ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
Кметь Ольга Гнатівна
УДК 616 – 002.8 – 085.214.3
ПІДВИЩЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ПІРАЦЕТАМУ ЗА ГОСТРОЇ ГІПОКСІЇ ШЛЯХОМ ЗАСТОСУВАННЯ БЛОКАТОРІВ ГЛУТАМАТНИХ РЕЦЕПТОРІВ
14.03.05 – фармакологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Одеса – 2006
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Буковинському державному медичному університеті МОЗ України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
Заморський Ігор Іванович,
Буковинський державний медичний
університет МОЗ України,
завідувач кафедри фармакології
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Воскресенський Олег Миколайович
Інститут стоматології АМН України,
завідувач відділу фармакології і токсикології, м. Одеса
доктор медичних наук, професор Посохова Катерина Андріївна
Тернопільський державний медичний університет ім. І.Я. Горбачевського
МОЗ України, завідувач кафедри фармакології з клінічними фармакологією,
фармацією та фармакотерапією, м. Тернопіль
Провідна установа:
Інститут фармакології та токсикології АМН України, відділ патофізіології, м. Київ
Захист відбудеться „ 01” _березня_2006 р. о 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65082, Одеса, Валіховський пров., 2)
З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Одеського державного медичного університету МОЗ України (65082, Одеса, Валіховський пров., 3)
Автореферат розісланий „_28__”__січня__ 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
к. мед. н., доцент Годован В. В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Профілактика і лікування патологій головного мозку, зокрема нейродегенеративних захворювань, ішемії, інсульту, судомних станів є однією з найактуальніших проблем сучасної медицини (Крыжановский Г.Н., 2002; Бєленічев І.Ф. та співавт., 2003). Протягом останніх десятиріч увага багатьох фармакологів залишається прикутою до вивчення нових лікарських засобів для лікування захворювань нервової системи, що виникають внаслідок ішемічного та гіпоксичного пошкодження нейронів, оскільки переважна більшість існуючих ліків не дає бажаного ефекту (Белостоцкая Л., Чайка Л., Гомон О., 2003; Ярош О.К, Дудко О.Т., 2003; Кресюн В.Й. і співав., 2004).
На сьогоднішній день встановлена роль NMDA-глутаматорецепторів у розвитку гострих і хронічних гіпоксичних пошкоджень нервової тканини. Вважають (Абрамец И.И., Комиссаров И.В., 2001; Tsimmerman I.S., Shchetkin2002; Семенов Д., Самойлов М., 2003), що в основі гіпоксичних пошкоджень нейронів головного мозку лежить комбінована дія гострого набряку клітин і активація постсинаптичних глутаматних рецепторів, яка виникає під впливом масивного вивільнення збуджувальних амінокислот з пресинаптичних аксонних терміналей. У цьому зв’язку привертають увагу похідні адамантану, до яких відноситься амантадин та мемантин. Досліджувані засоби виступають агоністами для дофамінергічної системи і антагоністами глутаматних рецепторів, володіють нейропротекторними властивостями (Bespalov A., 1999; Гмиро В.Е., Сердюк С.Е., 2000; Карабань И.Н. и соавт., 2002). Блокуючи NMDA-глутаматні рецептори, ці препарати зменшують загибель нервових клітин, яка виникає при аноксії, фокальній та глобальній ішемії мозку (Ходоров Б.И., 2000; Морозов И.С. и соавт., 2001). Враховуючи наведені вище особливості даних лікарських препаратів, стає зрозумілим їх клінічне застосування, зокрема при дегенеративних захворюваннях нервової системи (Гаврилова С. И., 2002; Карабань И.Н. и соавт., 2002; Зарубина И.В., 2003).
Встановлено, що використання комбінацій лікарських засобів часто має переваги перед терапією одним препаратом, зокрема тому, що при зниженні дози кожного з компонентів у більшості випадків не знижується, а підвищується ефективність комбінованого препарату і водночас зменшується виразність і кількість побічних ефектів (Ярош О.К., Дудко О.Т., 2003). Однією з таких перспективних комбінацій у нейрофармакології може бути поєднання двох відомих, апробованих часом груп препаратів Ї ноотропів (наприклад, їх „золотого стандарту” пірацетаму) та блокаторів глутаматних рецепторів (зокрема, мемантину або амантадину). Обгрунтуванням подібного підходу до вибору такої комбінації є різні механізми дії цих лікарських засобів. За наявними у сучасній літературі даними, пірацетам впливає переважно на метаболічні процеси та активує NMDA-глутаматні рецептори (Аведисова А.С. и соавт., 2001). Вважається, що даний препарат інтенсифікує окисно-відновні реакції, енергетичний обмін, підвищує вміст АТФ у мозку, сприяє утилізації глюкози, активує реалізацію потенційних нейрофізіологічних можливостей клітин головного мозку, особливо при гіпоксичних станах (Громов Л.О., 2001; Посохова К.А., Бережна І.Ю., 2002). Крім того, за останні роки встановлено, що пірацетам посилює зв’язок між глутаматними рецепторами і фосфоліпазою С. Водночас мемантин та амантадин зменшують дегенерацію нейронів, блокуючи глутаматні NMDA-рецептори (Елшанская М.В. и соавт., 2001). Тому доцільним є вивчення впливу поєднаного застосування пірацетаму та блокаторів глутаматних рецепторів NMDA-типу (амантадину та мемантину) за умов гострої гіпоксії.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Матеріали дисертаційної роботи є фрагментом планової науково-дослідної міжкафедральної роботи кафедр нормальної фізіології і фармакології Буковинського державного медичного університету (№ державної реєстрації 0103U004048). Дисертантом виконаний фрагмент розробки нових шляхів фармакологічної корекції гострої гіпоксії за допомогою поєднаного застосування пірацетаму та блокаторів NMDA-глутаматних рецепторів.
Мета роботи і завдання дослідження. Мета роботи підвищення нейрометаболічної ефективності пірацетаму при гострій гіпоксичній гіпобаричній гіпоксії шляхом застосування блокаторів NMDA-глутаматних рецепторів – мемантину та амантадину.
Для досягнення поставленої мети були сформульовані такі основні завдання:
Дослідити вплив пірацетаму при застосуванні його у різних дозах на нейрометаболічні процеси в структурах переднього мозку щурів при гострій гіпобаричній гіпоксії.
Визначити вплив мемантину на процеси пероксидації макромолекул в структурах переднього мозку щурів та функціональний стан центральної нервової системи за умов гострої гіпоксії.
З’ясувати вплив амантадину на процеси пероксидації ліпідів і білків в структурах переднього мозку та функціональний стан центральної нервової системи щурів за умов гострої гіпоксії.
Встановити вплив блокаторів NMDA-глутаматних рецепторів (мемантину і амантадину) та пірацетаму при їх поєднаному застосуванні за профілактичного і лікувального режимів їх ведення на нейрометаболічні процеси в структурах переднього мозку, антиамнестичні властивості та функціональний стан центральної нервової системи щурів при гострій гіпоксії.
Об’єкт дослідження – гостра гіпобарична гіпоксія.
Предмет дослідження – дослідження ефективності впливу пірацетаму та блокаторів NMDA-глутаматних рецепторів (мемантину та амантадину) на стан пероксидного окиснення ліпідів та активність ферментів антиоксидантного захисту у структурах головного мозку, функціональний стан та ноотропну активність центральної нервової системи білих щурів.
Методи дослідження – фармакологічні, фізіологічні, патофізіологічні, біохімічні, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше доведено, що пірацетам у дозі 200 мг/кг найкраще знижує вміст ТБК-активних продуктів, підвищує активність антиоксидантних ферментів головного мозку та функціональну активність центральної нервової системи лабораторних щурів і показує найвищий процент запам’ятовування умовного рефлексу за умов гострої гіпобаричної гіпоксії. Виявлено нормалізуючий вплив мемантину та комбінованого застосування пірацетаму і блокаторів глутаматних рецепторів (амантадину та мемантину) на інтенсивність пероксидного окиснення макромолекул, активність ферментів антиоксидантного захисту, енергетичний стан нервових клітин, функціональну активність центральної нервової системи. Встановлено антиамнестичні властивості та підвищення стійкості тварин до гіпоксії, а також доведена ефективність комбінованого введення пірацетаму та мемантину після моделювання гострої гіпоксії.
На спосіб лікування гострої гіпоксії за допомогою поєднаного застосування пірацетаму та мемантину отримано деклараційний патент України № 4864 „Спосіб корекції гіпоксичних станів” від 15.02.2005.
Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження дозволяють рекомендувати використання лікарських засобів адамантильної структури (зокрема, мемантину) у поєднанні з пірацетамом для корекції порушень прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в структурах лімбічної і стріопалідарної систем головного мозку і за умов гострої гіпоксичної гіпобаричної гіпоксії. Дану комбінацію можна також рекомендувати для клінічної апробації при порушеннях пам’яті та функціональних розладах центральної нервової системи іншого генезу.
Результати роботи можуть бути використані в навчальному процесі при викладанні курсів з фармакології, нервових хвороб, нормальної і патологічної фізіології. Результати отримали впровадження у практику наукових досліджень і навчальний процес кафедр фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, кафедри загальної та клінічної фармакології Одеського державного медичного університету, кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології Івано-Франківського державного медичного університету, кафедри біохімії і фармакології Сумського державного університету, кафедр нормальної фізіології, патологічної фізіології, нервових хвороб, психіатрії та медичної психології ім. С.М. Савенка Буковинського державного медичного університету.
Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз наукової літератури з обраної проблеми, визначені методичні підходи, здійснено всі експериментальні дослідження, статистичну обробку, систематизацію та аналіз отриманих результатів, разом з керівником сформульовано основні положення та висновки роботи. Біохімічні дослідження були виконані на базі Науково-дослідного інституту медико-екологічних проблем МОЗ України (дир. - д.мед.н., проф. Л.І. Власик), за що автор висловлює щиру подяку.
Апробація результатів дисертації. Основні фрагменти дисертаційної роботи були оприлюдненні на науковій конфе-ренції “Вікові аспекти чутливості організму до ксенобіотиків” (Чернівці, 2002); 65-й науковій конференції студентів та молодих вчених з міжнародною участю (Львів, 2004); X конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Чернівці, 2004); 78-й підсумковій науковій конференції студентів та молодих вчених з міжнародною участю (Чернівці, 2004); І міжнародній науково-практичній конференції “Створення, виробництво, стандартизація, фармако-економіка лікарських засобів та біологічно активних добавок” (Тернопіль, 2004); науково-практичній конференції молодих вчених “Вчені майбутнього” (Одеса, 2004); науковій конференції молодих вчених “Актуальні проблеми старіння”, присвяченій пам’яті академіка Володимира Веніаміновича Фролькіса (Київ, 2005); ІІ міжнародній медико-фармацевтичній конференції студентів та молодих вчених (Чернівці, 2005); VI Національному з’їзді фармацевтів України „Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України” (Харків, 2005); підсумкових наукових конференціях викладачів Буковинського державного медичного університету (Чернівці, 2003-2005 рр.).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 робіт, з них 5 статей у фахових журналах, зокрема 2 одноосібні, решта у матеріалах конференцій і конгресів. Отримано 1 деклараційний патент України на винахід.
Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 196 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, п’яти розділів власних досліджень, обговорення результатів роботи, висновків. Обсяг основного тексту дисертації складає 175 сторінок. Список літератури містить 294 джерела, з яких 95 – іноземних авторів. Робота ілюстрована 83 таблицями та 2 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені на 231 статевонезрілих та 56 статевозрілих конвенційних аутбредних щурах-самцях масою відповідно 65-75 г та 200-220 г і віком 1,5 та 6 місяців. За тиждень до початку досліджень визначали стійкість щурів до гострої гіпобаричної гіпоксії і в подальшому використовували лише середньостійких тварин (Березовский В.А., 1978). Гостру гіпобаричну гіпоксію моделювали в модифікованій проточній барокамері шляхом імітації підйому щурів на висоту 12000 м (Соколова И.А, Шахназаров А.А., Тимкина М.И., 1998) (з атмосферним тиском 19,4 кПа і парціальним тиском кисню рО2 в атмосферному повітрі 30,5 мм рт. ст.), яка є критичним рівнем для виживання тварин даного виду (Малышев А.Ю., Крапивин С.В., 1996) і близька до “смертельної площадки” – 12500 м. На “висотному плато” щурів витримували до моменту другого агонального вдиху (Корнеев А.А., Комисарова И.А., 1993), після чого здійснювали “спуск” на попередню нульову висоту, відновлюючи нормальний атмосферний тиск і життєдіяльність тварин, що забезпечувало реоксигенацію організму після гострої гіпоксії.
Для вивчення найбільш ефективної дози пірацетаму за умов гострої гіпоксії щурів було поділено на декілька груп, яким препарат вводили внутрішньочеревинно за 1 год (Воронина Т.А. и соавт., 2000) до моделювання оксидативного стресу у дозах 100, 200, 300, 400 та 500 мг/кг. Іншій групі тварин за 4 год (Spanagei R., Eilbacher B., Wilke R., 1994) до гіпоксії внутрішньочеревинно вводили мемантин або амантадин (Мерц+Ко, Німеччина) в дозі відповідно 10 та 100 мг на кг маси тіла (Гмиро В.Е., Сердюк С.Е., 2000). Третій групі вводили пірацетам (200 мг/кг) і мемантин у той же час до моделювання гіпоксії. Для експериментів обрана така доза на основі власних досліджень, за якими пірацетам у дозі 200 мг/кг найбільш достовірно знижував вміст ТБК-активних продуктів (ТБКАП) і підвищував активність ферментів антиоксидантного захисту (АОЗ) у структурах головного мозку тварин. Контрольним тваринам відповідних серій вводили еквівалентну кількість розчинника. З метою вивчення лікувальних властивостей пірацетаму та блокаторів NMDA-глутаматних рецепторів ще одній групі тварин препарати вводили одразу після припинення дії гіпоксії.
Евтаназію щурів виконували шляхом декапітації через 30 хв після припинення дії гострої гіпоксії, швидко забирали головний мозок (ГМ) – орган-мішень для гострої кисневої недостатності (Лукьянова Л. Д., 1996). Загальну чутливість організму до гострої гіпоксії при окремому та поєднаному введенні пірацетаму та мемантину оцінювали за показниками тривалості виживання щурів при моделюванні гіпоксії. Для оцінки пошкодуючого впливу гострої гіпоксії (Маньковская И.Н., 1991) у досліджуваних структурах ГМ (кора, гіпокамп, бліда куля та хвостате ядро) визначали стан перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) (вміст ТБКАП), продуктів перекисного окиснення білків (ПОБ), активність ферментів антиоксидантного захисту – каталази, глутатіонпероксидази (ГП), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ). Загальний вплив препаратів і гіпоксії на функціональний стан центральної нервової системи (ЦНС) враховували за біохімічним показником (активність ключового ферменту нейронів – Nа+, К+-АТФази) та патофізіологічними показниками (зміна орієнтовного, емоційного і рухового компонентів поводження у тесті “відкрите поле“). Ступінь амнезії, що виникає після гострої гіпоксії (Латышева Н.В., Раевский К.С., 2001), і, відповідно, антиамнестичну активність препаратів визначали за допомогою методики вироблення умовного рефлексу пасивного уникання (УРПУ) (Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д., 1991). Вміст ТБКАП визначали за реакцією з 2-тіобарбітуровою кислотою (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972), ПОБ - за реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином (Мещишен І.Ф., 1998). Активність каталази (Королюк М.А. и соавт., 1988), ГП (Геруш І.В., Мещишен І.Ф., 1998), Г-6-ФДГ (Захарьин Ю.Л., 1967) та Nа+, К+-АТФази (Дасаева Л.А., Вермель А.Е., 1996) оцінювали спектрофотометрично. Отримані дані обробляли методами варіаційної статистики за допомогою пакету програм “STATISTICA 5.0” (“Statsoft”, США) (Боровиков В.П., 1998) з використанням для оцінки вірогідності різниць окремих груп даних параметричного (t Стьюдента) критерію. Для визначення залежності між показниками різних груп даних використовували регресійний аналіз. Статистично вірогідними вважали зміни при р?0,05.
Результати досліджень та їх обговорення. Введення пірацетаму за 60 хв до створення гіпобаричної гіпоксії в дозі 100, 300, 400, 500 мг/кг призводило до дисбалансу в системі прооксидантно-антиоксидантної рівноваги у досліджуваних структурах ГМ. Однак після застосування пірацетаму у дозі 200 мг/кг знижувався вміст ТБКАП (табл. 1) і продуктів окиснювальної модифікації білків (ОМБ), зростала активність ферментів АОЗ - активність каталази вірогідно зростала у всіх досліджуваних структурах ГМ. При цьому активність Г-6-ФДГ вірогідно падала.
Таблиця 1
Вміст ТБК - активних продуктів та активність Nа+, К+-АТФази за дії пірацетаму у дозі 200 мг/кг у структурах головного мозку за гострої гіпобаричної гіпоксії (M±m, n=7)
Дослід-жувані структури | Вміст ТБК-активних продуктів,
мкмоль /г тканини | Активність Nа+, К+-АТФази,
мкмоль Рі / мг білка х хв
Контроль (нормоксія) | Гіпоксія | Пірацетам+гіпоксія | Контроль (нормоксія) | Гіпоксія | Пірацетам+гіпоксія
Кора ГМ | 3,05±0,08 | 5,03±0,09 | 2,19±0,14* | 1,41±0,14 | 0,87±0,03 | 1,77±0,04*
Гіпокамп | 3,29±0,13 | 4,87±0,15 | 1,92±0,09* | 1,76±0,09 | 1,11±0,09 | 2,53±0,15*
Бліда куля | 4,71±0,14 | 6,74±0,12 | 4,59±0,13* | 8,35±0,40 | 4,14±0,33 | 10,02±0,38*
Хвостате
ядро | 2,85±0,18 | 5,09±0,11 | 3,02±0,15* | 5,32±0,33 | 1,58±0,20 | 6,41±0,21*
Примітка: * - зміни вірогідно відрізняються від показників за умов гіпоксії
(р<0,05).
Активність Nа+, К+-АТФази реєструвалась достовірно більшою у корі в 2,0 раза, гіпокампі в 2,3 раза, блідій кулі в 2,4 раза, хвостатому ядрі в 4 раза у порівнянні з тваринами, які піддавались дії гіпоксії без введення препарату див. табл. 1.
При цьому вірогідно зростав показник інтегральної поведінкової активності в 1,6 раза (р<0,001) та виявлено підвищення запам’ятовування умовного рефлексу у досліджуваній групі тварин у 6,1 раза (р<0,001) в порівнянні з даними контролю(рис.1.). Поведінкові реакції у групах тварин, яким перед гіпоксією вводили пірацетам у дозах 300, 400 і 500 мг/кг, достовірно не змінювались. Водночас, показник УРПУ у щурів, які отримували пірацетам у таких же дозах, достовірно зростав на 57% (р<0,001), 43% (р<0,001) та 28% (р<0,001) відповідно.
Рис.1. Вплив різних доз пірацетаму на функціональну активність ЦНС та показ-ник умовного рефлексу пасивного уникання за гострої гіпоксії
У групі тварин, яким перед гіпоксією вводили одночасно пірацетам і амантадин, вміст ТБКАП достовірно знижувався у середньому 4,3 раза (p<0,05) в порівнянні з тваринами, яким перед гіпоксією вводили фізіологічний розчин. При цьому активність ГП у корі ГМ зростала в середньому в 1,9 раза (p<0,05). Поєднане введення цих препаратів перед гіпоксією призводило до вірогідного зниження активності Г-6-ФДГ у корі ГМ на 50%. Одночасне введення пірацетаму (200 мг/кг) і мемантину (10 мг/кг) перед моделюванням гіпоксії достовірно знижувало вміст ТБКАП у структурах ГМ у середньому в 5,5 раза (p<0,05) у порівнняні з тваринами з контрольними тваринами (табл. 2). Проте, даний показник знижувався лише у 2,5 рази (p<0,05) при окремому введенні досліджуваних препаратів. Причому в корі ГМ активність ГП зростала середньому в 2 раза (p<0,05) та знижувалась активність Г-ФДГ.
Водночас достовірно зростала активність каталази у всіх досліджуваних структурах: при окремому введенні препаратів перед гіпоксією лише у середньому в 2,2 раза (p<0,05), а при їх поєднаному введенні у середньому в 3,1 раза (p<0,05) у порівнянні з тваринами контрольної групи.
Таблиця 2
Вміст ТБК-активних продуктів у досліджуваних структурах головного мозку при поєднаному введені пірацетаму (200 мг/кг) та мемантину (10 мг/кг) перед моделюванням гострої гіпобаричної гіпоксії (M±m, n=7)
Досліджу-вані структури | Контроль (нормоксія) | Гіпоксія | Пірацетам і гіпоксія | Мемантин і гіпоксія | Пірацетам + мемантин
і гіпоксія
Кора ГМ | 8,55±0,59 | 19,03±0,762* | 7,92±0,36? | 9,68±0,38? | 4,78±0,32*,?,#,¦
Гіпокамп | 2,04±0,12 | 3,85±0,14* | 1,20±0,09*,? | 1,38±0,12*,? | 0,55±0,08*,?#,¦
Бліда куля | 3,47±0,11 | 5,36±0,12* | 1,81±0,14*,? | 1,93±0,10*,? | 0,96±0,05*,?,#,¦
Хвостате ядро | 3,18±0,12 | 5,20±0,10* | 2,00±0,04*,? | 2,49±0,13? | 0,97±0,04*,?,#,¦
Примітки: * -зміни вірогідно відрізняються від показників контролю (нормоксії);
?-показники вірогідно відрізняються від даних постгіпоксичної групи тварин;
# - показники вірогідно відрізняються від показників тварин, які знаходились за гіпоксії з попереднім окремим введенням пірацетаму;
? -дані вірогідно відрізняються від показників тварин, які знаходились за гіпоксії з попереднім окремим введенням амантадину;
¦ -дані вірогідно відрізняються від показників тварин, які знаходились за гіпоксії з попереднім окремим введенням мемантину.
Вміст продуктів ПОБ (рис.2), як після окремого, так і після поєднаного введення пірацетаму та амантадину або мемантину перед гіпоксією, достовірно знижувався. Поєднане введення пірацетаму та амантадину перед гіпоксією достовірно підвищувало активність Nа+, К+-АТФази у порівнянні з даними постгіпоксичних тварин, в корі ГМ в 3,1 раза, гіпокампі Ї в 2,3 раза, блідій кулі Ї в 2,9 раза, хвостатому ядрі Ї в 1,9 раза, що вказує на нормалізацію енергетичного балансу у нейронах за дії препаратів при патологічних процесах, що розвиваються внаслідок дефіциту кисню. При цьому у всіх структурах ГМ зростання було значнішим, ніж при окремому застосуванні препаратів.
У тварин, яким перед гіпоксією поєднано вводили пірацетам і амантадин (мемантин), спостерігали достовірне зростання показника норкового рефлексу та спостерігалася тенденція зростання інтегральних показників у порівнянні з даними нелікованої групи щурів. Водночас показники УРПУ у групі тварин, яким поєднано застосовували ці препарати перед гострою гіпоксією, перевищували на 59% (p<0,05) дані окремого введення досліджуваних лікарських засобів. Ці результати підтверджують наявність антиамнестичних властивостей у препаратів за таких умов експерименту.
Рис.2. Вміст продуктів окиснювальної модифікації білків (моль 2,4-динітрофенілгідразону/ г білка)у досліджуваних структурах головного мозку при поєднаному введенні пірацетаму та блокаторів глутаматних рецепторів (амантадину та мемантину) перед моделюванням гострої гіпобаричної гіпоксії
Примітки: * -зміни вірогідно відрізняються від показників контролю (нормоксії);
** - показники вірогідно відрізняються від даних постгіпоксичної групи тварин;
# - показники вірогідно відрізняються від показників тварин, які знаходились за гіпоксії з попереднім окремим введенням пірацетаму;
& -дані вірогідно відрізняються від показників тварин, які знаходились за з попереднім окремим введенням мемантину;
? -дані вірогідно відрізняються від показників тварин, які знаходились за гіпоксії з попереднім окремим введенням амантадину.
З метою з’ясування зв’язку між змінами досліджених біохімічних показників кори ГМ мозку та поведінковою активністю у молодих тварин, яким перед гіпоксією поєднано вводили пірацетам і мемантин, нами проведений множинний регресійний аналіз, який дозволив побудувати регресійні моделі змін функціональної здатності ЦНС у молодих тварин, що можуть відбуватись при попередньому поєднаному введенні пірацетаму та мемантину перед моделюванням гострої гіпобаричної гіпоксії. Зокрема, для досліджуваної групи тварин рівняння регресії було інформаційно здатним та статистично значущим і приймало такого вигляду:
y = 22,40 + 4,75х1 + 62,83х2 - 1,99х3 + 0,91х4 – 0,65х5, де y – інтегральна поведінкова активність; x1 – активність каталази; x2 – активність Na+, К+-АТФази; x3 – вміст продуктів ПОБ; x4 – активність Г-6-ФДГ; x5 – вміст ТБК-активних продуктів.
Отже, проведення множинного регресійного аналізу дозволило з’ясувати, що нормалізація поведінкової активності у щурів, яким перед гіпоксією поєднано вводили пірацетам та мемантин відбувається першу чергу на фоні зростання активності Na+, К+-АТФази, Г-6-ФДГ та каталази і зменшенням вмісту продуктів ОМБ та ТБКАП.
Таким чином, спільне застосування пірацетаму та мемантину викликає зміни в досліджуваних структурах ГМ тварин подібні до тих, що зареєстровані при окремому застосуванні даних лікарських засобів. Водночас, поєднане попереднє введення пірацетаму та мемантину істотніше нормалізує стан прооксидантно-антиоксидантної системи ГМ статевонезрілих щурів за умов гострої гіпоксії, ніж окреме введення препаратів.
Поєднане введення пірацетаму та амантадину перед гіпоксією підвищувало досліджувані показники: час втрати пози в 1,2 раза, час життя та час відновлення пози в 1,3 раза (табл. 3). Зростання даних показників також спостерігалося при поєднаному введенні пірацетаму та мемантину. Так, час втрати пози та час відновлення пози в 1,3 раза, час життя в 1,4 раза у порівнянні з контрольними постгіпоксичними тваринами.
Таблиця 3
Вплив окремого та поєднаного введення пірацетаму (200 мг/кг) та блокаторів NMDA-глутаматних рецепторів (амантадину (100 мг/кг) та мемантину (10 мг/кг)) на чутливість тварин до гострої гіпоксії (M±m, n=7)
Групи тварин | Час втрати пози, с | Час життя, с | Час відновлення пози, с
Гіпоксія | 74,10±1,017 | 177,92±1,877 | 95,62±2,044
Пірацетам і гіпоксія | 80,72±0,672* | 219,62±2,560* | 105,19±1,944*
Амандадин і гіпоксія | 77,35±0,509 | 188,19±1,122* | 102,41±1,101*
Мемантин і гіпоксія | 88,51±0,965* | 226,32±2,426* | 111,51±1,673*
Пірацетам + амантадин і гіпоксія | *,**,#
89,61±1,311 | *,**,#
233,19±1,345 | *,**,#
120,79±1,563
Пірацетам + мемантин і гіпоксія | *,**,¤
96,63±2,004 | *,**,¤
241,69±2,067 | *,**,¤
126,47±1,546
Примітки: * - показники вірогідно відрізняються від даних постгіпоксичної групи тварин;
**- показники вірогідно відрізняються від даних тварин, які знаходились за гіпоксії з попереднім окремим введенням пірацетаму;
# - показники вірогідно відрізняються від даних тварин, які знаходились за гіпоксії з попереднім окремим введенням амантадину;
¤ - показники вірогідно відрізняються від даних тварин, які знаходились за гіпоксії з попереднім окремим введенням мемантину.
Отже, поєднане введення пірацетаму та блокаторів глутаматних рецепторів (амантадину і мемантину) більш інтенсивніше підвищує досліджувані показники, ніж окреме введення препаратів перед гіпоксією.
При поєднаному введенні препаратів після гіпоксії активність каталази достовірно зростала у всіх досліджуваних структурах у корі – 2,0 раза; гіпокампі та хвостатому ядрі – 1,2 раза та в 1,4 раза у блідій кулі в порівнянні з постгіпоксичних тваринам без введення препаратів (табл. 4). Відповідно активність ГП у досліджуваній групі тварин вірогідно зростала у корі в 1,5 раза (p<0,05); гіпокампі – 1,2 раза (p<0,05); блідій кулі та хвостатому ядрі – 1,1 раза (p<0,05).
Поєднане введення пірацетаму та мемантину після гіпоксії, призводило до вірогідного зниження активності Г-6-ФДГ у корі ГМ та хвостатому ядрі у 1,2 раза (p<0,05), гіпокампі – 1,4 раза (p<0,05), блідій кулі – 1,1 раза (p<0,05) у порівнянні з тваринами, яким після гіпоксії вводили фізіологічний розчин.
Таблиця 4
Вміст ТБК-активних продуктів та активність каталази у досліджуваних структурах головного мозку при поєднаному введенні пірацетаму (200 мг/кг) та мемантину (10 мг/кг) після моделюванням гострої гіпобаричної гіпоксії (M±m, n=7)
Досліджу-вані структури | Вміст ТБК-активних продуктів,
мкмоль / г тканини | Активність каталази,
мкмоль/хв / мг білка
Контроль | Гіпоксія | Пірацетам
+ мемантин
і гіпоксія | Контроль | Гіпоксія | Пірацетам
+мемантин
і гіпоксія
Кора ГМ | 8,55±0,59 | 19,03±0,76* | 14,45±0,48*,** | 1,10±0,06 | 0,25±0,02* | 0,49±0,03*,**
Гіпокамп | 2,04±0,12 | 3,85±0,14 | 3,12±0,31*,** | 1,32±0,06 | 0,75±0,03* | 0,93±0,02*,**
Бліда куля | 3,47±0,11 | 5,36±0,12 | 4,33±0,18*,** | 0,77±0,05 | 0,27±0,02* | 0,37±0,09*,**
Хвостате ядро | 3,18±0,12 | 5,20±0,10* | 4,76±0,16*,** | 1,55±0,03 | 1,02±0,04* | 1,17±0,01*,**
Примітка. Умовні позначення такі ж, як і в табл. 3.
Поєднане введення пірацетаму та мемантину після гіпоксії достовірно знижувало вміст продуктів ПОБ (табл. 5) у корі ГМ та блідій кулі в 1,2 раза, гіпокампі – 1,3 раза, хвостатому ядрі - 1,4 раза в порівнянні з даними гіпоксичних тварин. Комбіноване введення пірацетаму та мемантину після гіпоксії підвищувало активність Nа+, К+-АТФази в середньому у 1,3 раза у порівнянні з даними постгіпоксичних тварин.
Таким чином, поєднане введення пірацетаму та мемантину після гострої гіпоксії нормалізує прооксидантно-антиоксидантну систему ГМ: знижує вміст ТБКАП, нормалізує вміст продуктів окиснювальної модифікації білків, підвищує активність каталази, ГМ, знижує активність Г-6-Ф, а також викликає підвищення активності Nа+, К+-АТФази. Отже, застосування мемантину на фоні введення пірацетаму підвищує його антигіпоксантні лікувальні властивості, нормалізуючи стан проксидантно-антиоксидантної рівноваги в ГМ та покра-щуючи функціональну активність ЦНС за умов гострої гіпобаричної гіпоксії.
Таблиця 5
Вміст продуктів ОМБ та активність Nа+, К+-АТФази у досліджуваних структурах головного мозку при поєднаному введені пірацетаму (200 мг/кг) та мемантину (10 мг/кг) після моделювання гострої гіпоксії (M±m,n=7)
Дослі-джувані структури | Вміст продуктів окислювальної модифікації білків, нмоль 2,4-динітрофенілгідразона/ г білка | Активність Nа+, К+-АТФази,
мкмольРі за хв на мг білка
Контроль | Гіпоксія | Пірацетам
+ мемантин
і гіпоксія | Контроль | Гіпоксія | Пірацетам
+ мемантин
і гіпоксія
Кора ГМ | 2,52±0,11 | 5,08±0,09* | 4,32±0,12*,** | 0,38±0,02 | 0,19±0,01* | 0,29±0,01*,**
Гіпокамп | 10,71±0,54 | 19,74±0,66* | 15,38±0,44*,** | 0,62±0,03 | 0,36±0,02* | 0,46±0,02*,**
Бліда куля | 24,14±0,63 | 38,76±0,80 | 33,41±0,66*,** | 1,16±0,02 | 0,32±0,02* | 0,40±0,01*,**
Хвостате ядро | 9,49±0,35 | 17,00±0,42* | 11,90±0,59*,** | 1,62±0,03 | 0,89±0,03* | 1,02±0,01*,**
Примітка: Умовні позначення такі ж, як і в табл. 4.
Отримані нами експериментальні дані, а також відомості з літератури дають можливість зробити таке припущення щодо механізму дії поєднаного застосування досліджуваних препаратів за умов гострої гіпоксії. Як відомо (Абрамец И.И., Комиссаров И.В., 2001; Раевский К.С. и др., 1997; Papas S., Crepel V., Ben-Ari Y., 1993), одним з пускових механізмів загибелі нейрона є активація NMDA-глутаматних рецепторів. Пірацетам також збуджує дані рецептори. Водночас, мемантин є блокатором цих рецепторів (Гмиро В.Е., Сердюк С.Е., 2000). За рахунок цього поєднання, на нашу думку, усувається пошкоджувальна дія збуджувальних нейромедіаторів, зокрема глутамату, та компенсується можливий недостатній нейропротекторний вплив пірацетаму при гострих гіпоксичних станах. Опираючись на отримані нами результати, можна припустити, що даній комбінації препаратів властивий синергічний ефект. Одержані результати можуть служити основою для подальшого вивчення і використання поєднаного застосування пірацетаму та мемантину для лікування захворювань ЦНС, зокрема тих, що супроводжуються виникненням гіпоксії.
ВИСНОВКИ
У дисертації наведено теоретичне узагальнення та експериментальне вирішення наукової задачі - підвищення лікувально-профілактичної ефективності пірацетаму за дії гострої гіпобаричної гіпоксії шляхом застосування блокаторів NMDA-глутаматних рецепторів (мемантину та амантадину) і показана більша синергічна дія у мемантину порівнянно з амантадином.
1. Пірацетам у дозі 200 мг/кг найкраще, ніж в інших дозах (100, 300, 400, 500 мг/кг), нормалізує порушену внаслідок дії гострої гіпоксії прооксидантно-антиоксидантну рівновагу в структурах головного мозку та покращує функціональний стан центральної нервової системи лабораторних щурів.
2. Блокатори глутаматних рецепторів Ї амантадин та мемантин Ї за умов гострої гіпоксії демонструють антиоксидантну (підвищуючи активність ферментів антиоксидантного захисту та зменшуючи вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів у структурах головного мозку щурів) та ноотропну (підвищуючи інтегральну поведінкову активність) дії. При цьому мемантин проявляє більшу ефективність, ніж амантадин.
3. Введення мемантину перед моделюванням гострої гіпобаричної гіпоксії у статевозрілих тварин зменшує пероксидне окиснення ліпідів у фронтальній корі, гіпокампі, хвостатому ядрі та блідій кулі головного мозку, що виражається у достовірному зниженні вмісту ТБК-активних продуктів, нормалізації вмісту продуктів окиснювальної модифікації білків; а також підвищує активність каталази, глутатіонпероксидази та Nа+, К+-АТФази, знижує активності глюкозо-6-фосфатдегідрогенази і лактатдегідрогенази.
4. Поєднане введення пірацетаму та блокаторів глутаматних рецепторів (амантадину або мемантину) ефективніше підвищує показники виживання тварин (час втрати пози, час життя та час відновлення пози) за гострої гіпобаричної гіпоксії, ніж окреме застосування цих препаратів.
5. Введення пірацетаму та амантадину перед гострою гіпобаричною гіпоксією підвищує показники поведінкової активності тварин, в основному за рахунок частоти реєстрації норкового рефлексу на 45 % (р<0,05) та горизонтальної рухової активності на 23 % (р<0,05), а також зменшує порушення пам’яті у постгіпоксичних тварин (за показниками умовного рефлексу пасивного уникання).
6. Поєднане попереднє введення пірацетаму та мемантину статевонезрілим і статевозрілим тваринам, які піддавались дії гострої гіпоксії, проявляє синергічні ефекти щодо ноотропної активності (зокрема, показник інтегральної поведінкової активності тварин збільшився в середньому на 26%, р<0,05), знижує вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів і білків та підвищує активність ферментів антиоксидантного захисту в структурах головного мозку.
7. Поєднане введення пірацетаму та мемантину після створення гострої гіпобаричної гіпоксії знижує вміст ТБК-активних продуктів (на 20р<0,05), ), зменшує вміст продуктів окиснювальної модифікації білків (на 19 %, р<0,05), посилює антиоксидантний захист нейронів за рахунок підвищення активності каталази (на 23 %, р<0,05), нормалізує активність Na+, К+-АТФази та зменшує порушення пам’яті у статевонезрілих тварин.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Заморський І.І., Кметь О. Г. Вплив мемантину на стан прооксидантної рівноваги у структурах головного мозку при гострій гіпоксії // Одеський мед. журн. – 2004. – №3 (83). – С. 13-16. (Дисертант самостійно провела пошук і аналіз літе-ра-тур-них джерел, зді-й-снила дослідження і статистичну обробку отриманих даних).
2. Кметь О. Г., Заморський І.І. Коригуючий вплив пірацетаму та мемантину на функціональний стан центральної нервової системи за умов гострої гіпоксії // Ліки. – 2004. – №3 – 4. – С. 19-23. (Дисертантом самостійно проведено дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).
3. Кметь О. Г. Вплив різних доз пірацетаму на стан прооксидантно-антиоксидантної рівноваги головного мозку за гострої гіпоксії // Буковинський медичний вісник. – 2004. – Т.8, №3. – С. 164 - 168.
4. Кметь О. Г., Заморський І.І. Вплив поєднаного уведення пірацетаму та мемантину на стан проксидантно-антиоксидантного балансу в головному мозку після гострої гіпоксії // Буковинський медичний вісник. – 2005. – Т.9, №2. – С. 114 - 116. (Дисертант самостійно провела дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).
5. Кметь О. Г. Вплив окремого і поєднаного застосування пірацетаму та мемантину на стан прооксидантно-антиоксидантної рівноваги головного мозку за умов гострої гіпоксії у статевозрілих щурів // Медицина сегодня и завтра. – 2005. - № 1. – С. 24 – 27.
6. Деклараційний патент на винахід 4864 Україна, 7 А61К31/00, А61Р9/00, Спосіб корекції гіпоксичних станів / Кметь О. Г., Заморський І. І. (Україна) - №20040503441; Заявл. 06.05.2004; Опубл. 15.02.2005; Бюлетень № 2. – 4 с (Дисертант самостійно здійснила дослідження статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).
7. Заморський І. І., Кметь О. Г. Модель виявлення вікової чутливості до дії ксенобіотиків за ішемічно-реперфузійного пошкодження головного мозку // Тези доп. наук. конференції “Вікові аспекти чутливості організму до ксенобіотиків”. – Чернівці: Медик, 2002. – С. 6. (Дисертант самостійно здійснила дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).
8. Кметь О. Г. Ноотропні ефекти поєднаного застосування пірацетаму та амантадину за гострої гіпоксії // Хист. – 2004. – вип. 5: Тези 78-ої підсумкової наук. конференції студентів та молодих вчених з міжнародною участю, Чернівці, 2004. – С. 79.
9. Кметь О. Г. Порівняльна характеристика впливу пірацетаму та мемантину на пероксидне окиснення білків у корі великих півкуль за їх окремого та поєднаного введення при гіпоксії // Тези доп. 65-ої наук. конференції з міжнародною участю студентів та молодих вчених. Ї Львів, 2004. – С. 426-427.
10. Кметь О. Г. Стан антиоксидантного захисту нейронів кори великих півкуль та гіпокампу за окремого та поєднаного введення пірацетаму та мемантину при гіпоксії // Тези доп. Х конгресу СФУЛТ. – Чернівці-Київ-Чикаго, 2004. Ї С.511.
11. Кметь О. Г. Стан пероксидного окиснення білків у структурах головного мозку за гострої гіпоксії при окремому і поєднаному застосуванні пірацетаму та мемантину // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю „Створення , виробництво, стандартизація, фармако-економіка лікарських засобів та біологічно активних добавок”. – Тернопіль, 2004. – С. 372-374.
12. Кметь О. Г., Заморський І. І. Активність лактатдегідрогенази в головному мозку щурів при окремому та поєднаному введенні пірацетаму і мемантину за умов гострої гіпоксії // Тези доп. міжнародної науково-практичної конференції молодих вчених ”Вчені майбутнього”. Ї Одеса, 2004. Ї С. 32-33. (Дисертант самостійно здійснила дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).
13. Кметь О. Г., Щупачинська А. Б., Дрогомирецький С. І. Вплив окремого та поєднаного введення пірацетаму та мемантину на активність прооксидантно-антиоксидантної системи головного мозку статевозрілих щурів за гострої гіпоксії // Хист. – 2005. – вип. 7: Матеріали ІІ міжнародної медико-фармацевтичної конференції студентів та молодих вчених, Чернівці, 2005. – С. . (Кметь О. Г. самостійно здійснила дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).
14. Кметь О. Г. Вплив окремого та поєднаного введення пірацетаму та мемантину на активність Na+, К+- АТФази у корі головного мозку статевозрілих щурів за гострої гіпоксії // Тези доп. наукової конференції молодих вчених ”Актуальні проблеми старіння”, присвяченої пам’яті академіка Володимира Веніаміновича Фролькіса. Ї Київ, 2005. Ї С. 69.
15. Кметь О. Г., Заморський І. І., Мандрюк Л. В. Вплив поєднаного введення пірацетаму та мемантину на стан антиоксидантного захисту нейронів за умов гострої гіпоксії // Тези доп. конгресу ФУЛТ. – Івано-Франківськ-Київ, 2005. Ї С. 511. (Кметь О. Г. самостійно здійснила дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).
16. Кметь О. Г., Заморський І.І Амантадин потенціює дію пірацетаму у попередженні вільно радикального окислення білків нервової тканини за умов гострої гіпоксії // Матеріали VI Національного з’їзду фармацевтів України „Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України”. – Харків, 2005. – С. 529. (Дисертант самостійно здійснила дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).
АНОТАЦІЯ
Кметь О. Г. Підвищення ефективності пірацетаму за гострої гіпоксії шляхом застосування блокаторів глутаматних рецепторів. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступення кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 – фармакологія. - Одеський державний медичний університет МОЗ України. Одеса, 2006.
Дисертація присвячена вивченню ефективності окремого і поєднаного застосування пірацетаму та блокаторів NMDA-глутаматних рецепторів (мемантину та амантадину) за умов гострої гіпобаричної гіпоксії. Доведено, що пірацетам у дозі 200 мг/кг найбільш досторівно нормалізує функціональну активність центральної нервової системи після впливу гострої гіпоксії. Спільне застосування пірацетаму (200 мг/кг) та блокаторів глутаматних рецепторів (мемантину (10 мг/кг) та амантадину (100 мг/кг)) викликає зміни в досліджуваних структурах головного мозку тварин подібні до тих, що зареєстровані при окремому застосуванні даних лікарських засобів. Водночас, поєднане попереднє введення пірацетаму та мемантину істотніше нормалізує стан прооксидантно-антиоксидантної системи головного мозку статевонезрілих щурів за умов гострої гіпоксії, ніж окреме введення препаратів, та діє ефективніше, ніж поєднане введення пірацетаму та амантадину.
Ключові слова: центральна нервова система, гостра гіпобарична гіпоксія, пірацетам, блокатори глутаматних рецепторів.
АННОТАЦИЯ
Кметь О. Г. Увеличение эффективности пирацетама при острой гипоксии путем применения блокаторов глутаматных рецепторов. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 – фармакология. Одесский государственный медицинский университет МЗ Украины. Одесса, 2006.
Диссертация посвящена изучению эффективности совместного применения пирацетама и блокаторов глутаматных рецепторов (мемантина и амантадина) в условиях острой гипобарической гипоксии у неполовозрелых и половозрелых крыс. Острую гипобарическую гипоксию моделировали в модифицированной проточной барокамере, имитируя подъем крыс на высоту 12000 м, которая является критической для выживания животных данного вида. На “высотном плато” крыс выдерживали до момента второго агонального вдоха, после чего “опускали” на прежнюю нулевую высоту.
Доказано, что пирацетам в дозе 200 мг/кг при внутрибрюшинном введении более эффективно нормализирует функциональную активность центральной нервной системы после воздействия острой гипоксии, что обосновало дальнейшее применение пирацетама именно в такой дозе. Совместное применение пирацетама (200
