Національна академія наук України

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології

ім. Р.Є.Кавецького

Міністерство охорони здоров’я України

Український науково-дослідний інститут онкології та радіології

ХОБТА АНДРІЙ ІВАНОВИЧ

УДК 616-006.6:57.052.6+.042.2

СЕКРЕЦІЯ КУЛЬТИВОВАНИМИ КЛІТИНАМИ ЕПІДЕРМОЇДНОЇ КАРЦИНОМИ ПЕПТИДУ З ВЛАСТИВОСТЯМИ ІНГІБІТОРА ПРОТЕЇНКІНАЗ

14.01.07 - онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Науковий керівник - | - кандидат біологічних наук Погрібний Петро Васильович,

старший науковий співробітник відділу біології пухлинної клітини Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України.

Офіційні опоненти : |

- доктор біологічних наук Казьмін Сергій Дмитрович, провідний науковий співробітник відділу біохімії пухлин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України.

- доктор біологічних наук Варбанець Людмила Дмитрівна, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України.

Провідна установа- |

Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, кафедра онкології

Захист відбудеться “26”_травня______1999 р. о _16:00

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України (252022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького

Автореферат розісланий “_23_”___квітня_________ 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук І.В.Абраменко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми.

Онкогенез супроводжується дисбалансом в продукції клітинами факторів росту і їх рецепторів. Пухлинні клітини продукують поліпептидні фактори росту, що забезпечуює в значній мірі автономний ріст новоутворень (Rudland et al., 1998, Smits, Funa, 1998), а також здатні до секреції факторів, що пригнічують проліферацію клітин (Bogdahn et al., 1989).

Зручною експериментальною моделлю для вивчення секреції факторів обох груп є культивовані пухлинні клітини різних ліній. У зв’язку з цим із застосуванням методів генної інженерії сконструйовано ряд клітинних субліній, що водночас гіперекспресують рекомбінантний трансформуючий фактор росту a (ТФРa) і рецептор епідермального фактора росту (McGeady et al., 1989, Погребной с соавт., 1993, 1997). Клітини даних субліній характеризуються більш злоякісним фенотипом, ніж їх попередники, за рахунок мітогенної дії ТФРa, що, як і епідермальний фактор росту (ЕФР), є лігандом рецептора ЕФР.

Пептиди, секретовані пухлинними клітинами, можуть впливати на суміжні клітини через дію на матрикс плазматичної мембрани, протеоглікани клітинної оболонки, мембранні білки і компоненти цитоскелету (He et al., 1998, Погребной с соавт., 1997). Тому дослідження спектру їх біологічної активності, механізмів дії і умов продукції є актуальною задачею сучасної онкології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконана у відділі біології пухлинної клітини Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України згідно з планом науково-дослідної роботи за темою: 0198U001092 “Дослідження участі дефенсинподібних пептидів в реалізації пухлинного фенотипу клітин та визначення можливостей їх використання в онкологічній клініці”. Робота виконувалась за підтримки грантами Міністерства України в справах науки і технологій (проект: 2/1297-97 “Розробка технології отримання та застосування хемокінів та цекропінів як протипухлинних засобів”) і Державного фонду фундаментальних досліджень (проекти: 5.2/80 “Вивчення регуляторних механізмів проліферації клітин, які аутокринно продукують трансформуючий фактор росту альфа” і 5.4/388 “Пептиди цекропінового ряду як антибіотики і можливі чинники неспецифічного імунітету при злоякісній трансформації клітин.”). Шифр проблеми 2.29.1.3.

Мета і задачі дослідження.

Мета роботи - виділити пептидні фактори, що секретуються культивованими пухлинними клітинами і приймають участь в регуляції росту клітин шляхом впливу на активність протеїнкіназ, а також охарактеризувати їх біологічну дію in vitro.

Основні задачі дослідження:

- скрининг середовищ інкубації клітин на наявність компонентів, здатних впливати на фосфорилювання рецептора ЕФР;

- розробка схеми виділення пептиду з властивостями інгібітора протеїнкіназ;

- визначення антимікробної активності виділеного пептиду;

- характеристика дії пептиду на протеїнкінази, виділені з клітин, і живі клітини in vitro;

- визначення умов секреції пептиду з властивостями інгібітора протеїнкіназ культивованими пухлинними клітинами.

Наукова новизна одержаних результатів.

В ході проведених експериментів в отриманих за допомогою методів генетичної інженерії клітинах, що водночас гіперекспресують рецептор ЕФР і здатні продукувати його ліганд (в даному випадку рекомбінантний ТФРa), вперше виявлено секрецію пептиду, який має властивості інгібітора протеїнкіназ, а також проявляє бактерицидну і гемолітичну активність. Пептид виділено і охарактеризовано спектр його біологічної дії. Для виділеного пептиду запропоновано назву АПЕК.

Особистий внесок здобувача.

Основні ідеї, наукові положення і висновки розроблені і оформлені дисертантом самостійно. Дисертант безпосередньо працював з культурами клітин, був задіяний на всіх етапах виділення антимікробного пептиду з властивостями інгібітора протеїнкіназ, а також у вивченні його біологічних властивостей. Дисертантом самостійно проведені дослідження гемолітичної і бактерицидної активності пептиду. В процесі виконання дисертації автор особисто відібрав та критично проаналізував доступну літературу, яка має відношення до теми дослідження.

Апробація результатів дисертації.

Основні результати і положення дисертації були апробовані на 8-му Європейському конгресі з біотехнології (Будапешт, Угорщина, 1997) і на Міжнародних курсах FEBS “Молекулярні механізми бактеріальної інфекції” (Спецес, Греція, 1998).

Публікації.

За матеріалами дисертації опубліковано 5 наукових статей в провідних фахових виданнях.

Структура і обсяг дисертації.

Дисертація викладена на 139 сторінках друкованого тексту, складається із вступу, огляду літератури, розділу з описом матеріалів і методів досліджень, 5 розділів, присвячених опису власних досліджень, а також аналізу і узагальненню їх результатів, висновків і списку використаних літературних джерел (207 найменувань, з них українською та російською мовами - 19, іноземними мовами - 188). Дисертація ілюстрована 21 рисунком, 2 таблицями.

ЗМІСТ РОБОТИ

Розділ 1. Огляд літератури.

Матеріал розділу відображає сучасний стан знань про трансформуючий фактор росту a, рецептор епідермального фактора росту, їх продукцію і фізіологічну роль. Коротко охарактеризовані клітинні сублінії А431/1522 і М-НeLa/1522, що продукують рекомбінантний ТФРa. Приведено огляд відомих пептидів тваринного походження, які мають антимікробну активність.

Розділ 2. Матеріали і методи досліджень.

Секрецію пептидів культивованими клітинами сублінії А431/1522 індукували стимуляцією експресії рекомбінантного ТФРa. Для цього клітини, що досягли субконфлюенту, інкубували в середовищі без сироватки, що містило 3 мкМ CdCl2, протягом 2 діб, як описано П.В.Погрібним з співавт. (1993, 1997). Інгібіторну активність препаратів середовищ інкубації по відношенню до протеїнкінази рецептора ЕФР досліджували у реакції аутофосфорилювання in vitro в препаратах плазматичних мембран клітин лінії А431. Плазматичні мембрани отримували у вигляді везикул за методикою, запропонованою Payrastre et al. (1991). Фосфорилювання рецептора ЕФР проводили з урахуванням протоколу Ю.Д.Іващенка з співавт. (1989). Ковалентне мічення рецептора ЕФР препаратом 125І-ЕФР проводили за допомогою сукцинімідилсуберату згідно рекомендацій Ю.Д.Іващенка з співавт. (1986).

Для виділення АПЕК було застосовано комбінацію хроматографічних процедур, в яких критерієм відбору фракцій була бактерицидна активність по відношенню до Bacillus mesentericus ATCC 31029. Середовища інкубації клітин фільтрували, ліофілізували, перерозчиняли в деіонізованій воді, доводили pH до 4,0 оцтовою кислотою і центрифугували при 10000 g протягом 10 хвилин. Для звільнення від високомолекулярних компонентів і часткового обезсолення супернатанти наносили на колонку PD-10 (Pharmacia, Швеція). Елюати концентрували за допомогою міні-колонок Sep-Pak C18 (Waters, США). Елюцію проводили ступінчастим градієнтом ацетонітрилу (10% і 70%, або 10%, 40% і 70%). Відібрані фракції розділяли гель-фільтрацією високого тиску на колонці ТSK-GEL Toyopearl HW-40 (Toyo-Soda, Японія). В якості фінального етапу очистки АПЕК застосовували рідинну хроматографію високого тиску в оберненій фазі на колонці Pep-RPC 5/5 C2-C18 (Pharmacia, Швеція). Концентрацію АПЕК обраховували за площею піку. Отриманий препарат АПЕК рехроматографували на колонці Ultrasphere ODS 5m (Beckman, США), після чого його гомогенність перевіряли електрофорезом в редукуючих умовах в системі буферів Laemmli (1970).

Антимікробну активність АПЕК визначали за пригніченням росту бактерій в тонкому шарі агарози методом Hultmark et al. (1983) з незначними модифікаціями.

Інгібіторну активність АПЕК по відношенню до протеїнкіназ визначали у реакції фосфорилювання in vitro. В якості джерела рецептора ЕФР використовували препарати плазматичних мембран клітин лінії А431. Активні цитозольні протеїнкінази (Lyn, Syk, PKCm) були отримані при участі к.б.н. С.В.Міхалап, к.б.н. Л.М.Шлапацької, к.б.н. Г.Г.Бердової і д.б.н. С.П.Сидоренко імунопреципітацією моноклональними антитілами з лізатів клітин лінії CESS. В якості контроля використовували антитіла Mab MOPC (всі антитіла фірми Santa Cruz Biotech, США). Денситометрію радіоавтографів і обчислення результатів проводили при участі С.І.Романюк і Д.В.Колибо за допомогою програми “Densitometry” (автор В.В.Вовк, ХемоТелеком, Україна).

Пригнічення синтезу ДНК в клітинах ліній Namalwa і Jurkat оцінювали за інкорпорацією 3Н-тимідину (Тессенов, 1979) при інкубації в присутності різних концентрацій АПЕК. Життєздатність клітин в культурах визначали за забарвленням 0,2%-м розчином трипанового синього.

Гемолітичну активність АПЕК детектували за лізисом еритроцитів людини в тонкому шарі агарози. АПЕК в серійних розведеннях вносили в лунки, пробиті в агарозі. Мінімальну гемолітичну концентрацію визначали екстраполяцією залежності площі зони гемолізу від логарифму концентрації АПЕК на значення площі лунки.

Цифровий матеріал, представлений у дисертаційній роботі, підлягав варіаційно-статистичній обробці (Урбах, 1975).

Розділ 3. Аутостимуляція клітин ендогенним ТФРa індукує секрецію інгібітора аутофосфорилювання рецептора ЕФР.

При дослідженні впливу препаратів, отриманих з середовищ інкубації пухлинних клітин різних ліній, на активність кінази рецептора ЕФР було показано, що деякі з них здатні пригнічувати як фонове, так і ЕФР-залежне аутофосфорилювання рецептора ЕФР. Найбільш виражений інгібіторний вплив на протеїнкіназну активність рецептора ЕФР здійснюють препарати середовищ інкубації клітин сублінії А431/1522, які були індуковані до експресії кДНК ТФРa.

Для пояснення явища, що спостерігається, було впроваджено фракціювання пептидів з середовища інкубації клітин сублінії А431/1522 ступінчастим градієнтом ацетонітрилу (10%, 40% і 70%) за допомогою міні-колонок Sep-Pak C18. Фракції, елюйовані 40% (далі - “Ф1”) і 70% (далі - “Ф2”) ацетонітрилу, тестували на ЕФР-конкурентну активність і здатність здійснювати вплив на аутофосфорилювання рецептора ЕФР в препаратах плазматичних мембран клітин лінії А431.

Для дослідження ЕФР-конкурентної активності фракцій було застосовано конкурентний варіант ковалентного мічення рецептора ЕФР препаратом 125І-ЕФР. Радіоавтограф, наведений на рис. 1, демонструє ЕФР-конкурентну активність фракції Ф1, що пояснюється присутністю в ній рекомбінантного ТФРa, і її відсутність у фракції Ф2.

Вплив фракцій на інтенсивність аутофосфорилювання рецептора ЕФР представлено на рис. 2. Фракція, елюйована 40% ацетонітрилу (Ф1), завдяки дії ТФРa, стимулює аутофосфорилювання рецептора ЕФР in vitro. Додавання ж компонентів фракції, елюйованої 70% ацетонітрилу (Ф2), в аналогічних умовах призводить до зниження рівня фосфорилювання рецептора ЕФР.

Судячи з наведених результатів, пригнічення аутофосфорилювання рецептора ЕФР компонентами середовищ інкубації клітин слід віднести на рахунок прямого інгібування кінази рецептора, а не конкуренції з лігандами за сайти зв’язування.

Рисунок 1. Радіоавтограф ковалентного мічення рецептора ЕФР препаратом 125І-ЕФР: 1 - в присутності надлишку ЕФР; 2, 3 - в присутності білків середовища інкубації клітин сублінії А431/1522 (2 - Ф1; 3 - Ф2); 4 - контроль.

Рисунок 2. Радіоавтограф фосфорилювання в препаратах мембран клітин лінії А431: 1 - контроль; 2-4 - при додаванні пептидних фракцій середовища інкубації клітин сублінії А431/1522, елюйованих відповідно 10%, 40% і 70% ацетонітрилу; 5 - в присунтості 0,1 мкМ ЕФР.

Результати аутофосфорилювання рецептора ЕФР при використанні несолюбілізованих мембранних везикул показали, що вплив фракції Ф2 на фосфорилювання в пробах подібний до дії мелітину, токсина яду медоносної бджоли, що здатний утворювати пори в ліпідних мембранах. Це свідчить на користь гіпотези про здатність компонентів фракції Ф2 до взаємодії з мембранами і їх пермеабілізації.

Розділ 4. Виділення пептиду з властивостями інгібітора протеїнкіназ (АПЕК) із середовища інкубації клітин сублінії А431/1522.

На основі аналізу результатів власних досліджень і співставлення їх з даними літератури було висунуте припущення про потенційну спорідненість пептидного інгібітора протеїнкінази рецептора ЕФР, що секретується культивованими клітинами, з дефенсинами - антимікробними пептидами, що продукуються фагоцитами і клітинами покривних тканин ссавців. З цих міркувань було застосовано тестування препаратів, отриманих із середовищ інкубації клітин, на здатність пригнічувати ріст бактерій в тонкому шарі агарози. При цьому було виявлено пряму кореляцію антимікробної активності препаратів з їх здатністю пригнічувати протеїнкіназну активність рецептора ЕФР. Надалі тестування антимікробної активності фракцій було застосовано на всіх етапах очистки пептиду.

Рисунок 3. Профіль елюції компонентів середовища інкубації клітин сублінії А431/1522 при гель-фільтрації високого тиску. Стрілками відмічено час елюції маркерів молекулярної маси (12 кД - цитохром С, 6 кД - інсулін, 3 кД - мелітин).

Враховуючи роботи по очистці антимікробних пептидів тварин (Moore et al., 1991, Fehlbaum et al., 1996 та ін.), для виділення пептиду з властивостями інгібітора протеїнкіназ з середовищ інкубації клітин субліній А431/1522 була застосована наступна послідовність хроматографічних процедур: гель-фільтрація низького тиску, концентрація на міні-колонках Sep-Pak C18, гель-фільтрація високого тиску, рідинна хроматографія високого тиску в оберненій фазі (ОФ РХВТ) з наступною рехроматографією. В результаті ОФ РХВТ фракція, що має антимікробну активність, вийшла єдиним симетричним піком в 62% ацетонітрилу. Заключні етапи отримання АПЕК проілюстровано хроматограмами (рис. 3, 4). Ступінь гомогенності препарату оцінювали електрофорезом.

При використанні запропонованої схеми з 100 мл середовища вдається виділити в середньому близько 5 мкг пептиду. Для отриманого препарату було запропоновано назву АПЕК (скорочено від: антимікробний пептид з клітин епідермоїдної карциноми) (Pogrebnoy et al., 1998).

Рисунок 4. Профіль елюції при очистці АПЕК за допомогою ОФ РХВТ на колонці Pep-RPC 5/5 C2-C18. Стрілкою вказаний час елюції АПЕК.

Молекулярна маса АПЕК, визначена гель-фільтрацією, становить близько 5 кД. При електрофорезі в редукуючих умовах АПЕК визначається однією смугою. Його електрофоретична рухомість відповідає молекулярній масі близько 3 кД і залежить від умов проведення електрофорезу. Невідповідність у визначених значеннях молекулярної маси, імовірно, пояснюється здатністю пептиду до димеризації в розчині, як це показано для дефенсинів (Hill et al., 1991).

Розділ 5. Характеристика біологічної активності АПЕК.

В якості критеріїв біологічної активності отриманого препарату АПЕК досліджували його дію на бактерії, культивовані клітини і еритроцити людини в суспензії, а також вплив на активність протеїнкіназ, виділених з клітин.

Рисунок 5. Визначення мінімальної інгібіторної концентрації АПЕК по відношенню до Bacillus mesentericus і Pseudomonas aeruginosa. Залежність площі зони, вільної від бактеріального росту, від логарифму концентрації АПЕК.

Для визначення антимікробної активності АПЕК його вносили в лунки, пробиті в шарі агарози, засіяної тест-культурами. Значення мінімальної інігібіторної концентрації (IC) визначалось із залежності площі зони, вільної від мікробного росту, від логарифму концентрації АПЕК в пробі екстраполяцією дозової кривої на значення площі лунки, як показано на рис. 5 для Bacillus mesentericus АТСС 31029 і Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145. Мінімальні інгібіторні концентрації АПЕК по відношенню до різних бактерій приведені в таблиці 1.

Таблиця 1.

Дія АПЕК на бактерії.

Назва штаму бактерії | Значення ІС** ІС - мінімальна концентрація, що пригнічує ріст бактерій , мкМ

Bacillus subtilis ATCC 6633 | 1,0 + 0,12

Bacillus mesentericus ATCC 31029 | 1,2 + 0,14

Staphylococcus aureus P-209 | 1,5 + 0,14

Staphylococcus aureus ATCC 25923 | 1,2 + 0,14

Micrococcus luteus ATCC 10240 | 16,0 + 1,20

Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 | 3,6 + 0,22

Escherichia coli K12 (l) | 0,3 + 0,10

Escherichia coli ATCC 25922 | >150

Proteus vulgaris ATCC 13315 | 100 - 150

Як видно з таблиці, АПЕК виявився загалом більш токсичним по відношенню до грампозитивних бактерій, ніж до грамнегативних, за винятком штаму Escherichia coli K12 (l).

В дещо вищих концентраціях (100-200 мкМ) АПЕК пригнічує ріст грибів: Fusarium graminearum, Penicillium griseus, Mucor plumbum. Фунгіцидної дії по відношенню до Candida albicans виявлено не було.

При дослідженні впливу різних концентрацій АПЕК на аутофосфорилювання рецептора ЕФР в препаратах плазматичних мембран клітин лінії А431 показано, що додавання 200 нМ пептиду в проби призводить до зниження рівня аутофосфорилювання принаймні в два рази. Денситометрія радіоавтографів показала, що АПЕК здійснює також вплив (здебільшого інгібіторний) на фосфорилювання інших білків в препаратах мембран клітин лінії А431.

Рисунок 6. Радіоавтограф аутофосфорилювання in vitro протеїнкіназ: Lyn (3, 4), Syk (5, 6) i PKCm (7, 8), імунопреципітованих відповідними антитілами. Для контроля (1, 2) імунопреципітацію виконували антитілами Mab MOPC. В пробах 2, 4, 6, 8 фосфорилювання проводилось в присутності 200 нМ АПЕК.

Для дослідження впливу АПЕК на активність імунопреципітованих цитозольних протеїнкіназ його додавали в проби до кінцевої концентрації 200 нМ. За даних умов АПЕК пригнічував активність досліджуваних протеїнкіназ: двох ізоформ Lyn (p56 - на 70% і p53 - на 42%), Syk - на 20% і PKCm - на 91%. Радіоавтограф, що ілюструє пригнічення активності цитозольних протеїнкіназ в присутності АПЕК, наведений на рис. 6.

При досліджені проліферативної активності культивованих клітин ліній Namalwa (лімфома Беркітта людини) і Jurkat (лімфобластні Т-клітини людини) за інкорпорацією 3Н-тимідину встановлено, що додавання в середовище інкубації АПЕК в концентраціях, вищих 6х10-8 М, призводить до зниження рівня синтезу ДНК в модельних клітинах. Додавання АПЕК в концентраціях 10-8 - 5х10-8 М призводить до невеликого, але вірогідного підвищення рівня синтезу ДНК в клітинах. Концентрації АПЕК, вищі ніж 5х10-6 М, викликали швидку - протягом кількох хвилин - загибель клітин.

Мінімальну літичну концентрацію АПЕК по відношенню до еритроцитів людини в наших дослідженнях визначено як 10-7 М.

Розділ 6. Умови продукції АПЕК.

Для перевірки припущення про зв’язок секреції культивованими клітинами АПЕК з дією лігандів рецептора ЕФР було застосовано тестування середовищ інкубації клітин з різним представництвом рецептора ЕФР на антимікробну активність. Було досліджено супернатанти клітин ліній KB, Colo320HSR, MCF-7, MEWO, CHO, Molt4, Raji, що інкубувались в стандартних умовах і в присутності ЕФР. В середовищах інкубації клітин більшості досліджених ліній антимікробної активності виявлено не було, окрім ліній M-HeLa і А431. В перших антимікробна активність детектується постійно на незначному рівні. В середовищі інкубації клітин лінії А431 поява антимікробної активності індукується інкубацією в присутності ЕФР.

При обробці клітин форболовими ефірами, що стандартно використовується для індукції секреції дефенсинів гранулоцитами (Chertov, 1996), посилення секреції антимікробних компонентів модельними клітинами не виявлено, а в клітинах лінії А431 спостерігається її послаблення.

Розділ 7. Аналіз і обговорення результатів.

Активність тирозинових протеїнкіназ відіграє значну роль в процесах злоякісної трансформації і прогресії пухлин. У зв’язку з цим пошук агентів, здатних блокувати передачу мітогенного сигналу, обумовлену активністю протеїнкіназ, набуває все більшої актуальності.

В результаті проведеної роботи нами виділено пептидний інгібітор протеїнкіназ АПЕК, що за своїми біохімічними і фізіологічними властивостями близький до дефенсинів, що продукуються в клітинах кісткового мозку і покривних тканин ссавців. Показано, що секреція АПЕК може бути індукована в пухлинних клітинах при їх стимуляції ендогенними або екзогенними факторами росту.

Висновки

1.

1.

1.

1.

1.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ НАУКОВИХ ПРАЦЬ

1.

1.

1.

1.

1.

АНОТАЦІЯ

Хобта А.І. Секреція культивованими клітинами епідермоїдної карциноми пептиду з властивостями інгібітора протеїнкіназ.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія.- Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН Украіни, Український науково-дослідний інститут онкології та радіології МОЗ України, Київ, 1999.

З середовищ інкубації клітин епідермоїдної карциноми людини, що експресують кДНК ген трансформуючого фактора росту a, виділено гідрофобний основний пептид, названий АПЕК, з молекулярною масою близько 3 кД. Встановлено, що секреція АПЕК клітинами ліній А431 і А431/1522 індукується дією лігандів рецептора епідермального фактора росту. Досліджено спектр біологічної активності виділеного пептиду. В дисертації показано інгібіторну дію АПЕК на протеїнкінази, а саме: ErbB (рецептор ЕФР), Lyn, Syk, PKCm. Визначено концентрації, в яких АПЕК пригнічує ріст ряду штамів бактерій. Описані зниження рівня синтезу ДНК в культивованих пухлинних клітинах при інкубації в присутності АПЕК і АПЕК-опосередкований гемоліз еритроцитів людини in vitro.

Ключові слова: АПЕК, інгібітор протеїнкіназ, рецептор ЕФР.

SUMMARY

Hobta A.I. Secretion of the peptide possessing the inhibitory activity towards the protein kinases by cultured epidermoid carcinoma cells.- Manuscript.

Thesis for the degree of candidate of biological sciences on speciality 14.01.07 - oncology.- R.E.Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology, and Radiobiology NAS of Ukraine, Institute of Oncology and Radiology Ministry of Health Care of Ukraine, Kyiv, 1999.

From the conditioned media of human epidermoid carcinoma cells expressing the transforming growth factor a cDNA gene, a hydrophobic cationic peptide named ECAP with molecular weight nearly 3 kDa is isolated. As it is established, the secretion of ECAP by A431 and A431/1522 cell lines is induced by ligands of the epidermal growth factor receptor. A spectrum of biological activities of the peptide is investigated. The inhibitory activity of ECAP towards the protein kinases namely ErbB (EGF receptor), Lyn, Syk, PKCm is shown. The growth inhibitory concentrations of ECAP relatively the different strains of bacteria are determined. Also suppression of DNA synthesis in cultured tumor cells in presence of ECAP and ECAP-mediated induction of erythrolysis in vitro is described.

Key words: ECAP, inhibitor of the protein kinases, EGF receptor.

АННОТАЦИЯ

Хобта А.И. Секреция культивируемыми клетками эпидермоидной карциномы пептида со свойствами ингибитора протеинкиназ.- Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 - онкология.- Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е.Кавецкого НАН Украины, Украинский научно-исследовательский институт онкологии и радиологии МЗ Украины, Киев, 1999.

Наряду с полипептидными факторами роста, опухолевые клетки продуцируют ряд факторов, угнетающих пролиферацию клеток. Удобной экспериментальной моделью для изучения секреции обеих групп факторов являются культуры опухолевых клеток. Ранее при использовании методов генной инженерии нами были получены клеточные сублинии А431/1522 и M-HeLa/1522, которые характеризуются более злокачественным фенотипом, по-сравнению с линиями-предшественниками, поскольку экспрессируют кДНК ген трансформирующего фактора роста a, введенный при помощи ретровирусного вектора.

В результате исследования влияния препаратов сред инкубации опухолевых клеток разных линий на фосфорилирование in vitro в препаратах плазматических мембран клеток линии А431 в ряде случаев показана их способность угнетать фосфорилирование рецептора ЭФР. Наиболее выраженным ингибиторный эффект по отношению к протеинкиназной активности ЭФР-Р оказался в средах инкубации клеток сублинии А431/1522, продуцирующих рекомбинантный ТФРa. После фракционирования пептидных компонентов кондиционированных сред оказалось, что фракция, ингибирующая аутофосфорилирование ЭФР-Р, не обладает ЭФР-конкурентной активностью и, как показали результаты фосфорилирования с использованием несолюбилизированных мембранных везикул, способна к взаимодействию с липидными мембранами.

На основании полученных результатов было выдвинуто предположение о гомологии пептидного ингибитора протеинкиназы рецептора ЭФР дефенсинам - группе антимикробных пептидов млекопитающих. Проведенное тестирование на бактериях выявило прямую корреляцию между бактерицидной активностью препаратов и их ингибиторным действием на протеинкиназную активность рецептора ЭФР.

При помощи хроматографических процедур из сред инкубации клеток сублинии А431/1522 выделен гидрофобный основный пептид со свойствами ингибитора протеинкиназ и бактерицидного агента. При электрофорезе в редуцирующих условиях выделенный пептид определяется единственной зоной с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе около 3 кД. Для пептида предложено название АПЭК (антимикробный пептид из клеток эпидермоидной карциномы).

В результате исследований спектра биологической активности выделенного пептида показано его ингибиторное действие на протеинкиназы, а именно ErbB (рецептор ЭФР), Lyn, Syk, PKCm в реакции аутофосфорилирования in vitro. Определены концентрации, в которых АПЭК угнетает рост ряда штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий. Кроме того, описано снижение уровня синтеза ДНК в культивируемых опухолевых клетках линий Namalwa и Jurkat при инкубации в присутствии АПЭК и АПЭК-опосредованный гемолиз эритроцитов человека in vitro.

Установлено, что АПЭК секретируется клетками линии А431 и сублинии А431/1522 в ответ на стимуляцию лигандами рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР и ТФРa), причём обработка клеток форболовыми эфирами препятствует секреции АПЭК.

Ключевые слова: АПЭК, ингибитор протеинкиназ, рецептор ЭФР.