ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ НЕЙРОХІРУРГІЇ ІМЕНІ АКАДЕМІКА А.П. РОМОДАНОВА
НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕСИТЕТ ІМЕНІ О.О. БОГОМОЛЬЦЯ
КАСЯНЕНКО Юрій Анатолійович
УДК 616.831/.832-002-092.9-08:616.831-089.843-031:611.018.8.013
ВПЛИВ СУСПЕНЗІЇ КЛІТИН ФЕТАЛЬНОГО МОЗКУ ЩУРІВ НА ПЕРЕБІГ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АЛЕРГІЧНОГО ЕНЦЕФАЛОМІЄЛІТУ
14.01.05 – нейрохірургія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук
Київ – 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті нейрохірургії імені академіка А.П Ромоданова АМН України, Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Цимбалюк Віталій Іванович, заступник директора Інституту нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова АМН України, завідувач кафедри нейрохірургії Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Шевага Володимир Миколайович, завідувач кафедри невропатології і нейрохірургії факультету післядипломної освіти Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького МОЗ України
доктор медичних наук, професор Могила Василь Васильович, Кримський державний медичний університет імені С.І. Георгієвського МОЗ України, завідувач курсу нейрохірургії кафедри нервових хвороб з курсами нейрохірургії та неврології
Провідна установа: Дніпропетровська державна медична академія, МОЗ України, кафедра нервових хвороб та нейрохірургії, м. Дніпропетровськ
Захист відбудеться 6 червня 2006 р. о 12 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д_26.557.01 в Інституті нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова АМН України (04050, м. Київ, вул. Мануїльського 32, конференц-зал)
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова (04050, м. Київ, вул. Мануїльського 32)
Автореферат розісланий 5 травня 2006 р.
Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради,
доктор медичних наук, професор ___________________ Чеботарьова Л.Л.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Лікування запально-дегенеративних захворювань нервової системи, що супроводжуються демієлінізацією, є актуальною медичною проблемою. Демієлінізуючі захворювання підрозділяються на мієлінопатії, або дисмієлінові хво-роби, і мієлінокластії, або мієлінокластичні захворювання (Гусев Е.И. та ін., 1999). При дисмієлінових захворюваннях наявний генетично детермінований дефект процесу за-кладки та формування мієліну. Причиною мієлінокластичних хвороб є руйнування нормально синтезованого мієліну. Мієлінокластичні захворювання зустрічаються ча-стіше, ніж дисмієлінові хвороби, до них належать розсіяний склероз (РС), поствак-цинальні та експериментальні енцефаломієліти та ін.
Експериментальний алергічний енцефаломієліт (ЕАЕ) – алергічне експериментальне захворювання центральної нервової системи у тварин з аутоімунним компонентом. ЕАЕ лише частково відповідає розсіяному склерозу – аутоімунному захворюванню, – але вважається найбільш вдалою моделлю РС (Марков Д.А., 1973). ЕАЕ – органоспеци-фічне алергічне захворювання, при цьому в органі-мішені, тобто мозку, розвиваються морфологічні зміни, переважно характерні для гіперчутливості уповільненого типу. Далі, при руйнуванні мієліну, розвивається антигенспецифічна відповідь, яка супро-воджується антигенспецифічним імунним запаленням у тканині центральної нервової системи (ЦНС).
Сучасні методи лікування демієлінізуючих захворювань базуються на вивченні основних механізмів саногенезу ЦНС при змодельованих демієлінізуючих процесах. Роботами останніх років показано, що окрім впливу на причину демієлінізації у хво-рих, необхідно забезпечувати передумови для відновлення ушкодже-ної структури оболонки аксонів (Бойко А.Н. та ін., 2003; Цимбалюк В.І. та ін., 2003). Такі переду-мови створює метод інтратекального введення у лікворні порожнини ЦНС клітин емб-ріональної нервової тканини (ЕНТ). Цей метод забезпе-чує відновлення кількості по-передників мієлінутворюючих клітин та нейральних стовбурових клітин у ЦНС за рахунок комплексного впливу нейральних стовбурових та прогеніторних клітин, які містяться в ЕНТ (Зозуля Ю.А. та ін., 2005).
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація пов’язана з науково-дослід-ною роботою: “Дослідити вплив ембріональної нервової тканини та її компонентів на рухові порушення у хворих з запально-дегенератив-ними ураженнями центральної нервової системи” (№ держреєстрації 0104U000414, В/І.К. 26.02.07.04), яка виконується в Ін-ституті нейрохірургії імені акад. А.П. Ромо-данова АМН України (2004-2006 рр.).
Мета дослідження – розробка та вдосконалення методів впливу клітин фетальної нервової тканини на перебіг експериментального алергічного енцефаломієліту.
Задачі дослідження:
1. Дослідити клінічний перебіг експериментального алергічного енцефаломієліту у щурів;
2. Дослідити вплив інтратекального введення клітин алогенного фетального мо-зку та ембріональної нервової тканини на неврологічний статус щурів з експе-риментальним алергічним енцефаломієлітом;
3. Оцінити показники імунної системи щурів з експериментальним алергічним енцефаломієлітом до та після лікування;
4. Дослідити морфологічні зміни в центральній нервовій системі щурів з експериментальним алергічним енцефаломієлітом до та після лікування;
5. Провести порівняльний аналіз ефективності інтратекального введення ембріональної нервової тканини та клітин алогенного фетального мозку на перебіг експериментального алергічного енцефаломієліту у щурів.
Об’єкт дослідження – модельне демієлінізуюче захворювання нервової системи у щурів.
Предмет дослідження – вплив суспензії клітин фетальної нервової тканини та її фракцій, збагачених на гліальні або нейрональні клітини, на перебіг модельного демієлінізуючого захворювання нервової системи у щурів.
Методи дослідження: експериментальний (моделювання демієлінізуючого захво-рювання нервової системи у щурів, лікування інтратекальним введенням клітин фе-тального мозку), клінічний (неврологічне спостереження за піддослідними тваринами), морфологічний, імунологічний, статистичний.
Наукова новизна отриманих результатів. Уперше встановлено диференційований вплив клітинних су-спензій та фракцій алогенного мозку різних термінів гестації на тяжкість перебігу та тривалість ЕАЕ (найбільш ранній і виражений лікувальний ефект спостерігався від інтратекального введення суспензії нативних клітин 10-денного ембріонального мозку щурів; інтрате-кальне введення нейронально збагаченої тканини фетального мозку призво-дить до більш раннього і вираженого лікувального ефекту, ніж уведення суспензії кріоконсервованих клітин та гліально збагаченої тканини фетального мозку). Підтверджено погіршення клінічного стану піддослідних тварин після введення кріо-консервованих суспензій та збагаченої на гліальні клітини фракції фетального мозку субокципітально на пікові клінічних проявів ЕАЕ. Одержані результати розширю-ють та доповнюють уявлення про особливості клінічного перебігу демієлінізую-чої патології ЦНС при використанні трансплантації фетальної нервової тканини. Удосконалена методика мо-делювання хронічної форми ЕАЕ з використанням стандартних компонентів, удоско-налені шкала тяжкості перебігу ЕАЕ у щурів із використанням багатофакторного спостереження та шкала трофічних порушень протягом захворювання.
Практичне значення отриманих результатів. Експериментальна робота може слугувати підґрунтям до використання трансплантації клітин фетального мозку у клінічній практиці при лікуванні демієлінізуючих захворювань ЦНС. При цьому відпрацьоване в експериментальних умовах інтратекальне введення клітинних суспензій, визначено недоцільність такого лікування на пікові клінічних проявів демієлінізуючої експериментальної патології, вивчені особливості впливу окремих фракцій фетального мозку чи суспензії клітин мозку ранніх термінів гестації, які можуть використовуватись у клінічній практиці при лікуванні демієлінізуючих захворювань людини.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним науковим дослідженням автора. Здобувач самостійно провів аналіз наукової літератури, визначив напрямок дослідження. Здобувач отримував клітинні суспензії для трансплантації, проводив лікування та довгострокове спостереження за хворими тваринами (147 щурів). Здобувач обробив результати дослідження з використанням статистичних критеріїв, здійснив аналіз отриманих результатів дослідження.
Усі розділи дисертаційної роботи написані здобувачем особисто.
Апробація результатів дисертації. Апробація дисертації проведена 02.12.05 на спільному засіданні Вченої ради Інституту нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова АМН України та кафедр нейрохірургії Київської медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України та Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України (протокол № 18).
Публікації. За матеріалами дисертаційного дослідження опубліковано 5 наукових друкованих праць, із них 1 колективна монографія, 3 статті в провідних фахових виданнях, 1 тези доповіді.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, трьох розділів власних досліджень, підсумку, висновків, списку використаних джерел. Робота викладена на 144 сторінках основного тексту, ілюстрована 15 рисунками, 26 графіками, 43 фотографіями, 17 таблицями. Перелік використаної літератури містить 180 джерел, 98 – іноземні, 55 – за останні 5 років.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ
Матеріали і методи дослідження. Матеріали дослідження базуються на 147 спостереженнях за хворими на ЕАЕ щурами (табл. 1), які були розподілені на 4 серії. В кожній серії експерименту були групи порівняння, які не отримували лікування. Також були групи з ад’ювантним енцефаломієлітом та групи, які отримували лікування кріоконсервованими алогенними клітинами (КАК), нативними алогенними клітинами (НАК) фетального мозку, клітинами ембріональної нервової тканини.
За рекомендаціями Давидової_Г.С. (1969) ЕАЕ індуковано енцефалітогенною сумішшю (ЕС), яка складалася з гомогената спинного мозку щурів та повного ад’юванту Фрейнда. Кожна тварина, залежно від серії експерименту, отримала від 1,2 до 8,4 мг мікобактерій туберкульозу, від 160 до 190 мг мозкової тканини (серія 1 – 8,4:190, серія 2 – 1,2:190, серії 3 і 4 – 1,33:160).
Таблиця 1
Розподіл хворих на ЕАЕ щурів по групах
Серія експерименту, клінічна група, кількість тварин в групі | Разом
Серія 1 | Серія 2 | Серія 3 | Серія 4
№1. Лікування КАК | №2. Лікування КАК, які не прилипають до пластика | №3. Група порівняння | №4. Група порівняння з легкою клінікою | №5. Ад’ювантний енцефаломієліт | №6. Група порівняння | №7. Лікування КАК | №8. Група порівняння | №9. Лікування КАК | №10. Група порівняння | №11. Лікування НАК, які прилипають до пластика | №12. Лікування НАК, які не прилипають до пластика | №13. Лікування клітинами ЕНТ | №14. Ад’ювантний енцефаломієліт
12 | 12 | 12 | 7 | 4 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 4 | 147
При спостереженні за хворими на ЕАЕ щурами використовувалася шкала сили рухів у кінцівках та хвості (від відсутності рухів – 0 балів до норми – 5 балів); шкала тяжкості ЕАЕ (від відсутності клінічних проявів – 0 балів до смерті – 5 балів); шкала трофічних порушень (від набряку дистальних відділів однієї кінцівки без порушення її функції – 1 бал до гангрени кінцівки – 6 балів).
Суспензії клітин фетального мозку різних термінів гестації були отримані під тіопенталовим наркозом (Сачков В.И. та ін., 1985) від 10-денних ембріонів та 18-денних плодів щурів кесаревим розтином. Збагачення на нейрональні або гліальні фракції проводилося з урахуванням досвіду, що нейральна стовбурова клітина (НСК) не прилипає до пластика (Сухих Г.Т. та ін., 2001). Інтратекальне введення суспензії клітин проводилося під тіопенталовим наркозом (Сачков В.І. та ін., 1985) з використанням інсулінових шприців. Кожній тварині у велику потили-чну цистерну було введено 0,1 мл суспензії клітин ембріонального або фетального мо-зку, що складає 2 млн. клітин.
Проводились морфологічні дослідження (світлова та електронна мікроскопія зрізів поперекового відділу спинного мозку щурів), імунологічні дослідження (визначення індексу лімфатичного вузла, індексу селезінки, клітинності лімфатичного вузла, клітинності кісткового мозку, тест спонтанної цитотоксичності мононуклеарів селезінки, вміст кортизолрезистентних лімфоцитів селезінки, визначення анти-ОБМ імуноглобулінів Е, вміст циркулюючих імунних комплексів у сироватках щурів, хворих на ЕАЕ).
Обробка даних проводилася на персональному комп’ютері з використанням пакету програм „Медична статистика”, Adobe® Photoshop® 5.0, Micro-soft® Excel® 10.0. У перебігові експерименту за резуль-татами спостереження використовувалися: дисперсійний аналіз, хі-квадрат з аналізом таблиць спряженості, критерій Крускала-Уолліса, критерій Ст’юдента та множинні порівняння, критерій Манна-Уітні.
Результати власних досліджень та їх обговорення. Після розвитку клінічних симптомів ЕАЕ формувалися приблизно однакові за ступенем тяжкості проявів захворювання групи щурів.
ЕАЕ в тварин у групах №1, №2 та №3 мав тяжкий перебіг, що зумовлено кількістю мікобактерій туберкульозу 8,4 мг та 190 мг мозкової тканини на одну тварину; це відповідає даним інших дослідників (Давидова Г.С., 1969, 1975). Особливостями клінічного перебігу ЕАЕ є спонтанне видужування тварин, що спостерігалось і в даних групах. Смертність у групах №1 та №2 складала 30% на висоті клінічних проявів ЕАЕ (15-20 доба після індукції ЕАЕ). Середня тяжкість ЕАЕ склала 3.4 бали в групі №1, 2.8 – у групі №2 на пікові клінічних проявів ЕАЕ (16 доба). При цьому тяжкість перебігу ЕАЕ в групі №1 у цей термін більша за тяжкість перебігу в групі порівняння №3 (3.1 бали) в 1.1 рази, а в групі №2 – менша в 1.1 (тобто статистично не достовірно). Після лікування групи №1 КАК та групи №2 КАК, збагаченими на нейрональну фракцію, спостерігається погіршення стану в обох групах наступної після інтратекального введення доби (17 доба), проте в групі №1 погіршення стану щурів статистично достовірне (p<0.05), а в групі №2 – не достовірне (p>0.05). Далі спостерігається поступове одужання хворих на ЕАЕ щурів у групах №1 та №2, яке настає на 32 добу. У групі порівняння №3 тварини хворіють більш важко, одужання настає лише на 38 добу. У групі №5 (ад’ювантний енцефаломієліт) у щурів також спостерігалася неврологічна симптоматика; тяжкість перебігу енцефаломієліту у цих тварин, однак, була не важкою, виражених парезів чи плегій не спостерігалось.
ЕАЕ у тварин у групах №6 та №7, навпаки, був легким – це зумовлено невеликою кількістю мікобактерій туберкульозу, яка була введена тварині при моделюванні ЕАЕ – 1,2 мг, – та відносно великою кількістю мозкової тканини – 190 мг. На пікові клінічних проявів ЕАЕ (18 доба) тяжкість ЕАЕ в групі №7 склала 1.4 бали і була більшою за тяжкість перебігу в групі порівняння №6 у 1.1 (тобто статистично не достовірно). Після лікування групи №7 КАК спостерігається статистично достовірне погіршення стану (p<0.05) наступної після інтратекального введення доби (19 доба). Показник тяжкості перебігу ЕАЕ в групі №7 досягає величини піку клінічних проявів лише на 22 добу, але далі спостерігається швидкий регрес проявів ЕАЕ до 30 доби. Одужання тварин у групі №7 настає на 38 добу.
Перебіг ЕАЕ в тварин у групах №8-13 відбувався за типом хронічного ремітуючого, з ремісіями та загостреннями через декілька діб. У цих групах спостерігалися виражені парези до плегій у хвості та кінцівках, але смертності не було. На пікові клінічних проявів (18 доба) тяжкість клініки в групі №9 складає 2.6 бали та більша за тяжкість клініки в групі порівняння №8 у 1.1 (тобто статистично не достовірно). Погіршення стану тварин у групі №9, яка отримала лікування КАК, наступної після інтратекального введення доби (19 доба) спостерігається і статистично достовірне (p<0.05). Далі клінічні прояви ЕАЕ в групі №9 швидко регресують, і тяжкість ЕАЕ на 22 добу складає 1.7 бали. Проте подальше спостереження виявляє досить поступовий регрес симптомів ЕАЕ, тяжкість якого складає на 32 добу 1 бал. Одужання тварин у групі №9 настає на 34 добу.
На пікові клінічних проявів (16 доба) тяжкість клініки ЕАЕ в групі №11 складає 2.8 бали, в групі №12 – 2.2 бали, в групі №13 – 2.6 бали. Такі показники більші за тяжкість ЕАЕ в групі порівняння №10 у 1.1 та 1.04 рази відповідно в групах №11 та №13 (тобто статистично не достовірно). У групі №12 тяжкість ЕАЕ менша за тяжкість ЕАЕ в групі порівняння №10 у 1.1 (тобто статистично не достовірно).
У перші дні після лікування спостерігалося погіршення стану тварин у групі №12, так само, як і в групах №1 та №7. У групах №11, №13 погіршення стану тварин після лікування не спостерігалось. Так, тяжкість ЕАЕ в групі №11 на 17 добу складає 2.5 бали, в групі №12 – 2.8 бали, а в групі №13 – 1.8 бали. У групі №12 на 17 добу тяжкість ЕАЕ більша за такий показник на 16 добу в 1.3 рази, а на 18 добу – в 1.4 рази (тобто статистично достовірно). Подальше спостереження виявляє швидкий регрес симптомів ЕАЕ в групі №13, яка отримала лікування інтратекальним введенням ЕНТ. Одужання щурів у цій групі настає на 24 добу. Лише окремі тварини (з найбільш тяжким перебігом ЕАЕ) цієї групи мають незначні симптоми ЕАЕ до 30 доби. Щури в групі №11, які отримали лікування інтратекальним введенням нейронально збагачених НАК фетального мозку, видужують на 32 добу. Щури в групі №12, які отримали лікування інтратекальним введенням гліально збагачених НАК фетального мозку, видужують на 38 добу.
В цілому, від індукції до перших проявів ЕАЕ – 8-12 днів, залежно від співвідношення компонентів ЕС. Далі, після 14 доби, стан усіх тварин в експерименті суттєво погіршується, парези в кінцівках чи хвості наростають до плегії, з’являються порушення функції тазових органів за типом нетримання (рис. 1).
На рис. 1 – тварина на висоті клінічних проявів ЕАЕ має задню параплегію, плегію хвоста, порушення функції тазових органів за типом нетримання. Спостерігається виражений набряк та почервоніння задніх кінцівок. Тварина виснажена та різко відрізняється від здорових тварин контрольної групи.
На 19 добу, після інтратекального лікування, в багатьох групах – тяжко хворі тварини (табл. 2, 3).
Таблиця 2
Розподіл тварин на 19 добу по тяжкості перебігу ЕАЕ (групи №1-7)
Група тварин
Тяжкість ЕАЕ | №1. Лікування КАК | №2. Лікування КАК, які не прилипають до пластика | №3. Група порівняння | №4. Група порівняння з легкою клінікою | №5. Ад’ювантний енцефаломієліт | №6. Група порівняння | №7. Лікування КАК
Легка | - | - | - | 60% | 75% | 20% | 30%
Середньо-важка | 50% | 70% | 100% | 40% | 25% | 80% | 50%
Важка | 50% | 30% | - | - | - | - | 20%
Таблиця 3
Розподіл тварин на 19 добу по тяжкості перебігу ЕАЕ (групи №8-14)
Група тварин
Тяжкість ЕАЕ | №8. Група порівняння | №9. Лікування КАК | №10. Група порівняння | №11. Лікування НАК, які прилипають до пластика | №12. Лікування НАК, які не прилипають до пластика | №13. Лікування клітинами ЕНТ | №14. Ад’ювантний енцефаломієліт
Легка | 78% | 22% | 22% | 22% | 44% | 78% | 100%
Середньо-важка | 22% | - | 56% | 56% | 56% | 22% | -
Важка | - | 78% | 22% | 22% | - | - | -
Зважаючи на отримані дані, тяжкість перебігу на 19 добу залежить від способу індукції ЕАЕ, тобто кількості мікобактерій туберкульозу в ЕС, та особливостей лікувальних впливів, тобто типу клітинної суспензії, яка вводиться хворим тваринам субокципітально.
На 21 добу від індукції ЕАЕ починає суттєво проявлятися лікувальний ефект від введення клітинних субстратів. Зміни в клініці ЕАЕ неоднозначні (табл. 4, 5).
Таблиця 4
Розподіл тварин на 21 добу по тяжкості перебігу ЕАЕ (групи №1-7)
Група тварин
Тяжкість ЕАЕ | №1. Лікування КАК | №2. Лікування КАК, які не прилипають до пластика | №3. Група порівняння | №4. Група порівняння з легкою клінікою | №5. Ад’ювантний енцефаломієліт | №6. Група порівняння | №7. Лікування КАК
Легка | - | - | - | 67% | 75% | 30% | 38%
Середньо-важка | 60% | 37% | 78% | 33% | 25% | 70% | 56%
Важка | 40% | 63% | 22% | - | - | - | 6%
Так, у групі №1 частина щурів із тяжким клінічним перебігом померла, в групі №9 є тварини з відсутніми клінічними проявами, в групі №13 – 5 тварин з 12 мають незначні клінічні прояви ЕАЕ.
Таблиця 5
Розподіл тварин на 21 добу по тяжкості перебігу ЕАЕ (групи №8-14)
Група тварин
Тяжкість ЕАЕ | №8. Група порівняння | №9. Лікування КАК | №10. Група порівняння | №11. Лікування НАК, які прилипають до пластика | №12. Лікування НАК, які не прилипають до пластика | №13. Лікування клітинами ЕНТ | №14. Ад’ювантний енцефаломієліт
Відсутність клініки | - | 12% | - | - | - | - | -
Легка | 22% | 22% | 78% | 82% | 82% | 89% | 100%
Середньо-важка | 78% | 33% | - | 6% | 18% | 11% | -
Важка | - | 33% | 22% | 12% | - | - | -
Отже, на 21 добу лікувальний вплив уже має місце, але характер змін залежить від типу суспензії клітин, введених субокципітально.
Далі відзначається поступове покращення стану тварин. Тривалість захворювання в групах, які отримали лікування КАК (без та із збагаченням на нейрональні клітини), тобто в групах №1 та №2, склала 32 доби з повним одужанням тварин, у зіставленні з групою порівняння №3, в якій одужання настало лише на 38 добу. У групі №7, яка отримала КАК, повне одужання спостерігається на 38 добу, у зіставленні з групою порівняння №6 – на 42; у групі №9 повне одужання має місце на 34 добу, а в групі порівняння №8 тварини хворіють до останнього забою на 150 добу з пері-одичними загостреннями та покращеннями стану. Тварини, які отримали лікування гліально збагаченими НАК, тобто з групи №12, мають повільну динаміку о-дужання, остаточно одужують на 38 добу. При цьому, якщо порівняти дві лінії регресії (рис._2), то стає очевидним покращення стану щурів, яких лікували гліально збагаченими НАК (група №12, регресивний вид), у зіставленні з групою порівняння (група №10, прогресивний вид) – нахил лінії регресії свідчить про покращення стану в групі №12.
Швидко видужують (на 32 добу), тварини, яких лікували нейронально збагаченими НАК (група №11), у зіставленні з групою порівняння №10. Але найшвидше видужують тварини, які отримали лікування ЕНТ (група №13) – на 24 добу. У групі спостереження №10 на 35 добу майже немає клінічних проявів, але до останнього розтину на 150 добу в цій групі спостерігаються періодичні загострення ЕАЕ.
У всіх груп порівняння, повного одужання в яких не спостерігається, наявні виражені трофічні порушення. Перші трофічні порушення починають проявлятись у тварин на 20 добу. З 20 по 30 добу трофічні порушення мають перехідний характер: за один день спостереження охоплюють одну кінцівку піддослідної тварини, через кілька днів – іншу. На 30 добу трофічні порушення спостерігаються в задніх кінцівках тварин та зберігаються на всьому перебігові захворювання. Трофічні розлади поступово прогресують і приводять до інвалідизації тварин.
Показники імунного статусу піддослідних тварин визначались комплексно при заборі матеріалу під час розтинів на 21-23, 35 та 150 добу після ін-дукції ЕАЕ. Для оцінки показників імунного статусу використовувався ряд імунологічних тестів, відносно простих у виконанні, інформативних та чутливих до регуляції цитокіновими впливами.
Визначено, що в ранні строки дослідження інформативні зміни проявляються у функціональній активності клітин. Отримані результати (рис. 3) щодо тенденції до нормалі-зації в деяких групах, а, в ряді випадків, навіть до посилення активності мононуклеа-рів в НСТ тесті, в ранні строки після лікування НАК та ЕНТ. Це свідчить про появу після лікування факторів, які впливають на функціональний стан моноцитів та клітин природних кілерів (Лісяний М.І. та ін., 2001). Оскільки експериментально виявлена тенден-ція до нормалізації та активації цитотоксичної активності, очевидно, можна припус-тити збільшення вмісту в імунній системі активуючих цитотоксичність цитокінів IL-2, або IFN-г, тобто інтерлейкінів із групи прозапальних цитокінів.
У більш віддалені строки дослідження зміни в імунній системі більше торкаються клітинності кісткового мозку (рис. 4). Зміни в кістковому мозку характерні для кожної групи тварин та залежать від особливостей перебігу ЕАЕ та особливостей лікувальних впливів. Найбільші зміни спостерігаються в групах, які отримують лікування ЕНТ та збагаченими на нейрони НАК. Це може свідчити про активні процеси в кістковому мозку у віддалені строки після лікування, стимульовані інтратекальним введенням клітинних суспензій, синтезом цитокінів під час репарації нервової системи.
Під час морфологічних досліджень визначено, що при лікуванні ЕАЕ НАК фетального мозку та ЕНТ на пікові клінічних проявів демієлінізуючого процесу (21 доба після індукції ЕАЕ) виявляється зменшення площі та ступеню демієлінізації відносно групи порівняння. При цьому тканина спинного мозку поперекових відділів щурів характеризувалася незначним набряком, зокрема інтраламеллярним і периаксональним. Значне покращення морфо-функціонального стану елементів спинного мозку в групі дослідження з використанням НАК фетального мозку та ЕНТ відбувається у більш віддалені терміни (35 доба). У віддалені терміни дослідження (150 доба) зафіксовано збільшення відносно групи порівняння, площі, зайнятої ремієлінізованими нервовими волокнами, що супроводжується відновленням, проліферацією та гіпертрофією олігодендроцитів з утворенням клітинних кластерів.
Оцінка морфометричних даних у групі порівняння №3, де тварини хворіють на ЕАЕ та не отримують лікування, визначає достовірне (p<0,05) зростання відношення товщини мієлінової оболонки до діаметра осьового циліндра Кмо-оц порівняно з контрольною групою здорових тварин на 21, 35 та 150 добу, тобто у всі терміни дослідження. При цьому Кмо-оц зростає в 1.7, 2.1 та 1.1 рази у відповідні терміни дослідження (рис. 5). Видно, що максимум коефіцієнта в групі №3 приходиться на 35 добу, що не корелює з клінічними даними. Очевидно, для розвитку морфологічних ознак патологічного процесу потрібен певний час.
У групі №1, яка отримала лікування КАК, Кмо-оц відносно контролю достовірно зростає в 1.8 та 1.5 рази (21 і 35 доба відповідно), і, на відміну від групи порівняння, сягає максимуму на 21 добу дослідження (що корелює з клінічними даними, з візуально відміченими на світлооптичному рівні змінами та змінами на ультраструктурному рівні – з посиленням периаксонального та міжламеллярного набряку). Кмо-оц далі поступово знижується, але дещо не досягає контрольних величин (утім, статистично не достовірно, р>0,05).
Найбільш близькими до контрольних є дані Кмо-оц у групах, які отримали лікування нейронально збагаченими НАК (група №11) та ЕНТ (група №13) (рис. 6), вже на 21 добу. Дані Кмо-оц у групах №11 і №13 на 21 і 35 добу достовірні відносно групи порівняння №10 (p<0,05). Зростання Кмо-оц у групах, які отримали лікування НАК, та в групі порівняння відносно контрольної групи здорових тварин спостерігається на 21, 35 та 150 добу, тобто у всі терміни дослідження. При цьому Кмо-оц у групі №11, яка отримала лікування нейронально збагаченими НАК, зростає в 1.4 та 1.2 рази (21 і 35 доба відповідно) і сягає максимуму на 21 добу, що корелює з клінічними даними. Кмо-оц у групі №12, яка отримала лікування гліально збагаченими НАК, зростає в 2.4 та 3 рази (21 і 35 доба відповідно) і сягає максимуму на 35 добу, що не відповідає клінічним даним перебігу ЕАЕ. В групі №13, яку лікували ЕНТ, Кмо-оц зростає в 1.5 рази на 21 добу, сягаючи величин контрольної групи на 35 і 150 добу, що повністю відповідає клінічним даним та свідчить про швидке клінічне та статистично достовірне одужання.
ВИСНОВКИ
1. У дисертації наведено обґрунтування теоретичного та практичного використання суспензії клітин фетального мозку для лікування експериментальної демієлінізуючої патології шляхом інтратекального введення;
2. Багатофакторне спостереження з використанням шкали оцінки тяжкості перебігу ЕАЕ у щурів дозволяє провести детальний аналіз і вивчити клінічні зміни в організмі експериментальних тварин;
3. Інтратекальне введення гліально збагачених нативних та кріоконсервованих алогенних клітин фетального мозку на пікові клінічних проявів ЕАЕ супроводжується погіршенням стану експериментальних тварин в перші доби після лікування;
4. Погіршення стану експериментальних тварин при інтратекальному введенні нейронально збагачених нативних алогенних клітин фетального мозку та клітин ембріональної нервової тканини на пікові клінічних проявів ЕАЕ відсутнє;
5. У ранні терміни (на 5 добу) після інтратекального введення клітин фетального мозку щурів змінюється функціональна активність клітин імунної системи, а у віддалені терміни (35-150 доба після індукції ЕАЕ) – змінюється клітинність кісткового мозку експериментальних тварин. Найбільш позитивні зміни в імунній системі експериментальних тварин визначаються при лікуванні нейронально збагаченими нативними алогенними клітинами фетального мозку та клітинами ембріональної нервової тканини;
6. Ремієлінізація спинного мозку щурів під впливом лікування нейронально збагаченими нативними алогенними клітинами фетального мозку та клітинами ембріональної нервової тканини починається в ранні строки (на 5 добу) після лікування. Морфометричні зміни в спинному мозку щурів, які отримують лікування, корелюють з клінічним перебігом ЕАЕ;
7. Лікування інтратекальним введенням нейронально збагачених нативних алогенних клітин фетального мозку призводить до більш раннього і вираженого ефекту, ніж введення суспензії кріоконсервованих алогенних клітин та гліально збагачених нативних алогенних клітин фетального мозку;
8. Інтратекальне введення ембріональної нервової тканини є найбільш ефективним методом для лікування ЕАЕ у щурів. Субокципітальне введення клітин фетального мозку щурів позитивно впливає на перебіг ЕАЕ в цілому, але недоцільне на висоті клінічних проявів захворювання.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Цымбалюк В.И., Лисяный Н.И., Маркова О.В., Пичкур Л.Д., Касяненко Ю.А. Динамика уровня кортизолрезистентных лимфоцитов у крыс с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом, леченных производными эмбриональной нервной ткани // Імунологія та алергологія. – 2003. – №1 – С. 40-43.
(Здобувачем виконано експериментальну частину, спостереження та лікування хворих на ЕАЕ тварин, розтини щурів)
2. Цимбалюк В.І., Лісяний М.І., Маркова О.В., Пічкур Л.Д. Любич Л.Д., Вербовська С.А., Касяненко Ю.А., Вотякова І.А., Василовська С.В. Результати хірургічного лікування експериментального алергічного енцефаломієліту // Трансплантологія. – 2003. – Т.4. – №1. – С. 33-35.
(Здобувачем виконано планування експерименту, спостереження за хворими на ЕАЕ тваринами, лікування інтратекальним введенням клітинних суспензій субокципітально, статистичну обробку матеріалів)
3. Маркова О.В., Касяненко Ю.А. Динаміка рівня кортизолрезистентних лімфоцитів в селезінці щурів з експериментальним алергічним енцефаломієлітом після лікування фетальними клітинами // Здобутки клінічної і експериментальної медицини. Матеріали XLVIII підсумкової науково-практичної конференції, „Укрмедкнига”, Тернопіль, 3 червня 2005 р. – С. 194-195.
4. Цимбалюк В.І., Касяненко Ю.А. Особливості моделювання та перебігу експериментального алергічного енцефаломієліту // Український нейрохірургічний журнал. – 2005. – №1. – С. 45–51.
(Здобувачеві належить експериментальний матеріал, статистичні обробки та результати досліджень, висновки щодо проведеного експериментального дослідження)
5. Цымбалюк В.И., Лисяный Н.И., Маркова О.В., Пичкур Л.Д., Касяненко Ю.А., Вотякова И.А., Василовская С.А. Лечение экспериментального аутоиммунного демиелинизирующего процесса интратекальным введением незрелых клеток головного мозга // Нейрогенная дифференцировка стволовых клеток. Под ред. Ю.А. Зозули, Н.И. Лисяного. – Киев, 2005. – С. 283-313.
(У монографії здобувач спільно з колективом авторів написав главу №12)
АНОТАЦІЯ
Касяненко Ю.А. „Вплив суспензії клітин фетального мозку щурів на перебіг експериментального алергічного енцефаломієліту”. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.05 – нейрохірургія. Інститут нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова. Національний медичний університет імені О.О. Богомольця. – Київ, 2005.
У результаті проведеного дослідження, яке базується на 147 спостереженнях за хворими на ЕАЕ щурами, встановлено особливості перебігу ЕАЕ під впливом суспензії алогенних клітин фетального мозку. Проведено багатофакторне спостереження з детальним аналізом клінічних змін в організмі експериментальних тварин. Отримані нові дані щодо перебігу ЕАЕ під впливом інтратекального введення клітинних суспензій на пікові клінічних проявів захворювання. Вперше описано відсутність погіршення клінічного стану щурів з ЕАЕ при лікуванні нейронально збагаченими нативними алогенними клітинами фетального мозку та клітинами ембріональної нервової тканини на пікові клінічних проявів захворювання.
Морфологічно та імунологічно доведено найкращий результат від інтратекального введення ембріональної нервової тканини.
На основі отриманих результатів обґрунтовано позитивний вплив інтратекального введення алогенних клітин фетального мозку на ЕАЕ в цілому та недоцільність використання такого лікування на висоті клінічних проявів захворювання.
Ключові слова: експериментальний алергічний енцефаломієліт, ад’ювант Фрейнда, кріоконсервовані алогенні клітини, нативні алогенні клітини, збагачення, фетальний мозок, ембріональна нервова тканина, інтратекальне введення.
АННОТАЦИЯ
Касяненко Ю.А. „Влияние суспензии клеток фетального мозга крыс на течение экспериментального аллергического энцефаломиелита”. – Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.05 – нейрохирургия. Институт нейрохирургии имени академика А.П. Ромоданова. Национальный медицинский университет имени О.О. Богомольца. – Киев, 2005.
В результате проведенного исследования, базирующегося на 147 наблюдениях за больными ЭАЭ крысами, установлены особенности клинического течения ЭАЭ и особенности изменений в организме экспериментальных животных под влиянием ле-чения суспензией аллогенных клеток фетального мозга. При моделировании ЭАЭ использовался отечественный адьювант и адьювант Difco USA. Использование двух адьювантов позволило тщательно изучить зависимость клинико-патоморфологиче-ских изменений в организме больных ЭАЭ животных от содержания микобактерий туберкулёза в энцефалитогенной смеси, а также получить хронически рецидивирующую форму ЭАЭ – наиболее близкую патогенетически к демиелинизирующим заболеваниям человека.
Группы экспериментальных животных составляли: группы сравнения (больные ЭАЭ крысы, не получившие лечения), группы с адьювантными энцефаломиелитами и группы, получившие лечение криоконсервиро-ванными аллогенными клетками, нативными аллогенными клетками фетального мозга и клетками эмбриональной нервной ткани раннего срока гестации. Клеточные суспензии фетального мозга крыс обогащались нейрональными и глиальными клетками, что позволило детально изучить влияние отдельных фракций на течение ЭАЭ и получить данные, свидетельствующие о том, что трансплантация какой-либо клеточной суспензии интратекальным введением является эффективной при лечении ЭАЭ.
Проведено многофакторное наблюдение с детальным анализом клинических изменений в организме экспериментальных животных. Получены новые данные течения ЭАЭ под влиянием интратекального введения клеточных суспензий на пике клинических проявлений заболевания. Впервые описано отсутствие ухудшения клинического состояния крыс с ЭАЭ при лечении нейронально обогащёнными нативными аллогенными клетками фетального мозга и клетками эмбриональной нервной ткани на пике клинических проявлений заболевания.
Сроки вскрытий животных (21, 35 и 150 сутки после индукции ЭАЭ) позволили изучить изменения в организме животных в ранний период после лечения (21 сутки), в период спонтанного выздоровления в некоторых группах (35 сутки) и в отдалённый период ЭАЭ (150 сутки). Для решения поставленных задач использован ряд информативных иммунологических методов (индексы лимфатического узла и селезёнки, клеточность костного мозга, НСТ-тест, частота выявления анти-ОБМ IgE, содержание циркулирующих иммунных комплексов), световая и электронная микроскопия, морфометрический анализ степени демиелинизации аксонов.
Морфологически и иммунологически доказан наилучший результат от интратекального введения эмбриональной нервной ткани. Клинические, иммунологические и морфологические данные детально обработаны с учётом различных статистических критериев (Стьюдента, Ньюмена-Кейлса, Вилконсона-Манна-Уитни).
Экспериментальные исследования позволили в условиях in vivo изучить влияние интратекального введения клеточных суспензий незрелого мозга на иммунопатогенез ЭАЭ и интенсивность процессов ремиелинизации в ЦНС после лечения.
На основе полученных результатов обосновано положительное влияние интратекального введения аллогенных клеток фетального мозга на течение ЭАЭ в целом и нецелесообразность использования такого лечения на высоте клинических проявлений заболевания.
Ключевые слова: экспериментальный аллергический энцефаломиелит, адьювант Фрейнда, криоконсервированные аллогенные клетки, нативные аллогенные клетки, обогащение, фетальный мозг, эмбриональная нервная ткань, интратекальное введение.
SUMMARY
Kasyanenko Yu.A. “The effect of suspension of fetal cerebral cell on course of experimental allergic encephalomyelitis”. – Manuscript.
This dissertation for a degree of candidate of medical sciences in speciality 14.01.05 – neurosurgery. – Academy of Medical Sciences of Ukraine. A.P. Romodanov Institute of Neurosurgery. National Medical University. – Kyiv, 2005.
As a result of carried out studies based on 147 observations of rats with EAE, are set up the specificities of clinical course EAE under effect treatment with the suspension of the allogenic cells of fetal brain.
It carried out multifactorial case with the detailed analysis of clinical changes in organism of the experimental animals. It obtained the new findings of course EAE under influence of the intratecal injection of cellular suspensions on the peak of the clinical features of illness. Newly is described the lack of the worsening of the clinical state of rats with EAE during the treatment with neuronal enrichment native allogenic cells of fetal brain and with the cells of embryonic nervous tissue on the peak of the clinical features of illness.
It is proved morphologically and immunobiologically the best result from intratecal injection of the embryonic nervous tissue.
On the basis of obtained results it is substantiated the positive effect of intratecal injection of the allogenic cells of fetal brain on course EAE as a whole and not expediency of the application of such cure on the altitude of the clinical features of illness.
Key words: experimental allergic encephalomyelitis, Adjuvant of Freund, the allogenic krioconserve cell, the allogenic native cell, enrichment, fetal brain, embryonic nervous tissue, intratecal injection.
__-
Підписано до друку 28.04.2006 р. Формат 60?90/16
Ум.друк.арт. 0,9. Обл.-вид.арк. 0,9.
Тираж 150 прим. Зам. №12.
„АВТОРЕФЕРАТ”
04050, м. Київ-50, Оргчарчопром-наладка, оф.125
т. 331-06-42
