АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

КРАВЧЕНКО КСЕНІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК [615.217.34:615.015.13.035.1-02:616.831-005.4]–092.9

Експериментальна оцінка нейропротективної дії

похідних бензотіазолу при церебральній ішемії

14.03.05 – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Дніпропетровській державній медичній академії МОЗ України на кафедрі фармакології та технології лікарських засобів

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Мамчур Віталій Йосипович, Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри фармакології та технології лікарських засобів

(м. Дніпропетровськ)

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України Громов Леонід Олександрович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділом нейрофармакології (м. Київ)

доктор біологічних наук Літошенко Олександр Якович, Інститут геронтології АМН України, завідувач лабораторії молекулярної генетики (м. Київ)

Провідна установа: Одеський державний медичний університет МОЗ України, кафедра

загальної та клінічної фармакології (м. Одеса)

Захист дисертації відбудеться “22__” __червня____ 2006 року о “13-00__” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 в Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Пот‘є, 14. Д.26.550.01 в Інституті фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е. Потьє, 14)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Пот‘є, 14. Д.26.550.01 в Інституті фармакології Інституту фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул.Е.Потьє,14)

Автореферат розісланий “18 ” _травня__ 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01,

кандидат біологічних наук ______________ І.В. Данова

загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Розповсюдження захворювань, пов’язаних з патологією головного мозку, робить проблему вельми значимою для клінічної практики та теоретичної медицини (О.Ф. Возіанов, 1996; И.С. Зозуля и соавт., 2005). Згідно міжнародним епідеміологічним дослідженням, щорічно від інсульту із 6 млн людей, які перенесли це захворювання, вмирає 4,7 млн. В Україні захворюваність інсультом складає 2,5-3 випадки на 1000 людей у рік, смертність – відповідно один випадок. Половина хворих, яким зберегли життя, втрачає працездатність та страждає від погіршення якості життя, нерідко стають інвалідами (С.М. Виничук и соавт., 2003). Тому пошук ефективних засобів запобігання та лікування захворювань мозку – церебропротекторів набуває особливого значення. Спектр їх терапевтичного використання не обмежується гострою ішемією головного мозку, а включає цілий ряд інших нозологічних форм, виникнення та розвиток яких пов'язані з метаболічним порушенням функції ЦНС та дисбалансом регуляторних нейротрансміттерів (І.В. Комісаров, 2003; Е.А. Гусев, 2001).

Наявність великої кількості нейромедіаторних амінокислот в різних відділах нервової системи, їх унікальна фізіологічна роль в роботі мозку, в механізмах нервово-психічної діяльності та пластичності можуть указувати на перспективність використання сполук, які впливають на глутаматергічну нейромедіаторну систему в якості лікарських засобів різного типу дії (протисудомних, протиішемичних, нейропротективних засобів, анальгетиків і т.і.) (А.Ю. Беспалов, Э.Э. Звартау, 2000). Концепція “глутамат-кальцієвої ексайтотоксичності” стала визначальною у скринінгу потенційних нейропротекторів. Ця концепція свідчить, що некроз або апоптоз нервових клітин при фокальній чи загальній ішемії мозку обумовлений надмірною активністю глутаматергічних нейронів і надмірним зростанням внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію в нейронах мозку, які збуджуються глутаматом (J. Castillo, A. Davalos, 1997; В.И. Скворцова, 2001).

Встановлено, що інгібітори вивільнення глутамату ефективно протидіють нейродегенеративним і ексайтотоксичним, ішемічним і гіпоксичним ушкодженням мозку (L. Beltran-Parrazal, 2003; P. Jimonet, 1998; T. Tzschentke, 1998; Doble, 1996; P. Couratier, 1994). Проте, препаратів цього ряду небагато, а для деяких із них суттєвими є побічні ефекти, які супроводжуються порушенням координації рухів та психомоторних реакцій (дизолципін, декстрометорфан, селфотел, пропентофіллін). Тобто, ці препарати, на жаль, здатні негативно впливати на важливі метаболічні та фізіологічні процеси центральної нервової системи (G. Devuyst, J. Bogousslavsky, 2001; A.A. Parsons, E.A. Irving, 2000; R.N. Auer, 1994).

У клінічній практиці для лікування бокового аміотрофічного склерозу використовується рилузол, а експериментальні дані свідчать про його властивості блокувати вивільнення глутамату (R.G. Miller, J.D. Mitchell, 2004; P.J. Shaw, P.G. Ince, 1997; P. Jimonet, F. Audiau, 1999). Тому з‘ясування ефективності рилузола та похідних його активної молекули або похідних бензотіазолу при ішемії головного мозку є актуальним завданням.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності до плану науково-дослідних робіт кафедри фармакології та технології лікарських засобів Дніпропетровської державної медичної академії "Особливості дії нейро- та психотропних лікарських засобів в умовах екстремальних ситуацій" (№ держреєстрації 0199U001559) та "Розробка методологій оцінки дії анальгетиків, анестетиків, антиоксидантів та їх комбінацій в умовах експериментальної патології ЦНС" (№ держреєстрації 0102U00344).

Мета і завдання дослідження. На основі скринінгових досліджень встановити нейропротективні властивості похідних бензотіазолу при експериментальній ішемії головного мозку та встановити найбільш активну сполуку.

Згідно з метою дослідження виконувались наступні завдання:

1. Провести фармакологічний скринінг потенційних церебропротекторів в ряду похідних бензотіазолу на моделі гострої ішемії головного мозку;

2. Дослідити вплив найбільш активної сполуки – амдифлузола (2-аміно-6-дифторометоксібензотіазол) порівняно з препаратами рилузола (рілутека, боризола) на поведінку, м‘язовий тонус та інтегративні функції мозку тварин з церебральною ішемією;

3. Визначити вплив амдифлузола і препаратів рилузола на енергетичний обмін і на інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів у тканинах головного мозку в тварин з гострим порушенням мозкового кровообігу;

4. Вивчити церебропротекторну дію амдифлузола і препаратів рилузола за морфологічними змінами тканин головного мозку щурів на моделі двосторонньої перев‘язки загальних сонних артерій;

5. Дослідити характер впливу амдифлузола і препаратів рилузола на викликану біоелектричну активність мозку та периферичних нервів.

Об’єкт дослідження – білі щури з ішемією головного мозку.

Предмет дослідження – церебропротективні властивості похідних бензотіазолу.

Методи дослідження – фармакологічні, токсикологічні, фізіологічні, біохімічні, морфологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. В дослідах in vivo на моделі ішемії головного мозку серед ряду похідних бензотіазолу, синтезованого науковим відділом Борщагівського хіміко-фармацевтичного заводу найбільші церебропротективні властивості показала сполука під робочою назвою амдифлузол (2-аміно-6-дифторометоксібензотіазол). Ці властивості реалізуються зниженням летальності щурів з церебральною ішемією, послабленням нейродегенеративних процесів, зменшенням зони некрозу у головному мозку, зниженням розвитку неврологічного дефіциту у тварин, послабленням ознак порушення функціонального стану ЦНС, гальмуванням надмірної активації процесів вільно-радикального окислення та нормалізацією показників енергетичного обміну. Нейрофізіологічними дослідами встановлено, що амдифлузол ефективно блокує проведення збудження до інтернейронів спинного мозку, ефективно зменшує рефлекторне збудження мотонейронів у моносинаптичній рефлекторній дузі. Дослідження нових похідних бензотіазолу у порівнянні з відомим блокатором глутаматергічної передачі рілутеком (МНН – рилузол, Aventis Pharma, Франція) і препаратом-генериком боризолом (МНН – рилузол, Борщагівський ХФЗ, Україна) дозволило припустити, що в основі церебропротективних властивостей амдифлузола лежить властивість ефективно гальмувати глутамат-кальцієву ексайтотоксичність, яка виникає при ішемії головного мозку.

Практичне значення отриманих результатів. Результати проведених досліджень експериментально обгрунтовують доцільність використання найбільш активної молекули в ряду похідних бензотіазолу під робочою назвою амдифлузол для профілактики і лікування ішемічних ушкоджень головного мозку.

Результати дисертаційної роботи впроваджено в учбовий процес кафедр фармакології Дніпропетровської державної медичної академії, Запорізького державного медичного університету, Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Луганського державного медичного університету, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є особистою науковою працею автора. Внесок дисертанта у її виконання полягає у визначенні мети і задач роботи, проведенні експериментальних досліджень, наукового аналізу та інтерпретації отриманих результатів, формулюванні основних положень та висновків дисертації. Автором особисто проведено патентно-інформаційний пошук, статистична обробка даних, опубліковані основні положення дисертації, написання і оформлення дисертації та автореферату.

Проведення морфологічних досліджень зразків тканин мозку експериментальних тварин виконано за консультативною допомогою професора кафедри патологічної фізіології Запорізького державного медичного університету А.В. Абрамова.

Нейрофізіологічні дослідження виконані за консультативною допомогою доцента кафедри нормальної фізіології Дніпропетровської державної медичної академії О.Г. Родинського.

Апробація роботи. Основні положення дисертації оприлюднені на ІІІ міжнародній науково-практичній конференції “Динаміка наукових досліджень” (Дніпропетровськ, 2004), Х Конгресі СФУЛТ (Чернівці – Київ – Чікаго, 2004), І Міжнародній науково-практичній конференції „Науковий потенціал світу” (Дніпропетровськ, 2004), Міжнародному медико-фармацевтичному конгресі „Ліки та життя” (Київ, 2005), 9-му Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2005), VIIІ міжнародній науково-практичній конференції “Наука і освіта” (Дніпропетровськ, 2005), VII міжнародному симпозіумі “Інсульт: діагностика, профілактика, лікування” (Судак, 2005), ІV міжнародній науково-практичній конференції “Динаміка наукових досліджень” (Дніпропетровськ, 2005), VI Національному з’їзді фармацевтів України „Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України” (Харків, 2005), ІІ науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005), III Всеукраїнській морфологічній науковій конференції “Карповські читання” (Дніпропетровськ, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових робіт, які повною мірою відображають її зміст, з них 5 – у наукових фахових журналах, рекомендованих ВАК України (2 - самостійно), 10 тез у матеріалах з‘їздів, конгресів, науково-практичних конференцій та симпозіумів.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 199 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, п‘яти розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків та списку використаних джерел, що включає 311 робіт, із них іноземних – 132. Роботу проілюстровано 36 таблицями, 37 рисунками.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження виконані на 498 білих нелінійних мишах масою 17-24 г та 488 білих нелінійних щурах масою 150 - 230 г. Тварини утримувалися на стандартному раціоні харчування віварію. Щури отримані із розплідника ІФТ АМН України. Всі експериментальні процедури і оперативні втручання здійснювали відповідно до “Положення про використання тварин в біомедичних дослідженнях”.

Об‘єктами фармакологічних досліджень були 7 оригінальних похідних 2-аміно-6-бензотіазолу, синтезованих дослідно-впроваджувальною лабораторією ЗАТ НВЦ “Борщагівський ХФЗ”, Україна. В якості препаратів порівняння використовували таблетки боризола (МНН рилузол, ЗАТ НВЦ “БХФЗ”, Україна) і рілутека (МНН – рилузол, Aventis Pharma, Франція), які також відносяться до ряду бензотіазолу.

Гостру токсичність похідних бензотіазолу вивчали при одноразовому введенні внутрішньошлунково мишам у зростаючих дозах згідно з Методичними рекомендаціями Фармцентру МОЗ України з експериментального вивчення токсичної дії потенційних лікарських засобів (Київ, 2000).

Скринінг нейро- та психотропних властивостей похідних бензотіазолу здійснювали на білих мишах згідно з методичними рекомендаціями “Доклінічні дослідження лікарських засобів” (Київ, 2002). Всі хімічні сполуки вводили в дозі 1/10 ЛД50 внутрішньошлунково за 40 хв до експерименту. Протисудомну активність досліджували у тесті коразолових судом; пролонгування похідними бензотіазолу снодійного ефекту оцінювали за властивістю збільшувати тривалість сну, викликаного введенням тіопенталу натрію; скринінг протигіпоксичної активності здійснювали на моделях гіпоксії замкнутого простору та гіпоксії змішаного типу; антиноцицептивну активність сполук досліджували на моделях „оцтово-кислі корчі” і „гаряча пластина”.

Дослідження протиішемічної активності похідних бензотіазолу проводили з використанням загальноприйнятих моделей експериментального порушення мозкового кровообігу: одно- та двосторонньої перев’язки загальних сонних артерій. Операції виконували на щурах під тіопенталовим наркозом (40 мг/кг, внутрішньоочеревинно), з використанням хірургічного доступу шляхом виділення сонних артерій і накладання на них шовкової лігатури (С.А. Шалимов и др.., 1989). Критеріями протиішемічної активності було зниження летальності щурів в динаміці і зменшення неврологічного дефіциту згідно шкали stroke-index (Р. McGrow,1977) і неврологічної шкали (Г.З. Суфіанова, 2001). Речовини вводили в дозі 1/10 ЛД50 внутрішньошлунково одноразово, за 40 хв до операції (профілактичне введення).

В наступних експериментах похідні бензотіазолу вводили з лікувальною метою після проведення оклюзії загальних сонних артерій у щурів, в дозі 1/10 ЛД50 внутрішньошлунково, щоденно.

Поведінкові реакції вивчали з використанням методу „відкрите поле” (Я. Буреш и соавт., 1991). До уваги брали показники горизонтальної і вертикальної рухової активності, дослідницьку активність (кількість обстежених норок), емоційну напругу (кількість болюсів і актів грумінгу). Мнестичні процеси вивчали по відтворенню енграм пам’яті при виробленні умовної реакції пасивного уникнення (УРПУ) (Ю.С. Бородкін, Ю.В. Зайцев, 1986).

Для біохімічних досліджень тканини головного мозку гомогенізували в сольовому ізотонічному розчині (0,15 М KCl) при охолодженні до +4єС за допомогою скляного гомогенізатора в співвідношенні 1:40. Після виділення ядер і незруйнованих клітин (1000 g) методом диференційного центрифугування (15000 g) виділяли цитозольну фракцію (М.И. Прохорова, 1982).

Екстракцію ліпідів проводили методом Р. Кейтса (1974). Безбілковий екстракт одержували додаванням точної наважки гомогенату тканини в хлорну кислоту (0,6 М) з наступною нейтралізацією 5,0 М К2СО3 (М.И. Прохорова, 1982).

Інтенсивність вільнорадикального окислювання оцінювали по накопиченню в тканинах початкових і кінцевих продуктів цього процесу: дієнових кон’югатів (ДК) неетерифікованих аліфатичних кислот (В.С. Коган, 1986), малонового діальдегіду (МДА) (Л.И. Андреева и соавт., 1988). Стан антиоксидантної системи організму оцінювали за активністю супероксиддисмутази (СОД) (С. Чевари, 1986) і каталази (М.А. Королюк и соавт., 1988).

Стан вуглеводньо-енергетичного обміну і циклу Кребса визначали за рівнем аденілових нуклеотидів (Н.Б. Захарова, Н.В. Рубин, 1980), глюкози, лактату, пірувату, малату та сукцинату (Т.А. Детлаф, 1974; М.И. Прохорова, 1982) у тканинах головного мозку.

Морфологічному дослідженню піддавали всю зону 4-го шару кори лівої та правої півкулі. Тканини головного мозку експериментальних тварин поміщали на 1 добу у фіксатор Карнуа і після стандартної гістологічної проводки тканину парафінували (Э. Пирс, 1962). Для вивчення морфології нейронів на ротаційному мікротомі виготовляли 4-мікронні зрізи нейронів кори, які де парафінували і зафарблювали для визначення змісту нуклеїнових кислот галлоціанін-хромовим галуном по Ейнарсону (Э. Пирс, 1962). Вивчення морфометричних і денситометричних характеристик нейронів проводили на комп‘ютерній системі цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина). Зображення, яке отримали на мікроскопі Axioskop, за допомогою високочутливої відеокамери COHU-4722 (COHU Inc., США) уводилося в комп‘ютерну систему цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина) та оцифровувалося за денситометричною шкалою. Ідентифікація клітин в отриманому зображенні здійснювалася в автоматичному режимі за допомогою пакета прикладних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина). Усі зазначені характеристики визначали індивідуально для кожної клітини в автоматичному режимі, що дозволяло одержати характеристику кожної клітини (Y.M. Kolesnik et al., 2002).

При дослідженні характеру впливу боризола, рілутека і амдифлузола на викликану біоелектричну активність спинного мозку та периферичних нервів реєстрували наступні види викликаних потенціалів: потенціали дорсальної поверхні спинного мозку; рефлекторні потенціали вентральних корінців; сумарні потенціали дорсальних і вентральних корінців (Е.А. Макий, П.А. Неруш, А.Г. Родинский, 2000). Оцінювали характер біоелектричної активності перед введенням речовин (вихідний рівень); приймали цей рівень за 100% та оцінювали зміни її через 10, 30, 60 та 120 хв після введення.

Результати підлягали статистичній обробці та представлені у вигляді середнього арифметичного (М) та стандартної похибки середнього арифметичного (m) для певної вибірки (n). Вірогідність різниці середніх значень досліджуваних показників оцінювали за t-критерієм Ст‘юдента, а також непараметричного критерію статистики – точного методу Фішера для чотирипільної таблиці (С.Н. Лапач, А.В. Чубенко, 2001).

Результати та їх обговорення. Визначення класу токсичності, фармакологічний скрінінг і порівняльна оцінка потенційних церебропротекторів в ряду похідних бензотіазолу на моделі гострої ішемії головного мозку. Згідно результатів дослідження гострої токсичності боризол відноситься до III класу токсичності (помірно токсичні речовини). Препарат порівняння рілутек характеризується близькими показниками і також належить до III класу токсичності. Похідні бензотіазолу під шифрами №1, 2, 4-7 відносяться до III класу токсичності (помірно токсичні речовини) – LD50 в межах 96,75 мг/кг – 413,5 мг/кг, крім сполуки №3 (LD50>10000 мг/кг) – V клас токсичності (практично нетоксичні речовини) згідно класифікації речовин за токсичністю (К.К. Сидоров, 1973) (табл. 1).

Таблиця 1

Визначення LD50 похідних бензотіазолу

Боризол

52,25±1,49 мг/кг

Рілутек

53,80±3,50 мг/кг |

№1

240,0±14,09 мг/кг

№2

413,50±17,16 мг/кг |

№3

>10 000 мг/кг |

№4

137,25±10,0 мг/кг

№5

118,25±10,20 мг/кг |

№6

96,75±14,05 мг/кг |

№7

117,0±28,0 мг/кг

Наступним етапом роботи була скрінінгова оцінка нейро- та психотропних властивостей похідних бензотіазолу.

При моделюванні коразолових судом у мишей боризол збільшував латентний період до початку судом на 68,93% у порівнянні з контролем, продемонстрував збільшення тривалості життя на 497,32% (р<0,05). Він також знижував відсоток тварин із клонічним і тонічним типом судом. За час спостереження летальність в групі мишей, які отримували боризол, складала 33,3%, в той час як у контрольній групі цей показник був 100%. Аналогічні результати отримали і в групі тварин, яким вводили препарат порівняння – рілутек у тій же дозі. Серед 7 похідних бензотіазолу найбільшу антикоразолову активність показала сполука під шифром №2, яка у 2,5 рази збільшувала тривалість латентного періоду до початку конвульсій у порівнянні з контролем, та у 8 раз пролонгувала життя тварин в умовах коразолової інтоксикації; при цьому 50% мишей вижило. Дещо меншою активністю відзначилися похідні бензотіазолу під шифрами №4 і №5, які фактично у 1,5 рази продовжували латентний період до початку конвульсій у порівнянні з контролем, та в 7 раз збільшували тривалість життя тварин, при цьому 66,7% мишей вижило. Похідні бензотіазолу №1, №3, №6 і №7 практично не проявили антикоразолової дії.

При дослідженні властивості пролонгувати гіпно-седативний ефект снодійного засобу – тіопенталу натрію показано, що в групі тварин, які отримали боризол, швидкість засинання тварин була практично такою ж, як у контролі. Різниці між групами тварин не спостерігали і у тривалості сна. Встановлено, що при введенні рілутека тривалість медикаментозного сна була співставлена з результатами, отриманими в групі боризол. Хімічна сполука №2 скорочувала час до початку медикаментозного сна на 11,1% та достовірно збільшувала його тривалість на 50 % (р<0,05). При введенні речовини під шифром №3 тіопенталовий сон наступав раніше на 38,8 % (р<0,05), ніж у контрольній групі, при цьому сон був на 30,44 % тривалішим. Похідне бензотіазола №4 несуттєво скорочував час до початку барбітурового сна на 22,2% порівняно з контролем, але при цьому сон був тривалішим за часом на 59,7% (р<0,05). Похідні бензотіазола №1, №5, №6 і №7 мали незначні відхилення від контрольної групи у тривалості медикаментозного сна.

Сполука №2 показала найкращий антигіпоксичний ефект, збільшуючи час життя мишей у замкнутому просторі на 67,12 % (р<0,05). Другою за адаптогенною активністю серед похідних бензотіазолу була сполука №6, яка на 43,15 % пролонгувала життя тварин у порівнянні з контролем (р<0,05). Речовини під шифрами №4 та №7 збільшували час життя тварин в умовах О2-дефіциту на 35,24 % і 23,28 % відповідно (р<0,05). Боризол продовжував життя тварин в замкнутому просторі на 19,46% у порівнянні з контрольною групою (р<0,05). Препарат порівняння рілутек показав ту ж активність.

Боризол, рілутек, сполуки №2, №4 підвищують також стійкість організму до отруєння натрію нітритом, яке проявляється достовірним збільшенням тривалості життя тварин в умовах експериментальної гіпоксії змішаного типу, що свідчить про наявність адаптогенних властивостей.

Про анальгезуючу активність досліджених речовин судили по змінам під їх впливом порога больової чутливості у тварин при різних видах больового подразнення. При визначенні механізмів периферичної анальгетичної дії в ряду похідних бензотіазолу антиноцицептивний ефект показали речовини №1, №2, №5 і №7, а також боризол і рілутек практично в однаковій мірі, вони на 50-60% зменшували кількість корчей після введення 0,6% розчину оцтової кислоти у мишей. За допомогою моделі “гаряча пластина” виявили відсутність центрального компоненту впливу похідних бензотіазолу на ноцицептивну систему, досліджені речовини не мають анальгетичних властивостей.

Метою наступного фрагменту дослідження був пошук потенційних церебропротективних засобів серед похідних бензотіазолу на експериментальній моделі гострої ішемії головного мозку.

Результати проведеної серії скринінгових досліджень фармакопрофілактичної активності похідних бензотіазолу в умовах двобічної оклюзії загальних сонних артерій підтверджують, що більшість речовин проявляють протиішемічну активність різного ступеню, яка реалізується зменшенням відсотку летальності щурів у порівнянні з контролем. Так, максимальний церебропротекторний ефект в умовах гострого порушення мозкового кровообігу (ГПМК) боризол і рілутек проявляють на 24 годину – вижило 37,5% тварин, у той час як у контрольній групі на 24 годину залишилося 12,5% щурів. Важливо відмітити, що на момент 100% загибелі контрольних щурів – 36 годин вижило 37,5% щурів як у групі, яка отримала боризол, так і в групі з рілутеком. На 72 годину спостерігання в групах боризол і рілутек вижило 25% тварин. В ряду похідних бензотіазолу у хімічної речовини №4 спостерігали найкращу антиішемічну активність. Так, на момент стовідсоткової загибелі щурів – 36 годин, в цій групі вижило 50% щурів, а на 72 години залишилось 37,5% тварин живих. Це найкращий показник серед дослідженого ряду. Речовині №4 надали робочу назву амдифлузол для зручності написання наступних розділів. Амдифлузол ми вивчали надалі як найбільш активну речовину серед похідних бензотіазолу, синтезованих дослідно-впроваджувальною лабораторією Борщагівського ХФЗ і його активність розглядали у порівнянні з боризолом і рілутеком у наступних розділах.

Амдифлузол і препарати рилузола запобігали загибелі щурів, істотно знижуючи розвиток неврологічного дефіциту за шкалою Mc Grow (табл.. 2).

Таблиця 2

Оцінка неврологічного дефіциту тварин з ГПМК за шкалою Mc Grow, по добі в балах

Препарат | Доза, мг/кг | Показник | Доба експерименту

1 | 2 | 3

Інтактні щури (псевдопрооперовані) | середній бал (M + m)

% тварин з тяжкою симптоматикою | 2,00±0,60

0 | 2,00±0,60

0 | 0,00±0,00

0

Боризол | 5 | середній бал (M + m)

% тварин з тяжкою симптоматикою | 8,40±2,22

100 | 7,60±1,54

80 | 4,80±1,33

60

Рілутек | 5 | середній бал (M + m)

% тварин з тяжкою симптоматикою | 8,20±1,90

100 | 7,60±1,35

80 | 4,50±2,12

60

Амдифлузол | 14 | середній бал (M + m)

% тварин з тяжкою симптоматикою | 7,40±1,88

100 | 6,60±1,33

80 | 4,00±0,24

40

Контроль

(фізіологічний розчин) | 0,1 мл/ 100 г | середній бал (M + m)

% тварин з тяжкою симптоматикою | 10,4±2,44

100 | 9,2±1,17

100 | Загибель тварин

Вплив амдифлузола і препаратів рилузола (рілутека, боризола) на поведінку, м‘язовий тонус та інтегративні функції мозку тварин з гострою ішемією головного мозку. Показники орієнтовно-дослідницької та емоційно-вегетативної активності щурів реєструвалися на 4-у добу після проведення однобічної оклюзії сонної артерії (у гострий період) і на 14-у добу (у відновлювальний період ішемії головного мозку) при щоденному внутрішньошлунковому введенні фармакологічних засобів. У тварин з порушеним мозковим кровообігом спостерігали зміни всіх компонентів поведінки у порівнянні з такими у псевдопрооперованих. Встановлено значне зниження орієнтовно-дослідницької активності тварин контрольної групи (ішемія) в період з 1 по 14 доби спостереження, особливо у гострий період. У цих щурів відмічався і дефіцит емоційно-вегетативних реакцій. Боризол, рілутек і амдифлузол знижували орієнтовно-дослідницьку активність щурів із порушеним мозковим кровообігом (рис. 1). Однак, речовини значно покращували емоційно-вегетативний компонент поведінки щурів. Позитивний ефект рілутека і боризола на емоційність тварин був більш виражений, ніж у амдифлузола на 4-у добу спостереження. Так, кількість актів грумінгу збільшувалась при дії боризола, рілутека і амдифлузола на 56,41%, 72,64% (р<0,05) і на 28,20%; а кількість болюсів дефекацій збільшувалась відповідно на 151,15%, 103% і 60,6% у порівнянні з контролем (р<0,05) (рис. 1).

Рисунок 1. Зміни поведінкових реакцій щурів у гострий період ішемії головного мозку (на 4-у добу після однобічної оклюзії загальних сонних артерій) під впливом амдифлузола, боризола і рілутека в тесті “відкрите поле”

* Р 0,05 – відносно контролю, ** Р 0,05 – відносно інтактних тварин.

Боризол, рілутек і амдифлузол на 14 добу спостереження достовірно знижують рухову активність щурів з ішемією: горизонтальну – на 67,27%, 65,45% і 70%; вертикальну – на 57,47%, 63,22% і 70,24% у порівнянні з контролем (р<0,05). Дослідницька активність ішемізованих тварин під впливом досліджених речовин знижується практично у 2 рази порівняно з контролем. Показники емоційно-вегетативної складової поведінки щурів змінюються неоднозначно: кількість актів грумінгу дещо перевищує контрольні значення – на 8,5%, 6% і 16,5% під впливом боризола, рілутека і амдифлузола відповідно; а кількість болюсів дефекації знижується під дією боризола і рілутека на 84,82% і 70,53% відповідно (р<0,05), незначно знижується – на 25,89% – у випадку застосування амдифлузола. Таким чином, амдифлузол здійснює позитивний вплив на покращення емоційно-вегетативних реакцій ішемізованих щурів.

У тварин з порушеним мозковим кровообігом спостерігали значне зниження м‘язової сили в період з 1 по 14 доби спостереження, особливо у гострий період (з 1 по 4 доби). Амдифлузол, боризол і рілутек мають помірно виражені міорелаксантні властивості при щоденному застосуванні на протязі 14 діб у щурів з ішемією головного мозку.

При дослідженні інтегративних функцій мозку тварин в умовах ГПМК спостерігалось погіршення навчання щурів в умовній реакції пасивного уникнення, вироблюваній в одному підкріпленні. При цьому чітко простежується позитивна динаміка проявів впливу амдифлузола і препаратів рилузола на згасання відтворення реакції пасивного уникнення при наявності судинної патології мозку. Також немаловажним є той факт, що у тварин з ішемією мозку похідні бензотіазолу дещо послаблюють здатність порушувати процеси відтворення енграм пам’яті порівняно з контрольними тваринами. Характерною рисою досліджених речовин є відсутність негативного їх впливу на мнестичні функції мозку в умовах ГПМК.

Вплив амдифлузола і препаратів рилузола (рілутека, боризола) на енергетичний обмін і на інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів у тварин з гострим порушенням мозкового кровообігу. Наші дослідження показали, що зниження мозкового кровообігу в експерименті приводить до О2-дефіциту і зменшеному притоку метаболітів в ішемізовані тканини головного мозку. Найбільш чутливим до О2-дефіциту є аеробний шлях утворення АТФ. У тварин з двобічною перев‘язкою загальних сонних артерій рівень АТФ в тканинах мозку щурів знизився на 65,3% на фоні зниження вмісту його попередника – АДФ на 43,8% і збільшення АМФ на 85,7% у порівнянні з інтактними тваринами. В умовах виявленого О2-дефіциту виникає гальмування дихального фосфорилювання і зниження дихальної АТФ, необхідної для роботи Na-K-АТФ-ази мітохондрій, Na-K-АТФ-ази плазматичних мембран і Са-АТФ-ази мембран саркоплазматичного ретикулума. Відбувається і активація процесів анаеробного гліколізу при експериментальному ГПМК – втричі збільшується вміст лактату при різкому зменшенні пірувату, малату і сукцинату, у 2 рази зменшується вміст глюкози в порівнянні з показником інтактних щурів. При курсовому призначенні блокаторів глутаматергічної передачі – боризола, рілутека і амдифлузола – виявлено виражений їх вплив на показники енергетичного обміну.

Важливим моментом у дії сполук було те, що збільшення АТФ відбувалося на фоні незначного побільшання вмісту АДФ і зниження АМФ (рис. 2). Сполуки, що досліджувались, підсилювали утилізацію продуктів гідролізу АТФ, що у свою чергу, мабуть приводило до гальмування утворення супероксидрадикалу в ксантиноксидазній системі. Збільшення вмісту АТФ відбувалося як при активації процесів гліколізу, так і значною мірою – циклу Кребса.

Речовини знижували рівень лактату, причому амдифлузол і боризол перевершували ефект рілутека. Найбільший вплив речовини здійснюють на вміст сукцинату, який збільшується у 2,5–3 рази (рис. 3).

Вміст глюкози в ішемізованому головному мозку тварин під впливом досліджуваних речовин збільшується на третину.

Препарати обмежують “вторинні” порушення біоенергетики (явища лактат-ацидозу та виснаження вуглеводів) за рахунок блокади глутамат-індукованого гліколізу. Препарати не здійснюють самостійної дії на процеси вироблення енергії. Можливий механізм підвищення фонду АТФ за рахунок стимуляції СДГ-залежного шляху, опосередкованого через активацію шунта Робертса (окислення ГАМК до янтарного напівальдегіду > янтарна кислота > її включення до циклу Кребса, обминаючи кисень-залежні ділянки).

Згідно з точкою зору багатьох дослідників, лікарські препарати, які використовуються нині або створюються як нейропротекторні засоби, повинні мати комплексний вплив на кілька ключових ланок зазначеного патобіохімічного каскаду (І.М. Башкін, 1994; Е.И. Гусев, 2001; І.Ф. Бєленічев, 2003). Важливою властивістю таких церебропротекторів поряд з протиішемічною дією повинна бути наявність антиоксидантного ефекту.

Наші дослідження показали, що на 14 добу після однобічної перев‘язки загальної сонної артерії виникає пригнічення активності ферментів, що відповідають за антиоксидантний захист. Активність антирадикального ферменту СОД знизилась на 21,65% у корі, на 22,34% у гіпокампі і на 35,71% – у стовбурі. Активність працюючого з ним у парі ферменту каталази зменшилась на 33,33% у корі, на 24,59% у гіпокампі та на 28,89% – у стовбурі. Тобто після перев‘язки загальної сонної артерії у структурах головного мозку виявилися метаболічні порушення – відбувається гальмування активності антиоксидантних систем. Ці спостереження дозволяють припустити, що зниження активності цих ферментів, особливо СОД, є причиною активації ВРПО в умовах О2-дефіциту.

Вивчені нами в попередніх підрозділах факти порушення метаболізму, які приводять до енергодефіциту і гальмуванню активності АОС при експериментальному порушенні мозкового кровообігу приводять до активізації ВРПО. Так, у ішемізованих щурів на 14 добу експерименту відбувалося зростання рівня ДК та МДА відносно інтактних тварин. Вміст ДК у корі збільшився на 74,31%, у гіпокампі – на 59,09% і у стовбурі мозку – на 71,47% порівняно з інтактними тваринами (р 0,05). Збільшена концентрація кінцевого продукту цього процесу – МДА у корі найбільші зміни – на 242,25%, у гіпокампі – на 135,71%, у стовбурі – на 195,31% (р 0,05). Дані спостереження корегуються зі зміною активності АО ферментів і порушенням енергетичного обміну.

Внутрішньошлункове введення амдифлузола, боризола і рілутека на протязі 14 діб приводило до гальмування процесів ПОЛ в ішемізованих структурах головного мозку. Всі три сполуки проявляли антиоксидантну активність.

Найбільшу активність проявляв амдифлузол, який має як антирадикальну, так і антиперекисну активність. Так, він знижував вміст основних продуктів ПОЛ – ДК – у корі – на 14,51%, у гіпокампі – на 35,05%, і у стовбурі – на 29,63%; МДА – у корі – на 63,78%, у гіпокампі – на 37,12% і у стовбурі – на 44,44% (р<0,05). При цьому спостерігалось підвищення активності антирадикальних ферментів СОД – у корі – на 16,08%, у гіпокампі – на 23,11%, у стовбурі – на 27,35%; і каталази – у корі – на 20,16%, у гіпокампі – на 21,27%, у стовбурі – на 21,76% (р<0,05).

Введення боризола призводило до зниження вмісту продуктів ПОЛ – ДК – у корі – на 39,26%, у гіпокампі – на 23,73%, і у стовбурі – на 8,69%; МДА – у корі – на 44,85%, у гіпокампі – на 28,78% і у стовбурі – на 32,80% (р<0,05). При цьому спостерігалось підвищення активності антирадикальних ферментів СОД – у корі – на 6,03%, у гіпокампі – на 10,37%, у стовбурі – на 15,38%; і каталази – у корі – на 12,90%, у гіпокампі – на 9,92%, у стовбурі – на 8,84%.

Курсове призначення тваринам з ішемією рілутека приводило до зниження вмісту продуктів ПОЛ – ДК – у корі – на 25,53%, у гіпокампі – на 21,87%, і у стовбурі – на 39,34%; і кінцевого продукту МДА – у корі – на 27,57%, у гіпокампі – на 53,78% і у стовбурі – на 52,91% (р<0,05). При цьому спостерігалось підвищення активності антирадикальних ферментів СОД – у корі – на 12,56%, у гіпокампі – на 20,75%, у стовбурі – на 23,07%; і каталази – у корі – на 25,0%, у гіпокампі – на 14,18%, у стовбурі – на 15,64%, що є показником позитивного впливу на обмінні процеси в тканинах головного мозку.

Нейропротекція постішемічних ушкоджень нейронів головного мозку щурів амдифлузолом, рілутеком і боризолом. Вивчені препарати мають значну церебропротективну дію (табл. 3). Так, боризол і рілутек згідно індексу нейродегенерації викликали практично рівне шестикратне ослаблення процесів нейрональної загибелі в соматосенсорній зоні фронтальної кори. Амдифлузол за цим показником мав дещо меншу активність – він послаблював нейрональну загибель втричі. За індексом покращання виживаності боризол, рілутек і амдифлузол мали практично однакову активність. Боризол і амдифлузол значно збільшували швидкість елімінації загиблих нейронів, ймовірно, унаслідок стимуляції активності мікрогліальних клітин мозку. Про це свідчить величина індексу відносної активності мікроглії більше одиниці. Рілутек не викликав достовірної зміни цього показника.

Застосування боризола, рілутека і амдифлузола значно активує проліферацію клітин глії і їх функцію, викликає посилення сателітозу, що є ведучим чинником забезпечення життєдіяльності нейронів при розвитку ішемічних уражень ГМ. Сателітні клітини астроглії утворюють контакти з нейроцитами, через які відбувається перенос іонів макроергічних сполук, РНК, білків, що забезпечує метаболізм ішемізованих нейронів. Розвиток сателітозу на фоні збільшення вмісту в тканині мозку малату, пірувату, АТФ, АДФ приводить до вираженої церебропротективної дії.

Таблиця 3.

Показники нейропротективної дії похідних бензотіазолу

при ішемії головного мозку

Характер досліду | Індекс нейродегенерації | Індекс покращання виживаності | Індекс відносної активності мікроглії

Інтактні тварини | 9,19––

Контроль | 1,95––

Боризол | 12,39 | 1,50 | 1,27

Рілутек | 11,40 | 1,26 | 0,65

Амдифлузол | 5,97 | 1,30 | 1,02

Характер впливу амдифлузола і препаратів рилузола (рілутека, боризола) на викликану біоелектричну активність спинного мозку та периферичних нервів. Рілутек і боризол практично в однаковій мірі ефективно блокують проведення збудження до інтернейронів спинного мозку, приблизно на 50%. Амдифлузол має достовірно більший пригнічуючий ефект – до 70%. Припускається, що гальмуюча дія досліджуваних препаратів на проведення збудження до інтернейронних систем базується принаймні на двох механізмах:

1) пригнічення синаптичної активації глутаматергічних синапсів на інтернейронах (головний механізм);

2) порушення проведення збудження в аферентних нервових волокнах (допоміжний механізм).

Виявлено, що рілутек при системному застосуванні незначно (біля 20%) блокує провідність по аферентних волокнах; практично не блокує проведення збудження по еферентних волокнах. В той же час при аплікації рілутека на нерв ступінь блокади їх така ж, як при системному введенні боризола. Блокада ж еферентних волокон в цьому разі суттєво вище – на 60% від вихідного рівня. Порушення провідності нервових волокон можна пояснити блокуючою дією досліджених препаратів на потенціалкеровані Nа+-канали (Макий Е.А., Неруш П.А., Родинский А.Г., 2000).

Показано, що амдифлузол, боризол і рілутек ефективно зменшують рефлекторне збудження мотонейронів у моносинаптичній рефлекторній дузі. Амдифлузол та боризол на перших етапах дії дещо менше впливають на пригнічення моносинаптичних рефлексів; але при розвитку дії їх ефективність зрівнюється. Вважаємо, що зменшення моносинаптичних рефлекторних відповідей при застосуванні досліджених препаратів виникає перш за все через блокаду синаптичної передачі (переважно глутаматергічної природи), в другу чергу – через блокаду проведення збудження по аферентним волокнам групи 1а, які мають моносинаптичні зв’язки з мотонейронами.

Таким чином, проведені дослідження дозволили виявити серед ряду похідних бензотіазолу одну найактивнішу сполуку – амдифлузол (речовина №4, 2-аміно-6-дифторометоксібензотіазол) з високими церебропротективними властивостями, що ймовірно, пов‘язано із властивістю гальмувати глутамат-кальцієву ексайтотоксичність, яка виникає при ішемії головного мозку та пригніченням надмірної активації процесів вільно-радикального окислення та нормалізацією показників енергетичного обміну.

Висновки

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове рішення наукового завдання, що полягає у експериментальному обгрунтуванні доцільності застосування з профілактичною та лікувальною метою амдифлузолу (найактивнішої сполуки серед ряду похідних бензотіазолу) в умовах гострого порушення мозкового кровообігу (ГПМК) ішемічного генезу.

1. На моделі гострої ішемії головного мозку білих щурів серед ряду похідних бензотіазолу виділили амдифлузол (речовина №4, 2-аміно-6-дифторометоксібензотіазол) як сполуку з найкращою церебропротективною активністю. При фармакопрофілактичному внутрішньошлунковому введенні щурам в дозі 14 мг/кг на 24 годину амдифлузол знижує летальність тварин з ГПМК на 50% відносно контролю, сприяє більш швидкому усуненню неврологічної симптоматики (на 2,5-5 балів); має антикоразолову – у 1,5 рази продовжує латентний період до початку конвульсій у порівнянні з контролем та в 7 разів збільшує тривалість життя мишей; протигіпоксичну – збільшує час життя тварин в умовах О2-дефіциту на 35,24% (р<0,05) і антитоксичну дію – збільшує час життя тварин у несприятливих умовах на 41,44% порівняно з контролем (р<0,05).

2. Амдифлузол (14 мг/кг) та препарати порівняння – боризол (5 мг/кг) і рілутек (5 мг/кг) в умовах ГПМК при щоденному внутрішньошлунковому введенні з лікувальною метою на протязі 14 діб знижують горизонтальну рухову активність ішемізованих щурів (на 60-70%), дослідницьку (кількість заглядань у нірки зменшується на 60-75%), але не емоційно-вегетативну активність у гострий період (з 1 по 4 доби після оклюзії загальної сонної артерії) порівняно з контролем (щури з ГПМК). Речовини не мають виражених міорелаксантних властивостей. Сполуки позитивно впливають на відтворення реакції пасивного уникнення при наявності судинної патології мозку – на 50-70% більше щурів зі збереженою навичкою, ніж у контролі. Досліджені речовини не справляють негативного впливу на мнестичні функції мозку в умовах ГПМК.

3. Застосування амдифлузола (14 мг/кг), боризола (5 мг/кг) і рілутека (5 мг/кг) в умовах ГПМК при щоденному внутрішньошлунковому введенні з лікувальною метою на протязі 4-х діб нормалізує біоенергетичні процеси у тканинах головного мозку. При цьому