ІНСТИТУТ ГІГІЄНИ ТА МЕДИЧНОЇ ЕКОЛОГІЇ ІМ. О.М. МАРЗЕЄВА

АМН УКРАЇНИ

КМЕТЬ ТАРАС ІГОРОВИЧ

УДК 616.273.2-085.214.21:612.017.2

ГІГІЄНІЧНЕ ЗНАЧЕННЯ КОМБІНОВАНОЇ ДІЇ НІТРАТУ НАТРІЮ ТА ХЛОРИДУ КАДМІЮ З УРАХУВАННЯМ ВІКОВИХ ОСОБЛИВОСТЕЙ ТА ХАРАКТЕРУ МЕТАБОЛІЗМУ

14.02.01. - Гігієна

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2006

Дисертація є рукопис.

Робота виконана в Буковинському державному медичному університеті

МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Власик Леонід Іванович

Буковинський державний медичний університет МОЗ України,

завідувач кафедри гігієни та екології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, Мудрий Іван Васильович, Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України, провідний науковий співробітник відділу гігієни пестицидів і агрохімікатів.

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Томашевська Людмила Анатоліївна, Інститут гігієни та медичної екології ім.О.М.Марзеєва АМН України, завідувач лабораторії токсикологічних досліджень

Провідна установа: Інститут медицини праці АМН України, лабораторія промислової токсикології та гігієни праці при використанні хімічних речовин, м. Київ.

Захист відбудеться „ 09 ” червня 2006 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.604.01 в Інституті гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України за адресою: 02094, м. Київ, вул. Попудренка, 50

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гігієни та медичної екології

ім. О.М. Марзеєва АМН України за адресою: м. Київ, вул. Попудренка, 50

Автореферат розісланий ” 05 ” травня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Б.Ю. Селезньов

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сталий економічний розвиток суспільства неможливий без створення оптимального середовища життєдіяльності для кожної людини. Безпосередню участь у вирішенні цієї проблеми займає профілактична медицина через виявлення та попередження шкідливої дії несприятливих факторів на організм. Сьогодні, поряд з можливістю організації профілактики на популяційному рівні, все більше багатообіцяючим стає підхід, який враховує в профілактичних рекомендаціях унікальність генотипу кожної людини (Викторов Т.В. та ін., 2003; Гармонов С. Ю. та ін., 2003; Яковлева О.А. та ін., 2000). Не випадково одним із пріоритетів, висунутих Європейським комітетом з довкілля та здоров’я, є ідентифікація найбільш уразливих груп населення, пошук маркерів чутливості і створення можливої стратегії їх захисту від впливу ксенобіотиків на виробництві та в побуті (Croes E.R., 1999; Suk W., Collman G. 1998).

В останні роки предметом інтенсивних досліджень стало вивчення ролі системи ацетилювання в схильності до шкідливої дії хімічних речовин. Існує припущення (Лубянова И.П. 2004; Pfost D.R. et al., 2000), що маркером схильності до дії несприятливих факторів навколишнього середовища, зокрема солей важких металів та сполук азоту виступає тип ацетилювання (Соблирова Ж.Х., Харина Е.А. 1999; Евгеньев М.И., та ін. 2002).

В Україні існують регіони з одночасним забрудненням важкими металами, зокрема кадмієм, а також нітратами, де їх надходження до організму перевищує гігієнічні нормативи в 5-10 разів (Горішна О.В. 2002; Грищенко С.В. та ін. 2004; Прокопов В.О., Тарабарова С.Б. та ін., 2000; Смоляр Н.І. та ін., 2004; Трахтенберг І.М. та ін., 1998). Враховуючи те, що їхні порогові концентрації встановлені без врахування віку та типу метаболізму, тобто дії на найбільш уразливі верстви населення, стає очевидною їх потенційна небезпека для цієї частини популяції.

З метою захисту населення від дії шкідливих хімічних факторів навколишнього середовища в останні роки увага бага-тьох науковців прикута до біологічної профілактики, під якою розуміють поєднане застосування різ-но-манітних природних і синтетичних загальнозміцнюючих засобів, що підвищують реак-тив-ність і резистентність організму, знижують ступінь ризику розвитку професійної та екологічно зу-мовленої патології (Зеленков В.Н., Заксас Н.П. 2000; Кацнельсон Б.А. та ін., 1999; Скальный А.В., Рудаков И.А. 2004; Шафран Л.М. та ін., 2004). До таких засобів відноситься ехінацея пурпурова, яка володіє антиоксидантними, адаптогенними, імуномодулюючими властивостями (Волошин О.І., Пішак В.П., 1999; Ганич О., 1996; Яковлєва Н.Ю. та ін., 1996). З літературних джерел відомі позитивні результати застосування препаратів ехінацеї пурпурової за умов впливу хімічних чинників, зокрема, свинцевої, нітратно-свинцевої інтоксикації (Дейнека С.Є., 1999; Янчук В.В., Власик Л.І., 2002). Проте досі не вивчалися протективні властивості ехінацеї пурпурової за одночасної дії нітрату натрію та хлориду кадмію з урахуванням віку та фенотипу ацетилювання.

З огляду на викладений стан проблеми, актуальність роботи зумовлена необхідністю вив-чен-ня впливу фенотипу ацетилювання та віку на перебіг шкідливих ефектів за умов комбінованого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію та обгрунтування на цій основі маркерів схильності і біо-хімічних критеріїв для гігієнічної оцінки обраного класу речовин, а також заходів біопрофілактики.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. У роботі узагальнено результати досліджень, за безпосередньої участі автора, проведених на кафед-рі гігієни та екології Буковинського державного медичного університету (м. Чернівці) згідно з планами НДР: “Аналіз дина-міки нітратного забруднення індивідуальних джерел водопостачання м.Чернівці і області, його вплив на стан здоров’я населення та експери-ментальне обгрунтування заходів профілактики шкідливої дії нітратів та сполук свинцю у віковому аспекті” (№ держреєстрації 01.00U005004); “Токсиколого-гігієнічна оцінка вікових та фенотипічних особливостей розвитку токсичних ефектів за умов комбінованої дії важких металів та нітратів” (№ держреєстрації: 0105000292).

Мета і завдання дослідження. На основі гігієнічної оцінки токсичних ефектів комбінованого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію запропонувати з урахуванням віку і особливостей характеру метаболізму біомаркери схильності та біохімічні критерії шкідливої дії, а також обгрунтувати застосування природних засобів біопрофілактики. Для досягнення поставленої мети були сформульовані такі основні завдання:

1.

2.

3.

4.

5.

Об’єкт дослідження – шкідливі ефекти хлориду кадмію та нітрату натрію з урахуванням віку та швидкості ацетилювання.

Предмет дослідження – комплекс параметрів, що визначають та характеризують шкідли-вий вплив нітрату натрію та хлориду кадмію, а також захисну дію настоянки ехінацеї пурпуро-вої.

Методи дослідження: гігієнічні; токсикологічні (гігієнічний лабораторний експеримент з моделюванням гострої і підгострої нітратно-кадмієвої інтоксикації); фізіологічні (оцінка функціонального стану центральної нервової системи); біохімічні (визначення активності ферментів у крові та печінці) та статистичні (обробка результатів) методи.

Наукова новизна одержаних результатів. У межах подальшого розвитку концепції еко-ге-не-тичного підходу доведено, що „повільний” тип ацетилювання має гігієнічне значення як маркер схильності до розвитку шкідливих ефектів за умов гострого впливу нітрату натрію та хлориду кад-мію незалежно від віку. Встановлено, що критеріями шкідливої дії у молодому віці можуть бути: ак-ти-вація процесів пероксидного окиснення білків плазми крові та пригнічення активності фер-мен-тів антиоксидантного захисту печінки (глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази); у доро-с-лих - зростання рівня середньомолекулярних пептидів сироватки крові та зниження вмісту ТБК-ак-тивних продуктів і активності ферментів антиоксидантного захисту (церулоплазміну та глута-тіон-пероксидази); у старих - активація процесів пероксидного окиснення білків плазми крові, зрос-тання рівня гемоглобіну, середньомолекурних пептидів, ТБК-активних продуктів. Доведено, що за умов підгострого впливу гігієнічне значення, як біохімічні критерії шкідливої дії нітрату нат-рію та хлориду кадмію, мають: зростання концентрації метгемоглобіну та зниження рівня гемо-г-лобіну у осіб зі „швидким” типом ацетилювання дорослого і старого віку, а також у молодих із „пові-льним” типом. Виявлено, що підгострий вплив модельних токсикантів викликав пригнічення ЦНС у молодому віці незалежно від типу метаболізму та у „повільних” ацетиляторів старого віку. Упер-ше доведено, що профілактичне застосування настоянки ехінацеї пурпурової за умов підгос-т-ро-го впливу нітрату натрію та хлориду кадмію забезпечувало більш виражену нормалізацію по-каз-ни-ків центральної нервової системи, стабілізацію рівня гемоглобіну і зниження метгемоглобінемії у до-рослих та старих осіб зі „швидким” типом ацетилювання, а також у молодих із „повільним” типом.

Практичне значення отриманих результатів. Матеріали досліджень використані при під-го-товці інформаційного листа „Система комплексної гігієнічної оцінки нітратно-кадмієвої ін-ток-си-кації” (затверджений проблемною комісією МОЗ України „Гігієна навколишнього середовища” /протокол №1 від 26.01.2006 р.). Науково обгрунтована можливість використання тесту аце-ти-лю-ван-ня як способу прогнозу схильності організму до токсичного впливу ксенобіотиків (патент 5050 Україна, 7 А61В10/00, G01N33/50, Спосіб прогнозування схильності організму до токсичного впли-ву ксенобіотиків / Кметь Т. І., Власик Л. І. - №20040604984; Заявл. 23.06.2004; Опубл. 15.02.2005; Бюл. №2). Проведені дослідження дозволяють рекомендувати профілактичне введення нас-тоянки ехінацеї пурупрової за умов комбінованого впливу полютантів особам різного віку в за-леж-ності від швидкості перебігу другої фази детоксикації ксенобіотиків. Результати роботи мо-жуть бути використані в навчальному процесі при викладанні курсів з гігієни та екології, токсикології і фармакології, медичної хімії.

Результати отримали впровадження у практичну діяльність Інституту екогігієни і токси-кології ім. Л.І. Медведя (м. Київ), науково-дослідного інституту медико-екологічних проблем МОЗ України (м. Чернівці), Українського науково-дослідного інституту промислової медицини (м. Кривий Ріг), у навчальні процеси кафедри загальної гігієни та екології Тернопільської державної медичної академії ім. І. Я. Горбачевського, кафедри гігієни і токсикології з курсом ФПДО Львівського національного медичного університету ім. Д. Галицького МОЗ України, кафедри гігієни та екології Буковинського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана аспірантом самостійно. Особистий внесок автора полягає у формулюванні мети і завдань досліджень, проведенні всього об’єму експериментальної частини роботи, опрацюванні наукової літератури, статистичній обробці результатів досліджень, аналізі та узагальненні одержаних даних, апробації результатів досліджень і підготовці до друку робіт.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення, висновки дисертаційної ро-бо-ти доповідались і обговорювались на: - науковій конфе-ренції “Вікові аспекти чутливості організму до ксенобіотиків” (Чернівці, 2002); - XIV з’зді гігієністів України (Дніпропетровськ, 2004); - II з’їзді Токсикологів України (Київ, 2004); - III Міжнародній науково-практичній кон-фе-рен-ції “Актуальні питання гігієни харчування та безпечності харчових продуктів” (Київ, 2004); - Все-українській науково-практичній конференції “Проблеми діагностики, профілактики та ліку-ва-н-ня екзогенних та ендогенних інтоксикацій” (Чернівці, 2004); - IY Національному конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004); - X конгресі світової федерації українських лікарських то-в--а-риств (СФУЛТ) (Чернівці, 2004); - 78-ій науковій конференції студентів та молодих вчених з міжнародною участю (Чернівці, 2004); - 57-ій міжнародній науково-практичній конференції сту-ден-тів та молодих учених (Ужгород, 2004); - 84-й, - 85-й, - 86-й підсумкових наукових ко-нфе-ренціях професорсько-викладацького складу Буковинського державного медичного університету (2003, 2004, 2005 рр.); - I Міжнародному конгресі „Медицина транспорту-2005” (м. Одеса, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 робіт, з них 8 статей (1 одноосібна), 1 інформаційний лист, 8 тез, отримано 1 патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Робота складається із вступу, огляду літератури, опису ме-то----дів досліджень, трьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів власних досліджень, висновків, списку використаної літератури. Дисертацію викладено на 156 сторінках друкованого тексту. Обсяг основного тексту становить 125 сторінок. Робота ілюстрована 37 таблицями, 9 рисунками. Список використаних літературних джерел налічує 285.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Загальна методика та основні методи дослідження. Для досягнення поставленої мети та реалізації передбачених завдань нами проведені експериментальні дослідження з урахуванням норм біоетики на білих конвенційних аутбредних щурах – самцях віком 1,5, 6 та 22 місяці.

Основні методи та обсяги досліджень наведені в таблиці.

Таблиця

Методи і обсяг виконаних досліджень

Показники | Кількість досліджень (проб)

1. Визначення типу ацетилювання у тварин | 940

2. Біохімічні дослідження в цільній крові:

-

235

-

3. Біохімічні дослідження в плазмі крові:

-

205

-

-

-

-

4. Біохімічні дослідження в еритроцитах:

-

42

-

-

5. Біохімічні дослідження в печінці:

-

235

-

-

-

-

-

-

-

-

6. Дослідження функціональної здатності ЦНС | 597

7. Загальна кількість щурів | 235

8. Проведення статистичної обробки отриманих результатів | 4275

Вибір нітрату натрію та хлориду кадмію як модельних токсикантів зумовлений: по-перше, значним забрудненням ними об’єктів довкілля (Мудрий І.В., 2001; Дубицький А.Ю. та ін., 1999); по-друге, наявністю у нітратів вираженої вікової чутливості (Гребняк Н.П. та ін., 1995); по-третє, можливістю (навіть при дотриманні ГДК для харчових продуктів) надходження до організму тільки з їжею такої кількості кадмію, яка перевищує рекомендовану ФАО/ВООЗ толерантну дозу в 7 разів для дітей та в 4 рази для дорослих (Satarug S. et al., 2004), а при перевищенні гігієнічних нормативів для повітря виробничих приміщень, атмосферного повітря, води водоймищ ще в 3-5 раз (Штабський Б.М., Гжегоцький М.Р., 1999); по-четверте, збільшується ризик комбінованого впливу сполук кадмію та нітратів на всі вікові групи населення через постійно зростаюче забруднення біосфери цими ксено-біотиками.

Для визначення ацетилюючої здатності тваринам вводили внутрішньошлунково (за допомо-гою зонда) сульфадимезин (на 1% крохмальному розчині), із розрахунку 100 мг/кг маси тіла. Про-тягом трьох годин у тварин збирали сечу, в якій визначали активність N-ацетилтрансферази [КФ 2.3.1.5.] за методом Пребсінг-Гаврилова в модифікації Тимофєєвої. За кількістю виділеного з сечею вільного та загального сульфадимезину дослідних тварин було поділено на дві групи: “швидкі” та “повільні” ацетилятори. У кожній групі виділено три підгрупи: I Ї контрольні тварини, II Ї тварини, яким вводили хлорид кадмію та нітрат натрію, III Ї тварини, яким вводили хлорид кадмію, нітрат натрію та настоянку ехінацеї пурпурової (“Фармацевтична фабрика” м. Київ, серія №30303). Кількість тварин у статистичній групі становила 7-8.

Підгостру інтокси-кацію моделювали шляхом внутрішньо-шлункового введення дослідним тваринам усіх вікових груп нітрату натрію в дозі 500 мг/кг маси тіла, що дорівнює 1/15 DL50 та хлориду кадмію - внутрішньоочеревинно в дозі 0,1 мг/кг, що дорівнює 1/150 DL50 упродовж 14 діб. Тваринам III підгрупи за 1,5 год до введення хлориду кадмію та нітрату натрію внут-рішньошлунково вводили спиртову настоянку ехінацеї пурпурової в дозі 0,25 мл/кг. Контрольній підгрупі тварин замість хлориду кадмію та нітрату натрію вводили, відповідно, ізотонічний розчин натрію хлорид (внутрішньоочеревинно) та водопровідну воду (внутрішньошлунково).

Гостру інтоксикацію моделювали шляхом одноразового введення хлориду кадмію (внутрішньоочеревинно) та нітрату натрію (внутрішньошлунково) в дозах близьких до Ѕ DL50.

За умов підгострої інтоксикації евтаназію щурів виконували через 24 години після останнього введення речовин під легким ефірним наркозом шляхом декапітації. За умов гострої дії ксенобіотиків декапітацію проводили на висоті загибелі тварин.

На фоні підгострого впли--ву нітрату натрію та хлориду кадмію і профілактичного застосування настоянки ехінацеї пурпурової на 7-й та 14-й дні експерименту у тварин різного віку вивчали функціональний стан ЦНС за показниками пове-дiн-кових реакцiй (Буреш Я., 1991).

Стан прооксидантної системи крові оцінювали за рівнем окиснювальної мо-ди--фікації білків (ОМБ) (Мещишен І.Ф., 1998); за активністю церулоплазміну (ЦП) (Колб В.Г., 1982) [КФ 1.16.3.1] за вмістом ТБК-активних продуктів (Васильєва Н.В., 1998) та активністю глу-та--тіонпероксидази (ГП) (Геруш І.В., 1998) у еритроцитах. Вивчення рівня ендогенної інтоксикації - за вмістом середньомолекулярних пептидів (СМП) у сироватці крові (Габриєлян Н.І., 1981). У цільній крові визначали концентрацію метгемоглобіну (Горн Л.Е., 1951), рівень гемо-глобіну (Архіпова О.Г. 1988); вміст білка плазми крові біуретовим методом (Комаров Ф.І., 1998); кон-цен-трацію вільних SH-груп в сироватці (Орехович В.Н., 1977) та еритроцитах (Мещишен І.Ф., 2002).

В гомогенаті печінки визначали вміст ТБК-активних продуктів (Владимиров Ю.А., 1972). Стан АОС печінки оцінювали за активністю глюкозо-6-фосфатдегідрогенази [КФ 1.1.1.49] у гемолізатах печінки – за методом Корнберга і Хорекера в модифікації Ю.Л. Захар’їна; глутатіонредуктази (ГР) (Beutler E, 1969), глутатіонпероксидази (Геруш І.В., 1998) [КФ 1.11.1.9], глутатіон – S - трансферази (Г-S-Т) [КФ 2.5.1.18] (Habig W.H., 1974), каталази [КФ 1.11.1.6] (Королюк М.А., 1988). Також визначали активність лактатдегідрогенази (ЛДГ) [КФ 1.1.1.27] (Меншиков В.В., 1987) та концентрацію вільних SH-груп (Мислицький В.Ф., 2003).

Математичну обробку отриманих результатів проводили на ПEОМ з використанням загаль-ноприйнятих методів статистики з розрахунком середніх величин (М), їх похибок (m), t-критерію достовірності Ст’юдента (Лакін Г.Ф., 1990). За статистично вірогідні вважали зміни при Р<0,05. Числові значення в таблицях наведені у вигляді середніх величин та їх стандартних похибок.

З метою вивчення впливу змін показників прооксидантної системи організму на поведінкову активність тварин різного віку за умов підгострої дії нітрату натрію та хлориду кадмію нами проведений множинний регресійний аналіз (Антомонов М.Ю., 2006).

Порівняння значущості впливу змін показників прооксидантної системи організму на ін.-тег-раль-ну поведінкову активність (ІПА) тварин різного віку проводили за величинами в-кое-фі-цієнтів, а відсоток впливу вивчених показників розраховували за формулою (Грачова Т.І., 2003):

ві2

d=---- х 100%

? ві2

Результати досліджень та їх обговорення. Гігієнічне значення гострої дії нітрату натрію та хлориду кадмію. На першому етапі роботи проводили пошук маркерів схильності до розвитку гострого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію за смертельним ефектом, середнім часом загибелі (TE50) та біохімічними показниками у тварин різного віку.

При введенні комбінації цих речовин у дозі Ѕ DL50 було встановлено, що на 4-й день ніт-рат-но-кадмієвої інтоксикації загинуло 50% тварин молодого віку із „повільним” типом аце-ти-лю-ва-н-ня, тоді як зі „швидким” типом – лише 25%. Слід відмітити, що середній час загибелі (TE50) у „повільних” ацетиляторів складав – 80±8,00 годин, а для тварин зі „швидким” типом аце-ти-лю-ва-н-ня - 56±8,00 годин. Серед дорослих відмічалась смертність у 50% тварин із „повільним” типом аце-тилювання, тоді як зі „швидким” типом – 36%. Середній час загибелі (TE50) у „повільних” аце-ти-ляторів складав 41,14±4,42 годин, тоді як зі „швидким” типом – 33,16±5,88 годин. У старих тва-рин початок загибелі відмічали через 6 годин після введення ксенобіотиків (TE50 – 24 години). В кін-ці першої доби загинуло 50% тварин із „повільним” типом ацетилювання, а зі „швидким” типом - лише 25%.

Таким чином, маркером схильності за смертельним ефектом є „повільний” тип ацетилювання в усіх вікових групах (рис.1). При цьому кумулятивний ефект (за TE50) був більш виражений у „повільних” ацетиляторів і зменшувався зі збільшенням віку у напрямку молоді > дорослі > старі.

Рис.1 Відсоток смертності у тварин різного віку з неоднаковою швидкістю ацетилювання за умов гострого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію

Схильність „повільних” ацетиляторів до гострого впливу модельних токсикантів підт-вер-д-жується проведеними біохімічними дослідженнями. Зокрема, за умов гострої нітратно-кадмієвої інтоксикації спостерігалось найбільш виражене зростання рівня СМП - маркерів ендогенної інтоксикації (Кліщ І.М., 1999), у „повільних” ацетиляторів дорослого і старого віку (рис.2).

Рис. 2. Рівень середньомолекулярних пептидів у тварин різного віку з неоднаковою швидкістю ацетилювання за умов гострого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію

Примітка: * - Р<0,05 відносно контролю

На фоні шкідливого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію у тварин розвивався асцит в результаті виходу плазми за градієнтом концентрації з внутрішньосудинного простору в інтерстицій. Це призвело до зростання рівня гемоглобіну (відносний еритроцитоз), яке було найбільш виражене у „повільних” ацетиляторів старого віку. У відповідь на потрапляння ксенобіотиків в організмі відбувалась інтенсивна генерація активних форм кисню, утворення вільних радикалів з наступною фрагментацією білкових молекул і пероксидним окисненням ліпідів. Процеси окислювальної модифікації білків були більш вираженими у молодих та старих тварин із „повільним” типом мета-болізму. В останніх спостерігалось також найбільш виражене підвищення вторинних продуктів ліпопероксидації. Пошкоджуючій дії вільних радикалів і пероксидних сполук перешкоджає АОС. Біохімічними критеріями, за якими оцінювали стан цієї системи у наших дослідженнях, виступали церулоплазмін та ферменти глутатіонової ланки антиоксидантного захисту. Отримані результати показують, що пригнічення активності глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази у молодих тварин та дисбаланс прооксидантної системи (зниження вмісту ТБКАП, активності ЦП та ГП) у дорослих є важливими біохімічними критеріями шкідливої дії у „повільних” ацетиляторів.

Отже, гігієнічне значення має „повільний” тип ацетилювання, як біомаркер схильності до розвитку гострого впливу обраних нами модельних токсикантів у тварин усіх вікових груп.

Гігієнічне значення підгострої дії нітрату натрію та хлориду кадмію. В реальних умовах на організм впливають значно менші дози ксенобіотиків, ніж у гострих дослідах, але діють вони тривалий час. Тому в наступній серії експериментів були використані біологічні моделі різного віку, які покликані були відтворити реакцію організму на щоденну дію факторів середньої інтенсивності. За умов підгострого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію відбувалися зміни у системі “гемоглобін-метгемоглобін”, що дало можливість їх використати як біохімічні критерії шкідливого впливу модельних токсикантів. Зокрема, на фоні комбінованого впливу ксенобіотиків відбувалось більш виражене зниження рівня гемоглобіну у молодих тварин із „повільним” типом ацетилювання та у „швидких” ацетиляторів дорослого і старого віку. Відомо (Ерстенюк Г.М.та ін., 2000), що у процесі катаболізму гемоглобіну, спричиненого дією полютантів, з гема вивільняється Fe2+, який окиснюється до Fe3+ з утворенням метгемоглобіну. Підвищення рівня цього деривату гемоглобіну спостерігалось у всіх вікових групах тварин (рис.3).

Рис.3. Рівень метгемоглобіну у крові щурів різного віку за умов підгострого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію

Примітка: * - Р<0,05 відносно контролю

Найбільше зростання даного показника відмічалось у молодих тварин із „повільним” типом ацетилювання та в меншій мірі у дорослих і старих осіб зі „швидкою” ацетилюючою здатністю. Отримані результати доповнюють дані літератури щодо більш вираженого токсичного впливу нітрату натрію (Власкина С.Г., 1994) на молодих тварин порівняно з дорослими, оскільки у наших дослідженнях більш схильними до розвитку метгемоглобінемії були тільки „повільні” ацетилятори інфантильного віку. На практиці це означає, що групу ризику до виникнення водно-нітратної метгемоглобінемії становлять діти з „повільним” типом ацетилювання. Небезпека розвитку метгемоглобінемії, по-перше, полягає в тому, що метгемоглобін не здатний зв’язувати кисень і транспортувати його до тканин (Горішна О.В., 2002) і це може бути однією з причин тканинної гіпоксії за умов підгострого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію. По-друге, при окисненні гемоглобіну до метгемоглобіну відбувається утворення супероксид-аніону, який не тільки пошкоджує клітинні мембрани, але й ініціює появу інших хімічно активних і цитотоксичних форм кисню з наступною активацією процесів окиснення ліпідів, білків та продуктів ендогенної інтоксикації. Зокрема, у наших дослідженнях було встановлено, що підгостре введення модельних токсикантів викликало найбільш виражене зростання СМП і ОМБ у молодих тварин із „повільним” ацетилювання та дорослих - зі „швидкою” ацетилюючою активністю. Підвищення вмісту вторинних продуктів ліпопероксидації найбільш виражене у гомогенаті печінки дорослих та в еритроцитах старих тварин зі „швидким” типом ацетилювання.

Отже, встановлена нами схильність „повільних” ацетиляторів до гострого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію за умов зменшення дози і збільшення тривалості введення залишилась тільки у молодих тварин. Свого часу В.П. Казначеєв виділив два конституційних типи людини - „спрінтери” та „стайєри” (Войтенко В.П., 1991). Організм перших добре захищений від інтенсивної, але короткочасної дії (гострий вплив), проте чутливий до тривало діючих факторів середньої і малої інтенсивності (підгострий та хронічний вплив). Організм „стайєрів” володіє протилежними якостями. Ці факти отримали пояснення в наших дослідженнях. За умов комбінованого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію „стайєрами” можна вважати тварин дорослого і старого віку з „повільним” типом ацетилювання, „спрінтерами” – зі „швидким” типом.

Таким чином, найбільше гігієнічне значення має „повільний” тип ацетилювання, як біомаркер схильності до розвитку підгострого впливу модельних токсикантів, у тварин молодого віку та „швидкий” тип – у дорослому і старому віці.

Підгострий вплив нітрату натрію та хлориду кадмію в динаміці призводив до пригнічення ЦНС за показниками поведінкових реакцій у щурів усіх вікових груп. Найбільш виражене пригнічення ІПА спостерігалося у молодих тварин незалежно від типу метаболізму та у старих із „повільним” ацетилювання. Якщо у старих осіб це можна пояснити переважанням процесів гальмування над збудженням та виснаженням упродовж віку адаптаційно-пристосувальних реакцій, то у молодих – функціональною незрілістю ЦНС, що проявляється незначною швидкістю метаболізму ксенобіотиків та високою проникливістю гематоенцефалічного бар’єру (Тимофеев В.П., Семенова В.В., 1993; Трахтенберг І.М. та ін., 2004). Свого часу Фролькіс В.В. висунув припущення, що вікові зміни нейрогуморальної регуляції різних систем виражаються в послабленні нервового впливу на тканини і підвищенні їх чутливості до гуморальних факторів. На основі цього положення можна зробити висновок, що найбільш суттєве значення в механізмі вікових змін належить тим реакціям і процесам, які внаслідок некомпенсованих змін в системі регуляції стають лімітованими. Дані лімітуючі фактори повинні в першу чергу враховуватись при гігієнічному регламентуванні потенційно небезпечних екзогенних факторів.

Проведення множинного регресійного аналізу дозволило з’ясувати, що порушення поведінкової активності у молодих тварин із „повільним” типом ацетилювання за умов підгострого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію відбувалося на фоні зростання вмісту вторинних продуктів ліпопероксидації печінки, рівня СМП плазми крові та в меншій мірі підвищення активності церулоплазміну, а у „швидких” ацетиляторів на фоні зростання продуктів ОМБ. В свою чергу порушення функціональної здатності ЦНС у старих тварин із „повільним” типом ацетилювання за умов підгострого впливу вище згаданих ксенобіотиків відбувалося на фоні зростання рівня СМП та концентрації метгемоглобіну, а у „швидких” ацетиляторів – зростання концентрації метгемоглобіну та зниження вмісту вторинних продуктів ліпопероксидації печінки.

Встановити зв’язок порушень поведінкової активності зі змінами показників прооксидантно-антиоксидантної системи організму у статевозрілих тварин не вдалося, про що свідчать статистично недостовірні результати множинної регресії.

Застосування множинного регресійного аналізу дозволило побудувати регресійні моделі змін функціональної здатності ЦНС у тварин з неоднаковою ацетилюючою активністю, що можуть відбуватись при підгострому впливі нітрату натрію та хлориду кадмію. Зокрема, рівняння регресії було інформаційно здатним та статистично значущим і приймало наступного вигляду для молодих тварин із „повільним” типом ацетилювання:

y = - 9,38 + 0,05x3 + 1,74x4 + 0,28x5

- для молодих тварин зі „швидким” типом ацетилювання:

y = 9,97 + 0,48x1

- для старих тварин із „повільним” типом ацетилювання:

y = - 12,09 + 0,95x2 + 4,93x4

- для старих тварин зі „швидким” типом ацетилювання:

y = 9,24 + 0,55x2 – 0,51x5,

де, y – ІПА; x1 – рівень ОМБ; x2 – концентрація метгемоглобіну; x3 – рівень ЦП; x4 – рівень СМП; x5 – вміст ТБК-активних продуктів у печінці.

Профілактичне застосування спиртової настоянки ехінацеї пурпурової за умов підгострого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію. Завершальною ланкою експериментальних досліджень було вивчення можливих протективних властивостей настоянки ехінацеї пурпурової за умов під гострого впливу модельних токсикантів. З літературних джерел відомі позитивні результати засто-су-вання-цього природного нутрієнта за умов ізольованого впливу нітрату натрію (Янчук В.В., Власик Л.І., 2002) та хлориду кадмію (Дейнека С.Є., 1999). Проте протекторні властивості фітопрепарата за умов їх підгострого впливу з урахуванням фенотипових розбіжностей серед популяції у віковому аспекті не проводились.

За результатами експериментів показано, що спиртова настоянка ехінацеї пурпурової справляла більш виражений коригуючий вплив на функціональний стан ЦНС, стабілізацію рівня гемоглобіну і зниження метгемоглобінемії у молодих тварин із „повільним” типом ацетилювання та у дорослих і старих - зі „швидким” типом ацетилювання, що ще раз підтверджує наш висновок про їх схильність до комбінованого впливу обраних токсикантів.

Протекторний вплив природного нутрієнта на стан ЦНС та концентрацію гемоглобіну і--ме-т-ге--мо---г-лобіну у швидких метаболізаторів може бути пов’язаним з наявністю в ній водо-ро-з-чи-н-но-го по--л--і--сахарида “ехінацина” (Самородов В.Н., 1996), який сприяє синтезу ендо-ген-них глю-ко-кор-ти-кої-дів, що збільшують утворення пантотенової кислоти – основної складової аце-тил-КоА (Вороніна Л.М., 2000). Даний субстрат необхідний для утворення N-ацетилтрансферази. Мо-ж-ливо, у „швидких” ацетиляторів статевозрілого та старого віку цей процес відбувався більш інтенсивно. Від-новлення рівня гемоглобіну можна пов’язати з тим, що складу природного нутрієнту входить за-лі-зо (Войтенко Г.М., Яковлєва Н.Ю., 1995), яке є необхідним компонентом для синтезу гема; іони К+ та Mg2+, які беруть участь у синтезі глутатіону – одного з основних антиоксидантів орга-ніз-му (Геруш І.В., 1998). Антиоксидантні та детоксикаційні властивості настоянки ехінацеї пур-пу-ро-вої зумовлені наявністю у ній біофлавоноїдів, поліфенолів, ненасичених жирних кислот, ко-фей-ної кислоти, вітамінів С та Е, макро- і мікроелементів, зокрема цинку та селену, пектинів, кліт-ковини, геміцелюлози (Геруш І.В., Мещишен І.Ф., 1995; Самородов В.Н., 1996; Пішак В.П, Волошин О.І., 1997).

Таким чином, проведений аналіз даних, які отримані в експериментах на тваринах та інших авторів, дозволив узагальнити існуючі погляди на необхідність диференційованого підходу до визначення небезпеки дії шкідливих факторів на осіб різних вікових груп. Тестування активності N-ацетилтрансферази можна рекомендувати з метою гігієнічної діагностики шкідливого впливу вивчених ксенобіотиків. Це потрібно враховувати у випадках інтоксикації пороговими дозами для виявлення зв’язків між станом здоров’я та забрудненням середовища нітратом натрію та хлоридом кадмію, а також при встановленні порогових доз і концентрацій на етапах гігієнічного нормування, що дасть можливість індивідуалізувати профілактичні заходи, сформувати групи ризику, розробити підходи до профвідбору для різних галузей виробництва тощо. Слід продовжити вивчення біомаркерів схильності та впровадити їх використання в існуючій системі гігієнічного регламентування для оцінки індивідуального ризику з метою забезпечення ефективної профілактики шкідливого впливу ксенобіотиків і гармонізації з загальноприйнятими у світовому співтоваристві підходами.

ВИСНОВКИ

1. У дисераційній роботі вирішене наукове завдання щодо обгрунтування використання в гігієнічних дослідженнях фенотипу ацетилювання, як біомаркера схильності до несприятливого впливу хімічних речовин та біопрофілактики шляхом застосування настоянки ехінацеї пурпурової. На моделях гострого та підгострого впливу нітрату натрію і хлориду кадмію з’ясовані вікові особливості та гігієнічне значення біохімічних змін як критеріїв шкідливої дії.

2. Біомаркером схильності до розвитку гострої нітратно-кадмієвої інтоксикації є „повільний тип” ацетилювання незалежно від віку за смертельним ефектом та середнім часом загибелі тварин.

3. При гігієнічній оцінці гострого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію за біохімічними критеріями встановлено, що біомаркером схильності являється „повільний” тип ацетилювання у тварин усіх вікових груп. Зокрема, у молодому віці критеріями шкідливої дії є: активація процесів пероксидного окиснення білків плазми крові на 53% та пригнічення активності ферментів антиоксидантного захисту печінки (глутатіонпероксидази на 19%, глутатіонредуктази на 13%); у дорослих тварин - зростання рівня середньомолекулярних пептидів сироватки крові у 2,8 рази та зниження вмісту ТБК-активних продуктів на 21% і активності ферментів антиоксидантного захисту (церулоплазміну на 30%, глутатіонпероксидази на 43%); у старих - активація процесів пероксидного окиснення білків плазми крові на 80%, зростання рівня гемоглобіну на 60%, середньомолекулярних пептидів і ТБК-активних продуктів, відповідно, у 2,2 та 2 рази.

4. Виявлена висока критеріальна значущість змін біохімічних показників при гігієнічній оцінці підгострого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію. Зокрема, у молодому віці маркером схильності слід вважати „повільний” тип ацетилювання, а критеріями шкідливої дії у них є: зниження рівня гемоглобіну на 24%, активація процесів пероксидного окиснення білків плазми крові на 25%, зростання рівня середньомолекулярних пептидів на 34% і концентрації метгемоглобіну у 6,7 рази; у дорослих тварин маркером схильності є „швидкий” тип ацетилювання, а критеріями шкідливої дії у них можна вважати – підвищення концентрації метгемоглобіну у 5,4 рази, зростання ТБК-активних продуктів на 41%, підвищення окиснювальномодифікованих білків на 18% і рівня середньомолекулярних пептидів на 16%, зниження рівня гемоглобіну на 30%; у старих тварин маркером схильності слід вважати „швидкий” тип ацетилювання, а критеріями шкідливої дії у них є: зниження рівня гемоглобіну на 20%, зростання концентрації метгемоглобіну у 2,9 рази на фоні підвищення кількості вторинних продуктів ліпопероксидації еритроцитів у 2 рази.

5. Підгостра дія нітрату натрію та хлориду кадмію викликала більш виражене пригнічення центральної нервової системи за показником інтегральної поведінкової активності у молодому віці на 97% незалежно від типу метаболізму та на 93% у „повільних” ацетиляторів старого віку.

6. За допомогою множинного регресійного аналізу виявлено, що порушення по-ве-дін-кової активності у молодих тварин із „повільним” типом ацетилювання за умов підгострого впливу нітрату натрію та хлориду кадмію обумов-лене зростанням вмісту вторинних продуктів ліпопероксидації печінки і рівня середньомолекулярних пептидів плазми крові, а у „швидких” ацетиля-торів зростанням продуктів окиснювальномоди-фікованих білків. Пору-шен-ня поведінкової активності у старих тварин із „повільним” типом ацетилювання відбувалося на фоні зростання рівня середньомолекулярних пептидів та концентрації метгемоглобіну, а у „швидких” ацетиляторів – зростання концентрації метгемоглобіну і зниження вмісту вторинних продуктів пероксидного окиснення ліпідів печінки.

7. Оптимальний профілактичний ефект настоянки ехінацеї пурпурової у разі одно-ча-с-ного впливу нітрату натрію та хлориду кадмію досягається у дорослих і ста-рих тварин зі „швидким”, а також у молодих із „повільним” типом ацетилювання та полягає у нормалізації поведінкових реакцій, стабілізації рівня гемоглобіну і зниження метгемоглобінемії. Фітопрепарат доцільно рекомендувати для адаптивної біопрофілактики порушень гомеостазу у груп ризику.

8. З метою забезпечення ефективної профілактики за умов шкідливого впливу полютантів, формування груп ризику, розробки підходів до профвідбору для різних галузей виробництва пропонується включати у схему постановки токсиколого-гігієнічного експерименту визначення фенотипу ацетилювання як способу прогнозування схильності організму до ксенобіотиків. Перспективи подальших досліджень пов’язані з впровадженням аналітичних технологій визначення індивідуальної схильності організму до шкідливого впливу хімічних сполук та розробки на цій основі заходів первинної та вторинної профілактики.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кметь Т.І., Власик Л.І. Динаміка змін поведінкових реакцій білих щурів ювенільного віку з різним типом ацетилювання за умов підгострого впливу хлориду кадмію та нітрату натрію // Буковинський мед. вісник. – 2003. – Т.7, №3. - С.111-114. (Дисертант самостійно провів дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).

2. Кметь Т.І., Власик Л.І. Особливості перебігу процесів вільнорадикального окиснення ліпідів та білків за умов нітратно-кадмієвої інтоксикації у інфантильних щурів з різним типом ацетилювання // Довкілля та здоров’я. – 2004.–№3 (30). – С. 11-14. (Кметь Т.І. самостійно провів пошук і аналіз літе-ра-тур-них джерел, зді-й-снив дослідження і статистичну обробку отриманих даних).

3. Кметь Т.І., Власик Л.І. Нітратно-кадмієва інтоксикація у тварин та протекторний вплив настоянки ехінацеї пурпурової // Проблеми харчування. – 2004. - №3. – С. 41-45. (Кметь Т.І. самостійно здійснив дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).

4. Кметь Т.І., Власик Л.І. Особливості стану пероксидного окиснення білків у тварин ювенільного з різним типом метаболізму за умов нітратно-кадмієвої інтоксикації // Современные проблемы токсикологии. – 2004. - №2. – С. 36-38. (Дисертант самостійно провів дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).

5. Кметь Т.І. Особливості реакції прооксидантно-антиоксидантної системи у старих щурів з різним типом ацетилювання за умов нітратно-кадмієвої інтоксикації // Гигиена труда.–2004. – Випуск 35. – С. 264-275.

6. Кметь Т.І., Власик Л.І. Тип ацетилювання – як маркер схильності до розвитку токсичних ефектів у інфантильних щурів при комбінованій дії хлориду кадмію та нітрату натрію // Клінічна та експериментальна патологія. – 2004.– Т. 3, №2. – С. 219-221. (Дисертант самостійно провів дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).

7. Кметь Т.І., Власик Л.І. Особливості впливу нітрату натрію та хлориду кадмію на поведінкові реакції старих щурів з різним типом метаболізму // Гігієна населених місць. – Київ, 2005. – вип. 46. – С. 190 – 194 (Кметь Т.І самостійно провів дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).

8. Кметь Т.І., Власик Л.І. Особливості гострого впливу хлориду кадмію та нітрату натрію на деякі показники крові старих тварин з різним типом ацетилювання // Буковинський мед. вісник. – 2005. – Т.9, №2. - С.116-117. (Дисертант самостійно здійснив дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).

9. Кметь Т.І., Власик Л.І. Застосування підходів ксеногенетики в онтогенетичних токсикологічних дослідженнях // Тези доповідей наукової конференції “Вікові аспекти чутливості організму до ксенобіотиків”. – Чернівці, 2002. – С. 7. (Кметь Т.І. самостійно провів дослідження, статистичну обробку та аналіз одер-жаних результатів).

10. Кметь Т.І. Вміст ТБК-активних продуктів у печінці щурів ювенільного та старого віку з різним ти----пом метаболізму за умов