість подвоєння біомаси (g),

доба | Число поколінь за добу, n

Штам з інтенсивним ростом (КВ1-1) | 0,32±0,01 | 2,15±0,06 | 4,67±0,16

Штам з помірним ростом (КС2-3) | 0,25±0,00 | 2,81±0,04 | 2,83±0,04

дерново-підзолистому грунті Полісся (поля Чернігівського інституту АПВ) та чорноземному грунті північного Лісостепу (поля Носівської селекційної дослідної станції). Виявлена мінливість всередині локальних популяцій має велике біологічне значення, оскільки сприяє існуванню виду B. в дуже відмінних умовах.

Симбіотичні властивості штамів бульбочкових бактерій сої, виділених з популяцій різних екотопів. Порівняльний аналіз нодулюючої активності (вірулентності) виділених нами штамів свідчить, що в численних, давно сформованих популяціях ризобій сої відбулася чітка диференціація бактерій на: високоактивні (50%), які достовірно перевищують стандартний штам, активні (23%), які були на рівні штаму 634б, та малоактивні (27%), які достовірно гірші за штам-еталон (рис. ). Нечисленні популяції складаються в основному з середньо-вірулентних штамів (85%). Нами виявлено, що штами з інтенсивним ростом за нодулюючою здатністю переважають помірнорослі штами.

кількість азотфіксуюча надземна

бульбочок активність маса

Рис. . Розподіл штамів бульбочкових бактерій сої за симбіотичною активністю (1-традиційні райони соєсіяння, 2-нові райони вирощування сої).

За активністю азотфіксації більшість бактерій (86%), які входять до складу популяцій з високою щільністю, є малоактивними і лише 14% - середньоактивні. В популяціях, які знаходяться на стадії формування, частка активних азотфіксаторів зростає до 29%. Тобто, із зростанням щільності місцевих популяцій бульбочкових бактерій спостерігається тенденція до збільшення частки неактивних штамів. На нашу думку, це пов’язано з тим, що внаслідок жорсткої взаємної конкуренції усередині популяцій, частина штамів не може реалізувати своїх симбіотичних властивостей повною мірою.

Виявлено, що лише 5% досліджених штамів утворюють високопродук-тивний симбіоз із соєю. Вони сприяли достовірному збільшенню надземної маси рослин на 14-16% у порівнянні з виробничим штамом B.634б. Всі штами є представниками популяцій ризобій сої чорноземних грунтів, багатих на органічну речовину.

Нами виявлено, що в польових умовах азотфіксуючий потенціал бульбоч-кових бактерій сої не завжди проявляється повною мірою. Коефіцієнт кореляції між кількістю бульбочок та їх масою становив 0,63, а між масою бульбочок та нітрогеназною активністю – 0,08. Лише при забезпеченні оптимальних умов для формування бобово-ризобіального симбіозу (вегетаційні досліди) можна виявити більш тісний зв’язок між досліджуваними показниками. Так, кількість бульбочок позитивно корелювала з їх масою (r ,67-0,92), а маса бульбочок – з їх нітрогеназною активністю (r ,46-0,76). Існує також чітко виражений взаємозв’язок між приростом сухої надземної маси рослин та масою бульбочок (r ,48-0,79). Даний факт вказує на те, що показник маси бульбочок може бути використаний в селекційній роботі з бульбочковими бактеріями сої як один з критеріїв прогнозування ефективності штамів.

РОЗДІЛ 6. ЕФЕКТИВНІСТЬ СИМБІОЗУ НОВИХ ШТАМІВ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ СОЇ З РОСЛИНОЮ-ЖИВИТЕЛЕМ В УМОВАХ ПОЛІССЯ ТА ЦЕНТРАЛЬНОГО ЛІСОСТЕПУ УКРАЇНИ

В результаті скринінгу штамів бульбочкових бактерій сої, виділених з різних місцевих популяцій, нами були відібрані шість штамів – найактивніших симбіонтів сої. Їх взаємовідносини з соєю вивчали в серії польових та виробничих дослідів в зонах Полісся та центрального Лісостепу України. Штами КН10, КН13 та КС2-3 сприяли підвищенню рівня симбіотичної азотфіксації та продуктивності сої. При інокуляції сої штамом КС2-3 урожай зерна був на рівні стандартного штаму B.634б. Штам КН10 виявився високоефективним і сприяв збільшенню урожаю на 2,2 ц/га порівняно до штаму-еталону (табл. ).

Відмічено позитивний вплив одержаних культур на якість урожаю. Вміст протеїну в зерні сої збільшувався на 0,3% (КС2-3) та 1,0% (КН10) порівняно до стандартного штаму.

У виробничих дослідах (центральний Лісостеп, Інститут кормів), на фоні численної місцевої популяції бульбочкових бактерій сої, штами КН10 та КН13 виявилися ефективнішими за стандартний штам B. 634б і забезпечували збільшення врожаю на 4,1 та 3,9 ц/га відповідно (табл. ).

Таблиця 5

Вплив інокуляції на насіннєву продуктивність сої сорту Устя

(польовий дослід, дерново-підзолистий грунт, 2003 р.)

Варіанти досліду | Урожай,

ц/га | % до контролю

Контроль (без інокуляції) | 20,67 | 100

Інокуляція B шт. 634б | 24,49 | 118

Інокуляція B. шт. КВ1-4 | 20,76 | 100

Інокуляція B. шт. КВ1-9 | 21,19 | 103

Інокуляція B. шт. КН13 | 22,68 | 110

Інокуляція B. шт. КН10 | 26,64 | 129

Інокуляція B. шт. КС2-5 | 21,78 | 105

Інокуляція B. шт. КС2-3 | 23,96 | 116

НІР05 | 3,16

Примітка. - достовірне підвищення показників виділено жирним шрифтом.

Таблиця 6

Ефективність нових штамів B. japonicum

(виробничі досліди, сірий лісовий грунт, 2003-2004 рр.)

Варіанти дослідів | Площа, га | Урожай, ц/га | Збільшення урожаю до

контролю,

ц/га | %

Соя сорту Феміда, 2003 рік

Інокуляція В. japonicum шт. 6346 | 3,3 | 16,9 | 100

Інокуляція В. japonicum шт. КН10 | 3,3 | 21,0 | 4,1 | 124

Інокуляція В. japonicum шт. КН13 | 3,3 | 20,8 | 3,9 | 123

Соя сорту Подільська 416, 2004 рік

Контроль (без інокуляції) | 6,5 | 18,6 | 100

Інокуляція В. japonicum шт. KH10 | 6,5 | 22,2 | 3,6 | 119

На штам бульбочкових бактерій сої КН10 отримано патент України та запропоновано використовувати його як біоагент біопрепаратів для забезпечення стабільних надбавок урожаю зерна сої в різних ґрунтово-кліматичних зонах.

ВИСНОВКИ

В результаті проведених досліджень встановлені особливості поширення та формування популяцій бульбочкових бактерій сої в п'яти ґрунтово-кліматичних зонах України.

1. Встановлено, що на досліджених територіях вид B. japonicum поширений нерівномірно. Він представлений окремими популяціями, щільність яких коливається від 101-102 до 103-104 клітин/г грунту. Найбільш численні популяції цих мікроорганізмів (17,0-25,0 тис. клітин/г грунту) виявлені в грунтах традиційних районів соєсіяння.

В межах досліджених регіонів розміщення популяцій бульбочкових бактерій сої є локальним і тісно пов'язаним з наявністю рослини-живителя. Подібний розподіл характерний як для нових, так і традиційних районів вирощування сої.

2. З насінням сої не відбувається активного розселення бульбочкових бактерій на нові території. Ризобій сої не виявлено в складі епіфітної та ендофітної мікрофлори насіння досліджених сортів сої.

3. Встановлено, що вид B. japonicum не займає домінуючого положення в мікробних ценозах кореневої зони сої. Для ґрунтів, де сою вирощують тривалий час, коефіцієнт рясності виду становить 0,01-0,1%, а для грунтів, де цю культуру тільки починають висівати – 0,0004-0,002%.

4. Інтенсивність симбіотичної фіксації азоту в агроценозах сої не залежить від щільності популяцій ризобій, а визначається їх азотфіксуючою активністю. Із збільшенням розмірів популяцій в них зростає частка малоактивних штамів.

5. Встановлено, що за наявності в грунті численних, давно сформованих популяцій, інтродукція штаму B. japonicum 634б не сприяє збільшенню кількості бульбочок та рівня симбіотичної азотфіксації сої.

В умовах грунтів з нечисленними популяціями ризобій сої інтродукція виробничого штаму приводить до збільшення кількості кореневих бульбочок в 1,3-10,0 разів та їх нітрогеназної активності в 1,3-2,7 раза.

6. На основі аналізу біологічних властивостей 140 виділених штамів, визначено, що досліджені популяції бульбочкових бактерій сої є гетерогенними. Серед мікросимбіонтів сої вперше виявлені штами з інтенсивним ростом (34% штамів), які відрізняються від помірнорослих штамів за питомою швидкістю росту, здатністю засвоювати вуглеводи, чутливістю до антибіотиків.

7. Серед культур різного еколого-географічного походження лише 5% штамів утворюють високопродуктивний симбіоз із соєю. Всі вони є представ-никами популяцій ризобій сої чорноземних грунтів з високим вмістом гумусу.

8. Встановлено, що при забезпеченні оптимальних умов для симбіотичної азотфіксації існує тісний кореляційний зв’язок між масою бульбочок і нітрогеназною активністю (r ,46-0,76) та надземною масою рослин (r ,48-0,79). Доведено, що показник маси бульбочок може бути використаний як один з критеріїв прогнозування ефективності штамів в селекційній роботі з бульбочковими бактеріями сої.

9. З популяцій ризобій сої чорноземного грунту Носівської селекційної дослідної станції виділено новий високоефективний штам бульбочковий бактерій сої КН10, застосування якого в зонах Полісся та центрального Лісостепу України сприяє збільшенню урожаю зерна ранньостиглих сортів сої на 2-4 ц/га порівняно до стандартного штаму B. 634б.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

На підставі аналізу даних поширення бульбочкових бактерій сої в різних ґрунтово-кліматичних зонах України сільськогосподарському виробництву пропонується:

· систематично застосовувати біопрепарати на основі бульбочкових бактерій сої як в нових, так і традиційних районах соєсіяння, з метою формування стабільних численних популяцій ризобій сої в грунті;

· за наявності в грунті популяцій B. з високою щільністю, використовувати біопрепарати на основі нових високоефективних штамів бульбочкових бактерій сої.

Сільськогосподарському виробництву пропонується новий високоефектив-ний штам бульбочкових бактерій сої B. КН10, який може бути використаний для виробництва біопрепарату ризобофіту. В симбіозі з соєю він активно фіксує азот повітря та сприяє підвищенню урожаю ранньостиглих