МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ Здоров’я України

Національний медичний університет імені О.О. Богомольця

УДК: 615.218.3 : 616-097

КУЦЕНКО Неля Леонідівна

Вплив МОНТЕЛУКАСТУ ТА ДЕЗЛОРАТАДИНУ

НА ІМУННУ ВІДПОВІДЬ НА АЛО- ТА ГЕТЕРОАНТИГЕНИ

14.03.08 – імунологія та алергологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Дисертація виконана в Центральній науково-дослідній лабораторії Української медичної стоматологічної академії Міністерства охорони здоров’я України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор

Кайдашев Ігор Петрович,

Українська медична стоматологічна академія,

завідувач Центральної науково-дослідної лабораторії,

завідувач кафедри внутрішніх хвороб з доглядом за хворими.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор,

Бережна Нінель Михайлівна;

Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології

ім. Р.Є. Кавецького НАН України,

завідуюча лабораторією імунології та алергології;

доктор медичних наук, професор

Чумак Анатолій Андрійович;

Науковий центр радіаційної медицини АМН України,

завідувач лабораторії молекулярної біології відділу клінічної імунології.

Провідна установа:

Інститут фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г. Яновського АМН України, м. Київ.

Захист відбудеться 04.05.2006 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.003.02 при Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця за адресою: 01023, м. Київ, вул. Шовковична 39/1, Центральна міська клінічна лікарня, корпус 2, аудиторія кафедри шкірних та венеричних хвороб.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного медичного університету імені О. О. Богомольця за адресою 03057, м. Київ, вул. Зоологічна 3.

Автореферат розісланий 02.04.2006 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02

Доктор медичних наук, професор Свирид С.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми визначається необхідністю з’ясування ролі лейкотрієнів (ЛТ) та гістаміну в реалізації імунної відповіді на антигени різної природи. Багаточисленними дослідженнями показано та доведено провідну роль метаболітів арахідонової кислоти ЛТ та біогенного аміну гістаміну в патофізіології запалення та алергічних захворювань (Kay A.B., 2001; Macglashan D., 2003). Встановлено, що ЛТ та гістамін, окрім класичних ефектів, які реалізуються на рівні органу, прямо або опосередковано впливають на функціональний стан клітин імунної відповіді, що обумовлює імуномодулюючі властивості цих медіаторів (Bachert C., 2002; Schneider E. et al., 2002; Kanaoka Y. et al., 2004). Така фізіологічна роль ЛТ та гістаміну обумовлена диференційованою експресією специфічних підтипів рецепторів на поверхні клітин, що беруть участь в різних формах імунної відповіді (Sarau H. et al., 1999; Church M.K., 2004). Незважаючи на значну кількість досліджень присвячених вивченню ЛТ та гістаміну, залишаються не зрозумілими питання про регуляцію вмісту цих медіаторів та їх регуляторний вплив при атопічній бронхіальній астмі (АБА). Одним із основних шляхів вивчення ролі ЛТ та гістаміну є використання їх селективних блокаторів, а саме монтелукасту та дезлоратадину.

У дослідженнях вищезгаданих препаратів традиційно увага дослідників направляється на вивчення їх основної дії, що визначається здатністю зв’язуватись з ЛТ та гістаміновими (Н) рецепторами і тим самим попереджувати фармакологічні ефекти ЛT та гістаміну.

На цей час отримані поодинокі дані про імунорегуляторні ефекти антилейкотрієнів та антигістамінних препаратів. Відмічено, що антагоністи ЛT рецепторів володіють протизапальною дією при гострому пошкодженні аспірином слизової оболонки шлунка (зменшення судинної проникливості та гранулоцитарної інфільтрації зони запалення) (Марусова И.Б. и др., 2002).

Прийом дезлоратадину хворими з атопією призводив до зменшення у них активності Т хелперів 2 типу та секреції інтерлейкіну (IЛ)-3, IЛ-6, фактору некрозу пухлин-?, гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактору активованими тучними клітинами та IЛ-8 базофілами, ендотеліальними клітинами, зниження експресії Р-селектину і молекул міжклітинної адгезії (Бережная Н.М., 2000; Walsh G.M., 2000).

Крім того, аналіз причин неузгодженості данних щодо дії гістаміну вказує на те, що використання структурно та фармакологічно ідентичних антагоністів Н рецепторів може виявляти різний ефект на функції клітин в одній і тій же дозі (Бережна Н.М., 1998; Church M.K., 2004).

Важливим було провести систематизовані дослідження монтелукасту та дезлоратадину та отримати результати їх впливу на різні типи імунної відповіді та на регуляцію функціональної активності імунокомпетентних клітин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є самостійним фрагментом НДР Української медичної стоматологічної академії (УМСА) “Вплив антилейкотрієнів та антигістамінних препаратів 2-го покоління на процеси апоптозу мононуклеарів периферійної крові у хворих з атопічною бронхіальною астмою”, № ДР 0103U004046, а також фрагментом НДР “Регуляція процесів апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічних захворювань”, № ДР 0102U001583.

Мета і задачі дослідження. Вивчити вплив монтелукасту та дезлоратадину на первинну та вторинну відповідь на ало- та гетероантигени в експерименті та при алергічній реакції, обумовленій алергенами домашнього пилу, у хворих АБА для поглиблення знань про регуляцію функціонального стану імунної відповіді.

Відповідно до мети роботи були визначені такі задачі:

1.

2.

3.

4.

Об’єкт дослідження – регуляція функціональної активності імунокомпетентних клітин.

Предмет дослідження – вплив монтелукасту та дезлоратадину на імунну відповідь на ало- та гетероантигени і на процеси апоптозу імунокомпетентних клітин.

Методи дослідження. Дозозалежний вплив монтелукасту та дезлоратадину на ало- та гетероантигени досліджували у тварин після імунізації алоспленоцитами та еритроцитами барана, відповідно. При цьому первинну та вторинну імунну відповідь на алоантигени визначали за розвитком алогенної реакції, а на гетероантигени за змінами титру гемолізинів та гемаглютинінів у імунізованих тварин. Дію дезлоратадину на процеси апоптозу Трег клітин у відповідь на алергени домашнього пилу, збагаченого дерматофагоїдними кліщами, досліджували при алергічному запаленні у хворих АБА сенсибілізованих цими алергенами. Процеси апоптозу визначали використовуючи метод проточної лазерної цитофлюориметрії.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше отримані дані впливу монтелукасту та дезлоратадину на імунну відповідь індуковану алоантигенами (алоспленоцитами), гетероантигенами (еритроцитами барана) та алергенами домашнього пилу. Встановлено, що під впливом монтелукасту та дезлоратадину спостерігається підсилення локальної алогенної реакції після імунізації алоспленоцитами та збільшення титру антиеритроцитарних антитіл (гемолізинів та гемаглютинінів) після імунізації гетероантигенами у експериментальних тварин, що свідчить про стимуляцію імунної відповіді на ало- та гетероантигени в експерименті. Крім того, індукція імунної відповіді обумовленої алоспленоцитами та еритроцитами барана в умовах блокади Н1 та цистеінілЛТ1 рецепторів (цистЛТР1), використовуючи їх селективні блокатори, дає можливість стверджувати про участь цих рецепторів в регуляції імунної відповіді на ало- та гетероантигени.

Вперше встановлено, що CD4+CD25+ Трег клітини, які відіграють одну з основних ролей в патогенезі алергічного запалення, у хворих АБА сенсибілізованих алергенами домашнього пилу, збагаченого дерматофагоїдними кліщами, в присутності цих алергенів відповідають стимуляцією апоптозу та зменшенням експресії Трег клітин в суспензії лімфоцитів, що свідчить про алергенспецифічний апоптоз Трег клітин з фенотипом CD4+CD25+. Отримані нові результати про дію дезлоратадину щодо запобігання розвитку алергенспецифічному апоптозу CD4+CD25+ T лімфоцитів під час імунної відповіді, індукованої алергенами домашнього пилу, збагаченого дерматофагоїдними кліщами, в умовах алергічного запалення. Крім того, регулюючі ефекти дезлоратадину на процеси апоптозу Трег клітин вказують на залучення Н1 та/або Н2 рецепторів у регуляцію цього процесу. Вперше продемонстровано, що гістамін та селективний блокатор Н1 рецепторів модулює процеси апоптозу CD4+CD25+ T лімфоцитів донорів in vitro, що супроводжується зміною кількості Т клітин з фенотипом CD4+CD25+ та їх апоптотичної активності.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати про підсилення імунної відповіді на ало- та гетероантигени під впливом антагоністу цистЛТР1 рецепторів монтелукасту, селективного блокатора Н1 рецепторів дезлоратадину в експерименті та про підвищення супресивних властивостей Трег клітин під впливом дезлоратадину в умовах імунної відповіді, індукованої алергенами домашнього пилу, при алергічному запаленні свідчить про імуномодулюючі властивості досліджуваних препаратів та залежність їх ефектів від умов дії. Результати дозволяють прогнозувати та використовувати додаткові властивості дезлоратадину та монтелукасту з метою патогенетично обгрунтованої терапії захворювань в алергології та клінічній імунології. Зростання титру специфічних антитіл, що належать до IgM та IgG, під впливом монтелукасту та дезлоратадину, може бути використано для підвищення ефективності специфічної імунотерапії у хворих з алергією (підвищення рівня алергенспецифічних блокуючих антитіл класу IgG). На основі результатів роботи, використовуючи дезлоратадин для підсилення гуморальної імунної відповіді, розроблено спосіб корекції імунної відповіді. Підсилення імунної відповіді на алоантигени та сингенні алоантигени під впливом досліджуваних препаратів є протипоказанням прийому монтелукасту та дезлоратадину в трансплантації.

Результати проведених досліджень виявили, що прийом дезлоратадину в дозі 5мг протягом 10 днів пригнічує розвиток алергенспецифічного апоптозу CD4+CD25+ Трег клітин хворих АБА сенсибілізованих алергенами домашнього пилу, що свідчить про залучення Н1 та/або Н2 рецепторів в даний процес і може бути представлений як один із способів корекції алергенспецифічного апоптозу CD4+CD25+ T лімфоцитів. Зниження апоптозу Tрег клітин під впливом дезлоратадину потребує необхідності урахування під час його прийому, а також, можливо, застосовувати як додатковий засіб для досягнення імунологічної толерантності, наприклад, під час проведення специфічної імунотерапії.

Матеріали дисертації використовують в учбовому процесі на кафедрах мікробіології, вірусології та імунології; експериментальної та клінічної фармакології з клінічною імунологією та алергологією; патологічної фізіології УМСА.

Особистий внесок здобувача. Автором проведено патентно-інформаційний пошук, підібрано літературу, виконані методики по дослідженню імунної відповіді у тварин та процесів апоптозу лімфоцитів на проточному цитофлюориметрі, викладено результати та сформовано основні положення й висновки у відповідності до мети і задач дослідження. Автор вдячний професору L.M. DuBuske (Дослідницький інститут імунології Нової Англії, Гарднер, США) за фінансову підтримку виконання окремих фрагментів дослідження.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації представлені на V З’їзді імунологів та алергологів СНД, м.Санкт-Петербург, (2003); 58 науково-практичній конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету імені О.О. Богомольця з міжнародною участю „Актуальні проблеми сучасної медицини”, м.Київ, (2003); школі молодих вчених „Сучасні аспекти клінічної імунології та алергології”, м.Полтава, (2003); І Всеукраїнській науково-практичній конференції „Імунотропні препарати в клінічній практиці”, м.Київ, (2004); ХХІІІ Конгресі Європейської Академії Алергології та Клінічної Імунології, м.Амстердам, Нідерланди, (2004); щорічному З’їзді Американського Коледжу Алергології, Астми та Імунології, м.Бостон, США, (2004) та м.Анахейм, США (2005); на 12-у міжнародному конгресі імунології і ІV щорічній конференції федерації товариства клінічних імунологів, м.Монреаль, Канада, (2004); VIІ Українській науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації, м.Київ, (2005), на 61-у щорічному З’їзді Американської Академії Алергології, Астми та Імунології, м.Сан Антоніо, США, (2005); ХХІV Конгресі Європейської Академії Алергології та Клінічної Імунології, м.Мюнхен, Німеччина, (2005); на засіданні Апробаційної ради №1 УМСА і на засіданні апробаційної Вченої Ради „Теоретична медицина” Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця.

За матеріалами дисертації опубліковано 19 наукових робіт, серед них 1 стаття в міжнародному журналі та 6 статтей у журналах, рекомендованих ВАК України, 11 тез доповідей, 1 деклараційний патент на винахід.

Структура і обсяг дисертації. Матеріали роботи викладені на 144 сторінках комп’ютерного тексту, містить 17 таблиць, 12 рисунків. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали та методи”, 4 розділів власних досліджень, 221 літературних джерел, з яких 49 є вітчизняними і 172 – зарубіжними.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Групування дослідів. Дослідження імунної відповіді на ало- та гетероантигени були проведені на 204 щурах лінії Вістар віком 4-5 місяців, 93 лабораторних мишах лінії СВА віком 6-8 тижнів. Лабораторних тварин утримували в умовах віварію УМСА на типовому раціоні годування (раціон 3.2 згідно наказу 1179 про нормативи годування лабораторних тварин в закладах охорони здоров’я). Всі маніпуляції з тваринами проводились за дозволом біоетичної комісії УМСА.

Первинну та вторинну імунну відповідь на алоантигени досліджували в локальній реакції регіональних лімфатичних вузлів у щурів після імунізації алоантигенами (алоспленоцитами) та сингенними алоантигенами (сингенними алоспленоцитами). Первинну та вторинну імунну відповідь на гетероантигени досліджували у мишей за стандартною методикою визначення специфічних антитіл до еритроцитів барана, а саме титр гемаглютинінів та гемолізинів імунізованих тварин.

Згідно методичного підходу, тварини дослідних груп отримували фармакологічні препарати: блокатор цистЛТР1 – монтелукаст натрію (“Сингуляр”, MSD, США) в дозі 0,015мг, 0,15 мг та 1,5 мг на кг маси тварини або селективний антагоніст Н1 рецепторів – дезлоратадин (“Еріус”, Шерінг-Плау, США) в дозі 0,007 мг, 0,07 мг та 0,7 мг на кг маси тварини. Препарати вводили перорально з інтервалом 24 години протягом всього періоду імунізації.

Для вивчення in vivo впливу дезлоратадину на алергенспецифічний апоптоз CD4+CD25+ Трег клітин хворих з АБА, сенсибілізованих алергенами дерматофагоїдних кліщів, під спостереженням знаходилось 6 пацієнтів віком 20-40 років на АБА легкої та середньої ступені важкості в період ремісії, сенсибілізованих алергенами домашнього пилу, які знаходились на лікуванні в пульмонологічному відділенні 1-ої Міської клінічної лікарні та склали основну групу. Відповідно, 6 практично здорових осіб складали групу порівняння. Вибірки пацієнтів були врівноважені за віком та статтю. Забір крові у пацієнтів та донорів проводили на основі заключення комісії по біоетиці УМСА та погодження пацієнтів.

Пацієнти основної групи отримували антигістамінний препарат 2-покоління – дезлоратадин, активний метаболіт лоратадину (“Еріус”, Шерінг-Плау, США) перорально один раз на добу у дозі 5 мг протягом 10 днів (Коростовцев Д.С., 2002; Емельянов А.В., 2003).

Для виявлення змін рівня апоптозу постановку методик проводили, використовуючи суспензію лімфоцитів, безпосередньо після виділення клітин з периферійної крові, після неспецифічної та специфічної стимуляції паралельно з контрольними пробами. Неспецифічну стимуляцію проводили використовуючи 4-форбол-12-миристат-13-ацетату (ФМА) (Sigma, США) в концентрації 8,1 х 10-9М протягом 3 годин (Fontenot A.P. et al., 2003; Nishimoto Y. Et al., 1997). Під час специфічної стимуляції до інкубаційного середовища додавали алергени домашнього пилу, збагачених дерматофагоїдними кліщами (Dermatofagoides farine) (виробництва МП “Імунолог”, м. Вінниця, Україна) в кінцевій концентрації 10 мкг/мл; алергени попередньо діалізували для видалення консервантів та інкубували протягом 96 годин (Onishi J. et al., 1997).

Для уточнення ролі гістаміну та селективного блокатору Н1 рецепторів в регуляції функціональної активності імунокомпетентних клітин проводили дослідження впливу даного медіатору та дезлоратадину на процеси апоптозу CD4+CD25+ Трег клітин периферійної крові донорів in vitro. Для проведення експерименту окремо добиралися 6 умовно здорових осіб. Виділені лімфоцити периферійної крові інкубували в поживному середовищі з додаванням гістаміну (Sigma, США) в концентраціях 0,01, 0,1 та 1 ?M (Petraroli A. et al, 2002) або дезлоратадину (“Еріус”, Шерінг-Плау, США) в концентраціях 0,1, 1 та 10 ?M (Huger M., 2002; Biller H. et al., 2002). Визначали загальну кількість та рівень апоптозу Трег клітин безпосередньо після виділення клітин, через 24 та 72 години інкубації.

Імунологічні дослідження проводилися на базі Центральної науково-дослідної лабораторії УМСА.

Методи досліджень.

Для дослідження імунної відповіді на алоантигени імунізацію щурів проводили шляхом одноразового введення в пучку однієї задньої кінцівки зависі алоспленоцитів або сингенних спленоцитів в дозі 5?106 клітин в 0,1 мл стерильного фосфатно-сольового буферу (ФСБ). Аналогічно проводили реімунізацію з інтервалом в 30 днів для дослідження вторинної імунної відповіді. Первинну імунну відповідь досліджували на 7 добу після імунізації та вторинну імунну відповідь на 5 добу після реімунізації в локальній реакції регіональних лімфатичних вузлів, яка дозволяла за розмірами останніх судити про активність реакції відторгнення алогенного трансплантату та реакції трансплантат проти хазяїна (РТПХ). Суть методу полягала у визначенні ваги (з точністю до 0,05 мг) підколінних лімфатичних вузлів, які дренують ділянку введення клітин, та симетрично їм розташованих інтактних лімфовузлів. Активність реакції визначали за різницею ваги дослідного та ваги інтактного лімфовузла (Twist V., et al., 1973; Поверенный А.М. и др., 2002).

Для дослідження імунної відповіді на гетероантигени мишей імунізували внутрішньочеревно суспензією еритроцитів барана у 0,15М розчині хлориду натрію в дозі 2?108 клітин на тварину (Пастер Е.У. и др., 1989). Відповідно, для дослідження первинної та вторинної імунної відповіді на гетероантигени кров експериментальних тварин отримували через 6 днів після первинної імунізації та на 5 добу після реімунізації (з інтервалом 30 днів) (Coons A.H. et al., 1995) та визначали титр гемолізинів та гемаглютинінів.

Фенотип лімфоцитів аналізували за допомогою визначення експресії маркерів на поверхні клітин, використовуючи одночасно декілька моноклональних антитіл проти поверхневих антигенів (дво-, трьох- та чотирьохкольорове забарвлення), які мічені різними флюорисцентними барвниками. При цьому були використані моноклональні антитіла проти CD3 мічені FITC, СD4 - PE-TR, СD8 – FITC, CD19 – RPE, CD25 – RPE (виробництва Caltag, США).

Для виконання поставленої задачі – дослідження процесів апоптозу – були використані методики, що характеризують процеси апоптозу у відповідності до стадій його розвитку (Кайдашев И.П., 1998). Так, вивчали експресію молекул CD95 на поверхні клітин та внутрішньоклітинного білка Bcl-2 для визначення чутливості лімфоцитів до апоптозу. Розвиток апоптозу визначали за допомогою аннексіну V (AnV), який зв’язується з фосфатидилсерином, що з’являється на поверхні клітин, залучених в апоптоз, а також за допомогою флюорисцентного барвника пропідіуму йодиду (РІ) (Koopman G. et al., 1994).

Рівень апоптозу та фенотип лімфоцитів визначали, аналізуючи проби на проточному цитофлюориметрі EPIX LX-MCL (Beckman Coulter, США), використовуючи програму System IITM software. Для збудження флюорисценції використовували аргоновий лазер з довжиною хвилі 488 нм. Додатково до флюорисцентних параметрів проводили реєстрацію прямого та бокового світорозсіювання клітин, що дозволяло виключати з аналізу конгломерати клітин та їх уламки. Підрахунок клітин проводили протягом 300 секунд, при цьому кількість проаналізованих клітин в пробі складала від 15 до 20 тисяч.

Цифровий матеріал обробляли за допомогою параметричних та непараметричних методів статистичного аналізу програми “STATISTICA”, які дозволяють безпосередньо оцінювати генеральну сукупність вибірок, їх загальні властивості і перевіряти гіпотези щодо них. При цьому обчислення середньої арифметичної (М), середньоквадратичного відхилення (m), вірогідності отриманих результатів проводили за допомогою t-критеріїв Стьюдента. Перевагу в статистичному підході надавали непараметричним методам, грунтуючись на їх потужності при невеликих обсягах вибірок, можливості застосування для дослідження півкількістних і порядкових значень, а також застосування при порівнянні вибірок, уникаючи обчислення характеру розподілу величин (Пилипенко М.І. та ін., 2000; Румшинський Л.З., 1971).

Результати досліджень та їх обговорення

Під час проведених експериментальних досліджень впливу монтелукасту на імунну відповідь на алоантигени відмічено, що імунізація тварин алоантигенами та одночасний прийом монтелукасту призводить до стимуляції алогенної реакції в локальному варіанті в результаті збільшення маси підколінних лімфатичних вузлів лапи, в яку було введено суспензію алоспленоцитів або сингенних алоспленоцитів.

Різниця мас регіональних лімфатичних вузлів за умов первинної та вторинної імунної відповіді обумовленої алоспленоцитами значно збільшувалася під впливом препарату в середній терапевтичній та максимальній дозі. Імунізація сингенними алоспленоцитами на фоні прийому монтелукасту призводить до збільшення майже в 2 рази різниці мас підколінних лімфатичних вузлів в усіх експериментальних дозах препарату. При цьому, як повідомлялось, чисельність клітин у регіональному лімфатичному вузлі після імунізації тварин суспензією лімфоцитів може збільшуватися не тільки за рахунок проліферації введених клітин, але і в результаті залучення в зону реакції власних клітин реципієнта (Поверенный А.М., 2002).

Отримані результати вказують на індукцію реакції відторгнення алогенного трансплантату та реакції трансплантат проти хазяїна (РТПХ) в локальному варіанті при первинній та вторинній імунній відповіді після імунізації алоспленоцитами та сингенними алоспленоцитами, що свідчить про стимулюючу дію монтелукасту в реалізації імунної відповіді обумовленої алоантигенами.

Під час вивчення впливу монтелукасту на імунну відповідь на гетероантигени відмічена стимуляція синтезу антиеритроцитарних антитіл після імунізації мишей еритроцитами барана. При цьому стимулюючий ефект антагоністу цистЛТР1 на синтез антитіл виражений більше за умов розвитку вторинної імунної відповіді на гетероантигени, що супроводжується індукцією синтезу гемолізинів та в дозозалежній мірі гемаглютинінів (табл.1).

Таблиця 1

Вплив монтелукасту на розвиток вторинної імунної відповіді на гетероантигени

Титр антитіл,

log2 | Імунізація еритроцитами барана

(n=6) | Імунізація еритроцитами барана + монтелукаст в дозі 0,015 мг/кг

(n=5) | Імунізація еритроцитами барана + монтелукаст в дозі 0,15 мг/кг (n=5) | Імунізація еритроцитами барана + монтелукаст в дозі 1,5 мг/кг (n=6)

Титр гемолізинів | 8,5±1,38 | 10,67±0,52* | 8,83±1,47 | 11,5±0,84*

Титр гемаглютинінів | 10,5±1,05 | 12,17±0,41* | 12,33±1,03* | 13,0±0,63*

Примітка: * - вірогідність відмін показників від тварин імунізованих виключно еритроцитами барана (р<0,05).

Отримана нами дозозалежна індукція алогенної реакції та стимуляція синтезу гемолізинів, гемаглютинінів під впливом монтелукасту підтверджує, що імунна відповідь на алоантигени та гетероантигени є залежним процесом від дії ЛТ. Показано, що блокатори як циклооксигенази, так і ліпоксигенази дозозалежно стимулюють гуморальну імунну відповідь, що позначається на одній з кінцевих ланок – формуванні антитілоутворюючих клітин у селезінці, але вплив блокатора ліпоксигеназ виражений значно більше (Мартинової Т.В. та співавт., 2003). Така ж закономірність була виявлена і в ефекті блокаторів на утворення антигеніндукованих клітин – супресорів у селезінці та їх функціональної активності (пригнічення супресії або навіть відміна здатності досліджуваних клітин бути супресорами). Звичайно, взявши до уваги багатоланцюговість імунної відповіді, припущено аналогічний вплив блокаторів ЛТ і на інші ланки імунної відповіді (Калинкович А.Г., 1989; Мартинової Т.В. та співавт., 2003). Оскільки супресорні клітини є суттєвим фактором регуляції імунної відповіді, зміни їх кількості і активності можуть відігравати вирішальну роль у клітинній ланці імунної відповіді, що може бути одним з механізмів отриманої нами індукції алогенної реакції в локальному варіанті під впливом монтелукасту.

Є дані, що блокада одного підтипу рецепторів може призводити до дії ЛТ через інші, експресія яких може різнитись в межах одного органу або навіть однієї клітини. Крім того, цистЛТР1 та цистЛТР2 (не виключена можливість існування іншого підтипу рецептора) реалізують сигнали більш ніж через один клас G білків, активуючи кальційзалежну та кальційнезалежну протеінкіназу С. Ці властивості є залежними від типу клітини та рівня експресії рецепторів (Diamant Z. et al., 1999).

У результаті наступних експериментальних досліджень виявлено, що у тварин, імунізованих алоантигенами на фоні прийому дезлоратадину, збільшується маса та різниця мас регіональних лімфатичних вузлів. При цьому імунізація тварин як алоспленоцитами, так і сингенними алоспленоцитами призводить до індукції реакції відторгнення алогенного трансплантату та РТПХ в локальному варіанті (максимальне збільшення різниці регіональних лімфатичних вузлів за умов розвитку первинної імунної відповіді, майже в 3 рази під впливом препарату в дозі 0,07мг/кг, а за умов вторинної імунної відповіді – в 2 рази в максимальній дозі дезлоратадину), що свідчить про стимулюючий вплив препарату на імунну відповідь на алоантигени.

З’ясовано, що введення дезлоратадину тваринам наступної експериментальної моделі призводило до вірогідного збільшення титру антиеритроцитарних антитіл, що обумовлює залучення Н1 рецепторів до регуляції гуморальної ланки імунної відповіді. Крім того, за умов розвитку первинної імунної відповіді відмічена індукція гемолізинів, а під час вторинної – і гемаглютинінів, і гемолізинів, що вказує на стимулюючий вплив дезлоратадину на синтез специфічних антитіл, які належать переважно до класу IgG (табл.2).

Таблиця 2

Вплив дезлоратадину на розвиток вторинної імунної відповіді на гетероантигени

Титр антитіл,

log2 | Імунізація еритроцитами барана

(n=6) | Імунізація еритроцитами барана + дезлоратадин в дозі 0,007 мг/кг

(n=5) | Імунізація еритроцитами барана + дезлоратадин в дозі 0,07 мг/кг (n=5) | Імунізація еритроцитами барана + дезлоратадин в дозі 0,7 мг/кг (n=6)

Титр гемолізинів | 8,5±1,38 | 9,5±1,52 | 10,67±1,03* | 10,0±0,89*

Титр гемаглютинінів | 10,5±1,05 | 12,67±1,97* | 12,17±0,41* | 12,67±0,82*

Примітка: * - вірогідність відмін показників від тварин імунізованих виключно еритроцитами барана (р<0,05).

Доведено, що різновид функцій Тх1 та Тх2 клітин генетично не детермінований процес, а є залежним від сигналів, які отримують клітини під час стимуляції. З’ясовано, що ендогенний метаболіт гістамін здатний впливати на співвідношення Тх1/Тх2 клітин та синтез імуноглобулінів (Banu Y. et al., 1999; Elliot K.A. et al., 2001; Jutel M., 2001). Важливим є той факт, що взаємодія між медіатором і цитокінами спільна до того часу, поки деякі цитокіни не вплинуть на синтез, вивільнення гістаміну та експресію Н рецепторів (Gutzmer R., 2002). Незважаючи на численні дослідження, ефекти гістаміну на співвідношення Тх1/Тх2 клітин суперечливі. Є дані про вплив гістаміну на дендритні клітини, що спонукає до диференціювання Т0 клітин в бік Тх2. Інші результати також свідчать про стимулюючі властивості гістаміну на синтез цитокінів Тх2 клітин (Osna N., 2001). Крім того, результати нещодавно проведених досліджень повідомляють про залежність ефекторних функцій гістаміну від експресії підтипу Н рецепторів на поверхні клітин (Banu Y. et al., 1999; Jutel M., 2001). Відмічено, що на поверхні Тх1 та Тх2 клітин різниться експресія підтипів Н рецепторів, що обумовлює специфічність відповіді цих клітин під впливом гістаміну (Jutel M., 2001). При цьому Тх1 переважно експресують Н1 рецептори, в той час як Н2 рецептори регулюють Тх2 клітини. Гістамін стимулює імунну відповідь за Тх1 типом шляхом взаємодії з Н1 рецепторами, а зв’язування медіатору з Н2 рецепторами призводить до пригнічення імунної відповіді як за Тх1, так і за Тх2 типом, що обумовлене активацією різних внутрішньоклітинних сигналів. Ці дані отримані в результаті проведених експериментальних досліджень у мишей. Показано, що у тварин з генетичним дефектом Н1 рецепторів пригнічений синтез ІНФ-? та домінують Тх2 цитокіни – ІЛ-4 та ІЛ-13, а при відсутності Н2 рецепторів у експериментальних тварин відмічена стимуляція імунної відповіді за Тх1 та Тх2 типом. Є дані, що індукція ІЛ-3 призводить до значного підсилення експресії Н1 рецепторів на поверхні Тх1 клітин, обумовлюючи протиалергічну дію через ці клітини. Окрім ефекторних дій гістаміну через специфічні рецептори виявлена зміна профілю цитокінів під впливом медіатору через регуляцію простагландіну Е, оксиду азоту, протеінкінази А. Крім того автором (Kathleen A. et al., 2003) було доведено залучення Янус-кіназ та цитоплазматичних білків – активаторів транскрипції STAT в передачі сигналу індукованого гістаміном під час регуляції Тх1 та Тх2 цитокінів.

Аналіз літературних джерел свідчить, що у мишей гістамін стимулює анти-IgM індуковану проліферацію В клітин, на відміну від тварин з генетичним дефектом Н1 рецепторів, у яких відмічена супресія синтезу антитіл. Ці дані свідчать про важливість передачі внутрішньоклітинних сигналів через Н1 рецептори у відповідь на стимуляцію В клітинних рецепторів, що було підтверджено під час експериментальних досліджень у мишей, визначаючи синтез специфічних антитіл на Т-залежні антигени, а саме на овальбумін. Проведені спостереження дають підставу стверджувати, що у тварин з відсутністю Н1 рецепторів відмічаються високі рівні синтезованих овальбумін-специфічних IgG1, IgG1b, IgG3 та IgE, порівнюючи з тваринами у яких відсутні Н2 рецептори (Jutel M., 2001). Отже, ці дані вказують на важливість та різновиди клітинно-опосередкованої дії гістаміну в регуляції імунної відповіді.

В результаті проведених експериментальних досліджень впливу дезлоратадину на розвиток алергічного запалення було показано пригнічення синтезу медіатору ранньої та пізньої фази під впливом препарату в низькій концентрації in vitro, що свідчить про модуляцію клітинної імунної відповіді під час алергічного запалення у хворих з алергією. На підставі отриманих даних було припущено, що дезлоратадин модулює співвідношення Тх1/Тх2 цитокінів, при цьому домінуючими стають Тх1 (Marshal J., 2003). Паралельно цим дослідженням зарубіжними вченими були проведені вивчення впливу дезлоратадину на Т клітинну імунну відповідь на моделі бронхіальної астми у мишей. Досліджено, що на фоні прийому препарату у відповідь на овальбумін Т лімфоцити сенсибілізованих тварин відповідали зменшенням синтезу ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-13 та стимуляцією ІФН-?. Отримані дані свідчать про індукцію Т клітинної відповіді за Тх1 типом та супресію алергічного запалення дихальних шляхів. На підставі отриманих результатів автором було запропоновано використовувати Н1 антигістамінні препарати під час специфічної імунотерапії для отримання більш позитивного ефекту та зменшення прогресування бронхіальної астми (Bryce P.J., 2003).

Численні дослідження в області імунології свідчать про регуляторний вплив CD4+CD25+ Т лімфоцитів у підтримці гомеостазу імунної системи (Shevach E.M., 2002; McHugh R.S., 2002; Karim M. et al., 2002). Крім того, ці клітини були виявлені серед Т лімфоцитів периферійної крові хворих на атопічні захворювання шкіри та дихальних шляхів, що вказує на участь Трег клітин в регуляції алергічного запалення. З’ясована їх здатність пригнічувати синтез цитокінів як Тх1, так і Тх2 клітинами під час активації Т лімфоцитів (Akbari O., 2003; Bellinghausen I., 2003).

Під час проведеного нами аналізу алергічної реакції у хворих на АБА, сенсибілізованих алергенами домашнього пилу, збагаченого дерматофагоїдними кліщами, визначали фенотип лімфоцитів відразу ж після виділення з периферійної крові донорів та хворих на АБА. Показано, що у хворих кількість CD4+CD25+ Т клітин значно нижча ніж у здорових осіб. На відміну від цього, кількість CD4+ та CD19+ Т лімфоцитів у хворих АБА була вищою. Ці зміни спостерігались на фоні відсутності вірогідної різниці експресії CD3+ та CD8+ Т клітин безпосередньо після виділення з периферійної крові донорів та хворих на АБА.

Добре відомий той факт, що баланс між популяціями клітин залежить від процесів проліферації та апоптозу. Неодноразово було показано, що одним із патогенетичних механізмів розвитку алергічних захворювань (включаючи риніти та АБА) є порушення процесів апоптозу серед різних популяцій лімфоцитів (Foresi A. et al., 2000; Noma T. et al., 2002; Hill S.J., 1997). Під час вивчення експресії маркерів апоптозу CD4+CD25+ Трег клітинами хворих на АБА сенсибілізованих алергенами домашнього пилу, збагаченого дерматофагоїдними кліщами, показано, що у осіб даної групи зменшений відсоток цих клітин експресуючих CD95 та підвищена експресія антиапоптотичного білка Bcl-2 в порівнянні з показниками здорових осіб.

Відомо, що стимуляція синтезу ІЛ-10 та трансформуючого фактору росту (ТФР)-? CD4+CD25+ Т клітинами призводить до зменшення синтезу IgE на фоні стимуляції IgG4 та IgA. Результати проведених досліджень призвели до виникнення припущень про те, що імунна відповідь на алергени у здорових осіб та хворих алергією є результатом співвідношення між алергенспецифічними Трег клітинами та Тх2 клітинами (Akdis C.A. et al., 1998; Akdis C.A. et al., 2003; Jutel M. et al., 2003).

Встановлено, що процеси апоптозу імунокомпетентних клітин (моноцитів та лімфоцитів) відіграють важливу роль в регуляції імунних реакцій. Наприклад, у дослідженнях in vitro під час культивування моноцитів хворих на бронхіальну астму з алергеном, до якого вони сенсибілізовані, виявлено підсилення експресії поверхневих антигенів моноцитів у порівнянні з показниками здорових осіб або після проведеної специфічної імунотерапії у хворих на бронхіальну астму. У хворих на АБА після проведеної специфічної імунотерапії значно вищий рівень апоптозу моноцитів у порівнянні з донорами або хворими, які отримували тільки лише базисну терапію. Таким чином, модуляція експресії CD14 на поверхні моноцитів та процесів апоптозу цих клітин може бути обумовлена алергеніндукованим механізмом (Monteseirin J. et al., 2003).

Досліджуючи імунну відповідь обумовлену алергенами домашнього пилу, збагаченого дерматофагоїдними кліщами, під час алергічної реакції ми визначали рівень апоптозу CD4+CD25+ Трег клітин після проведеної специфічної стимуляції суспензії лімфоцитів донорів та сенсибілізованих хворих АБА використовуючи ці алергени (рис.1).

Рис.1 Експресія маркерів апоптозу CD4+CD25+ Трег клітин донорів та хворих на АБА після специфічної стимуляції алергенами домашнього пилу, збагаченого дерматофагоїдними кліщами.

Примітка: Білі стовпчики відображають середні контрольні значення в результаті інкубації з стерильним фосфатно-сольовим буфером, а сірі – з алергенами. Для CD4+CD25+Bcl-2 Т клітин тут і надалі показана середня інтенсивність флюорисценції, а для інших клітин - % позитивних клітин.

Нами встановлено, що на фоні відсутності змін рівня апоптозу Трег клітин практично здорових осіб під впливом алергенів домашнього пилу, CD4+CD25+ Т лімфоцити сенсибілізованих хворих відповідали стимуляцією апоптозу, а саме збільшенням кількості AnV-зв’язаних Трег клітин та зменшенням інтенсивності флюорисценції Bcl-2. Зміна рівня апоптозу CD4+CD25+ Т лімфоцитів хворих АБА супроводжувалась зменшенням їх загальної кількості в присутності алергенів.

Отримані результати свідчать, що CD4+CD25+ Т лімфоцити сенсибілізованих хворих на АБА піддаються апоптозу, який індуковано специфічним антигеном. Досліджений нами алергенспецифічний апоптоз Трег клітин при атопічних захворюваннях, можливо, відіграє ключову роль у зниженні рівня регуляторних цитокінів – IЛ-10 та TФР-?, які синтезуються цими клітинами, і є одним із патогенетичних механізмів розвитку алергічного запалення.

Під час вивчення впливу дезлоратадину на Трег клітини при алергічному запаленні виявлено зміну апоптотичної активності цих клітин, а саме, лікування хворих на АБА дезлоратадином 5мг протягом 10 днів призводило до підсилення інтенсивності флюорисценції антиапоптотичного білка Bcl-2 CD4+CD25+ Т лімфоцитами та зменшення експресії на поверхні цих клітин молекул CD95, що супроводжувалось збільшенням загальної кількості цих клітин в суспензії лімфоцитів периферійної крові.

Визначаючи зміни алергенспецифічного апоптозу Трег клітин периферійної крові сенсибілізованих хворих на АБА після лікування дезлоратадином вдалося помітити, що CD4+CD25+ Т лімфоцити у відповідь на специфічну стимуляцію відповідали незначними коливаннями змін рівня процесів апоптозу цих клітин (переважно в бік пригнічення), порівнюючи з показниками контрольних проб (внесення до інкубаційного середовища стерильного фосфатно-сольового буферу). Ці результати супроводжувались вірогідним зростанням загальної кількості Трег клітин у суспензії лімфоцитів сенсибілізованих хворих у відповідь на стимуляцію алергенами домашнього пилу, збагаченого дерматофагоїдними кліщами (рис.2). Отже, прийом дезлоратадину 5мг протягом 10 днів у хворих АБА попереджає розвиток алергенспецифічного апоптозу Трег клітин за умов розвитку імунної відповіді обумовленої алергенами домашнього пилу.

Визначено, що прийом Н1 антигістамінних препаратів у хворих на передодні першої ін’єкції алергену позитивно впливав на тривалість ефективності імунотерапії. Отримані результати, на думку авторів, обумовлені пригніченням експресії Н1 рецепторів на поверхні Т лімфоцитів, що призводить до індукції Н2 рецепторів. Таким чином, була показана позитивна роль гістаміну в імунній регуляції під час специфічної імунотерапії (Jutel M. et al., 1997). Аналіз літературних даних свідчить про зростаючу кількість досліджень, присвячених вивченню антагоністів Н2 рецепторів в результаті появи стверджень про їх активну участь в регуляції імунної відповіді (Arnold R. et al., 2002; Ying S. et al., 2002).

Рис.2 Алергенспецифічний апоптоз CD4+CD25+ Т регуляторних клітин хворих на АБА після прийому дезлоратадину.

Враховуючи важливість гістаміну, як одного з основних медіаторів алергічного запалення, необхідним було дослідити його регуляторний вплив на CD4+CD25+ Т лімфоцити. В результаті проведених досліджень впливу гістаміну на Трег клітини периферійної крові донорів in vitro визначено, що через 24 години інкубації суспензії лімфоцитів в присутності медіатору CD4+CD25+ Т клітини відповідали підвищенням експресії AnV, що супроводжувалось збільшенням їх загальної кількості. На відміну від цього, через 72 години інкубації відмічено зменшення CD4+CD25+AnV+ Т клітин на фоні зниження Трег клітин в суспензії. Отримані дані свідчать про залучення гістаміну до регуляції функціональної активності Трег клітин. З літературних джерел відомо, що гістамін приймає участь в індукції периферичної толерантності під час специфічної імунотерапії. Одним із механізмів цього процесу є стимуляція продукції ІЛ-10 дендритними клітинами, а також Тх2 клітинами (Mazzoni A. et al., 2001). Крім того, гістамін підсилює супресивну активність ТФР-? Т клітин (Muller U. et al., 2001). Всі ці механізми обумовлені взаємодією медіатору з Н2 рецепторами, які експресуються на поверхні Тх2 клітин, супресією синтезу ІЛ-4, ІЛ-13 та пригніченням Т клітинної проліферації (Jutel M. et al., 2001). Отже, ці дані свідчать про залучення Н2 рецепторів в регуляцію периферичної толерантності та супресії імунної відповіді, що також було підтверджено під час проведення специфічної імунотерапії у хворих з атопічними захворюваннями (Muller U. et al., 2001).

Для уточнення ролі Н1 рецепторів та гістаміну в регуляції фукціональної активності CD4+CD25+ Т лімфоцитів наступним етапом досліджень було визначення впливу селективного блокатору Н1 рецепторів дезлоратадину на CD4+CD25+ Т лімфоцити практично здорових осіб in vitro. Показано, що через 24 години інкубації Трег клітини відповідали пригніченням рівня апоптозу цих клітин, що супроводжувалось зменшенням їх рівня експресії в суспензії лімфоцитів. Отже, регуляторний вплив дезлоратадину на процеси апоптозу та загальну кількість Трег клітин свідчить про залучення Н1 та/або Н2 рецепторів в регуляцію функціональної активності цих клітин.

Таким чином, прийом монтелукасту та дезлоратадину під час імунізації тварин алоантигенами стимулює розвиток алогенної реакції в експерименті та призводить до індукції синтезу IgG та IgM антитіл (збільшення титру гемолізинів та гемаглютинінів) під час імунізації гетероантигенами. Крім того, дезлоратадин в реалізації імунної відповіді обумовленої алергенами домашнього пилу, збагаченого дерматофагоїдними кліщами при алергічному запаленні попереджує