ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Кравченко Микола Олександрович

УДК 577.353.5:612.822

Кальцієва регуляція гальмівної синаптичної передачі між нейронами культури гіпокампу

03.00.02 – біофізика

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Київ 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Федулова Світлана Анатоліївна

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

завідуюча лабораторією біофізики синаптичної передачі

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Малишева Маргарита Костянтинівна

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

ст. науковий співробітник, зав. відділом нейрохімії

кандидат біологічних наук

Пархоменко Микола Тимофійович

Інститут біохімії ім. О. В. Паладіна НАН України

пров. науковий співробітник відділу нейрохімії

Провідна установа: Національний Університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, кафедра біофізики, м. Київ

Захист відбудеться "30" травня 2006 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ 01024.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології
ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ 01024.

Автореферат розісланий 28 квітня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Нейрони обмінюються між собою інформацією переважно за допомогою хімічних синапсів. У таких синаптичних з’єднаннях потенціал дії, який генерується поблизу соми, розповсюджується вздовж аксона до пресинаптичної терміналі, де відкриває потенціал-керовані Са2+-канали. Іони кальцію, потрапляючи при цьому всередину нервових терміналей, запускають швидке вивільнення везикул, що містять нейротрансмітер, молекули якого зрештою й сприймаються рецепторами на постсинаптичній клітині. Практично всі типи синапсів регулюються цілою низкою коротко- та довготривалих процесів, з яких деякі сприяють зменшенню, а інші – збільшенню амплітуди постсинаптичного сигналу (синаптичної сили). В деяких синапсах при повторюваному використанні відбувається синаптичне підсилення і домінує полегшення нейропередачі; в інших наслідком є зменшення синаптичної сили і розвивається депресія . У більшості випадків, імовірно, має місце накладання великої кількості регуляторних процесів, і результуючий вплив являтиме собою комбінацію полегшення та депресії, причому зміни синаптичної сили істотно залежатимуть від особливостей часових характеристик синаптичної активації.

Добре відомо, що основним джерелом вільних іонів кальцію, які ініціюють викликане надходженням потенціалу дії вивільнення нейромедіатора з пресинаптичних закінчень, виступає позаклітинне середовище. Однак, показано, що пресинаптичні кальцієві депо, зокрема, депо ендоплазматичного ретикулуму, безсумнівно приймають участь у запуску вивільнення медіатора . Припущення про кальцій-опосередкований контроль регуляторних процесів з постсинаптичного боку також знайшли експериментальне підтвердження у працях різних авторів . Таким чином, питання про існування та внесок різних пре- та постсинаптичних механізмів у регуляцію пластичності синаптичної передачі на тому чи іншому експериментальному об’єкті наразі залишається відкритим.

У більшості робіт з дослідження короткочасної синаптичної пластичності увага акцентується на вивченні лише однієї з її форм – або депресії, або полегшення. Одне з дискусійних питань, пов’язаних з синаптичною пластичністю, торкається здатності нервових клітин змінювати притаманний їм характер пластичності. З огляду на наявність у гіпокампі різних типів ГАМК-ергічних інтернейронів, які є ключовою ланкою у формуванні специфічних для гіпокампу ритмів електричної активності і, за останніми літературними даними, зумовлюють коротко- та довгострокові зміни гальмівної передачі, актуальність має також порівняння різних типів пластичності, спостережуваних на одному й тому самому об’єкті, а також можливих переходів між ними.

З іншого боку, накопичення знань про синаптичну передачу в цілому спонукає до поглибленого вивчення її особливостей на якомога більш елементарному рівні. На сьогодні більшість авторів використовує непрямі методи для дослідження синаптичної пластичності на рівні поодинокої терміналі. Тому особливий інтерес представляє не тільки аналіз кальцій-залежної регуляції короткочасної синаптичної пластичності, а й порівняння її властивостей при одночасній активації різної кількості синаптичних терміналей.

Усе вищезгадане й визначило необхідність дослідження особливостей кальцій-залежної регуляції короткочасної пластичності гальмівних синаптичних зв’язків між культивованими нейронами гіпокампу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках наукових тем Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця “Дослідження молекулярних механізмів – проявів функціонування геному, що зумовлюють специфічність діяльності фізіологічних систем організму в нормі та патології” (Державний реєстраційний номер 0102U002472), “Вивчення ролі Са2+ як внутриклітинного посередника у активності синапсів холінергічних вегетативних нейронів та ГАМК-ергічних нейронів гіпокампу” (Держ. реєстр. № 0102U000830), “Дослідження збуджуючої та гальмівної синаптичної передачі центральних та периферичних нейронів в залежності від функціональних властивостей їх пре- та постсинаптичних мембран” (Держ. реєстр. № 0105U003232) та наукового проекту Державного фонду фундаментальних досліджень “Шляхи регуляції синаптичної передачі через впливи на субмікронну структуру синапсів” (Держ. реєстр. № 05.07/00237).

Мета дослідження. Метою роботи було вивчити короткочасні зміни синаптичної сили ГАМК-ергічної передачі між культивованими нейронами гіпокампу при впливі на кальцій-опосередковані регуляторні механізми на рівні поодинокої терміналі та при інтегральній активації багатьох синаптичних закінчень одного аксона.

Завдання дослідження.

1. Визначити характер впливу, зумовленого активаторами вивільнення кальцію з депо ендоплазматичного ретикулуму, на синаптичну передачу між нейронами гіпокампу в культурі.

2. Проаналізувати короткочасні зміни ефективності синаптичної передачі при парній стимуляції за умов спустошення кальцієвих депо під дією агоністів ріанодинових рецепторів.

3. Дослідити залежність параметрів короткочасної синаптичної пластичності від величини деполяризації поодинокої синаптичної терміналі та зовнішньоклітинної концентрації іонів кальцію.

4. Порівняти властивості синаптичного зв’язку, сформованого поодинокою терміналлю та кількома закінченнями одного аксона при спустошенні кальцієвих депо.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі описана одна з форм короткочасної синаптичної пластичності – зміна ефективності синаптичної передачі при стимуляції парами імпульсів. Показано, що в умовах культивування можуть існувати два типи нейронів, які здатні проявляти суттєво відмінні типи такої пластичності – депресію та полегшення при парній стимуляції.

Показано, що речовини, які ініціюють вивільнення кальцію з депо ендоплазматичного ретикулума, складним чином регулюють синаптичну передачу – за рахунок впливу як на пре-, так і на постсинаптичні механізми. Також виявлено, що поодинокі ГАМК-ергічні синапси здатні не лише варіювати ступінь короткочасної пластичності, а й радикально змінювати її характер в залежності від кількості іонів кальцію, присутніх у зовнішньому середовищі.

Отримані експериментальні дані суттєво доповнюють сучасні уявлення стосовно механізмів, відповідальних за кальцій-залежну регуляцію ефективності гальмівних синаптичних зв’язків у ЦНС.

Теоретичне та практичне значення роботи. Результати дисертаційної роботи представляють передусім фундаментальний інтерес, оскільки отримано нові дані стосовно короткочасної пластичності гальмівної синаптичної передачі та її регуляції за допомогою кальцій-опосередкованих механізмів. Отримані відомості щодо змін ефективності синаптичної передачі на рівні поодинокої терміналі та інтегрального синаптичного з’єднання дозволяють глибше проаналізувати процеси, які відіграють фундаментальну роль в нормальному функціонуванні ЦНС та розвитку нейрональних мереж. Результати роботи дозволяють наблизитись до розуміння феномену пам’яті в цілому, оскільки нейронна мережа гіпокампу вважається місцем локалізації процесів, які регулюють здатність до навчання та формують основи пам’яті.

Особистий внесок автора в отримання наукових результатів. Робота з налагодження установки для електрофізіологічних досліджень та системи локальної аплікації, з отримання та обробки експериментальних даних, з аналізу та узагальнення результатів досліджень була виконана особисто автором. В розробці загальної концепції роботи, її обговоренні та редагуванні брали участь співавтори публікацій.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення дисертаційної роботи було викладено на семінарах Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАНУ (Київ, 2003, 2005 р.) та наступних наукових конференціях: Second Kiev Symposium "Smooth Muscle Physiology and Biophysics" (28-31 жовтня 2003 р., Київ, Україна), Конференція для молодих вчених "Перспективні напрямки наукових досліджень" (17-18 листопада 2003 р., Київ, Україна), "First Ukrainian Congress for Cell Biology" (25-28 квітня 2004 р., Львів, Україна), International Workshop in Cell Physiology "Transport Mechanisms Across Cell Membranes: Channels and Pumps" (13-17 жовтня 2004 р., Санкт-Петербург, Росія).

Публікації. Результати роботи опубліковано в 3 статтях у наукових фахових журналах та тезах 5 доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, методів досліджень, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 269 найменувань. Роботу викладено на 154 сторінках та ілюстровано 27 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

У Вступі обґрунтовано актуальність дослідження короткочасної синаптичної пластичності, внутрішньоклітинних кальцієвих депо і поодиноких гальмівних синапсів, сформульовано мету та задачі дослідження, наведено відомості про наукову новизну, практичне значення та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів дисертації.

Розділ Огляд літератури присвячений висвітленню основних понять мембранної теорії збудження; опису складу, типів, функцій ГАМК-рецепторів; огляду внутрішньоклітинних кальцієвих депо та їх взаємодії з механізмом вивільнення нейротрансмітера; класифікації типів синаптичної пластичності.

Для досягнення поставленої мети у розділі Методика досліджень описано використані матеріали та методи досліджень, а саме:

1. Приготування первинної культури дисоційованих нейронів гіпокампу низької щільності;

2. Методика фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” для реєстрації постсинаптичних струмів;

3. Методика позаклітинної електричної стимуляції аксона пресинаптичного нейрона;

4. Методика локальної позаклітинної суперфузії для аплікації фармакологічних речовин;

5. Методика позаклітинної електричної стимуляції поодинокої терміналі пресинаптичного нейрона;

6. Статистична обробка отриманих результатів за допомогою стандартних методів аналізу.

Приготування культури дисоційованих нейронів гіпокампу. Для отримання культури використовувались новонароджені щури лінії Вістар. Тварин декапітували, головний мозок вміщували в мінімальне середовище Ігла ("Sigma", США) с додаванням 20 мМ буфера HEPES, 25 од/мл натрієвої солі бензилпеніциліну та 25 мкг/мл стрептоміцину сульфату. За допомогою скальпеля гіпокамп відокремлювали від решти відділів мозку і розрізували у поперечному напрямку на частини 1 ? 2 мм завтовшки. Ферментативну обробку здійснювали 0,05%-м розчином трипсину (тип XII-S, "Sigma", США) при кімнатній температурі (23 ? 25С) протягом 5-6 хвилин. Потім тканину промивали чотири рази розчином для культивування, до складу якого входили: мінімальне середовище Ігла, 10% кінської сироватки, 6 мкг/мл інсуліну, 2,3 мг/мл бікарбонатного буферу NaHCO3, 25 од/мл натрієвої солі бензилпеніциліну та 25 мкг/мл стрептоміцину сульфату. Суспензію клітин отримували за допомогою механічної дисоціації набором пастерівських піпеток з діаметрами кінчиків, які послідовно зменшувались. Кількість клітин в одиниці об’єму вихідної суспензії підраховувалась за допомогою камери Горяєва. Шляхом додавання розчину для культивування кількість клітин в одиниці об’єму кінцевої суспензії доводилось до такого рівня, при якому щільність клітин при висіванні становила 30000 од/см2.

Клітини висаджували на чашку Петрі, яка була попередньо оброблена полі-L-орнітином. В скляне кільце діаметром 9 мм, яке обмежувало площину посадки, наливалось 250 мкл суспензії. Чашки Петрі з суспензією вміщувались в інкубатор ("Jouan", Франція) з контрольованим вмістом двоокису вуглецю (5% СО2) в повітряно-газовій суміші, контрольованим температурним режимом (37С) та постійним пасивним зволоженням. На третій день культивування для пригнічення проліферації гліальних клітин в середовище додавали цитозин-в-D-арабіно-фуранозид (5 мкМ). Режим обробки культури цитозин-в-D-арабіно-фуранозидом підбирався таким чином, щоб пригнітити проліферацію гліальних клітин на такій стадії, коли кількість астроцитів була достатньою для утворення гліального моношару. Повторна повна заміна розчину для культивування проводилась через 20 ? 24 години.

Електрофізіологічні експерименти проводились на нейронах, культивованих протягом 14 – 28 днів, при кімнатній температурі (20 ? 23С). На цей час клітини формували необхідну для досліджень кількість синаптичних контактів, також можна було чітко ідентифікувати типи клітин. Для експериментів відбирались не тільки нейрони, які мають виражену пірамідальну форму, а також і мультиполярні. Їх розмір складав приблизно 20 ? 30 мкм.

Електрофізіологічні методи. Для вимірювання трансмембранних струмів, які відводились від культивованих нейронів гіпокампу, було застосовано метод фіксації потенціалу на обмеженій ділянці клітинної мембрани ("patch-clamp"), який було описано Неєром та Сакманом . Підтримуваний потенціал в експериментах становив –75 мВ. Значення природного потенціалу спокою культивованих нейронів гіпокампу, за нашими вимірюваннями, коливались в межах –50 ? –60 мВ.

В експериментах використовувався зовнішньоклітинний розчин наступного складу (мМ): NaCl 140, KCl 3, CaCl2 2, MgCl2 2, Hepes 20, глюкоза 30. Піпеточний розчин містив (мМ): К-глюконат 100, KCl 50, EGTA 10, MgCl2 5, HEPES 20. При дослідженні гальмівних постсинаптичних струмів у зовнішньоклітинний розчин безпосередньо перед початком дослідів додавали блокатори іонотропних глутаматних рецепторів NMDA- та
не-NMDA-типів: відповідно DL-2-аміно-5-фосфоновалеріанову кислоту
(DL-AP5) и 6,7-динітрохіноксалін-2,3-діон (DNQX) у концентрації 20 мкМ кожен. У дослідах, де проводилась стимуляція поодинокої пресинаптичної терміналі, до складу зовнішньоклітинного розчину включався також блокатор натрієвих каналів тетродотоксин (TTX) у концентрації 0,5 мкМ. Заповнені розчином, піпетки мали опір 8-10 МОм. Експериментальна установка була зібрана на базі інвертованого мікроскопу Axiovert 35 (Carl Zeiss, ФРН), який при використанні фазовоконтрасного об’єктиву з масляною імерсією забезпечував 1000-кратне оптичне збільшення. В експериментах використовувався підсилювач електричних сигналів Axopatch-1D (Axon Instruments, США). Сигнали відцифровувались та записувались за допомогою АЦП LabMaster TL-1 та програмного пакету pClamp 6.0 (Axon Instruments, США) з частотою дискретизації 10 кГц. Електричні сигнали, які відводились від нервових клітин, піддавались фільтрації за допомогою апаратного високочастотного фільтру Бесселя з частотою зрізу 2 кГц.

Локальна електрична стимуляція проводилась за допомогою стимулятора з ізольованим виходом ISO-Flex (AMPI, Ізраїль); стимулятор було заземлено на спільний з підсилювачем індиферентний електрод. Стимуляційна мікропіпетка з діаметром отвору близько 2 мкм, яку виготовляли за технологією аналогічно піпеткам для реєстрації струмів, заповнювалась стандартним зовнішньоклітинним сольовим розчином і з’єднувалась з виходом стимулятора. Опір такої піпетки, заповненої розчином, становив 5 ? 7 МОм.

Струми реєстрували при подразненні аксона прямокутними імпульсами напруги негативної полярності тривалістю 300 мкс. Частота стимуляції становила 0,2 Гц. Амплітуда напруги на вході стимуляційної піпетки змінювалась в межах від 30 до 60 В, зміна стимулюючого сигналу на виході була лінійною в межах всіх вхідних напруг. Інтервал між імпульсами в парі (при вивченні короткочасної синаптичної пластичності) становив 150 мс.

Методика локальної стимуляції, яка була застосована в цій роботі, детально описана в роботі Федулової та співавт. . Суть методики полягає у тому, що стимуляція відбувається за рахунок локального зміщення потенціалу у зовнішньоклітиннному розчині в безпосередній близькості від стимулюючої піпетки (Рис. 1). На відміну від методики електричної стимуляції аксону тривалість прямокутного імпульсу напруги в даному випадку повинна становити не менше 3 мс. Це дозволить напряму активувати потенціалкеровані кальцієві канали в пресинаптичній терміналі і запустити каскад реакцій, що призведуть до вивільнення нейромедіатора. |

Рис. 1 Електрична стимуляція поодинокого синаптичного закінчення (мікрофотографія досліду, оптичний мікроскоп, фазовий контраст). До постсинаптичної клітини підведено піпетку для реєстрації струмів. На проксимальному дендриті знаходиться чітко візуально ідентифікований синаптичний бутон (показаний у збільшеному вигляді на вставці).

Аплікація фармакологічних речовин здійснювалась за методикою швидкої локальної суперфузії (Veselovsky et al., 1996).

Аналіз даних. Кінетичні параметри викликаних постсинаптичних струмів визначались за допомогою програмного пакета Clampfit 9.0 (Axon Instruments, США). Результати представлені в тексті як середнє значення ± похибка середнього.

У розділі Результати викладено результати досліджень змін характеристик гальмівних ГАМК-ергічних струмів, зареєстрованих при спустошенні кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулума.

Спочатку було проведено серію дослідів з визначення іонної природи постсинаптичних струмів та їхньої чутливості до специфічного агоністу ГАМКА-рецепторів. З рівняння Нернста рівноважний хлорний потенціал при використанні описаних вище розчинів (концентрація іонів хлору в зовнішньо- та внутрішньоклітинному середовищах становить відповідно 150 та 58 мМ) за кімнатної температури (23 °С = 296 К) буде дорівнювати –24,2 мВ. В експериментальних умовах, використовуючи стимуляцію аксона пресинаптичної клітини, при різних значеннях підтримуваного потенціалу в межах від –100 до 0 мВ було зареєстровано викликані постсинаптичні струми, для яких було побудовано вольт-амперні характеристики. За характеристиками було розраховане усереднене значення потенціалу реверсії, яке виявилось рівним –28,2 ± 4 мВ (n = 3). Також було використано комбінацію методик швидкої локальної суперфузії та іонофоретичної аплікації для безпосереднього прикладання агоніста ГАМК-рецепторів (10 мМ) на сому нейрона.

Усереднене значення потенціалу реверсії становило –24,3 ± 1 мВ (n = 4). Як видно з Рис. 2, потенціали реверсії струмів, викликаних електричною стимуляцією та аплікацією ГАМК (на малюнку, відповідно –28,7 та –24,9 мВ), мають досить близькі значення. |

Рис. 2 Хлорні струми, викликані активацією ГАМК-рецепторів. А – приклад запису ГПСС, викликаних електричною стимуляцією аксона; Б – приклади запису струмів, викликаних іонофоретичною аплікацією
-аміномасляної кислоти (10 мМ). Обидва графіки побудовано в однаковому масштабі. Відведення струмів здійснювались від різних клітин. В – відповідні вольт-амперні характеристики постсинаптичних струмів, побудовані за реєстраціями
А (*) та Б (?).

На основі порівняння отриманих експериментальних даних з теоретично розрахованими було зроблено висновок про те, що розглянуті струми переносяться переважно іонами хлору.

Для ідентифікації рецепторів, які приймають участь у проведенні зареєстрованих струмів, було застосовано локальну аплікацію відомого селективного антагоністу ГАМКА-рецепторів бікукуліну метоброміду в концентрації 10 мкМ. Як видно з Рис. 3, бікукулін майже повністю
(до 8 ± 1% від контрольної) пригнічував амплітуду ГПСС, викликаних стимуляцією аксона. Ефект зменшення амплітуди був достовірним (t-тест Ст’юдента, n = 4) і зворотнім.

Рис. 3 Пригнічення викликаних постсинаптичних струмів блокатором ГАМКА-рецепторів бікукуліном. Приклади реєстрації вГПСС: А – в контролі, Б – при аплікації бікукуліну метоброміду (10 мкМ). В обох випадках усереднення проводилось за 10 послідовними реєстраціями.

Оскільки бікукулін майже повністю та зворотно блокував зареєстровані вГПСС, струми були віднесені до таких, що опосередковуються ГАМКА-рецепторами.

Участь кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму в регуляції гальмівної синаптичної передачі між культивованими нейронами гіпокампу. Після остаточного визначення природи викликаних ПСС було досліджено пластичність синаптичної передачі при стимуляції парами імпульсів.

В якості кількісної міри синаптичної пластичності було обрано т.зв. коефіцієнт парної стимуляції (КПС, paired-pulse ratio, PPR). Цей коефіцієнт обчислюється як відношення амплітуди другої відповіді у парі до першої. В залежності від значення КПС при стимуляції парою імпульсів може спостерігатись депресія (КПС ) або полегшення (КПС ).

Популяція нейронів виявилась суттєво неоднорідною за характером короткочасної синаптичної пластичності при парній стимуляції аксонів. Клітини (точніше, пари клітин) демонстрували як полегшення (КПС , Рис. 4 А), так і депресію при парній стимуляції (КПС Рис. 4 Б). Слід відмітити, що, хоча коефіцієнт парної стимуляції й міг змінюватись під час реєстрації, для кожної окремої клітини його значення було або завжди більшим, або завжди меншим за одиницю (тобто в процесі дослідів ми не спостерігали переходів від депресії до полегшення і навпаки).

Рис. 4 Два характерні типи відповідей на стимуляцію парами імпульсів. Приклади реєстрації пар вГПСС від нейронів, що демонстрували:
А – полегшення (КПС ) та Б – депресію при парній стимуляції (КПС ). В кожному випадку представлено по 20 послідовних реєстрацій викликаних струмів.

З досліджених 25 нейронів в контрольних умовах n = 16 виявляли депресію (в середньому КПС = 0,77 ± 0,02), n = 9 – полегшення при парній стимуляції (в середньому КПС = 1,12 ± 0,04). Окрім зазначеної особливості, відмінностей між двома підгрупами постсинаптичних клітин ідентифікувати не вдалось – за морфологічними, віковими, електрофізіологічними ознаками, а також за всіма характеристиками викликаних постсинаптичних струмів популяція нейронів була однорідною. Спираючись на літературні дані, було зроблено припущення про те, що якісна різниця у характері синаптичної пластичності пов'язана з гетерогенністю популяції пресинаптичних нейронів.

В першій серії експериментів було розглянуто короткочасну пластичність гальмівної синаптичної передачі за умови вичерпання запасів іонів кальцію у ретикулярних депо. За рахунок зовнішньоклітинного прикладання кофеїну чи ріанодину (10 мМ та 50 нМ відповідно) ініціювався кальцій-активований викид кальцію (CICR) з депо ендоплазматичного ретикулуму. Результатом було спустошення кальцієвих депо і, як наслідок, виключення їх з участі у процесі генерації кальцієвого сигналу в пресинаптичний терміналях.

Кофеїн (10 мМ) значно знижував амплітуди постсинаптичних відповідей при парній стимуляції (Рис. 5 А, Б). Зменшення амплітуди вГПСС було характерне для всіх 10 досліджених нейронів (з них у n = 6 випадках було зафіксовано депресію та у n = 4 випадках – полегшення при парній стимуляції). Такі ж самі експерименти (Рис. 5 В, Г) були проведені з додаванням ріанодину (50 нМ) на n = 15 клітинах. Якісно однакові зворотні зміни амплітуд викликаних гальмівних постсинаптичних струмів спостерігали в обох підгрупах нейронів: як для клітин з характерною депресією (n = 10), так і з полегшенням (n = 5) при парній стимуляції.

В таблиці 1 наведені значення усереднених відносних (у порівнянні з контролем - 100%) показників викликаних струмів, зареєстрованих на клітинах з двох підгруп при прикладанні активаторів вивільнення кальцію з внутрішньоклітинних депо. Статистичну достовірність відмінностей вказано як:* P < 0,05, *** P < 0,001 (t-тест Ст’юдента).

Рис. 5 Приклади дії кофеїну та ріанодину на струми, викликані парною стимуляцією. А – контроль; Б – прикладання кофеїну (10 мМ); В – контроль (інша клітина); Г – прикладання ріанодину (50 нМ) В кожному випадку усереднення за 20 послідовними реалізаціями.

Таблиця 1 |

кофеїн (10 мМ) | ріанодин (50 нМ)

депресія | полегшення | депресія | полегшення

Відносна амплітуда першого вГПСС | 24 ± 4% *** | 16 ± 4% *** | 86 ± 6% | 51 ± 8% *

Відносний КПС | 93 ± 6% | 95 ± 5% | 88 ± 3% * | 99 ± 1%

Кількість клітин n | 6 | 4 | 10 | 5

Порівняння коефіцієнтів варіації струмів виявило, що обидві досліджені речовини викликають статистично достовірне (P < 0,05) збільшення значень CV амплітуд постсинаптичних струмів (відношення середньоквадратичного відхилення амплітуд вГПСС до їхнього усередненого значення) – як перших, так і других струмів у парах. Як правило, зміна коефіцієнту варіації амплітуд вГПСС відображає пресинаптичні зміни, отже отримані результати будуть свідчити на користь пресинаптичної локалізації місць регуляції ефективності синаптичної передачі при аплікації активаторів кальцій-активованого вивільнення кальцію з депо.

Як відомо, ріанодин може виступати і в якості активатора кальцій-індукованого виходу кальцію з ретикулярних депо, і навпаки, блокувати ріанодинові рецептори ендоплазматичного ретикулуму, перешкоджаючи вивільненню кальцію в цитоплазму. Перший ефект спостерігається при наномолярних концентраціях речовини (10 ? 100 нМ), другий – при мікромолярних (1 ? 10 мкМ). При цьому процеси АТФ-залежного заповнення кальцієвих депо (робота SERCA) залишаються без змін. Було проведено порівняння ефектів впливу різних концентрацій (“активуючої” та “блокуючої”) ріанодину на пластичність ГАМК-ергічної передачі між нейронами гіпокампу.

Виявилось, що блокування ріанодинових рецепторів ендоплазматичного ретикулуму їхнім агоністом у концентрації 5 мкМ знижує амплітуди викликаних ГПСС та показник співвідношення амплітуд струмів у парах (КПС), а також дещо сповільнює кінетику їхньої інактивації, проте всі ці ефекти не виявились статистично достовірними (t-тест Ст’юдента, P > 0,05 для всіх величин). До того ж, в усіх (n = 6) досліджених парах клітин на початку дослідів було зареєстровано депресію при парній стимуляції (КПС < 1). Тому порівняння впливу на параметри вГПСС ріанодину у “блокуючій” концентрації (n = 6) проводилось лише із впливом “активуючої” концентрації на відповідну групу клітин (n = 10). Результати, отримані після усереднення даних, були зведені в таблицю 2. Для порівняння ефектів було використано нормування всіх параметрів на значення відповідних величин в контрольних умовах (100%). Статистичну достовірність відмінностей відповідних параметрів у порівнянні з контролем вказано як * P < 0,05 (t-тест Ст’юдента).

Таблиця 2 |

Концентрація ріанодину

50 нМ

(“активуюча”) | 5 мкМ

(“блокуюча”)

Амплітуда вГПСС | 86 ± 6% | 95 ± 19%

КПС | 88 ± 3% * | 95 ± 12%

Коефіцієнт варіації амплітуд струмів CV | 174 ± 28% * | 188 ± 68%

Константа часу спаду спаду | 104 ± 3% | 146 ± 19%

Час до піку | 102 ± 2% | 100 ± 3%

Таким чином, було виявлено, що “відключення” кальцієвих депо ЕР за допомогою різних речовин відбивається на ефективності гальмівної синаптичної передачі у вигляді пригнічення останньої, причому ступінь інгібування залежить від типу фармакологічного агента.

Було досліджено також спонтанну гальмівну електричну активність
n = 19 культивованих нейронів. В дослідах було використано такі ж самі концентрації кофеїну та ріанодину (10 мМ та 50 нМ відповідно), що і в попередній серії експериментів. Зареєстровані спонтанні ГПСС в цілому мали ті ж самі кінетичні характеристики, що і викликані ГПСС, і сильно варіювали за амплітудою (7 ? 112 пА).

Кофеїн пригнічував гальмівну спонтанну активність нейронів. Середня частота виникнення спонтанних ГПСС при його аплікації знижувалась до
42 8% від контрольного рівня, середня амплітуда – до 71 6% (n = 7) від контрольного рівня. Спостережуваний ефект був зворотним. Аплікація іншого фармакологічного агенту, ріанодину (50 нМ), викликала подібний ефект. Було зафіксовано незмінність амплітуд спонтанних ГПСС (в середньому
97 7%, n = 12) та зменшення частоти появи ГПСС в середньому до 74 9% у порівнянні з контрольними значеннями.

У наступній серії досліджень з процесу синаптичної передачі було виключено вплив пресинаптичних факторів. Для цього було досліджено постсинаптичні струми, викликані прямою аплікацією агоніста (ГАМК, 100 мкМ). Усереднення даних показало, що і кофеїн (10 мМ, n = 5), і ріанодин (50 нМ, n = 7) достовірно (P < 0,01, t-тест Ст’юдента) зменшують відносні амплітуди ГАМК-викликаних струмів відповідно до 59 ± 3% та до
56 ± 13% у порівнянні з контрольними значеннями. В той самий час відносні значення постійних часу спаду струмів достовірно (P 0,95, t-тест Ст’юдента) не змінювались – їх значення при прикладанні кофеїну та ріанодину складали відповідно 104 ± 3% та 112±28%.

Таким чином, можна констатувати, що пригнічення амплітуд ГПСС, викликаних аплікацією ГАМК, чітко вказує на незаперечну присутність постсинаптичних факторів, які регулюють викликані ГПСС.

Гальмівні постсинаптичні струми, викликані стимуляцією поодинокої терміналі. З огляду на те, що імовірнісний характер вивільнення нейромедіатору не може бути безпосередньо досліджений при одночасній активації великої кількості синаптичних закінчень, було проведено серію експериментів з використанням методики стимуляції поодинокої пресинаптичної терміналі культивованих нейронів гіпокампу щура.

На відміну від методики стимуляції аксону пресинаптичного нейрону, де електрична стимуляція при досягненні порогового значення деполяризації викликає виникнення потенціалу дії за правилом “все або нічого”, зміна амплітуди стимулюючого імпульсу при подразненні поодинокої терміналі дозволяє контролювати ступінь деполяризації мембрани синаптичного закінчення. Такі умови досягались за допомогою градуальної зміни амплітуди стимулу.

Було досліджено пластичність при парній стимуляції синаптичних терміналей n = 5 нейронів, з яких 4 на початку досліду демонстрували депресію при парній стимуляції (в середньому друга відповідь була меншою за першу). Ще на одній клітині спочатку було зареєстровано полегшення при парній стимуляції (КПС = 1,2), яке в процесі досліду змінилось на депресію. Імовірність вивільнення медіатору (відношення кількості зареєстрованих струмів до загальної їхньої кількості) знаходилась в межах 0,24 ? 1,00.

Як і очікувалось, усереднені значення амплітуд вГПСС (51 ± 6 пА, n = 5) були майже на порядок меншими за ті, які було отримано в дослідах зі стимуляцією аксонів, що зумовлено різною кількістю поодиноких синаптичних закінчень, які одночасно активуються при різних методиках стимуляції. На те ж саме вказують і значення коефіцієнтів варіації амплітуд вГПСС (в середньому 0,43 ± 0,03, n = 5), які були значно вищими за аналогічні показники при стимуляції аксонів. Останній факт також відбиває суттєвий внесок пресинаптично локалізованих механізмів, що беруть участь у генерації зареєстрованих струмів.

Виявилось, що при поступовому (і лінійному) збільшенні/зменшенні амплітуди стимулюючої напруги UСТИМ більшість параметрів постсинаптичних струмів змінюється нелінійно. Як видно з Рис. 6, залежності імовірності вивільнення медіатору, а також усередненої амплітуди та коефіцієнту варіації амплітуд вГПСС від сили стимуляції мають вигляд кривих з чітко вираженими екстремумами.

Потрібно відзначити, що для досягнення більшої чистоти експериментів, а саме уникнення таких явищ, як: можливе “звикання” синапсу до стимуляції, поступове зменшення амплітуди постсинаптичної відповіді (т.зв. “rundown”) або руйнування пресинаптичної терміналі, амплітуда стимулу в дослідах могла змінюватись не тільки від меншої до більшої, а й у зворотному напрямку (як, наприклад, в експерименті, що представлений на Рис. 6). Також, після отримання графіку залежності повністю проводилось контрольне повернення до одного з попередніх значень амплітуди стимуляції.

Рис. 6 Залежності параметрів викликаних ГПСС від амплітуди електричного стимулу за нормальної концентрації іонів кальцію у зовнішньоклітинному розчині ([Ca2+]о = 2 мМ). А - імовірність вивільнення медіатора, Б – коефіцієнт варіації амплітуд струмів, В – коефіцієнт парної стимуляції, Г – усереднена амплітуда вГПСС. На малюнках А, Б, Г сірі квадрати відповідають першим струмам у парах; білі кружечки – другим струмам. На малюнку В пунктирна лінія відображає межу між депресією (КПС < 1) та полегшенням при парній стимуляції (КПС > 1).

Як видно з Рис. 6 В, коефіцієнт парної стимуляції не тільки змінювався в процесі поступового збільшення/зменшення амплітуди стимулу нелінійним чином, а й міг бути як меншим, так і більшим за одиницю. Така картина була характерною для трьох з п’яти досліджених клітин. В інших двох експериментах КПС, хоч і змінювався досить істотно, проте був завжди меншим за одиницю – короткочасна синаптична пластичність була представлена виключно депресією при парній стимуляції. Під час дослідів КПС (значення усереднювались за 30 послідовними записами вГПСС при кожній сталій амплітуді UСТИМ) варіював у межах 0,33 ? 1,48 і в середньому дорівнював 0,78 ± 0,04 (n = 5).

Крім зміни електрорушійної сили для іонів Са (при електричній стимуляції поодинокої терміналі) іншим важливим фактором, який здатний впливати на кількість цих іонів всередині синаптичної терміналі, виступає концентрація кальцію у позаклітинному середовищі.

Було досліджено зміни пластичності при парній стимуляції поодиноких синаптичних закінчень за умов підвищеного та зниженого вмісту іонів кальцію в зовнішньоклітинному розчині.

Виявилось, що при підвищенні концентрації кальцію до 5 мМ ефекти, які спостерігались при нормальній [Ca2+]о (2 мМ) якісно залишаються незмінними. Різниця полягає в тому, що крива імовірності Pr = f(UСТИМ) після досягнення максимального значення Pr = 1 не зменшується при подальшому збільшенні напруги на стимуляційній піпетці. Що стосується пластичності при парній стимуляції, в усіх п’яти досліджених клітинах було зареєстровано депресію при парній стимуляції. Ця депресія була значно більш вираженою, ніж при нормальній [Ca2+]о, КПС в середньому складав 0,48 ± 0,03 (n = 5) (Рис. 7 В). Випадків, коли КПС перевищував одиницю (усереднення проводилось за 30 послідовними записами вГПСС при одному сталому значенні UСТИМ) зареєстровано не було.

Рис. 7 Графіки залежностей коефіцієнтів парної стимуляції від амплітуди стимулюючого напруги у розчинах з різними концентраціями іонів кальцію.
А – [Ca2+]o= 0,5 мМ, Б – [Ca2+]o= 2 мМ, В – [Ca2+]o= 5 мМ). В усіх трьох випадках реєстрація проводилась від різних клітин.

В дослідах зі зниженою концентрацією іонів кальцію спостерігалась протилежна (з точки зору синаптичної пластичності) картина. Початково в усіх п’яти клітинах спостерігалось полегшення при парній стимуляції. В ході дослідів при зміні амплітуди стимуляції в двох клітинах (з п’яти) КПС зменшувався до значень, менших за одиницю, проте у середньому він становив 1,17 ± 0,08 (n = 5) (Рис. 7 А). При зниженні [Ca2+]о до 0,5 мМ імовірність вивільнення нейромедіатора значно знижувалась (хоча якісно графік залежності
Pr = f(UСТИМ) залишався незмінним у порівнянні з експериментами при
[Ca2+]о = 2 мМ), що істотно відбивалось на усереднених значеннях амплітуд вГПСС.

Результати, отримані після усереднення за 5-ма клітинами для кожної з трьох різних зовнішньоклітинних концентрацій іонів кальцію, були зведені в таблицю 3. Статистичну достовірність відмінностей параметрів розраховано по відношенню до величин за нормальної концентрації [Ca2+]o (2 мМ) і вказано як: ** P < 0,01, *** P < 0,001 (t-тест Ст’юдента, n = 5).

Таблиця 3 |

[Ca2+]o

Знижена

(0,5 мМ) | Нормальна

(2 мМ) | Підвищена

(5 мМ)

Амплітуда вГПСС, пА | 7,6 ± 1,5 *** | 50,6 ± 6,4 | 50,2 ± 3,8

КПС | 1,17 ± 0,08 *** | 0,78 ± 0,04 | 0,48 ± 0,03 **

Коефіцієнт варіації амплітуд струмів CV | 0,59 ± 0,02 ** | 0,43 ± 0,03 | 0,34 ± 0,04

Імовірність вивільнення Pr | 0,46 ± 0,04 *** | 0,85 ± 0,03 | 0,93 ± 0,02

Константа часу спаду спаду, мс | 36,3 ± 3,0 *** | 58,5 ± 2,6 | 57,0 ± 3,7

Час до піку, мс | 11,4 ± 0,9 | 12,1 ± 0,5 | 11,2 ± 0,4

Як видно, переважна більшість параметрів вГПСС, зареєстрованих в умовах зниженого вмісту кальцію, достовірно відрізнялась від контрольних значень. Натомість, підвищення [Ca2+]o викликало зміну лише однієї з характеристик (КПС). Отже, було зроблено висновок про те, що саме зниження [Ca2+]o є тим фактором, який зумовлює відхилення від нормальних умов життєдіяльності нейронів гіпокампу в умовах культивування.

Для визначення впливу кальцієвих депо на пластичність гальмівної синаптичної передачі було застосовано методику, аналогічну до такої, яка використовувалась в серії експериментів із стимуляцією аксонів культивованих нейронів гіпокампу. Спустошення депо ендоплазматичного ретикулуму викликалось за допомогою локальної аплікації агоніста ріанодинових рецепторів кофеїну (10 мМ) за умов нормального вмісту іонів кальцію (2 мМ) в зовнішньоклітинному розчині. Зона аплікації охоплювала сому та проксимальні дендрити постсинаптичного нейрона, на яких і знаходились пресинаптичні закінчення, обрані для електричної стимуляції.

Як і очікувалось, кофеїн суттєво (і зворотно) зменшував амплітуду викликаних ГАМК-ергічних струмів. В цій серії експериментів було досліджено n = 8 клітин. Після цього отримані результати (нормовані до контрольних значень) було порівняно з даними, які характеризували короткочасну пластичність викликаних ГПСС при стимуляції аксонів (Таблиця 4). Оскільки при подразненні поодиноких терміналей спостерігалась лише депресія при парній стимуляції, порівняння проводилось з відповідною групою клітин, досліджених раніше. Виявилось, що основна відмінність полягає у зміні коефіцієнтів варіації постсинаптичних струмів, яку викликає аплікація кофеїну – в той час, як при стимуляції аксонів спустошення кальцієвих депо супроводжувалось збільшенням CV амплітуд викликаних струмів на 109 ± 60% (n = 6), при подразненні поодинокої синаптичної терміналі спостерігалось зменшення CV на 14 ± 4% (n = 8). При порівнянні інших параметрів з контрольними значеннями достовірних відмінностей у впливах 10 мМ кофеїну на різних рівнях виявлено не було (t-тест Ст’юдента).

Таблиця 4 |

При стимуляції аксонів | При стимуляції поодиноких терміналей

Амплітуда вГПСС | 24 ± 4% *** | 40 ± 9% **

КПС | 93 ± 6% | 101 ± 14%

Коефіцієнт варіації амплітуд струмів CV | 209 ± 60% *** | 86 ± 4%

Константа часу спаду спаду | 87 ± 8% | 81 ± 4%

Час до піку | 123 ± 11% *** | 124 ± 7% ***

Кількість клітин n | 6 | 8

Підсумовуючи результати, можна констатувати, що, імовірно, у регуляції гальмівної синаптичної передачі приймають участь не тільки ті кальцієві депо ендоплазматичного ретикулуму, що зосереджені безпосередньо у пресинаптичному закінченні, а й такі, що розташовані в постсинаптичних клітинах.

Обговорення. В багатьох роботах часто спостерігають (і описують) лише один з видів короткочасної пластичності – або депресію при парній стимуляції , або (набагато рідше) полегшення . Найцікавішою особливістю проведених нами експериментів є те, що в них було зафіксовано як перший, так і другий випадки. При цьому клітини, які демонстрували депресію, зустрічались в середньому у 2 рази частіше (16 проти 9 випадків), ніж ті, які демонстрували полегшення. Потрібно відзначити, що і під час прикладання фармакологічних агентів, і після їхнього відмивання характер синаптичної пластичності при парній стимуляції для кожної окремої клітини залишався незмінним (тобто депресія не переходила у полегшення і навпаки). Нейрони для дослідів відбирались неупереджено; між групами клітин, які відрізнялись за характером короткочасної синаптичної пластичності, виявити додаткові відмінності за морфологічними чи віковими ознаками, використовуючи математичні критерії, не вдалося.

За даними літератури відомо, що багато властивостей (зокрема, параметри пластичності при парній стимуляції) викликаних збуджуючих постсинаптичних струмів істотно залежать від відділу мозку, з якого походить пресинаптична клітина . Більш того - навіть нейрони гіпокампу, розташовані у різних його зонах, можуть проявляти різні форми коротко- та довгострокової синаптичної пластичності . У гіпокампі за морфологічними та фізіологічними ознаками, внутрішньоклітинними компонентами, типовими зразками інервації було класифіковано багато типів інтернейронів (які й утворюють ГАМК-ергічні синапси). Відомо також, що пірамідні