МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ХАКЛ Олена Василівна

УДК 577.323

ВПЛИВ ІОНІВ МЕТАЛІВ НА СТРУКТУРНІ ПЕРЕХОДИ днк

У ВОДНИХ РОЗЧИНАХ СПИРТІВ ТА СЕЧОВИНИ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків - 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі молекулярної біофізики Фізико-технічного інституту низьких температур ім. Б. І. Вєркіна НАН України.

Науковий керівник:

доктор фізикоматематичних наук, професор,

БЛАГОЙ Юрій Павлович,

Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б. І. Вєркіна НАН України, завідувач відділу молекулярної біофізики.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор, Веселков Олексій Никонович, Севастопольський державний технічний університет, директор департаменту фізики та хімії;

кандидат фізико-математичних наук, Больбух Том Вікторович, Інститут радіофізики та електронікі ім. А.Я.Усікова НАН України, старший науковий співробітник відділу біофізики (м. Харків).

Провідна установа:

Інститут фізики НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться « 29 » квітня 1999 pоку о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському державному університеті, 310077, м.Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського державного університету: 310077, м.Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий « 27 » 03 1999 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С. В.

1

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення взаємодії ДНК з іонами металів має велике значення з точки зору важливої ролі, котру відіграють іони металів в процесі функціонування генетичного апарату in vivo. Разом з водою, іони металів стабілізують структури нуклеїнових кислот, визначають рівновагу між різними формами вторинної та третинної структури. Значення дослідження дії іонів металів на структуру ДНК особливо зростає у зв’язку з екологічним та радіаційним забрудненням довкілля. Крім того, комплекси ДНК з іонами металів можуть правити за модельну систему при вивченні дії цілого ряду лікарських речовин, що сполучаються з нуклеїновими кислотами за катіоним механізмом, на структуру ДНК.

Відомо, що компактизація ДНК є невід’ємною частиною процесу функціонування ДНК in vivo, тому вивчення процесу компактизації викликає великий інтерес з погляду розкриття фізичних механізмів, відповідальних за функціонування біологічних молекул. Проте наявність та механізм компактизації ДНК під дією двовалентних іонів металів у водних розчинах практично не вивчені. Крім того, in vivo ДНК знаходиться в умовах зниженої активності води, які in vitro можуть моделю-ватися шляхом додавання до розчину ДНК менш полярних, ніж вода, розчинників. Тому представляється цікавим вивчити структурні переходи ДНК під дією двовалентних іонів металів у змішаних розчинах, які містять домішки неелектролітів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконувалась у відповідності з планом науково-дослідних робіт відділу молекулярної біофізики Фізико-технічного інституту низьких температур ім. Б.І.Вєркіна НАН України за темою «Дослідження структурних та фізико-хімічних властивостей комплексів нуклеїнових кислот з білками та біологічно активними речовинами» (шифр теми 1.4.10.18.2).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - вивчення структурних переходів ДНК, які відбуваються при взаємодії з іонами Cu2+ та Са2+ у розчинах, та встановлення впливу низки факторів (діелектричної проникності, структури розчину, температури) на структурні переходи ДНК.

У відповідності до вказаної мети завданнями дослідження були:

·

· провести порівняльний аналіз впливу речовин, які стабілізують та руйнують структуру води, на Cu2+- та Са2+-індуковану компактизацію ДНК в широкому інтервалі концентрацій неелектролітів та двовалентних іонів металів;

2

·

· провести аналіз отриманих результатів в рамках теорій конденсації протиіонів та рівноважного зв’язування; обрати модель, що більш адекватно описує взаємодію іонів двовалентних металів з ДНК.

Наукова новизна одержаних результатів.

·

· показана можливість компактизації високомолекулярної ДНК під дією двовалентних іонів металів (Cu2+ та Са2+) у водному розчині при кімнатній температурі. Запропонована модель компактизації, одержані оцінки констант зв’язування та параметрів кооперативності;

· вперше проведено вивчення впливу ряду неелектролітів (етанолу, 1,2-пропандіолу, гліцерину) та температури на компактизацію ДНК у розчині під дією іонів Cu2+ та Са2+ у широкому інтервалі концентрацій неелектролітів (0 20 об.%);

· вперше вивчено вплив сечовини на компактизацію ДНК у розчині під дією іонів Cu2+;

· вперше досліджено вплив етанолу, 1,2-пропандіолу та гліцерину на структурні переходи у поліфосфатах під дією іонів Са2+ у змішаних розчинах в інтервалі концентрацій неелектролітів 0 15 об.%.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані в роботі експериментальні дані про вплив складу розчинника та температури на структурні переходи ДНК під дією іонів металів можуть знайти застосування при розробці та вивченні впливу лікарських речовин, що знаходяться у катіонній формі, на ДНК. Дані про вплив іонів металів на структурні переходи ДНК у розчинах таких кріопротекторів, як 1,2-пропандіол та гліцерин, що широко застосовуються, можуть бути використані у кріобіології при розробці методик зберігання генетичного матеріалу.

Особистий внесок здобувача. В роботах 1,3-5,10-12: аналіз публікацій за темою, отримання експериментальних даних та їх обробка, розрахунки констант зв’язування та параметрів кооперативності, участь у обговоренні результатів та формулюванні висновків. В роботі 2: участь у проведенні вимірювань, участь в обробці та аналізі експериментальних даних та в обговоренні результатів. В роботах 6-9: весь обсяг робіт, пов’язаний з постановкою задачі, аналізом публікацій за темою, отриманням експериментальних даних та їх математичною обробкою, формулюванням висновків.

3

Апробація результатів дисертації. Результати роботи за темою дисертації доповідалися і обговорювалися на 2 національних та 13 міжнародних конференціях: XII школа-семінар «Спектроскопiя молекул та кристалiв» (Ніжин, 1995); II з’їзд українського біофізичного товариства (Харків, Україна, 1998); NATO-ASI Conference «Cytotoxic, Mutagenic and Carcinogenic Potential of Heavy metals Related to Human Environment» (Poland, 1996); 3rd European Conference on Bio-inorganic Chemistry (The Netherlands, 1996); XXIII European Congress on Molecular Spectroscopy (Hungary, 1996); Second International Symposium «Algorithms for Macromolecular Modelling» (Germany, 1997); 2nd European Biophysics Congress (France, 1997); 16th Annual International Meeting of the Molecular Graphics and Modelling society «Model(l)ing '97» (Germany, 1997); 7th European Conference on Spectroscopy of Biological Molecules (Spain, 1997); 6th International Summer School on Biophysics «Supramolecular structure and function» (Croatia, 1997); 7th International Symposium on Macromolecule-Metal Complexes MMC7 (The Netherlands,1997); Summer School «Physics of molecular biology» (Denmark, 1998); XXXIII International conference on coordination chemistry «The Chemistry of Metal Ions in Everyday Life» (Italy, 1998); Conference on Physics of Biological Systems (Ukraine, 1998); NATO-ASI «Metal-Ligand Interactions in Chemistry, Physics and Biology» (Italy, 1998).

Публікації. Результати дисертації опубліковано в 12 наукових працях, у тому числі в 9 статтях та в 1 матеріалах і 2 тезах конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, п’яти розділів, висновків і списку використаних літературних джерел (238 найменувань). Повний обсяг дисертації складає 188 сторінок, з них список використаних літературних джерел - 23 стор., ілюстрації - 34 стор.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність обраної теми, сформульовані мета і задачі дослідження, визначена наукова новизна і практична цінність одержаних результатів.

В розділі 1 подано літературний огляд, який охоплює аналіз теоретичних та експериментальних досліджень, що стосуються впливу іон-гідратного оточення на структуру та конформаційні переходи ДНК у розчинах, конденсації ДНК, а також використання методу ІЧ-спектроскопії для вивчення структурних переходів у нуклеїнових кислотах.

В розділі 2 дано характеристику об’єктів та методів досліджень. Об’єктами досліджень були нативна ДНК тимуса теляти з молекулярною вагою 1.9*107 Da, ДНК «Serva» з молекулярною вагою 2106 Da та поліфосфати Nan+2PnO3n+1 "Sigma" з середньою довжиною ланцюга 655 P. Препарати ДНК та поліфосфатів розчиняли в 10-3 або 510-3 М

4

какоділатному буфері, рН 7.0. Кінцева концентрація ДНК становила (3.55.5)10-2 М фосфору.

В роботі використовувались: метод ІЧ-спектроскопії, який дозволяє вивчати утворення комплексів ДНК з іонами металів у розчині та структурні переходи, що можуть відбуватися у макромолекулі в результаті взаємодії з іонами металів; метод світлорозсіювання, який дозволяє реєструвати утворення розсіюваних центрів у розчині та проводити оцінку їх розмірів; метод НВЧ-діелектрометрії, який дає інформацію про рухливість молекул води у змішаних розчинах, що містять домішки неелектролітів.

В розділі 3 представлені результати дослідження взаємодії ДНК з іонами металів різної валентності у водному розчині методами ІЧ-спектроскопії та світлорозсіювання. Показано, що при взаємодії ДНК з іонами Tb3+, Сu2+, Mn2+ та Ca2+, але не з іонами Na+ (до 1.2 М), у розчині відбувається різке збільшення інтенсивності смуг поглинання (СП) як фосфатних груп (мал. 1,2), так і азотистих основ ДНК. Зв’язування цих іонів з ДНК в плівках не призводить до значного збільшення інтенсивності СП. У роботі розглядаються різні можливі причини зростання інтенсивності смуг поглинання у ІЧ спектрах комплексів ДНК-Mt2+. На прикладі комплексів ДНК з іонами Tb3+, які викликають компактизацію ДНК (Tajmir-Riahi, 1993), показано, що причиною зростання інтенсивності смуг поглинання може служити перехід ДНК у компактний стан під дією іонів Mtn+, оскільки зміни в ІЧ-спектрах комплексів ДНК з іонами Tb3+ у водному розчині аналогічні змінам, що відбуваються в ІЧ-спектрах комплексів ДНК з дослідженими двовалентними іонами металів (мал. 1). Утворення компактних розсіюваних часток у розчині при взаємодії ДНК з іонами Mt2+ показано також методом світлорозсіювання - в міру збільшення концентрації іонів Сu2+ оптична густина розчинів ДНК з іонами Сu2+ в області 330-625 нм, в якій відсутні смуги поглинання ДНК, зростає (мал. 3), що свідчить про утворення розсіюваних часток. В області концентрацій іонів Сu2+/Р 0.20.8 відбувається утворення компактних розсіюваних часток ДНК з середнім радіусом 40 нм; в цьому інтервалі концентрацій іонів Сu2+ розміри часток залишаються постійними і збільшення розсіювання іде за рахунок росту кількості розсіюваних центрів. При Сu2+/Р > 0.8-0.9 відбувається злипання компактних часток у агрегати з розмірами 120-160 нм.

5

Мал. 1. ІЧ спектри ДНК (1 та 1’) та комплексів ДНК з іонами металів у водному розчині в області поглинання фосфатних груп ДНК. Концентрація іонів Mtn+: 2 - 2.610-2, 3 - 3.410-2, 4 - 9.410-4, 5 - 1.710-3 M; концентрація ДНК - 1 - 0.05, 1’- 0.036 M фосфору.

Мал. 2. Залежності відносної зміни інтенсивності R смуги поглинання S від повної концентрації іонів Mtn+ у розчині для комплексів ДНК з іонами Mtn+ у водному розчині. Концентрація ДНК - (3.65)10-2 М, [Na+]=10-3 M, pH 7, температура 290С.

R = Di/D0, де Di - оптична густина у максимумі смуги поглинання комплексу ДНК з i-тою концентрацією метала, D0 - та ж сама величина для ДНК без іонів дво- або тривалентних металів.

Мал. 3. Залежності оптичної густини розчину ДНК з іонами Cu2+ від хвильового числа. Концентрація ДНК - 3.210-3 М, концентрація іонів Cu2+, М:

1 - 0, 310-5, 10-4; 2 - 10-3; 3 - 1.210-3; 4 - 210-3; 5 - 310-3; 6 - 410-3; 7 - 710-3; 8 - 10-2.

Таким чином, збільшення інтенсивності смуг поглинання при зв’язуванні ДНК з іонами Сu2+ в

області концентрацій Сu2+/Р < 0.70.8 (мал. 2) пов’язано з конденсацією ДНК під дією іонів Сu2+, зменьшення інтенсивності СП при підвищенні концентрації іонів металу пов’язане з агрегацією компактних часток ДНК та частковим осаджуванням ДНК.

Ефективність досліджених іонів в індуціюванні компактизації ДНК, як в області поглинання фосфатних груп, так і азотистих основ, зростає з валентністю іонів ([Tb3+] >> [Cu2+] >> [Mn2+] > [Ca2+]) (мал. 2) та корелює з константами зв’язування цих іонів з азотистими основами ДНК, в той час як константи зв’язування іонів Ca2+, Mn2+ та Cu2+ з

6

фосфатними групами в умовах експерименту порівнянні (Благой, 1991). Таким чином, компактизація ДНК обумовлюється взаємодією іонів Mt2+ з азотистими основами, в результаті якої можлива незначна дестабілізація ДНК.

Зростання інтенсивності смуг поглинання відбувається у вузькому інтервалі концентрацій дво- та тривалентних іонів (мал. 2), що свідчить про високу позитивну кооперативність процесу компактизації ДНК. При підвищенні концентрації іонів Na+ у розчині до 0.2 або 1 М кооперативність різко знижується, що обумовлено конкуренцією іонів Mt2+ та Na+. Таким чином, механізм компактизації ДНК під дією іонів Mt2+ включає в тому числі і електростатичний механізм.

Мал. 4. Модель між- (А) та внутрішньо-молекулярної (В) компактизації ДНК під дією двовалентних іонів металів у розчині; C - початкова стадія утворення тору при взаємодії ДНК, що моделюється ланцюжком вільно-з’єднаних сегментів, з двовалентними іонами металів у розчині.

В роботі запропонована модель компактизації ДНК під дією іонів Mtn+ (мал. 4).

В роботі розглядається математична модель утворення упорядкованої структури (тора) при взаємодії іонів Mt2+ з ДНК на прикладі зв’язування іонів з поліелектролітом, який представле-ний ланцюжком вільно-з’єднаних сегментів, що несуть негативний заряд (мал. 4, С). На першому етапі відбувається зв’язування одного або кількох двовалентних катіонів з двома віддаленими по ланцюгу сегментами з утворенням петлі, розмір якої буде визначатися жорсткістю поліелектролі-ту. При утворенні такого комплексу буде відбуватися програш в ентропії, причому зменшення ентропії буде тим

більше, чим вище жорсткість молекули (тобто чим більше радіус петлі), але можливий виграш в ентальпії (Н буде знижуватися). Константа утворення першого зв’язку буде визначатися як (1),

де G0 - зміна вільної енергії Гіббса: (2),

G0, H0 та S0 - зміни вільної енергії, ентальпії та ентропії при утворенні петлі. Низька вирогідність цього процесу визначається більшим щодо абсолютної величини значенням S0 (S0<0 та H0<0), при цьому TS~ H, G0 мале і величи-на константи К0 мала. В міру

7

залучання у зв’язування подальших сегментів втрата в ентропії при зв’язуванні наступного сегменту іоном Mt2+ буде зменшуватися, тому що буде втрачатись рухливість тільки досить невеликої ділянки ланцюга, отже число мікростанів, доступних системі, буде зменшуватися. Оскільки виграш в ентальпії при утворенні кожного із зв’язків буде однаковий, при збільшенні ступеня зв’язування G буде зростати і, відповідно, буде зростати і константа зв’язування, визначаючи кооперативність процесу компактизації ДНК під дією іонів Mt2+. Так, при утворенні другого зв’язку (мал. 4, С): .

При утворенні N - того зв’язку

(3), де S1av - середня зміна ентропії при утворенні зв’язків з 2 по N. У даному випадку N - кількість зв’язків між сегментами поліелектроліту, що утворилися за участю іонів Mt2+. Таким чином N пропорційно числу сегментів, які утворили зв’язки. Визначим Nt як загальне число сегментів, зв’язування яких необхідне для повної компактизації, тоді N/Nt буде визначати ступінь компактизації неелектроліту r. Приймаючи для великих N , (3) з урахуванням (2) можна записати у вигляді

(4),

де W - коефіціент, який дорівнює . Таким чином, додаток до вільної енергії є пропорційним ступеню компактизації.

Беручи до уваги (4), запишемо: , де , K0 - константа, яка визначає величину порогової концентрації двовалентних іонів металів, необхідної для початку компактизації, - параметр кооперативності. При цьому рівняння зв’язування у формі Скетчарда перетворюється на
(5), де r - ступінь компактизації ДНК (тобто частка ділянок, які при даних умовах утворили впорядковані структури), Cf - концентрація вільних іонів Mt2+ (тобто тих іонів, які не приймають участі в утворенні компактної структури ДНК), D - повна концентрація іонів Mt2+ у розчині: , P - молярна концентрація ДНК, n - коефіціент, що визначає необхідну для індуціювання компактизації ДНК частину місць зв’язування, які зайняли іони Mt2+. Величина r може характеризувати ступінь зв’язування іонів Mt2+ в процесі

8

компактизації ДНК (однак лише тих іонів, зв’язування з якими безпосередньо призводить до компактизації).

В розділі 4 представлені результати дослідження впливу етанола, 1,2-пропандіола (1,2-ПД), гліцерина і сечовини на компактизацію ДНК під дією іонів Сu2+ у розчинах при температурах 29 та 450С в інтервалі концентрацій спиртів 0 20 об.% та сечовини 0 5 М. Зміни у спектрах, які відбуваються при взаємодії ДНК з іонами Сu2+ в досліджених змішаних розчинах, аналогічні змінам, що відбуваються у водному розчині. Вигляд залежностей R (C) (мал. 5) для комплексів ДНК - Cu2+ у вивчених водно-спиртових розчинах подібний до

Мал. 5. Залежності відносної зміни інтенсивності R смуги поглинання S від повної концентрації іонів Cu2+ у розчині для комплексів ДНК з іонами Cu2+ у змішаних розчинах, які містять : А - 1,2- ПД, В - гліцерин. Температура - 290С.

залежності R (C) у водному розчині, таким чином, зв’язування іонів Cu2+ з ДНК індукує компактизацію біополімеру також у змішаних розчинах. В міру зростання концентрації етанола і 1,2-ПД у розчині монотонно зменшується порогова концентрація іонів Cu2+, необхідна для компактизації ДНК (мал. 6), що може бути обумовлено збільшенням констант зв’язування іонів Na+ та Cu2+ при зниженні діелектричної проникності розчину. В межах теорії конденсації протиіонів дані мал. 6 (криві 1,2) можна пояснити додатковою конденсацією протиіонів на поліелектроліті, що призводить до нейтралізації більшої частини заряду (у відповідності до (Wilson, Bloomfiled, 1979), частка заряду, нейтралізованого при зв’язуванні поліелектроліта з протиіонами валентності Z, дорівнює , = q2/TkBb). Збільшення об’ємної кількості етанолу та 1,2-ПД у розчині веде до зростання констант зв’язування К0 і параметрів кооперативності (мал. 7). При цьому ізотерми зв’язування набувають немонотонний характер з метастабільними і нестабільними ділянками, що характеризуються зворотньою залежністю r від Cf, які для стабільного процесу

9

повинні бути замінені на залежність із стрибком по r, що свідчить про фазовий перехід. Таким чином, перехід ДНК в компактний стан під дією іонів Cu2+ може набувати характер фазового переходу. Вплив гліцерину на порогову концентрацію іонів Cu2+ носить немонотонний характер (мал. 6), що може бути пов’язано з залежністю стабілізуючої або

Мал. 6. Залежності порогової концентрації Спор іонів Cu2+ (1-3, ліва шкала) і Са2+ (4, права шкала), необхідної для компактизації ДНК, від об’ємної концентрації неелектроліта для смуги поглинання S для комплексів ДНК з іонами Mt2+ у змішаних розчинах, що містять: 1,4 - етанол, 2 - 1,2-ПД. 3 - гліцерин.

Мал. 7. Залежності ступеня зв’язування r від вільної концентрації іонів Cu2+ у розчині (Cf) для комплексів ДНК з іонами Cu2+ у водному (1) та змішаних розчинах, які містять 9 об.% етанола (2), 1,2-ПД (3) та гліцерина (4). Крапки - дані експерименту, лінії - теоретичні залежності, розраховані за формулою (5); константи зв’язування К0 та параметри кооперативності вказані на малюнку.

дестабілізуючої дії гліцерину на структуру розчину від його концентрації (Timasheff, 1993). Кооперативність процесу компактизації ДНК у водно-гліцеринових розчинах зменшується (мал. 5, 7), що може бути обумовлено розупорядкованою дією гліцерину на структуру води (в тому числі гідратну). Немонотонність впливу гліцерину зберігається і при 450С. Оскільки зміни діелектричної проникності розчину в міру зростання концентрації гліцерину носять монотонний характер, можна зробити висновок про те, що в даному випадку компактизація

10

ДНК визначається не тільки діелектричною проникністю водного розчину неелектроліта, як це випливає з теорії конденсації протиіонів, але й структурою змішаного розчину.

При температурі 450С зменшується концентрація іонів Cu2+, яка необхідна для компактизації ДНК у водному розчині, що пов’язано із зниженням температури плавлення ДНК в присутності іонів міді, утворенням денатурованих ділянок на ДНК і зростанням констант зв’язування іонів Cu2+ з цими ділянками (Сорокін, 1987), а також зі зменшенням гнучкої жорсткості ДНК.

Досліджені неелектроліти - етанол, 1,2-ПД, гліцерин - при малих об’ємних концентраціях у розчині стабілізують структуру води, тому представляється цікавим вивчити структурні переходи ДНК під дією іонів Cu2+ у водних розчинах сечовини, яка руйнує структуру води. Зміни в ІЧ спектрах комплексів ДНК з іонами Cu2+ у розчинах, які містять сечовину, аналогічні змінам, що відбуваються у водному розчині. Інтенсивність смуг поглинання фосфатних груп ДНК при взаємодії з іонами Cu2+ зростає, т.ч. в присутності сечовини ДНК під дією іонів Cu2+ переходить у компактну форму. Для всіх досліджених розчинів залежності R (C) мають вигляд кривої з насиченням, аналогічний залежності для комплексів ДНК з іонами Сu2+ у водному розчині. Таким чином в присутності сечовини зберігається кооперативний характер процесу компактизації ДНК (мал. 8). В міру зростання концентрації сечовини кооперативність зменшується, що може бути пов’язано з порушенням впорядкованої структури води, у тому числі такої, що входить у гідратну оболонку ДНК.

Характер залежності С1/2 (C1/2 - концентрація іонів Сu2+, при який R(С1/2)=Rmax/2) від концентрації сечовини у розчині (мал.9) можна пояснити конкуренцією двох різнонаправлених процесів: з одного боку, при зростанні діелектричної проникності розчину при додаванні сечовини зменшується доля заряду на фосфатах, нейтралізованого за рахунок зв’язування поліелектроліту з протиіонами, з іншого боку, дегідратація іонів Na+ та Сu2+ в присутності сечовини призводить до більш ефективної екраніровці зарядів на фосфатах, що посилює ефект іонів Сu2+. Певно, в області А переважають саме ефекти, пов’язані з дегідратуючим впливом сечовини на протиіони (Na+ та Сu2+) та саму макромолекулу. В областях В та С серед можливих механізмів впливу сечовини на Cu2+-індуковану компактизацію ДНК можна відзначити зростання розчину при збільшенні концентрації сечовини, що перешкоджає додатковій конденсації протиіонів, а також конкуренцію молекул сечовини та іонів Cu2+ за місця зв’язування на ДНК. Таким чином, в даному випадку процес переходу ДНК у компактний стан під дією іонів міді визначається не стільки ефектами зміни діелектричної проникності розчину, скільки ефектами сольватації.

11

Мал. 8. Залежності відносної зміни інтенсивності R смуги поглинання S від повної концентрації іонів Cu2+ у розчині для комплексів ДНК з іонами Cu2+ у водних розчинах сечовини з концентрацією: 0 (1), 0.17 (2), 0.25 (3), 1 (4) и 3 (5) М.

Мал. 9. Залежності величини С1/2 від концентрації сечовини у розчині для смуг поглинання S (1) та аS (2) для комплексів ДНК з іонами Сu2+.

В розділі 5 представлені результати дослідження впливу етанолу, 1,2-пропандіолу та гліцерину на конденсацію ДНК під дією іонів Са2+ у змішаних розчинах при температурі 29 та 450С в інтервалі концентрацій неелектролітів 020 об.%. Показано, що залежність порогової концентрації іонів Са2+, необхідної для компактизації ДНК у змішаних розчинах, від об’ємної концентрації неелектролітів у розчині має немонотонний характер. При концентраціях етанола, які стабілізують структуру води, порогова концентрація іонів Са2+ зростає (див. мал. 6, крива 4). Зменшення необхідної концентрації іонів Са2+ при концентрації етанола 15-25 об.%, як і у випадку компактизації ДНК під дією іонів Cu2+, можна пояснити зростанням констант зв’язування протиіонів з ДНК і частки скомпенсованого заряду на ДНК за рахунок додаткової конденсації протиіонів при зниженні розчину, а також частковою дестабілізацією структури ДНК.

В області концентрацій етанола 5-10 об.%, в якій відбувається зростання порогової концентрації іонів Са2+ (мал.6), спостерігалося кооперативне зменшення характеристичної в’язкості ДНК у водно-спиртовому розчині в результаті змін у третинній структурі ДНК, обумовлених зменшенням сил далекодії в макромолекулі (Веселков, 1988). Таким чином, конформаційні зміни в молекулі нативної ДНК, що відбуваються внаслідок структурних перебудов у змішаному розчиннику, можуть призводити до зміни концентрації іонів Са2+, необхідної для переводу ДНК у компактний стан. При стабілізації молекули ДНК необхідна для компактизації концентрація іонів Са2+ зростає, а при дестабілізації макромолекули ДНК ця концентрація зменшується. Вирогідно, дестабілізація макромолекули ДНК полегшує процес компактизації під дією двовалентних іонів металів.

12

Для переводу ДНК у компактний стан у водному розчині при 450С потрібна більша концентрація іонів Сa2+, ніж при 290С, що можна пояснити зростанням гідратації протиіонів при цій температурі (Самойлов, 1957) та ослабленням їх екраніруючої дії на фосфатні групи ДНК. Таким чином, процесс переходу ДНК у компактний стан залежить від гідратації протиіонів. Механізм впливу температури на компактизацію ДНК в присутності іонів Cu2+, які мають більшу спорідненість до основ ДНК, відрізняється від механізму впливу температури на Cа2+-індуковану компак-тизацію ДНК: у випадку іонів міді переважають ефекти зростання констант зв’язу-вання іонів Cu2+ з денатурованими сайтами, що утворилися, на ДНК та зменшення жорсткості макромолекули, у випадку іонів кальція - зниження екраніруючої дії протиіонів при зростанні їх гідратації з температурою. Невеликі домішки 1,2-ПД та гліцерину (4 об.%) різко знижують необхідну для компактизації концентрацію іонів Cа2+ та кооперативність процесу компактизації, що може бути пов’язано з їх дестабілізуючою дією на структуру розчинника (при 450С) і на саму макромолекулу.

У п’ятому розділі також представлені результати дослідження взаємодії поліфосфатів (рР) як модельної системи ДНК з іонами Са2+ у водному та змішаних розчинах, що містять етанол, 1,2-пропандіол та гліцерин (015 об.%). При зв’язуванні рР з іонами Са2+ у водному розчині відбувається зростання інтенсивності смуги поглинання S, що свідчить про утворення більш впорядкованих компактних структур. При збільшенні концентрації іонів Са2+ спостерігається агрегація поліфосфатів, що супроводжується зменшенням інтенсивності СП. Процес утворення конденсатів рР під дією іонів Са2+ має більш кооперативний характер, ніж процес компактизації високомолекулярної ДНК за рахунок меншої жорсткості ланцюгів поліфосфатів.

В міру зростання концентрації етанола та 1,2-ПД у розчині монотонно зменшується концентрація іонів Са2+, яка необхідна для індуциювання конденсації поліфосфатів, що можна пояснити посиленням екраніруючої дії протиіонів на заряди фосфатних груп поліфосфатів в результаті зростання констант зв’язування при зменшенні розчину. Оскільки вплив етанолу на компактизацію ДНК під дією іонів Cа2+ носить немонотонний характер (мал. 6), можна припустити, що структура розчину сильніше впливає на процес компактизації більш високомолекулярної структури - ДНК - через те, що в її молекулі наявні сильні гідрофобні взаємодії. Вплив гліцерину на необхідну для конденсації рР концентрацію іонів Са2+ носить немонотонний характер. В міру зростання об’ємної концентрації неелектроліту у розчині зменшується кооперативність процесу конденсації поліфосфатів під дією іонів Са2+ в ряду етанол > 1,2-ПД > гліцерин.

13

виСНОВКИ

1.

1.

1.

1.

1.

Компактизація ДНК під дією іонів Сu2+ у змішаних розчинах, що містять етанол, 1,2-ПД та гліцерин, залежить не тільки від діелектричної проникності розчину, але й від структури розчину, що утворюється.

1.

1.

1.

14

гідратації: зростання гідратації призводить до зростання необхідної для компактизації ДНК концентрації іонів Mt2+, дегідратація іонів знижує необхідну концентрацію іонів. При невеликих змінах діелектричної проникності середовища ефекти сольватації можуть переважати.

1.

1.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

15

10.

1.

1.

1.

1.

АНОТАЦІЯ

Хакл О.В. Вплив іонів металів на структурні переходи ДНК у водних розчинах спиртів та сечовини. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02-біофізика.-Харківський державний університет, м.Харків,1999.

Методами ІЧ-спектроскопії та світлорозсіювання досліджені структурні переходи ДНК під дією іонів Cu2+ та Ca2+ у водному та змішаних розчинах, що містять етанол, 1,2-пропандіол, гліцерин (020 об.%) та сечовину (05 М) при температурі 29 та 450С. Показано, що при взаємодії ДНК з іонами Cu2+ та Ca2+ у водному та змішаних розчинах ДНК переходить у компактний стан, який характеризується впорядкованою морфологією; часткова дестабілізація структури ДНК полегшує компактизацію. Одержана оцінка розмірів компактних часток, запропонована модель компактизації. Показно, що компактизація ДНК має високу позитивну кооперативність, яка залежить від структури розчину. Досліджена залежність компактизації ДНК від валентності та гідратації протиіонів, температури, складу розчинника. Встановлено, що у змішаних розчинах компактизація ДНК залежить не тільки від діелектричної проникності, але й від структури розчину.

Одержані результати обговорюються в межах теорій конденсації протиіонів (ССТ) та рівноважного зв’язування. Показано, що теорія рівноважного зв’язування, на відміну від ССТ, задовільно описує процес компактизації ДНК під дією іонів Mt2+.

16

Ключові слова: ДНК, іони металів, ІЧ-спектроскопія, змішані розчини, етанол, 1,2-пропандіол, гліцерин, сечовина, компактизація, температура.

АННОТАЦИЯ

Хакл Е.В. Влияние ионов металлов на структурные переходы ДНК в водных растворах спиртов и мочевины. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02-биофизика. - Харьковский государственный университет, г. Харьков, 1999.

Методами ИК-спектроскопии и светорассеяния исследованы структурные переходы ДНК под действием ионов Cu2+ и Ca2+ в водном и смешанных растворах, содержащих этанол, 1,2-пропандиол, глицерин (020 об.%) и мочевину (05 М) при температуре 29 и 450С. Показано, что при взаимодействии ДНК с ионами Cu2+ и Ca2+ в водном и смешанных растворах ДНК переходит в компактную форму, характеризующуюся упорядоченной морфологией; частичная дестабилизация структуры ДНК облегчает компактизацию. Получена оценка размеров компактных частиц, предложена модель компактизации. Показано, что компактизация ДНК имеет высокую положительную кооперативность, которая зависит от структуры раствора. Исследована зависимость компактизации ДНК от валентности и гидратации противоионов, температуры, состава растворителя. Установлено, что в смешанных растворах компактизация ДНК зависит не только от диэлектрической проницаемости, но и от структуры раствора.

Полученные результаты обсуждаются в рамках теорий конденсации противоионов (ССТ) и равновесного связывания. Показано, что теория равновесного связывания, в отличие от ССТ, удовлетворительно описывает процесс компактизации ДНК под действием ионов Mt2+.

Ключевые слова: ДНК, ионы металлов, ИК-спектроскопия, смешанные растворы, этанол, 1,2-пропандиол, глицерин, мочевина, компактизация, температура.

SUMMARY

Hackl E.V. Metal ions effect on DNA structural transitions in aqueous solutions containing alcohols and urea. - Manuscript.

Thesis for candidate’s degree by speciality 03.00.02 - biophysics. - Kharkov State University, Kharkov, 1999.

Using methods of IR spectroscopy and light scattering, DNA structural transitions are studied under the action of Cu2+ and Ca2+ ions in aqueous and mixed solutions containing ethanol, 1,2-propanediol, glycerol (020 v.%) and urea (05 М) at temperatures 29 and 450C. It is shown that on its interaction with Cu2+ and Ca2+ ions in aqueous and mixed solutions DNA transits into a compact form characterized with the ordered morphology; at the same time the intensity of absorption bands in IR spectra of DNA metal complexes increase sharply.

It is shown that the partial DNA destabilization facilitates its compactisation. The measure of sizes of compact particles is obtained. The compactisation model including inter- and intramolecular mechanisms is proposed. It is shown that DNA compactisation is of high positive cooperativity depending on the solution structure and decreases in the presence of substances disrupting the water structure. DNA compactisation dependencies on the counterions valence and hydration, the Na+ ions content in solution, the temperature and content of solvents are studied.