Національна академія наук україни

ІНСТИТУТ ХІМІЇ ПОВЕРХНІ

На правах рукопису

КОНДАКОВА ЛЮДМИЛА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 541.183:577.152.1

ІММОБІЛІЗОВАНА НА КРЕМНЕЗЕМАХ ГАЛАКТОЗООКСИДАЗА: ОДЕРЖАННЯ, ВЛАСТИВОСТІ, ЗАСТОСУВАННЯ

01.04.18 - фізика і хімія поверхні

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Київ _2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті хімії поверхні НАН України

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор

Тьортих Валентин Анатолійович,

Інститут хімії поверхні НАН України,

головний науковий співробітник

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор

Тарасенко Юрій Олександрович,

Інститут сорбції та проблем ендоекології НАН України,

завідувач відділом

доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

головний науковий співробітник

Провідна установа: Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “23” травня 2006 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.210.01 в Інституті хімії поверхні НАН України (03164, Київ-164, вул. Генерала Наумова, 17).

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту хімії поверхні НАН України за адресою: 03164, Київ-164, вул. Генерала Наумова, 17.

Автореферат розіслано “19” квітня 2006 р.

Вчений секретар

cпеціалізованої вченої ради Г.П. Приходько

ВСТУП

Актуальність теми. Галактозооксидаза належить до мідьвмісних металоферментів і виконує в організмі важливі функції в обмінних процесах. Перспективним є використання цього ферменту в клінічних дослідженнях при діагностиці ряду захворювань, пов’язаних з порушеннями обміну D-галактози (галактоземія). Галактозооксидаза є високочутливим тестом як на вільну D_галактозу, так і на D_галактозу, що входить до складу оліго- і полісахаридів. Проте обмежене використання галактозооксидази для аналітичного визначення галактозовмісних вуглеводів в значній мірі визначається високою вартістю ферменту (виділяється головним чином з грибів Fusarium graminearum, Polyporus circinatus та Dactyllium dendroides) і його низькою стабільністю. Тому важливим є одержання препаратів іммобілізованої галактозооксидази. Як відомо, іммобілізовані ферменти мають ряд суттєвих переваг порівняно з їхніми нативними попередниками, зокрема вони мають більш високу стабільність, придатні до багаторазового використання та тривалого зберігання. Важливо також, що такі гетерогенізовані ферментні препарати є зручними моделями для вивчення дії ефекторів. Додаткових переваг надає іммобілізація ферментів на кремнеземних носіях. Проте іммобілізація галактозооксидази на кремнеземних матрицях практично не вивчалася. Тому актуальним є розробка методів іммобілізації галактозооксидази на поверхні кремнеземів; вивчення впливу ряду ефекторів на активність і стабільність гетерогенних біокаталізаторів і одержання препаратів іммобілізованого ферменту, що придатні для визначення галактози та галактозовмісних вуглеводів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в Інституті хімії поверхні НАН України у відповідності з науково-дослідними тематиками держбюджетних тем: “Спрямовані синтези в поверхневому шарі дисперсних оксидів та вуглецевих адсорбентів з метою одержання прищеплених каталізаторів та вибіркових поглиначів токсичних речовин із біологічних рідин” (№ державної реєстрації 30023851), “Хімічне та геометричне модифікування кремнезему та вуглецевих матеріалів з метою одержання селективних адсорбентів і активних іммобілізованих препаратів” (№ державної реєстрації 01840049114), “Синтез та хімічні перетворення поверхневих структур оксидів кремнію, алюмінію, титану та їхніх композицій” (№ державної реєстрації 0199U002301), “Теоретичні дослідження і розробка лікарських композитів з сорбційним механізмом дії і регульованою фармакокінетикою” (№ державної реєстрації 0199U002299) та “Закономірності адсорбційної взаємодії та хімічних перетворень на поверхні дисперсних оксидів в суспензіях біоактивних молекул, полімерів, клітин та мікроорганізмів” (№ державної реєстрації 0103U006286) та у рамках комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій”.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала в розробці методів іммобілізації галактозооксидази на поверхні вихідного і модифікованих кремнеземів, вивченні впливу ряду ефекторів, а саме: ферріціаніду калію, натрієвої солі етилендіамінтетраоцтової кислоти та іонів міді(ІІ) на стабільність і активність гетерогенних біокаталізаторів, одержанні препаратів, які придатні для визначення галактози і галактозовмісних вуглеводів у складних сумішах, а також для синтезу гліцеринового альдегіду ферментативним шляхом. Для досягнення цієї мети вирішувались наступні задачі:

- вивчити адсорбцію галактозооксидази на поверхні кремнезему при різних співвідношеннях фермент/носій;

- одержати активні і стабільні препарати галактозооксидази, ковалентно закріпленої на поверхні хімічно модифікованих кремнеземів;

- дослідити вплив ефекторів на властивості нативної та іммобілізованої галактозооксидази;

- створити активні іммобілізовані препарати для аналітичного визначення галактозовмісних цукрів та ферментативного окиснення гліцерину до гліцеринового альдегіду.

- Об’єкти дослідження: макропористий кремнезем (силохром); хімічно модифіковані кремнеземи; галактозооксидаза з Fusarium graminearum ІМВ-F-1060.

- Предмет дослідження: адсорбційна і ковалентна іммобілізація галактозооксидази на поверхні вихідного та модифікованих кремнеземів; вплив ефекторів на активність і стабільність одержаних іммобілізованих біокаталізаторів.

- Методи дослідження: полярографія (проточний кисневий електрод Кларка) для визначення концентрації галактози та галактозовмісних вуглеводів у розчинах, спектрофотометрія видимої області для визначення вмісту гліцеринового альдегіду та концентрації поверхневих аміногруп, УФ_спектроскопія для оцінки концентрації білків в розчинах, адсорбційні вимірювання та методи ферментативної кінетики.

Наукова новизна одержаних результатів. Одержано активні препарати галактозооксидази, адсорбованої на поверхні кремнеземних матриць, та встановлено, що при певних співвідношеннях фермент/носій можна створити препарати, що мають суттєво вищу (~ у 20 разів) активність порівняно із нативним біокаталізатором. Запропоновано одностадійний метод “самоіммобілізації” галактозооксидази на поверхні аміноорганокремнезему за допомогою 2,4_галактогексодіальдози - продукту ферментативної реакції окиснення галактози. Здійснено іммобілізацію галактозооксидази на аміноорганокремнеземах, активованих 2,4_толуілендіізоціанатом і хлористим ціануром. Показано, що використані способи ковалентного зв’язування дозволяють одержати препарати з однаковою активністю та стабільністю. Досліджено вплив ферріціаніду калію, натрієвої солі етилендіамінтетраоцтової кислоти та іонів міді(ІІ) на властивості іммобілізованої і розчинної галактозооксидази. Встановлено, що препарати виявляють максимальну активність і стабільність при концентраціях ефекторів в діапазоні 10-5_-3 моль/л.

Практичне значення одержаних результатів. Створено проточно-інжекційну систему, що містить реактор з іммобілізованою галактозооксидазою та проточний кисневий електрод Кларка, для аналізу субстратів ферменту в розчинах. Встановлено, що області лінійної зміни відгуку аналітичної системи від концентрації субстрату становлять: для галактози 2_ ммоль/л, для лактози 5_ ммоль/л і для раффінози 0,2-2,0 ммоль/л.

Показано можливість застосування іммобілізованої галактозооксидази для визначення галактозовмісних вуглеводів в складних сумішах, зокрема в молочних продуктах дитячого харчування і продуктах цукрового виробництва. Гетерогенні препарати перспективні для використання в складі проточного реактора для одержання гліцеринового альдегіду ферментативним окисненням гліцерину.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом проведено підбір та аналіз літературних даних, особисто одержано всі основні експериментальні результати. Виділення і очищення галактозооксидази з Fusarium graminearum ІМВ-F-1060 здійснювалися у співпраці з кандидатом біологічних наук Т.Т. Бугловою та кандидатом біологічних наук О.В. Корольовою (Скоробагатько) в Інституті мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Постановка задачі, обговорення результатів дослідження та формулювання висновків проводилися спільно з науковими керівником доктором хімічних наук, професором В.А. Тьортих. Узгодження методик синтезу модифікованих кремнеземів та обчислення кінетичних параметрів ферментативних реакцій проводилися разом з В.В. Янишпольським.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідалися на V Всесоюзному біохімічному з’їзді, Київ, 1985 р.; V Всесоюзному симпозіумі з інженерної ензимології, Кобулетті, 1985 р.; Першій та другій Всесоюзних школах-семінарах з хімії поверхні твердих тіл, Славско, 1987 і 1989 р.р.; International Conference Cаrpathian Euroregion (CERECO'97), Miskolc-Lillafured, Hungary, 1997; III Міжнародній конференції з хімії високоорганізованих сполук та наукових засад нанотехнології, С-Петербург, Росія, 2001 р.; Міжнародній конференції “Функціоналізовані матеріалі: синтез, властивості, застосування”, Київ, 24_ вересня 2002 р.; VII Polish-Ukrainian Symposium on Theoretical and Experimental Studies of Interfacial Phenomena and their Technological Applications, Lublin, Poland, 15_ September, ; звітній конференції з комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій”, Київ, 2-3 лютого 2005 р.

Публікації. По темі дисертації опубліковано 5 статей, тези 9 доповідей на вітчизняних і міжнародних конференціях та одержано 3 авторських свідоцтва на винаходи.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із загальної характеристики роботи (вступ), огляду літературних даних (розділ 1), методичної частини (розділ 2), експериментальної частини (розділи 3-5), висновків та переліку використаних джерел. Матеріали дисертаційної роботі викладено на 121 сторінці машинописного тексту, що містить 6 таблиць, 38 рисунків та бібліографію із 227 посилань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано вибір теми і актуальність дисертаційної роботи, сформульовано мету і задачі дослідження, відображено наукову новизну та практичне значення одержаних експериментальних результатів.

РОЗДІЛ 1. Одержання і властивості іммобілізованих ферментів. У першому розділі дисертації проведено огляд літературних даних щодо способів іммобілізації ферментів, властивостей оксидоредуктаз і, зокрема, галактозооксидази. Проаналізовано переваги кремнеземних носіїв та способи зв’язку ферментів з цими носіями. Наведено дані щодо методів зв’язування ферментів з поверхнею вихідних неорганічних носіїв, а також способів іммобілізації ферментів на функціональних органокремнеземах. Розглянуто накопичені дані по властивостях розчинної та іммобілізованої галактозооксидази та наведено найпоширеніші приклади використання біокаталізатору в аналітичних цілях. На основі проведеного аналізу літератури обгрунтовано необхідність розробки способів іммобілізації галактозооксидази на кремненеземних матрицях і вивчення властивостей одержаних препаратів.

РОЗДІЛ 2. Об’єкти та методи дослідження. У другому розділі наведено опис використаних хімічних реагентів, методів дослідження та способів синтезу іммобілізованих препаратів. Детально описано будову кисневого електроду Кларка, який було застосовано для визначення ферментативної активності розчинної та іммобілізованої галактозооксидази у проточно–інжекційній системі (рис. 1, 2).

1 _комірка для вимірювання ферментативної активності;

2 _отвір для введення розчину ферменту;

3 – магнітна мішалка;

4 _зовнішня поверхня електроду;

5 _напівпроникна мембрана;

6 _внутрішня поверхня електроду; 7 _ платиновий катод;

8 _срібний анод.

Рис. . Кисневий електрод (В) і комірка для вимірювання ферментативної активностіА). Простір між зовнішньою і внутрішньою поверхнею електроду заповнено 1 М Kcl.

Для іммобілізації галактозооксидази на поверхні кремнеземних носіїв – силохромів (С-80, питома поверхня 78 м2/г, фракція 0,25_,5 мм), використовували як вихідні матриці, так і синтезували ряд модифікованих сорбентів, що містили групи, які здатні з’вязувати фермент ковалентно.

1 _ємність з буферним розчином;

2 _мікронасос;

3 _демпфер;

4 _кран-дозатор;

5 _розчин субстрату;

6 _колонка з іммобілізованим ферментом;

7 _проточний кисневий електрод;

8 _ підсилювач;

9 _самописець;

10 _інтегратор.

Рис. . Схема установки для визначення активності іммобілізованих оксидаз і аналітичного визначення вуглеводів.

Для одержання аміноорганокремнеземів вихідний силохром нагрівали при 400С протягом 2 год. для видалення фізично адсорбованої води, заливали розчином _амінопропілтриетоксисилану в толуолі із розрахунку 0,2 г силану на 1 г носія і кип’ятили у реакторі зі зворотнім холодильником при постійному перемішуванні 2 год.:

SiOH + (C2H5O)3SiCH2CH2CH2NH2 SiС2H5)2CH2CH2CH2NH2

Після цього носій відмивали толуолом і ацетоном до повного видалення органосилану, що не зв’язався з поверхневими гідроксильними групами носія, і висушували. Контроль за повнотою відмивання здійснювали візуально по відсутності кольорової реакції промивної рідини з саліциловим альдегідом.

Ковалентне зв’язування галактозооксидази з поверхнею носія забезпечувалось активацією аміноорганокремнеземів хлорангідридом ціанурової кислоти за схемою:

та 2,4-толуілендіізоціанатом за схемою:

Однотипні групи 2,4-толуілендіізоціанату та хлористого ціанура суттєво відрізняються по хімічній активності. Тому використання таких реагентів дозволяє провести процес зв’язування в два етапи. При цьому спочатку в реакцію вводяться аміноорганосилільні групи поверхні модифікованої кремнеземної матриці, а на другому етапі - функціональні групи сполук, які потрібно іммобілізувати.

Відомо, що галактозооксидаза в присутності молекулярного кисню окиснює галактозу до 2,4-галактогексодіальдози. Цей діальдегід (продукт ферментативного окиснення) вперше було запропоновано нами для одержання ковалентно зв’язаної на аміноорганокремнеземі галактозооксидази за наступною схемою:

Описано методики дослідження впливу ряду ефекторів (ферріціаніду калію, CuCl2·2H2O, натрієвої солі ЕДТА, етилендіамінтетраоцтового комплексу міді) на активність розчинної та іммобілізованої галактозооксидази. Вивчення впливу ефекторів на властивості іммобілізованої галактозооксидази проводили в імпульсному режимі та шляхом неперервного прокачування субстрату з відповідним реагентом через колонку з гетерогенним біокаталізатором. Діапазон концентрацій, що вивчали, становив: для ферріціаніду калію – від 10-7 до 5•10_ моль/л; для іонів двохвалентної міді – від 3•10-7 до 7,4•10-3 моль/л; натрієвої солі ЕДТА – від 10-7 до 2,5•10-3 моль/л; етилендіамінтатраоцтового комплексу міді – від 10-5 до 3•10-3 моль/л.

РОЗДІЛ 3. Одержання препаратів іммобілізованої галактозооксидази. У третьому розділі проаналізовано використані у роботі способи активації аміновмісних носіїв за допомогою хлорангідрида ціанурової кислоти та 2,4_толуілендіізоціаната та підходи до іммобілізації ферменту на цих носіях. Представлено результати вивчення сорбції галактозооксидази на вихідному силохромі, аміноорганокремнеземі та аміноорганокремнеземі, активованому продуктом ферментативної реакції окиснення галактози.

Як відомо, адсорбція на інертних матрицях є одним з найбільш простих і доступних методів іммобілізації ферментів. Особливу роль при цьому грають електростатичні, ван_дер-ваальсові і гідрофобні взаємодії, водневі зв’язки. Вважається, що через низьку міцність зв’язку ферменту з носієм методом адсорбції важко одержати стабільні іммобілізовані препарати, хоча в літературі є приклади успішного використання даного способу. Аналіз літературних джерел показує, що безпосередня сорбція галактозооксидази на неорганічних носіях не вивчалася.

Ми звернули увагу на ту обставину, що на вихідному силохромі галактозооксидаза була адсорбована настільки міцно, що її не вдалося змити з поверхні носія буферами з різними рН (рН=5,5; 4,5; 8,2) і різною молярністю (0,05 - 0,1 М). Обумовлено це, можливо, тим, що поверхня частинок вихідного кремнезему в розчині має негативний заряд, а макромолекули галактозооксидази мають чітко виражені основні властивості. В таблицях 1 і 2 представлено дані щодо залежності активності сорбованого на вихідному силохромі ферменту від активності розчинів (0,05 м Na_фосфатний буфер, рН=7,0) галактозооксидази, які використано для адсорбції, і зміни активності адсорбованого на силохромі ферменту від рН середовища.

Оптимальний результат спостерігається при концентрації розчинного ферменту 1,3 од./г носія (одна Міжнародна одиниця ферментативної активності відповідає кількості ферменту, що здійснює перетворення одного мікромолю субстрату за одну хвилину; далі од.). Аналіз наведених в таблиці 2 даних показує, що зміна рН та типу буферу в межах вказаних співвідношень не впливає значним чином на ступінь активності ферменту. Запропонований спосіб дозволяє одержати високоактивний препарат іммобілізованого ферменту. Більш за те, при певних співвідношеннях (0,1 _ ,3 од./г) одержаний іммобілізований препарат має активність, яка значно (у  разів) перевищує активність вихідного ферменту. Важливою є і та обставина, що використаний для іммобілізації носій не потребує попередньої активації.

Дослідження препаратів галактозооксидази, закріпленої на поверхні кремнезему хімічними зв’язками, показують (таблиця 3), що у випадку використання для іммобілізації розчинів галактозооксидази з активністю 12-80 од., одержані гетерогенні препарати зберігають 100-75% вихідної активності.

Таблиця 1

Залежність активності сорбованого на вихідному силохромі ферменту від концентрації розчинної галактозооксидази (для сорбції галактозооксидази змішували 10 мл розчину біокаталізатора з активністю 0,1–2,5 од. та 1 г вихідного кремнезему; суміш інкубували протягом 2 год. при кімнатній температурі).

активність ферменту у вихідному розчині, од./мл | Співвідношення фермент/носій при адсорбції, од./г | Активність гетерогенного препарату, од./г

0,13 | 1,3 | 28,6

0,01 | 0,1 | 2,4

0,25 | 2,5 | 13,0

0,002 | 0,1 | 0,1

0,27 | 2,7 | 2,6

2,70 | 27,0 | 6,5

Активність одержаних препаратів зберігається протягом двох місяців в умовах протокового реактора (при пропусканні 50 л буферу та 1000_кратного об’єму субстрату). Стабільність препаратів ферменту, ковалентно іммобілізованого двома використаними способами, суттєво не відрізняється.

Ми дослідили оптимальні співвідношення компонентів при закріпленні галактозооксидази за допомогою 2,4-галактогексодіальдози на поверхні аміновмісного кремнезему. Аналіз даних таблиці 4 показує, що максимально активні препарати можна одержати при додаванні 0,90_,88 г галактози та 80_од. активності ферменту на грам носія. Запропонований спосіб дозволяє скоротити процес одержання іммобілізованої галактозооксидази за рахунок виключення стадій активації поверхні носія, а також збільшити активність одержаних препаратів.

Таблиця 2

Залежність активності сорбованої на вихідному силохромі галактозооксидази від рН (змішували 10 мл розчину біокаталізатора з активністю 0,98 од. з 1 г вихідного кремнезему у 0,05 М буферах із різними значеннями рН; суміш інкубували протягом 2 год. при кімнатній температурі).

активність ферменту у вихідному розчині, од./мл | Співвідношення фермент/носій при адсорбції, од./г | рН

буферу | Активність гетерогенного препарату,

од./г

0,010 | 0,10 | 4,5 | 1,74

0,014 | 0,14 | 5,8 | 1,53

0,018 | 0,18 | 6,1 | 1,44

0,098 | 0,98 | 7,0 | 10,89

0,026 | 0,26 | 8,2 | 4,68

0,014 | 0,14 | 9,1 | 2,84

0,001 | Активність відсутня | 4,3 | Активність відсутня

0,001 | Активність відсутня | 9,2 | Активність відсутня

Таблиця 3

Залежність активності одержаних препаратів галактозооксидази, іммобілізованої на аміноорганокремнеземах, активованих хлорангідридом ціанурової кислоти (АсилХЦ) або 2,4-толуілендіізоціанатом (АсилТДІ) від вихідної активності розчинного ферменту (до 1 г відповідного носія додавали 50 мл розчину ферменту в 0,05 М фосфатному буфері рН=7,0 і струшували протягом 2 год. при кімнатній температурі).

Вихідна

активність

галактозо-оксидази, од. |

АсилХЦ |

АсилТДІ

Активність,

од./г | Доля збереження

активності | Активність,

од./г | Доля збереження

активності

23 | 21 | 0,90 | 20,5 | 0,89

115 | 69 | 0,60 | 68 | 0,59

12 | 12 | 1,00 | 12 | 1,00

140 | 75 | 0,54 | 76 | 0,54

80 | 59 | 0,74 | 60 | 0,75

Таблиця 4

Автоіммобілізація галактозооксидази на аміноорганокремнеземі (до 50 мл розчину галактозооксидази з активністю 76_од. і 50 мл розчину, який містив 0,9_,24 г галактози в 0,05 М Na-фосфатному буфері рН=7,0 додавали 1 г носія, струшували 2 год. при кімнатній температурі).

співвідношення компонентів на 1 г

аміноорганокремнезему | Активність іммобілізованого препарату, од./г

Галактоза, г | Галактозооксидаза,

вихідна активність, од.

0,36 | 46 | 9

2,88 | 46 | 45

0,18 | 46 | 4,5

3,24 | 46 | 45

1,44 | 46 | 38

0,90 | 23 | 20

0,90 | 115 | 89

0,90 | 140 | 89

0,90 | 12 | 12

0,90 | 80 | 75–

23 | 1–

69 | 4–

115 | 5

РОЗДІЛ 4. Вплив ефекторів на активність і стабільність іммобілізованної та розчинної галактозооксидази. У четвертому розділі представлено результати вивчення впливу ефекторів на активність і стабільність розчинної та іммобілізованної галактозооксидази.

Як відомо, коли реакція перебігає з швидкістю, що близька до такої у відсутності активатора, то такий активатор вважається несуттєвим. Несуттєві активатори можуть проявляти свою дію в результаті зв’язування з ферментом чи з субстратом (або з обома учасниками комплексу). У простій впорядкованій системі буде спостерігатися часткова активація, якщо комплекс ES розпадається з утворенням продуктів:

де Е – фермент; S – субстрат; А – активатор;

ЕS, ESA – фермент-субстратний комплекс та комплекс фермент-субстрат-активатор, відповідно;

Р – продукт реакції.

Для випадку активації іонами металу можна розглянути рівноваги взаємодії субстрату і металу один з одним і з ферментом, що мають наступний вигляд:

E+M EМ (Ка);

EМ+S EМS (Кs);

E+S ES (Кs);

ЕS+М EМS (Ка);

M+S МS (Ко);

Е+МS EМS (Каs).

Використовуючи рівняння швидкості псевдопершого порядку, при концентраціях субстрату (0,05 _ моль/л) для різних активаторів було розраховано константи активації і Міхаеліса (Ка та Кm), величини яких наведено в таблиці 5.

Таблиця 5

Константи активації та Міхаеліса для різних активаторів галактозооксидази

Активатор | Константа Міхаеліса

(Кm), моль/л | Константа активації

(Ка), моль/л

K3[Fe(CN)6] | 10-2 | 10-5

Na-ЕДТА | 10-2 | 10-5

CuCl2 | 10-2 | 10-3 _10-7

Na-ЕДТА + CuCl2 | 10-3 | -

Базуючись на одержаних результатах, можна зробити висновок про те, що найбільш ефективно з ферментом з’єднується комплекс MS.

Встановлено, що неперервне пропускання буферної суміші, яка містить 10-4 моль/л ферріціаніду калію, через колонку з іммобілізованою галактозооксидазою дозволяє підвищити до десяти разів (в залежності від початкової активності препарату) ферментативну активність при імпульсному (50 мкл 0,1 М розчину галактози) введенні субстрату (рис. 3). У випадку присутності в буферній суміші феріціаніду калію препарати іммобілізованої на кремнеземі галактозооксидази у режимі імпульсного каталізу можуть бути використані на протязі достатньо довгого часу (більше 3 місяців, приблизно 600 аналізів). При цьому падіння активності вихідного препарату не перевищує 30%. Ферріціанід калію в концентрації 10-3-10-5 моль викликає зворотню інактивацію галактозооксидази. При неперервному пропусканні 0,05 М рН=7,0 фосфатного буферу, який містить 3·10_ моль Cu2+ (500 мл на протязі 4 год.), через колонку з іммобілізованою галактозооксидазою і імпульсному введенні субстрату активність препаратів гетерогенного біокаталізатора не змінюється. Неперервне прокачування через колонку з іммобілізованою галактозооксидазою цієї буферної суміші, призводить до того, що активність препарату швидко зменшується. Інактивація, імовірно, пов’язана з тим, що надлишок іонів міді неспецифічно зв’язується з молекулою білку, викликаючи інактивацію ферменту, подібно до іонів інших важких металів (рис. 4).

Рис. . Вплив ферріціаніду калію в концентрації 10 мкМ1) і 100 мкМ2) на підвищення активності іммобілізованої галактозооксидази (імпульсне введення субстрату). |

Рис. . Кінетика зміни активності іммобілізованної галактозооксидази при неперервному (2 мл/хв. пропусканні 100 мМ розчину галактози (1), та при пропусканні того ж розчину субстрату, що містить 10-4 М К3[Fe(CN)6] (2) або 310_ М CuCl2 (3).

Таким чином, вплив ферріціаніду калію та іонів міді(ІІ) на активність іммобілізованної галактозооксидази аналогічний до впливу на розчинний фермент. Однак при тривалій роботі спостерігаються ефекти, які не проявляються при використанні розчинного ферменту, зокрема, зменшення стабільності у присутності ефекторів.

Показано, що максимальна активність ферменту у присутності натрієвої солі ЕДТА досягається при її концентрації 10-4 моль. Активуючий вплив Na-ЕДТА можна пояснити тим, що цей реагент, виступаючи комплексоутворювачем, може зв’язувати іони важких металів, які інактивують галактозооксидазу. Неперервне пропускання буферного розчину, який містив Na-ЕДТА, через колонку з іммобілізованною галактозооксидазою призводить до швидкого падіння активності ферменту внаслідок вимивання іонів міді з активного центру. Встановлено, що інактивований в процесі каталізу фермент може бути повністю реактивований при неперервному прокачуванні через колонку буферної суміші іонів міді(ІІ) 10-5 моль і імпульсному введенні субстрату протягом 90-100 год.

Введення у реакційну суміш етилендіамінтетраацетату з міддю(ІІ) у концентрації -4 моль дозволяє одержати стабільні препарати галактозооксидази з підвищеною активністю (таблиця 6).

Рис. . Реактивація іммобілізованої галактозооксидази (імпульсне введення субстрату) на протязі 1-5 (a), 20-30 (b) та 96-110 год. (c).

Таблиця 6

Вплив ЕДТА-комплексу міді на активність галактозооксидази (неперервне прокачування відповідного буферу і імпульсне введення субстрату) в розчині з концентрацією галактози 0,1 моль/л

концентрація ЕДТА-комплексу міді в розчині, моль/л |

Активність ферменту, од. | Коефіцієнт підвищення активності ферменту

10-5 | 2,01 | 15,2

4.10-5 | 4,55 | 34,5

1.10-4 | 9,80 | 74,2

4.10-4 | 5,16 | 39,1

1.10-3 | 1,05 | 7,9

3.10-3 | 0,28 | 2,1

0 | 0,13 | 1

Раніше було відомо і нами підтверджено, що рН-оптимум розчинної галактозооксидази знаходиться при рН=7,0 і відхилення від цього оптимуму значно знижує активність ферменту (рис. , ). На активність ковалентно зв’язаної галактозооксидази зміна рН середовища в межах 5,8-8,0 практично не впливає.

РОЗДІЛ 5. Аналітичне використання іммобілізованної галактозооксидази. У п’ятому розділі подано результати дослідження аналітичного використання іммобілізованих препаратів галактозооксидази. На основі проточного кисневого електроду Кларка було створено систему, яка дозволяє проводити ферментативний аналіз водних розчинів галактозовмісних вуглеводів у складних сумішах. Відгук електроду реєстрували за допомогою самописця (КСП_) у вигляді піків. Для модельних буферних розчинів було одержано калібрувальні криві, які дозволяють по інтенсивності піку визначати вміст відповідного вуглеводу в зразках, що аналізуються.

Рис. 6. Вплив рН на активність розчинної галактозооксидази. | Рис. 7. Визначення рН-оптимуму розчинної галактозооксидази.

Здатність іммобілізованної на активованих кремнеземах галактозооксидази кількісно окиснювати раффінозу було використано для визначення її вмісту в негідролізованих продуктах цукрового виробництва (патоках). Лінійний відгук системи – до 2,0 г/л (рис. ). Лактозу було визначено у молочних продуктах дитячого харчування (СГД_, СГД_УФ, Віталакт, ВМК_, ВМК_). Лінійний відгук системи _до 3,4 г/л (рис. 9).

При імпульсному режимі визначення раффінози і лактози іммобілізованою галактозооксидазою, фермент був стабільний протягом 14-16 діб, інші компоненти негідролізованих продуктів цукрового виробництва і молочних сумішей не заважали визначенню вказаних вуглеводів. Одержані препарати іммобілізованої галактозооксидази цілком задовольняють необхідним вимогам для їхнього використання в аналітичних цілях при визначенні лактози (5-100 ммоль/л), галактози (2-20 ммоль/л), раффінози (0,1-2 ммоль/л).

Як показано Вега Ф.А. із співавторами (1998 р.) галактозооксидаза перетворює гліцерин у практично 100% чистий гліцеральдегід і фермент проявляє абсолютну прохіральну специфічність. Нами встановлено можливість використання іммобілізованої галактозооксидази для одержання гліцеральдегіду. Для препаратів іммобілізованого біокаталізатора було показано•(рис. ), що максимальна активність ферменту спостерігається у присутності 10-3-10-5 моль/л ЕДТА комплексу міді(ІІ) і імпульсному введенні розчину субстрату, який містив 100 мкмоль/л ферріціаніду калію. Таке співвідношення ефекторів було використано при вивченні швидкості реакції окиснення гліцерину. З одержаних даних випливає, що залежність швидкості реакції окиснення від концентрації лінійна у межах концентрації гліцерину 1_ мл/100мл Na_фосфатного буферу рН=7,0. Швидкість реакції окиснення гліцерину у присутності ферріціаніду калію у 4-10 разів вища за швидкість окиснення у відсутності ефекторів.

Рис. . Залежність швидкості реакції окиснення раффінози іммобілізованою галактозооксидазою від концентрації раффінози: (1) розчин раффінози; (2_) розчини паток в 0,05 М рН=7,0 Na_фосфатному буфері. | Рис. . Залежність швидкості реакції окиснення лактози іммобілізованою галактозооксидазою від концентрації лактози: розчин лактози (1); розчини молочних продуктів дитячого харчування ВМК–1 (2) та ВМК–2 (3).

Рис. . Залежність швидкості реакції окиснення гліцерину іммобілізованою галактозо-оксидазою від концентрації гліцерину: (1) - субстрат без активаторів; (2) – неперервне пропускання буферу, що містить ЕДТА-комплекс міді (10-4 моль/л), та імпульсне введення субстрату з К3[Fe(CN)6]; (3) – субстрат, що містить ЕДТА-комплекс міді (10-4 моль/л).

Таким чином показано, що одержані препарати іммобілізованого біокаталізатора можуть бути використані в аналітичних цілях для кількісного визначення галактозовмісних вуглеводів та ферментативного окиснення гліцерину.

ВИСНОВКИ

1. Як свідчить аналіз літературних даних, іммобілізацію галактозооксидази на поверхні неорганічних носіїв досліджено недостатньо. Разом із тим гетерогенні препарати цього важливого мідьвмісного біокаталізатора є перспективними для використання в тонкому органічному синтезі і для аналітичного визначення галактози та інших галактозовмісних вуглеводів.

2. Встановлено, що адсорбція галактозооксидази на поверхні кремнезему при певних співвідношеннях фермент/носій призводить до одержання препаратів, активність яких суттєво (у  разів) перевищує активність нативного біокаталізатора. Препарати стабільні при промиванні буферними розчинами з рН=4,5-8,2.

3. З використанням аміновмісних кремнеземів, активованих хлористим ціануром або 2,4_толуілендіізоціанатом, одержано активні та стабільні препарати галактозооксидази, що закріплені на поверхні носія за допомогою ковалентних зв’язків.

4. Показано, що продукт ферментативної реакції окиснення галактози (2,4_галактогексодіальдоза) є ефективним зшиваючим реагентом, що дозволяє здійснити ковалентне зв’язування ферменту з носієм через аміногрупу поверхні. Це дозволило розробити зручний одностадійний метод “самоіммобілізації” галактозооксидази на поверхні аміноорганокремнеземів з одержанням препаратів, активність яких є вищою у порівнянні із ферментом, закріпленим на активованих кремнеземних матрицях.

5. Досліджено вплив ефекторів на властивості нативної та іммобілізованої галактозооксидази. Показано, що максимальна активність та стабільність гетерогенних препаратів ферменту досягається при неперервному прокачуванні через проточний реактор буферного розчину, що містить CuCl2 та Na-ЕДТА, та при умові введення в розчин субстрату K3[Fe(CN)6].

6. Створено проточно-інжекційну систему, що містить іммобілізовану галактозооксидазу та проточний кисневий електрод Кларка, для аналізу субстратів ферменту в розчині. Встановлено, що області лінійної зміни відгуку аналітичної системи від концентрації субстрату становлять: для галактози 2 _  ммоль/л, для лактози 5-100 ммоль/л і для раффінози 0,1_,0 ммоль/л.

7. Показано можливість застосування іммобілізованої галактозооксидази для визначення галактозовмісних вуглеводів в складних сумішах, зокрема в молочних продуктах дитячого харчування і продуктах цукрового виробництва. Гетерогенні препарати перспективні також для одержання гліцеринового альдегіду ферментативним окисненням гліцерину.

Публікації за темою дисертації

1. Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А., Буглова Т.Т., Королева О.В. Некоторые свойства галактозооксидазы из Fusarium graminearum ИМВ–F–1060, иммобилизованной на аминоорганокремнеземах // Укр. биохим. журн. – 1984 – т.56, № 4. С. 394-398.

Здобувачем одержано препарати галактозооксидази, іммобілізованої на аміноорганокремнеземах, модифікованих за допомогою 2,4_толуілендіізоціанату і хлорангідриду ціанурової кислоти, вивчено субстратну специфічність, рН_залежність і стабільність одержаних препаратів.

2. Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А., Буглова Т.Т., Скоробагатько О.В. Влияние феррицианида калия и ионов меди(ІІ) на свойства иммобилизованной галактозооксидазы // Укр. биохим. журн. – 1988 – т.60, № 6. С. 34-38.

Здобувачем вивчено вплив ферріціаніду калію іонів міді(ІІ) на властивості іммобілізованої галактозооксидази у проточно-інжекційній системі. Порівняно властивості розчинної та іммобілізованної галактозооксидази.

3. Кондакова Л.В. Свойства галактозооксидазы в иммобилизизованном и растворимом состоянии. Материалы конференции молодых ученых химического факультета МГУ, ч.2, М.: МГУ, 1989. – С.81-85. - Деп. в ВИНИТИ, 08.08.89, №5358_В89.

Здобувачем вивчено вплив натрієвої солі ЕДТА на активність розчинної та іммобілізованної на кремнеземі галактозооксидази

4. Kondakova L.V., YanishpolskiiTertykhAdsorption and chemisorption of galactose oxidase on silica surface // Chemistry, Physics and Technology of Surfaces. - Kyiv: KM Academia. – 2002. – Iss. 7-8. _P. 150-157.

Здобувачем розроблено метод одержання активних та стабільних препаратів адсорбованої галактозооксидази.

5. Кондакова Л.В., Янишпольський В.В., Тьортих В.А. Адсорбційна та ковалентна іммобілізація галактозооксидази на кремнеземніх носіях // Збірник наукових праць “Фізико–хімія конденсованих систем і міжфазних границь”, Київ: ВПЦ “Київський університет” – 2005. – С. 46-51.

Здобувачем розроблено оптимальні умови для одержання гетерогенізованих препаратів галактозооксидази.

6. А. с. 1521775 СССР Способ получения иммобилизованой галактозооксидазы/ Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А., Буглова Т.Т., Скоробагатько О.В. -Опубл. 1987, Бюл. № 42. – 3 с.

Здобувачем розроблено спосіб ковалентної іммобілізації галактозооксидази на поверхні аміновмісного кремнезему за допомогою продуктів ферментативної реакції (2,4–галактогексодіальдоза). Підібрано оптимальні співвідношення компонентів для одержання максимально активних препаратів.

7. А. с. 1723124 СССР Способ иммобилизации галактозооксидазы / Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А., Буглова Т.Т. -Опубл. 1991, Бюл. № 12. – 3 с.

Здобувачем запропоновано і розроблено спосіб іммобілізації галактозооксизази на вихідному силохромі з метою одержання активних препаратів гетерогенного біокаталізатору.

8. А. с. 1742326 СССР Способ активации галактозооксидазы / Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А., Буглова Т.Т. -Опубл. 1992, Бюл. № 23. – 4 с.

Здобувачем запропоновано і розроблено спосіб активації біокаталізатору шляхом введення активатора в розчин ферменту.

9. Кондакова Л.В. Повышение стабильности галактозооксидазы из Fusarium graminearum ИМВ–F–1060 при иммобилизации на неорганических матрицах. // IV Всесоюзный симпозиум ”Инженерная энзимология”. – Москва, май 1983. – С.26.

Здобувачем вивчено стабільність препаратів іммобілізованної галактозооксидази.

10. Кондакова Л.В., Королева О.В., Буглова Т.Т. Аналитическое использование галактозооксидазы // IV Всесоюзный симпозиум ”Инженерная энзимология”. – Москва, май 1983. – С. 27.

Здобувачем досліджено можливість аналітичного використання галактозооксидази у біотехнологіі.

11. Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Буглова Т.Т. Исследование влияния сорбции ионов меди(ІІ) на свойства иммобилизованной галактозооксидазы // V Всесоюзный симпозиум по инженерной энзимологии. – Кобулетти. – 1985. – С. 65.

Здобувачем детально досліджено вплив іонів міді(ІІ) на властивості іммобілізованної галактозооксидази.

12. Кондакова Л.В. Иммобилизация галактозооксидазы на активированных аминоорганокремнеземах // Школа–семинар по химии поверхности дисперсных твердых тел. – Славско – 1987, март – С. 52.

Здобувачем розроблено методи ковалентного зв’язування ферменту з носієм через аміногрупи поверхні.

13. Кондакова Л.В., Янишпольский В.В. Влияние сорбции ионов меди(ІІ) на свойства иммобилизованной галактозооксидазы // Школа–семинар по химии поверхности дисперсных твердых тел. – Славско – 1989, март 6-9. – С. 76.

Здобувачем вивчено вплив іонів міді(ІІ) на властивості іммобілізованної галактозооксидази в проточно-інжекційній системі.

14. Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А. Иммобилизация галактозооксидазы на исходных и модифицированных кремнеземных матрицах // ІІІ Международная конференция “Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии”. Авторефераты докладов. – С.-Петербург, 2001, 24-29 июня. – С. 303-306.

Здобувачем розроблено методи іммобілізації галактозооксидази на вихідному кремнеземі, підібрано оптимальні умови для одержання активних та стабільних препаратів.

15. Kondakova, TertykhYanishpolskii V., Adsorption and covalent immobilization of galactose oxidase on silica matrices // Proceedings of VIIUkrainian Symposium on Theoretical and Experimental Studies of Interfacial Phenomena and their Technological Applications. – Lublin. – 2003. – P. 115-116.

Здобувачем вивчено властивості одержаних препаратів гетерогенного біокаталізатора.

16. Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А. Влияние эффекторов на активность и стабильность препаратов иммобилизованной галактозооксидазы // Тезисы Межд. конф. “Функционализованные материалы: синтез, свойства и применение”. _ Киев. – 24_ сентября 2002 г. – С. 110.

Здобувачем детально вивчено концентраційні межі, в яких спостерігається максимальна активність і стабільність препаратів іммобілізованної галактозооксидази.

17. Тьортих В.А., Янишпольський В.В., Кондакова Л.В., Кліщар І.В. Іммобілізовані на кремнеземних матрицях органічні ліганди і біокаталізатори для чутливих елементів сенсорних систем // Конференція–звіт з Комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій”. – Київ, 2-3 лютого. – 2005. – С. 24.

Здобувачем запропоновано метод визначення галактозовмісних вуглеводів у розчинах з використанням іммобілізованого ферменту.

Анотація

Кондакова Л.В. Іммобілізована на кремнеземах галактозооксидаза: одержання, властивості, застосування. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 01.04.18 – фізика і хімія поверхні. – Інститут хімії поверхні НАН України, Київ, 2006.

Дисертаційну роботу присвячено розробці методик одержання активних і стабільних препаратів галактозооксидази, іммобілізованої на вихідному кремнеземі та аміноорганокремнеземах, активованих 2,4_толуіленідіізоціанатом, хлористим ціануром та 2,4_галактогексодіальдозою, і вивченню властивостей гетерогенних каталізаторів з метою використання для аналізу галактозовмісних вуглеводів.

Обгрунтовано спосіб одержання активних і стабільних препаратів галактозооксидази, адсорбованої на вихідному кремнеземі. При певних співвідношеннях ферменту і носія одержані таким методом препарати мають активність, яка суттєво (~ у 20 разів)перевищує активність нативного біокаталізатору. Запропоновано одностадійний спосіб одержання препаратів галактозооксидази, ковалентно зв’язаних через аміногрупи поверхні за рахунок продукту ферментативного окиснення галактози (2,4–галактогексодіальдози). Одержані цим способом препарати мають активність більш високу у порівнянні із ферментом, закріпленим на активованих кремнеземних матрицях.

Визначено оптимальні концентрації ефекторів, при яких іммобілізований та розчинний фермент мають максимальну активність і стабільність. Показано, що максимальна активність гетерогенного біокаталізатора спостерігається при неперервному прокачуванні через проточний реактор буферного розчину, що містить CuCl2 і Na-ЕДТА, і імпульсному введенні розчину субстрату, в який додано ферріціанід калію.

Розроблено проточно-інжекційну систему, що включає реактор з іммобілізованою галактозооксидазою та проточний електрод Кларка, для аналізу субстратів ферменту. Показано можливість використання іммобілізованої галактозооксидази для визначення галактозовмісних вуглеводів в складних сумішах (молочних продуктах дитячого харчування і продуктах цукрового виробництва) та в тонкому органічному синтезі (одержання гліцеринового альдегіду).

Ключові слова: галактозооксидаза, кремнезем, аміноорганокремнезем, іммобілізація, гетерогенний біокаталізатор, галактозовмісні вуглеводи, електрод Кларка, проточно_інжекційна система.

АННОТАЦИЯ

Кондакова Л.В. Иммобилизованная на кремнеземах галактозооксидаза: получение, свойства, применение. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 01.04.18. – физика и химия поверхности. – Институт химии поверхности НАН Украины, Киев, 2006.

Диссертация посвящена разработке методик получения активных и стабильных препаратов галактозооксидазы, иммобилизованной на исходном кремнеземе, а также на аминоорганокремнеземах, активированных хлористым циануром, 2,4_толуилендиизоционатом и 2,4-галактогексадиальдозой, изучению свойств полученных гетерогенных препаратов фермента с целью их использования для анализа галактозосодержащих углеводов.

Разработан способ получения активных и стабильных препаратов галактозооксидазы, адсорбированной на исходном кремнеземе. Адсорбция галактозооксидазы на исходном кремнеземе позволяет исключить стадии активации носителя и при определенных соотношениях фермента и носителя могут быть получены гетерогенные биокатализаторы, обладающие активностью, которая существенно (~ в 20 раз) превышает активность нативного фермента.

Активные и стабильные препараты иммобилизованой галактозооксидазы были получены при ковалентном связывании фермента с аминоорганокремнеземами, активироваными хлористым циануром и 2,4_толуилендиизоционатом. Активность полученных гетерогенных препаратов падает при проведении 600 анализов субстрата в течение трех месяцев на 30%, однако, после соответствующей калибровки это слабо сказывается на проведении последующих 100 анализов в течение 8 час. Разработан одностадийный метод “самоиммобилизации” галактозооксидазы за счет продукта ферментативного окисления галактозы - 2,4-галактогексадиальдозы, который оказался эффективным сшивающим реагентом, позволяющий осуществлять ковалентную связь фермента с носителем через аминогруппы поверхности. Активность таких препаратов превышает активность ферментов, закрепленных на активированных кремнеземных матрицах.

Иследовано влияние ряда эффекторов (K3[Fe(CN)6]; Na-ЕДТА; CuCl2; Na_ЕДТА+CuCl2) на свойства нативной и иммобилизованной галактозооксидазы. Определены оптимальные концентрации эффекторов, при которых фермент имеет максимальную активность и стабильность. Показано, что максимальная активность гетерогенного биокатализатора проявляется при непрерывном прокачивании через проточный реактор буферного раствора, содержащего CuCl2 и Na_ЭДТА (10_ _ _ моль/л), и импульсном введении раствора субстрата, содержащего феррицианид калия (10-4 моль/л).

Разработана проточно-инжекционная система, содержащая иммобилизованную галактозооксидазу и проточный кислородный электрод Кларка, для анализа субстратов фермента в буферных растворах. Показано, что область линейного отклика аналитической системы охватывает следующие концентрации субстратов: для галактозы 2-20 ммоль/л, для лактозы 5-100 ммоль/л и для раффинозы 0,1-2,0 ммоль/л. Показана возможность использования иммобилизованной галактозооксидазы для определения галактозосодержащих углеводов в сложных смесях (молочных продуктах детского питания и продуктах сахарного производства) и в тонком органическом синтезе для получения глицеринового альдегида).

Ключевые слова: галактозооксидаза, кремнезем, аминоорганокремнезем, иммобилизация, гетерогенный биокатализатор, галактозосодержащие углеводы, электрод Кларка, проточно_инжекционная система.

ABSTRACT

Kondakova L.V. – Galactose oxidase immobilized on silica: preparation, properties, application. – Institute of Surface Chemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006. – Manuscript.

The present work was intended to analyze the experience acquired in developing of preparation methods of samples of galactose oxidase from Fusarium graminearum, immobilized on the parent and modified silica matrices.

Adsorption of galactose oxidase on silicas is proceeding moderately fast and we can not remove enzyme completely with a buffer solutions with pH 4.5 and 8.2. It was observed that at the definite ratios of the enzyme and carrier an activity of the immobilized preparations can lay over an activity of the solutions of the native biocatalyst. Covalent immobilization of galactose oxidase was carried out on the aminopropylsilicas activated with tolylene 2,4_diisocyanate and cyanuric chloride. In the both cases the sufficiently stable preparations are formed and their activity was held constant for some months.

Covalent attachment of the biocatalyst with the carrier surface takes place at the adsorption galactose oxidase on amine-containing silica matrices from solutions including enzyme and galactose. Preparation activity is conserved during two months in the conditions of flow-reaction. In the