АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА

КАЛІНІЧЕНКО СВІТЛАНА ВІКТОРІВНА

УДК 537.868.047:579.871.1(043.3)

ВПЛИВ ЕЛЕКТРОМАГНІТНИХ ПОЛІВ НА БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ТОКСИНОУТВОРЮЮЧИХ КОРИНЕБАКТЕРІЙ

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата медичних наук

Харків – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Бабич Євген Михайлович,

Інститут мікробіології та імунології

ім. І.І. Мечникова АМН України,

завідувач лабораторії специфічної

профілактики краплинних інфекцій

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Мінухін Валерій Володимирович,

Харківський державний медичний університет

МОЗ України, професор кафедри мікробіології,

вірусології та імунології

доктор біологічних наук, професор

Варбанець Людмила Дмитрівна,

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д.К. Заболотного НАН України,

завідуюча відділом біохімії мікроорганізмів

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім Л.В. Громашевського АМН України, м.Київ

Захист дисертації відбудеться “ 22 червня 2006 р. о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14/16).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України (61057, м.Харків, вул. Пушкінська, 14/16).

Автореферат розісланий “ 17 травня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01

к.мед.н., с.н.с. Бруснік С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Реалізація епідемічного процесу дифтерійної інфекції на тлі вакцинопрофілактики відбувається переважно у вигляді бактеріоносійства, рівень якого може суттєво змінюватись (Деміховська О.В., Чудна Л.М., 1999; Мохорт Г.А., та співав., 2001). Різна інтенсивність циркуляції штамів пов’язана з періодичними формуваннями епідемічно значущих, тобто більш вірулентних та пристосованих до колонізації епітелію популяцій збудника (Онищенко Т.Є., Мірошниченко В.П., 2002; Мельников В.Г. и соавт., 2004).

Передача патогенів від інфікованих до здорових осіб у значній мірі обумовлена здатністю бактерій проникати через природні бар’єри та протидіяти неспецифічним факторам захисту організму людини (Волянський Ю.Л., Бабич Є.М. і співав., 1999; Young D. et al., 2002; Беляев Н.Е., 2004).

Ключовим механізмом заселення є адгезія бактерій, у той час як інвазію мікробів у міжклітинні прошарки обумовлюють, насамперед, гіалуронідаза і нейрамінідаза, а також антикомплементарні властивості бактерій (Бухарин О.В., 2000; Klemm P., Schembri M.A., 2000; Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. и соавт., 2003).

Ступінь активності прояву вказаних ознак обумовлює в значній мірі епідемічну значущість циркулюючих штамів (Костюкова Н.Н., 2001). У зв’язку з цим важливо знати, які фактори сприяють формуванню популяцій збудника дифтерії з різною здатністю бактерій до персистенції.

Найбільш обґрунтованою є точка зору про наявність зв’язку між популяційними змінами патогенних бактерій, у тому числі і коринебактерій, та циклічною діяльністю Сонця (Чижевський А.Л., 1931; Вельховер С.Т., 1937; Чернощеков К.А., Лепехин А.В., 1993). Так, у роки з мінімальною сонячною активністю, в більшості країн Європи спостерігалось підвищення питомої ваги штамів токсиноутворюючих коринебактерій і ріст випадків захворювань на дифтерію. Ця тенденція відмічена і іншими вченими по відношенню до геомагнітних збурень (Sister F.D., Senftle F.E., 1961). Послідуючі роботи по вивченню впливу різних фізичних чинників на біологічні властивості збудників дифтерії показали, що оптичні (лазерні) та ультрафіолетові промені, зокрема, можуть викликати активацію гену токсигенності, зниження адгезивних властивостей, зміну антикомплементарної та антилізоцимної активності у досліджених бактерій (Мироненко Л.Г., 2001; Бирюкова С.В. и соавт., 2003; Волянський Ю.Л. та співав., 2004).

Приведені роботи присвячені дослідженням адаптуючих змін лише окремих ознак патогенів, що сприяють персистенції збудника. Не визначені особливості дії фізичних факторів на продукцію коринебактеріями гіалуронідази та нейрамінідази, які забезпечують високі інвазивні властивості, не розкритими залишаються питання впливу хвильових чинників на кінетику росту та антикомплементарну активність штамів. Кожна із перелічених ознак не може охарактеризувати персистуючу здатність циркулюючих штамів. В роботі вперше за основу взятий комплексний підхід до вивчення впливу фізичних індукторів на формування епідемічно значущих варіантів збудника дифтерії. Друга методична особливість роботи полягає в тому, що для експериментальних досліджень були застосовані низькоенергетичні фізичні чинники, які за частотним діапазоном та потужністю потоку близькі окремим складовим природного електромагнітного фону. До найбільш перспективних з них відносяться міліметрові випромінювання, мішенню для яких, частіше всього, є клітинні мембрани та їх окремі ділянки, які знаходяться в природному збудженому стані в частотному діапазоні 30-300 ГГц (Девятков Н.Д. и соавт., 1968; Frцhlich H., 1980; Кивва Ф.В., 1999).

Вивчення впливу низькоенергетичних електромагнітних факторів на окремі біооб’єкти (ентеробактерії, неферментуючі грам-негативні бактерії, Candida spp., Staphylococcus spp., та ін.) дозволило виявити найбільш активні індуктори, до яких віднесені міліметрові хвилі в частотних діапазонах 40,0 ГГц; 42,2 ГГц; 50,3 ГГц; 58,0 ГГц; 61,0 ГГц та 64,5 ГГц. Вони з успіхом застосовуються для прискорення накопичення маси біотехнологічно значимих мікроорганізмів, стимулювання продукції клітинами корисних сполук, стимуляції транспорту іонів тощо (Гемба В.Н., 1991; Baranski S., Czerski P., 1996; Чалий О.В., 2001; Byrd E.A., 2002; Тамбиев А.Х. и соавт., 2003; Майбородин А.В. и соавт., 2004; Самуилов В.Д., 2005).

Приведені результати послужили орієнтиром при виборі фізичних чинників для опромінення токсиноутворюючих коринебактерій. На сьогоднішній день питання про вплив їх на біологічні властивості даних патогенів залишаються не повністю з’ясованими. Обраний напрямок досліджень може стати перспективним не тільки для з’ясування в експериментах окремих особливостей формування епідемічно значущих популяцій збудника дифтерії, але й для розробки технологій одержання штамів коринебактерій із заданими біологічними властивостями.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом планової науково-дослідної роботи ІМІ ім. І.І. Мечникова АМН України „Вплив електромагнітних полів в широкому діапазоні частот на біологічні властивості збудників дифтерії та кашлюку” № держреєстрації 0103U001403. Дисертант є співвиконавцем вказаної наукової роботи.

Мета й завдання дослідження. Мета роботи – вивчити ефективність застосування низькоенергетичних міліметрових хвиль як індукторів цілеспрямованих змін біологічних властивостей токсиноутворюючих коринебактерій.

Для досягнення поставленої мети сформульовано такі завдання:

1. Вивчити вплив надзвичайновисокочастотного (НЗВЧ) опромінення на кінетику росту та процеси токсиноутворення у патогенних коринебактерій.

2. З'ясувати характер змін інвазивних властивостей коринебактерій після впливу на них НЗВЧ-опромінення.

3. Дослідити вплив НЗВЧ-опромінення на адгезивні властивості токсиноутворюючих коринебактерій.

4. Вивчити вплив НЗВЧ-опромінення на антикомплементарні властивості патогенних коринебактерій

5. Провести дослідження репаративних процесів у коринебактерій при застосуванні міліметрових хвиль різного частотного діапазону.

Об’єкт дослідження: токсиноутворюючі коринебактерії, ферменти коринебактерій, фізичні чинники впливу.

Предмет дослідження: біологічні властивості коринебактерій (кінетика росту, ферментативна активність, токсиноутворення, адгезивна активність мікроорганізмів, фактори інвазії, захисні процеси).

Методи дослідження: мікробіологічні, фізичні, біохімічні, математико-статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше визначені особливості впливу міліметрових хвиль різних частотних діапазонів (40,0 ГГц; 42,2 ГГц; 50,3 ГГц; 58,0 ГГц; 61,0 ГГц та 64,5 ГГц) на кінетику росту токсиноутворюючих коринебактерій, динаміку підвищення та зниження адгезивних властивостей опромінених тест-культур у порівнянні з неопроміненими, формування штамів з різними інвазивними властивостями за гіалуронідазною, нейрамінідазною активностями та антикомплементарною здатністю.

Встановлено, що зазначені фізичні чинники викликають адаптивні зміни захисних реакцій у біооб’єктів та стимулюють процеси по відновленню втрачених властивостей у патогенних коринебактерій, як то розщеплення глюкози, крохмалю, наявність каталазної активності.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлення стимулюючого впливу міліметрових хвиль на кінетику росту коринебактерій має практичне значення щодо розробки фізичних технологій в разі необхідності накопичення мікробної маси та одержання окремих продуктів метаболізму.

Отримані експериментальні дані, щодо стимулювання міліметровими хвилями захисних систем коринебактерій та процесів відновлення втрачених біологічних властивостей, відкривають перспективу застосування міліметрових хвиль в частотному діапазоні 61,0 ГГц для забезпечення стабільності біологічних властивостей штамів-продуцентів.

На основі вивчення впливу міліметрових хвиль на адгезивні процеси автор розробив спосіб модуляції адгезивних властивостей мікроорганізмів та отримав позитивне рішення про видачу патенту України на винахід (№ а 2005 07329, від 22.07.05 р.).

Особистий внесок здобувача. Автором проведено патентно-інформаційний пошук й аналіз літератури за темою дисертації. Особисто виконано практичну та експериментальну частини роботи: зокрема вивчення біологічних властивостей токсиноутворюючих коринебактерій; дослідження впливу різних діапазонів міліметрових хвиль на кінетику росту, токсиноутворення, адгезивну активність, патогенні властивості, проведення статистичної обробки результатів досліджень та оформлення дисертації. Розділи роботи, які пов’язані з вивченням впливу фізичних факторів на збудників дифтерії, виконані здобувачем на базах Інституту радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України, біохімічні - біохімічної лабораторії Державного наукового-експертного фармакопейного центру, бактеріологічної і санітарно-гігієнічної лабораторій СЕС Орджонікідзевського району м. Харкова. Постановка мети, завдань та обговорення одержаних результатів проводилась спільно з науковим керівником та співробітниками Інституту радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України.

Автор висловлює щиру подяку лікарям-бактеріологам СЕС Орджонікідзевського, Червонозаводського, Комінтернівського, Жовтневого районів м. Харкова та міської СЕС за допомогу в наданні клінічного матеріалу для досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення дисертації доповідались та обговорювались на Міжнародній науковій конференції “Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями” (м. Харків, 23-24 жовтня 2003 р.); 6-ій підсумковій регіональній конференції, присвяченій 80-річчю санепідемслужби України (м. Харків, 19-20 грудня 2003 р.); Міжвузівській конференції молодих вчених “Медицина третього тисячоліття” (м. Харків, 20 січня 2004 р.); X з’їзді Товариства мікробіологів України (м. Одеса, 15-17 вересня 2004 р.); ХІV з’їзді мікробіологів, епідеміологів та паразитологів України (м. Полтава, 2004 р.); 7-ій підсумковій регіональній конференції, присвяченій 200-річчю Харківської вищої медицинської школи (м. Харків, 20-21 грудня 2004 р.); 2-му Міжнародному радіоелектронному форумі “Прикладная радиоэлектроника. Состояние и перспективы развития” (м. Харків, 19-23 вересня 2005 р.); Міжнародній науковій конференції “Актуальные вопросы борьбы с инфекционными заболеваниями в гуманной и ветеринарной медицине” (Харків, 28-30 листопада 2005 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 16 наукових праць, у тому числі 6 статей у фахових виданнях, визначених ВАК України, із них 4 самостійно.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 166 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів досліджень, висновків. Робота ілюстрована 37 таблицями та 17 рисунками. Список використаних джерел, який викладено на 27 сторінках, містить 255 посилань, серед яких українською та російською мовами 155 та 100 робіт іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Огляд літератури включає 3 підрозділи, в яких розглянуто характеристику патогенних представників роду Corynebacterium, як чинників різних захворювань, та умови їх персистенції в організмі людини; проаналізовано дані щодо впливу електромагнітних полів на біооб’єкти, в тому числі і на мікроорганізми, охарактеризовано можливі механізми біологічної дії низькоенергетичних електромагнітних полів.

Матеріали і методи досліджень. Взято в досліди 98 циркулюючих та 14 музейних штамів токсиноутворюючих коринебактерій, одержаних із бактеріологічних лабораторій СЕС м. Харкова.

Джерелами мікрохвильового випромінювання служили стандартні високочастотні генератори Г4-141 і Г4-142 з діапазоном частот для Г4-141: f1=37,5-53,57 ГГц; для Г4-142: f2=53,57-78,33 ГГц та середньою щільністю потоку потужності енергії - 0,1 мВт/см2. У якості фактору ушкодження мікробних клітин використовували ртутно-кварцеву лампу ПРК-4, яка забезпечує діапазон ультрафіолетового опромінення (УФО, л=240-578 нм). Усі використані в дослідах прилади фізичних індукторів були надані Інститутом радіофізики і електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України згідно з “Договором о научно-техническом сотрудничестве между Институтом радиофизики и электроники им. А.Я. Усикова НАН Украины и Институтом микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины” від 31 жовтня 2003 р. (атестат акредитації № 100-1573/2004, дійсний до 25.11.2007 р., виданий Державним комітетом України з питань технічного регулювання та споживчої політики).

Опромінення проводили за наведеною нижче методикою: скляні пробірки, що містили мікробну суспензію у фізіологічному розчині (рН=7,2), при кімнатній температурі, без перемішування, розташовували на невеликій відстані від розкриву рупорної антени. Умови проведення досліджень змінювали за діапазоном та тривалістю опромінення.

В експериментах проведено вивчення впливу НЗВЧ-опромінення (міліметрові хвилі) певних діапазонів частот (40,0 ГГц; 42,2 ГГц; 50,3 ГГц; 58,0 ГГц; 61,0 ГГц та 64,5 ГГц) на кінетику росту коринебактерій – 60 штамів, на швидкість розщеплення глюкози – 30 штамів, на активність окремих ферментів енергетичного обміну (НАД-залежної дегідрогенази і цитратсинтетази) – 20 штамів, інвазивні та патогенні властивості коринебактерій (токсиноутворення, адгезивні процеси, антикомплементарна активність, активність гіалуронідази, нейрамінідази й уреази) – 101 штам, а у 14 штамів проведено вивчення протекторної дії міліметрових хвиль. Синхронізацію культур проводили за допомогою дії низької температури (Баснакьян И.А., 1992).

Виділення мікробів проводили у відповідності з Наказом №192 від 03.08.1999 р. МОЗ України. Ідентифікацію коринебактерій здійснювали за допомогою мікротест-систем ММТ D (PLIVA-Lachema а.s., Чехія).

Приготування суспензій мікроорганізмів із визначеною концентрацією мікробних клітин проводили за допомогою електронного приладу Densi-La-Meter (PLIVA-Lachema а.s., Чехія) по шкалі McFarland згідно з інструкцією до приладу. Кінетику росту вивчали за приростом біомаси за визначену кількість часу (S. John Pirt, 1975).

Для визначення впливу міліметрових хвиль на кінетику росту коринебактерій проводили опромінення тест-культур засіяних у бульйонний субстрат, тест-культур у фізіологічному розчині та незасіяного бульйонного субстрату. Після впливу фізичних чинників опромінені тест-культури засівали в неопромінений бульйон, а в зразки опроміненого рідкого живильного середовища вносили неопромінені культури мікроорганізмів. Контролями служили не оброблені фізичними індукторами тест-культури, засіяні в неопромінений бульйонний субстрат. Усі види експериментальних зразків, разом з контрольними, вирощували при 37 0С. Концентрацію мікробних клітин визначали через 4, 8 та 18 годин культивування.

Швидкість розщеплення глюкози вивчали за часом зміни забарвлення субстрату з індикатором (Герхардт Ф., 1984). Продукцію екзотоксину визначали за допомогою методу дискодифузії у агаровому гелі, згідно з “Методическими рекомендациями по применению модифицированной среды Пизу и индикаторных бумажных дисков для идентификации, биохимического типирования и определения токсигенности дифтерийных бактерий” (Ю.Г. Фельдман та ін., 1988).

Адгезивні властивості токсиноутворюючих коринебактерій вивчали за методикою Брилиса В.И. та ін. (1986).

Активність уреази визначали за швидкістю розщеплення відповідного субстрату за стандартною методикою (Герхардт Ф., 1984). Гіалуронідазну активність виявляли за схемою McClean у модифікації Кур'яти Н.В. (2005), в якості субстрату використовували комерційний препарат гіалуронової кислоти (OXOID Ld, England). Вивчення нейрамінідазної активності здійснювали із використанням комерційних тест-систем NEIRAMINOtest (API bioMerieux, France). При визначені ступеню активності даного ензиму користувалися шкалою, згідно якої активність ферменту оцінювалась як низька за показниками в межах 0–2,0 ммоль/мл, середня – 2,1-8,9 ммоль/мл, висока – 9,0-16,0 ммоль/мл, дуже висока – 16,1 ммоль/мл і вище (Вишнякова Л.А., Резцова Ю.В., 1990).

Антикомплементарну активність (АКА) штамів коринебактерій визначали за допомогою фотометричного методу (Брудастов Ю.А., 1992; Лабинская, 2004).

Вивчення ферментів, асоційованих з циклом трикарбонових кислот, здійснювали у безклітинному гомогенаті стандартними методиками (Atkinson D.E., 1977; Muller-Kraft G., Babel W., 1983).

Визначення кількості життєздатних мікроорганізмів проводили шляхом підрахунку колонієутворюючих одиниць (КУО) у відповідній кількості посівного матеріалу (Турьянова М.Х., Каппа М., 1995).

Досліди проводили в трьох – чотирьох повтореннях. Результати аналізували статистично (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962; Гельман В.Я., 2002) за допомогою комп’ютерних програм Microsoft Excel 2000 та "Biostat-4" (Лапач С.Н. та співавт., 2000).

Результати досліджень та їх аналіз. Результати власних досліджень викладено в третьому-шостому розділах.

Виходячи з даних літератури відносно того, що міліметрові хвилі частотних діапазонів 40,0 ГГц; 42,2 ГГц; 50,3 ГГц; 58,0 ГГц; 61,0 ГГц і 64,5 ГГц припустимо орієнтовані на активацію енергії збудження атомів та є найбільш активними індукторами, які застосовуються в біотехнологічних процесах, у роботі проведено, в першу чергу, вивчення впливу цих фізичних чинників на біологічні властивості токсиноутворюючих коринебактерій (кінетику росту, розщеплення глюкози, активність ферментів, адгезивні властивості, фактори патогенності і інвазії та процеси відновлення захисних систем після застосування ушкоджуючого впливу).

Встановлено, що зміни біологічних властивостей токсиноутворюючих коринебактерій відбувались при впливі фізичних чинників на біооб’єкти впродовж 8-ми годин.

Дослідження показали, що на кінетику росту впливали міліметрові хвилі двох із шести досліджених частотних діапазонів – 42,2 ГГц та 61,0 ГГц. Причому зміни інтенсивності росту патогенних коринебактерій відбувались тільки в перші 8 годин їх вирощування. Через 18 годин культивування біооб’єктів показники концентрації мікробних клітин (конц. мк. кл.) в усіх досліджених зразках статистично не відрізнялись (табл. 1).

Застосування міліметрових хвиль у частотному діапазоні 61,0 ГГц приводило до стимулювання ростових процесів. Темпи приросту біомаси були найбільш високими в перші 4 години. Показники концентрації мікробних клітин в усіх дослідних зразках перевищували в 2,0-2,2 рази відповідні характеристики контрольних проб (р<0,001). Через 8 годин інкубації культур інтенсивність приросту в усіх експериментальних зразках уповільнилась, проте значення концентрації клітин все ж таки були вище на 15,2-29,5% у порівнянні з контролем (р<0,05).

При застосуванні міліметрових хвиль в частотному діапазоні 42,2 ГГц спостерігався, навпаки, статистично значимий ефект пригнічення кінетики росту досліджених мікробів. Він був найбільш вираженим у перші 4 години культивування коринебактерій (в 1,6-1,9 рази, р<0,05) і спостерігався продовж 8 годин (приріст біомаси у опромінених тест-культур досягав лише 71,4-80% від біомаси контрольних проб, р<0,05).

Таблиця 1

Вплив міліметрових хвиль у частотних діапазонах 42,2 ГГц і 61,0 ГГц на кінетику росту токсиноутворюючих коринебактерій

Час

вирощування | Середні показники (Mm)

конц. мк. кл. неопромінених бактерій в бульйоні (контроль) | Середні показники (Mm) конц. мк. кл. бульйонної культури після опромінення:

тест-культури

в діапазоні | бульйону

в діапазоні | тест-культури і бульйону

в діапазоні

42,2 ГГц | 61,0 ГГц | 42,2 ГГц | 61,0 ГГц | 42,2 ГГц | 61,0 ГГц

4 години |

0,053 ± 0,003 | 0,033 ± 0,004** | 0,11 ± 0,006** | 0,029 ± 0,003** | 0,12 ± 0,007** | 0,027 ± 0,002** | 0,12 ± 0,007**

8

годин |

0,105 ± 0,003 | 0,084 ± 0,003* | 0,123 ± 0,004* | 0,076 ± 0,004* | 0,136 ± 0,007* | 0,075 ± 0,003* | 0,121 ± 0,007*

18 годин |

0,307 ± 0,016 | 0,308 ± 0,005 | 0,314 ± 0,02 | 0,297 ± 0,015 | 0,320 ± 0,014 | 0,311 ± 0,008 | 0,321 ± 0,012

Примітки:

* - різниця достовірна, р<0,05;

** - різниця достовірна, р<0,001

Результати експериментів свідчать про те, що мікробні клітини досить швидко реагують на опромінюючий фактор. При цьому ростові властивості тест-культур змінюються не тільки в разі прямої дії міліметрових хвиль на клітини, але й при опосередкованому впливі на них через опромінені зразки рідкого поживного середовища.

Інтенсивність росту факультативних анаеробів обумовлена в першу чергу процесами, що впливають на гліколітичне розщеплення вуглеводів (насамперед глюкози) та активність окислювального катаболізму в аеробних умовах у циклі трикарбонових кислот. Для дослідження впливу міліметрових хвиль на кінетичні властивості токсиноутворюючих коринебактерій доцільним було вивчити ферментативну активність опромінених тест-культур відносно універсального джерела енергії – глюкози.

Застосування фізичних чинників у частотних діапазонах 40,0 ГГц; 50,3 ГГц; 58,0 ГГц та 64,5 ГГц не приводило до суттєвих змін швидкості ферментації глюкози. У той же час опромінення тест-культур у діапазоні 61,0 ГГц сприяло підвищенню каталітичної діяльності гліколітичних ферментів. Так, контрольні штами токсиноутворюючих коринебактерій утилізували глюкозу впродовж 6,3-7,5 годин, а після застосування фізичного чинника в частотному діапазоні 61,0 ГГц розщеплення біооб’єктами даного вуглеводу тривало всього 3,3-4,4 години, тобто ферментація глюкози відбувалась в 1,7-2,1 разів швидше порівняно з неопроміненими культурами (р<0,05). Під впливом міліметрових хвиль в діапазоні 42,2 ГГц ферментація глюкози коринебактеріями уповільнювалась на 1,5-2,2 години порівняно з контрольними культурами (р<0,05).

Зазначене дозволило припустити, що дані фізичні фактори можуть стимулювати чи пригнічувати ферментні системи бактеріальних клітин, зміна активності яких швидко позначається на кінетиці розвитку мікробів.

Подальшим етапом досліджень було вивчення активності ферментів циклу трикарбонових кислот – НАД-залежної дегідрогенази, яка каталізує реакції окислювального декарбоксилювання пірувату та ключового регуляторного ферменту цитратсинтетази, який визначає загальну швидкість циклу (рис. 1).

Як і в попередніх дослідах, на активність ензимів впливали тільки міліметрові хвилі в частотних діапазонах 42,2 ГГц та 61,0 ГГц. Перші з них викликали зниження активності НАД-залежної дегідрогенази, в середньому, у 1,2 рази (р<0,05); другі – стимулювали її активність в 1,2-1,3 рази (р<0,05). Щодо цитратсинтетази, то на її активність впливав фізичний індуктор тільки із частотою коливань 61,0 ГГц – він збільшував активність зазначеного ферменту в 1,2 рази (р<0,05).

Рис. 1. Активність ферментів циклу трикарбонових кислот

Формування епідемічно значущих популяцій збудника дифтерії пов’язано з високою здатністю бактерій заселяти слизові оболонки біологічних ніш людини. До основних механізмів, що забезпечують персистенцію бактерій, в тому числі і збудників інфекційних захворювань, відноситься здатність мікроорганізмів до адгезії.

Вивчення адгезивних властивостей циркулюючих коринебактерій, порівняно з музейними штамами, показало, що у свіжовилучених культур середні показники адгезії (СПА) були більш вищими – (4,26±0,12 – 4,78±0,18) проти (2,54±0,16 – 2,98±0,14) у музейних штамів.

Встановлено, що достовірні зміни показників адгезивного процесу були відмічені, як і в попередніх дослідах, тільки для двох діапазонів міліметрових хвиль – 42,2 ГГц і 61,0 ГГц (рис. 2).

Рис. 2. Зміна середнього показника адгезії (СПА) коринебактерій залежно від частотного діапазону

Опромінення тест-культур у частотному діапазоні 42,2 ГГц приводило до вираженого зниження показників адгезивного процесу в усіх, взятих в дослід, штамів патогенних коринебактерій. Так, середня кількість прикріплених на одному еритроциті бактерій знижувалась, порівняно з неопроміненими культурами, при вивченні музейних штамів у 1,6-2,1 рази (р<0,01), в разі опромінення циркулюючих штамів – відповідно в 1,9-2,3 рази (р<0,01). Кількість еритроцитів, що брали участь в адгезивному процесі, зменшувалась на 27,2-32,0% (р<0,05) при дослідженні музейних штамів коринебактерій, а вивчення цього показника після хвильового впливу у циркулюючих штамів – на 32,4-35,8% (р<0,05).

Міліметрові хвилі в діапазоні 61,0 ГГц викликали у опромінених тест-культур протилежний - стимулюючий ефект, який характеризувався значним підвищенням середніх показників адгезії у музейних тест-культур - (4,1±0,12 – 4,4±0,08) проти (2,54±0,16 – 2,98±0,14) (р<0,001), та коефіцієнту адгезії - (87,1±0,98 – 89,0±1,11)% проти (68,8±0,88 - 78,2±0,87)% (р<0,05). Така ж тенденція відзначена і у свіжовилучених штамів, у яких СПА та КА після опромінення збільшувались, в середньому, відповідно в 1,6 рази та 1,2 рази (р<0,01). Та обставина, що при різних частотних діапазонах спостерігаються протилежні за напрямком ефекти у опромінених бактерій, дозволяє визнати специфічність впливу на тест-культури хвильових індукторів.

Виявлені різнонаправлені ефекти впливу міліметрових хвиль на адгезивні властивості тест-культур притаманні в однаковій мірі для всіх взятих у досліди токсиноутворюючих коринебактерій не залежно від їх видової характеристики.

Проникненню бактерій крізь слизові оболонки сприяють специфічні ферменти. До них, в першу чергу, відноситься гіалуронідаза. Даний ензим розщеплює гіалуронову кислоту, яка перешкоджає бактеріям проникати через міжклітинні шляхи.

У роботі вперше досліджено гіалуронідазну активність патогенних коринебактерій після дії на них міліметрових хвиль. При визначені вихідної гіалуронідазної активності у виділених штамів було встановлено, що найбільш високу здатність розщеплювати відповідний субстрат проявляли штами Corynebacterium diphtheriae gravis токсигенний (C.d.gravis tox+) - (0,48±0,01) умовних одиниць (ум. од). У представників Corynebacterium diphtheriae mitis токсигенний (C.d.mitis tox+), Corynebacterium diphtheriae belfanti токсигенний (C.d.belfanti tox+) та Corynebacterium ulcerans токсигенний (C.ulcerans tox+) ця властивість виявилась менш вираженою - (0,32±0,015), (0,26±0,01) та (0,18±0,03) ум. од. відповідно (рис. 3).

Рис. 3. Активність гіалуронідаз у різних штамів токсиноутворюючих коринебактерій

Вивчення опромінених ізолятів коринебактерій показало, що індукуючий ефект викликали тільки хвильові чинники в частотному діапазоні 42,2 ГГц та 61,0 ГГц. Перші з них обумовлювали зниження в 1,6 рази, а другі, навпаки, підвищення в 1,5 рази гіалуронідазної активності у досліджених штамів (р<0,05). Застосування міліметрових хвиль з частотою коливань 40,0 ГГц; 50,3 ГГц; 58,0 ГГц та 64,5 ГГц не супроводжувалось достовірними змінами активності зазначеного ензиму у опромінених тест-культур.

До найбільш важливих інвазивних факторів відноситься також нейрамінідаза, яка розщеплює сіалові кислоти поверхневих рецепторів епітеліоцитів. Завдяки цьому останні набувають додаткову здатність взаємодіяти з адгезинами мікробів.

Встановлено, що всі досліджені штами токсиноутворюючих коринебактерій продукували фермент нейрамінідазу, але в різних концентраціях. Експериментально визначено, що музейні штами мали низьку активність цього ферменту. У циркулюючих культур активність нейрамінідази була від середньої до дуже високої (рис. 4).

Найбільш виражений індукуючий ефект щодо активності нейрамінідази проявляли міліметрові хвилі з коливанням 42,2 ГГц та 61,0 ГГц. Під впливом пригнічуючого чинника (42,2 ГГц) активність нейрамінідази зменшувалась у штамів C.d.gravis tox+ із вихідною низькою ферментативною здатністю - в 3 рази (р<0,01), а з більш високою – у 1,4-1,9 разів (р<0,05); у штамів C.d.mitis tox+ відповідно в 1,7 рази (р<0,05) та 1,2-1,4 рази (р<0,05); у представників C.d.belfanti tox+ - в 1,4 та 1,7 рази (р<0,05), а у C.ulcerans tox+ - в 1,5 та 2,7 рази (р<0,05). Застосування міліметрових хвиль у частотному діапазоні 61,0 ГГц обумовлювало підвищення нейрамінідазної активності у тест-культур C.d.gravis tox+ в 1,2-1,5 рази, у C.d.mitis tox+ - в 1,2-2,1 рази (р<0,05), у представників C.d.belfanti tox+ - в 1,2-2,4 рази (р<0,05), у ізолятів C.ulcerans tox+ в 1,4-2,3 рази (р<0,05).

Рис. 4. Розподіл циркулюючих штамів за активністю нейрамінідази

Зміна активності нейрамінідази внаслідок опромінення тест-культур іншими індукторами спостерігалась (залежно від виду коринебактерій), як в бік посилення (при впливі хвилями в діапазонах 40,0 ГГц; 58,0 ГГц і 64,5 ГГц), так і зниження розщеплення сіалових кислот (при дії міліметрових хвиль у діапазонах 40,0 ГГц; 50,3 ГГц і 64,5 ГГц).

Приведені результати свідчать про можливість застосування низькоенергетичних міліметрових хвиль, як індукторів змін ферментативної активності коринебактерій. Це дозволило б впливати на бажані ознаки тест-об’єктів і не посилювати при цьому активність ензимів, що пов’язані з патогенними властивостями збудника.

До ферментів агресії, які приймають участь у колонізації епітеліоцитів, відноситься і уреаза. Оскільки уреаза є одним із факторів патогенності бактерій, доцільним було проведення вивчення впливу міліметрових хвиль на активність цього ензиму в уреазопозитивних штамів C.ulcerans tox+.

Про зміну активності цього ензиму судили за швидкістю розщеплення відповідного субстрату (сечовини). Усі взяті у дослід штами мали досить високу уреазну активність – розщеплювали субстрат впродовж 6-8 хвилин.

Вивчення впливу міліметрових хвиль різних діапазонів на активність уреази показало, що індукуючий ефект викликали тільки хвильові чинники в частотному діапазоні 42,2 ГГц та 61,0 ГГц. Перші з них обумовлювали підвищення в 11,2 рази (р<0,001), а другі, навпаки, зниження в 4,3 рази швидкості розщеплення сечовини (р<0,01).

Персистенція збудника залежить від вираженості інвазивних властивостей та здатності патогена знижувати під час колонізації рівень захисних реакцій макроорганізму, в тому числі активність комплементу.

При визначенні здатності патогенів протистояти захисним реакціям макроорганізму було з’ясовано, що різні штами коринебактерій мають неоднакову антикомплементарну активність: більш вищу здатність до інактивації комплементу мали штами C.d.gravis tox+, а найменшу – штами C.ulcerans tox+.

Встановлено, що при впливі фізичних факторів в частотних діапазонах 40,0 ГГц; 42,2 ГГц; 50,3 ГГ4 58,0 ГГц; 64,5 ГГц і 61,0 ГГц – тільки останній посилював антикомплементарну активність штамів (табл. 2). У різних представників токсиноутворюючих коринебактерій вона збільшуваласть в 2,3-2,9 рази, порівняно з контрольними ізолятами (р<0,001).

Таблиця 2

Вплив міліметрових хвиль на антикомплементарну активність токсиноутворюючих коринебактерій (в перерахунку на одиниці С'Н50)

Діапазон частоти коливань

(ГГц) | Середні показники антикомплементарної активності (M±m) у представників:

C.d.gravis tox+ |

C.d.mitis tox+ |

C.d.belfanti tox+ | C.ulcerans tox+

40,0 | 2,9±0,23 | 2,7±0,2 | 2,5±0,19 | 2,1±0,18

42,2 | 2,7±0,21 | 2,5±0,22 | 2,3±0,21 | 2,0±0,2

50,3 | 2,9±0,18 | 2,7±0,23 | 2,5±0,2 | 2,1±0,21

58,0 | 2,9±0,21 | 2,7±0,19 | 2,5±0,22 | 2,1±0,19

61,0 | 6,7±0,12* | 6,4±0,17* | 6,5±0,15* | 6,2±0,17*

64,5 | 2,9±0,2 | 2,7±0,22 | 2,5±0,21 | 2,1±0,2

неопромінені | 2,9±0,22 | 2,7±0,21 | 2,5±0,22 | 2,1±0,17

Примітка. * - різниця достовірна, р<0,001

Відомо, що здатність до продукування екзотоксину є важливою ознакою при визначенні епідемічної значущості штамів коринебактерій. Тому окрема серія дослідів була присвячена вивченню впливу НЗВЧ-опромінення на цю характеристику.

Вивчення впливу міліметрових хвиль на процеси токсиноутворення у опромінених тест-культур дозволило з’ясувати, що дія фізичних факторів на біооб’єкти не приводила до змін даної біологічної властивості у патогенних коринебактерій.

Згідно з даними літератури, бактеріям притаманні спеціальні захисні системи, які забезпечують досить високу резистентність прокаріот до дії негативних факторів зовнішнього середовища (Kwee S.S., 2002; Banik S. et.al., 2003). На сьогоднішній день питання, щодо впливу фізичних чинників на захисні реакції бактеріальної клітини, вивчалися лише окремими вченими (Подгорский В.С. и соавт., 2004). У літературі більше уваги приділено особливостям пошкоджуючої дії ультрафіолетових (УФ) променів, температурного впливу та дії деяких хімічних агентів (Баснакьян И.А., 2003).

Зазначений напрямок досліджень має велике значення при необхідності збереження вихідних властивостей біотехнологічно значущих штамів-продуцентів.

Здатність коринебактерій протистояти пошкодженню вивчали за кількістю колонієутворуючих клітин у контрольних тест-культур, у субпопуляцій після дії на них ультрафіолетовими променями, а також у тест-культур, які опромінювали послідовно спочатку міліметровими хвилями, а потім ультрафіолетом, або навпаки.

Дослідження показали, що застосування ультрафіолетового чинника в усіх випадках приводило до різкого (29,8 разів) зниження кількості життєздатних бактерій порівняно з контрольними зразками (р<0,001).

Опромінення міліметровими хвилями тест-культур підвищувало їх резистентність до дії бактеріцидного фактора. Під впливом хвиль у частотних діапазонах 50,3 ГГц, 58,0 ГГц та 64,5 ГГц ультрафіолетові промені проявляли менш виражену пошкоджуючу дію на субпопуляції: при початковому опроміненні міліметровими хвилями зразків кількість колонієутворюючих одиниць була вищою в середньому в 3 рази, а в разі застосування їх після дії УФ – в 6 разів, порівняно з тест-культурами, які обробляли тільки ультрафіолетовим чинником (р<0,001). Міліметрові хвилі в частотному діапазоні 42,2 ГГц проявляли більш виражені протекторні властивості. Вони забезпечували збереження життєздатних клітин при застосуванні УФ променів відповідно в 4,3 рази та 12,3 рази більше, ніж вищезазначені чинники (р<0,001).

Ще активнішими виявились міліметрові хвилі з частотою 61,0 ГГц. У бактерій, опромінених спочатку ультрафіолетом, а потім міліметровими хвилями, або навпаки, протекторний ефект, відповідно, спостерігався у (73,49-74,97)% і (27,99-29,6)% клітин, тоді як при застосуванні міліметрових хвиль частотних діапазонів 40,0 ГГц, 50,3 ГГц, 58,0 ГГц та 64,5 ГГц питома вага життєздатних бактерій не перевищувала (19,34-19,65)% і (9,87-10,65)%, а в діапазоні 42,2 ГГц – здатними до колонієутворення залишалося (40,06-40,36)% і (13,99-14,14)% субпопуляцій (р<0,001) (табл. 3).

Таблиця 3

Вплив міліметрових хвиль діапазону 61,0 ГГц на колонієутворюючу здатність коринебактерій

Тест-культури | Середні показники життєздатних бактерій, КУО/мл (M±m)

C.d.gravis tox+ | C.d.mitis

tox+ | C.d.belfanti tox+ | C.ulcerans tox+

Неопромінені |

9,81 ± 0,28•109 | 9,79 ±

0,32•109 | 9,83 ±

0,29•109 | 9,86 ±

0,27•109

Опроміненні НЗВЧ | 9,79 ±

0,32•109 | 9,82 ±

0,29•109 | 9,81 ±

0,28•109 | 9,84 ±

0,28•109

Опроміненні УФО | 0,33 ±

0,021•109 | 0,32 ±

0,021•109 | 0,34 ±

0,021•109 | 0,29 ±

0,022•109

Опроміненні

НЗВЧ+УФО | 2,82 ±

0,09•109 | 2,74 ±

0,11•109 | 2,91 ±

0,09•109 | 2,87 ±

0,09•109

Опроміненні

УФО+НЗВЧ | 7,21 ±

0,12•109 | 7,34 ±

0,11•109 | 7,28 ±

0,12•109 | 7,26 ±

0,12•109

Примітка. *109 – перерахунок на ступінь розведення

Міліметрові хвилі в діапазоні 61,0 ГГц проявляли здатність стимулювати процеси щодо відновлення окремих біологічних властивостей музейних штамів бактерій, втрачених під час тривалого зберігання (понад 15 років). Так, відновлення каталазної активності спостерігалося у 98,88%, а відновлення ферментації глюкози у 89,52% ізолятів після одноразового опромінення 11 штамів тест-культур впродовж 30 хвилин. Дворазове опромінення сприяло відтворенню здатності продукувати каталазу в усіх ізолятах, а після трьохразового тридцятихвилинного застосування фізичного чинника вказане відбулося і по відношенню до розщеплення глюкози. Щодо розщеплення крохмалю, то після одноразового опромінення музейних культур відновлення цієї властивості спостерігалося лише у 53,3% ізолятів, і тільки п’ятиразове повторення впливу міліметрових хвиль впродовж 30 хвилин викликало формування гомогенної на 96,7% популяції по здатності розщепляти вказаний субстрат.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення впливу низькоенергетичних фізичних індукторів, що обумовлюють зміни біологічних властивостей токсиноутворюючих коринебактерій, і нове вирішення наукового завдання щодо встановлення ролі міліметрових хвиль різних частотних діапазонів у формуванні субпопуляцій патогенів з низькими та високими інвазивними властивостями.

Визначена можливість змінювати кінетику росту та антикомплементарні властивості, гіалуронідазну та нейрамінідазну активності у збудника дифтерії, що робить перспективними розробки нових технологій стосовно одержання штамів із заданими властивостями та прискорення процесів накопичення біомаси бактерій.

1. Встановлено, що застосування хвильового чинника в частотному діапазоні 42,2 ГГц викликає, впродовж фази логарифмічного розвитку тест-культур, зниження приросту біомаси субпопуляцій, а під впливом індуктора з коливанням 61,0 ГГц – в зазначеній стадії спостерігається підвищення кінетики росту коринебактерій.

2. Визначено, що опромінення в діапазоні 42,2 ГГц обумовлює пригнічення у біооб’єктів розщеплення гіалуронової кислоти, сіалових кислот, глюкози та зниження каталітичної здатності цитратсинтетази (р<0,05); в той час як індуктор з частотою 61,0 ГГц підвищує швидкість розщеплення глюкози і ферментації гіалуронової та сіалових кислот, збільшує активність цитратсинтетази та посилює протикомплементарну дію (р<0,05).

3. Міліметрові хвилі в частотних діапазонах 42,2 ГГц та 61,0 ГГц проявляють індукуючі властивості стосовно показників адгезивного процесу у патогенних коринебактерій. Застосування фізичного чинника із коливанням хвиль 42,2 ГГц обумовлює зниження здатності мікробних клітин прикріплюватись до еритроцитів, а міліметрові хвилі з частотою коливань 61,0 ГГц, навпаки, викликають стимулюючий ефект.

4. Показано, що фізичні чинники викликають зміну уреазної активністі у штамів C.ulcerans tox+. Опромінення біооб’єктів в діапазоні 42,2 ГГц сприяє підвищенню швидкості розщеплення сечовини, в той час як застосування індуктора з коливанням 61,0 ГГц призводить до уповільнення ферментативного процесу.

5. Встановлено, що міліметрові хвилі усіх досліджених діапазонів мають виражений захисний ефект. Застосування їх до впливу ультрафіолету на коринебактерії знижує пошкоджуючу дію останнього в 3-7,7 рази (р<0,001). При використанні міліметрових хвиль після обробки тест-культур ультрафіолетом спостерігався ще більш виражений захисний ефект. Ще більш виражений (в 6-14 разів) захисний ефект спостерігався при використанні міліметрових хвиль після обробки тест-культур ультрафіолетовим опроміненням.

6. Визначено, що міліметрові хвилі в частотному діапазоні 61,0 ГГц стимулюють відновлення втрачених за роки зберігання біологічних ознак токсиноутворюючих коринебактерій (каталазної активності, часу ферментування глюкози та крохмалю) після п’ятиразового опромінення впродовж 30 хвилин.

7. Стабільність змін у біологічних властивостях досліджених штамів коринебактерій після впливу фізичними індукторами зберігалась продовж 3-5 пасажів. Це робить перспективними розробки нових технологій щодо отримання штамів із заданими властивостями.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Калініченко С.В. Вплив електромагнітних хвиль надтовисокочастотного діапазону на адгезивні властивості коринебактерій // Вісник Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна. Серія: Медицина. – 2004. - №639, вип.9. - С. 7-11.

2. Калініченко С.В. Вплив міліметрових хвиль на стійкість коринебактерій до негативних факторів фізичної природи // Вісник проблем біології і медицини. – 2005. - №2. - С. 70-74.

3. Калініченко С.В. Вплив міліметрових хвиль на алостеричну регуляцію ферментів коринебактерій, асоційованих із циклом трикарбонових кислот // Проблеми медичної науки та освіти. – 2005. - №2. - С. 81-83.

4. Влияние миллиметровых волн на ферментативную активность коринебактерий, продуцирующих экзотоксин / Волянский Ю.Л., Калиниченко С.В, Коваленко О.И., Кивва Ф.В., Бабич А.Е. // Експериментальна і клінічна медицина. – 2004. - № 2. - С. 36-39. (Здобувач визначив тривалість впливу та діапазони міліметрових хвиль, які призводили до зміни часу розщеплення глюкози, та зміни уреазної активності одного з біоваріантів коринебактерій, провів статистичну обробку та аналіз одержаних результатів, підготував матеріали до публікації).

5. Зміна антибіотикочутливості у збудників дифтерії та кашлюку під впливом електромагнітних хвиль міліметрового діапазону / Калініченко С.В., Колоколова О.Б., Бабич Є.М., Ківва Ф.В., Коваленко О.І., Верезуб Л.Г., Ткач Л.М., Перетятко О.Г., Ждамарова Л.А. // Вісник Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна. Серія: Медицина. – 2005. - №658, вип.10. - С. 72-77. (Здобувач визначив залежність зміни резистентності у збудників дифтерії до протимікробних засобів залежно від діапазону міліметрових хвиль, статистично обрахував, проаналізував результати та підготував матеріали до публікації).

6. Вплив міліметрових хвиль на активність нейрамінідази токсиноутворюючих коринебактерій / Калініченко С.В., Волянський Ю.Л., Бабич Є.М., Колоколова О.Б., Крестецька С.Л. // Вісник Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна. Серія: Медицина. – 2005. - №705, вип.11. – С. 5-9. (Здобувач визначив залежність зміни активності нейрамінідази залежно від діапазону впливу міліметрових хвиль, статистично обрахував, проаналізував результати та підготував матеріали до публікації).

7. Калініченко С.В. Вплив електромагнітних полів на мікроорганізми (огляд літератури) // Анали Мечниківського Інституту. – 2005. - №1. - С. 108-119. ()

8. О некоторых особенностях влияния электромагнитного излучения на биологические объекты разных классов / Коваленко О.И., Кивва Ф.В., Сукач Л.А., Калиниченко С.В., Бабич Е.М. // Эпидемиология, экология и гигиена: Сборник материалов 6-ой итоговой региональной конференции, посвященной 80-летию санэпидслужбы