НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ЛЕОНОВА НАТАЛІЯ ОСИПІВНА

УДК: 579.222: 631.461.5: 579.262 + 631.811.98

ФІЗІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM

ТА ЕФЕКТИВНІСТЬ СОЄВО-РИЗОБІАЛЬНОГО СИМБІОЗУ

ЗА ДІЇ ФІТОРЕГУЛЮВАЛЬНИХ РЕЧОВИН

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі загальної та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної академії наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Іутинська Галина Олександрівна,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, заступник директора з наукової роботи

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Курдиш Іван Кирилович,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях

доктор сільськогосподарських наук, професор

Волкогон Віталій Васильович,

Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН, директор інституту

Провідна організація: Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

м. Київ.

Захист відбудеться “15” листопада 2006 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м. Київ, МСП, вул. Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, вул. Заболотного, 154

Автореферат розісланий “13” жовтня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У зв'язку із впровадженням нових агротехнологій у сільському господарстві особливо актуальною є проблема екологічної стабільності ґрунтів та якості продукції рослинництва. Значний інтерес при цьому становить кругообіг азоту. Відомо, що азотфіксувальні мікроорганізми здатні засвоювати молекулярний азот, неорганічні та органічні сполуки азоту. Прижиттєво і після відмирання вони виділяють в навколишнє середовище біологічно активні азотвмісні речовини, які відіграють важливу роль у формуванні урожаю бобових та у відновленні родючості ґрунтів (Рубенчик, 1960; Коць та ін., 2001; Спайнк и др., 2002; Патика та ін., 2003).

У складних взаємовідносинах симбіотрофних бактерій і бобових рослин важливе значення мають метаболіти мікробного та рослинного походження. Останнім часом зростає зацікавленість дослідників до участі у цих процесах рослинних метаболітів фіторегулювальної дії – флавоноїдів. Ці речовини стимулюють розвиток бульбочкових бактерій, активізують nod-гени, що керують механізмами інфікування коренів бобових ризобіями та формування нодуляційного апарату. У літературі накопичена інформація стосовно хімії флавоноїдів, біогенезу, розподілу та біологічної ролі в рослинах (Харборн, 1968; Rolfe, 1988; Winkel-Shirley, 2001; Gonzalez, Marketon, 2003). У той же час, недостатньо даних щодо впливу флавоноїдів на азотний метаболізм симбіотичних діазотрофів, на накопичення ними біомаси та екзополімерів, а також на ефективність симбіозу з рослинами.

В сучасному землеробстві досить широко застосовуються синтетичні і природні регулятори росту рослин (РРР), які діють у незначних концентраціях, регулюючи основні фізіологічні процеси (Шевелуха, 2001; Пономаренко, 2003). Мало дослідженим залишається питання впливу РРР на ґрунтові мікроорганізми, зокрема симбіотрофні азотфіксатори та взаємовідносини між мікро- та макросимбіонтами.

Отже, дослідження впливу фіторегулювальних речовин природного і синтетичного походження на фізіологічну активність діазотрофів – мікро-симбіонтів бобових актуальні і важливі для розуміння механізмів формування і пошуку шляхів підвищення продуктивності симбіотичних систем.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в межах науково-дослідної роботи відділу загальної та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за темами: “Еколого-функціональні особливості мікробних угруповань ґрунту в умовах сучасного розвитку агроекосистем” (номер державної реєстрації 0101U003050/2.28.99), “Збереження та забезпечення належного функціонування об’єкта, що становить національне надбання – колекція мікроорганізмів ІМВ НАНУ” (номер державної реєстрації 0105U003954) та проекту Фонду фундаментальних досліджень “Дослідити закономірності функціонування ризосферних та епіфітних мікробних ценозів бобових під впливом нових композицій фунгіцидної дії” (№ 06-7/00020).

Мета і завдання досліджень. Мета дисертаційної роботи полягала у дослідженні фізіологічної активності бульбочкових бактерій сої, формування, функціонування і ефективності симбіотичної системи соя-ризобії за дії фіторегулювальних речовин.

Для виконання поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

· дослідити накопичення біомаси Bradyrhizobium japonicum за дії флавоноїдів та регуляторів росту рослин;

· вивчити вплив фіторегулювальних речовин на продукування ризобіями сої екзополімерів, встановити їх компонентний склад та молекулярно-масові характеристики;

· визначити активність основних ферментів азотного обміну у Bradyrhizobium japonicum за умов культивування з фіторегуляторами;

· вивчити вплив регуляторів росту рослин на проростання насіння сої і формування проростків на природному та інфекційному фонах;

· дослідити особливості формування та функціонування симбіотичної системи Bradyrhizobium japonicum-Glycine max L. (Merr.) за дії фіторегулювальних речовин;

· оцінити ефективність соєво-ризобіального симбіозу за умов застосування регуляторів росту рослин.

Об’єкт дослідження – контрастні за симбіотичними властивостями штами Bradyrhizobium japonicum 71т (УКМ В-6035) та B. japonicum 21110; тест-культури фітопатогенних бактерій; флавоноїди; регулятори росту рослин; рослини сої (Glycine max L. (Merr.)) сортів Київська 98 і Київська 27.

Предмет дослідження – процеси накопичення біомаси та екзополімерів ризобіями сої, активність основних ферментів азотного обміну, формування, функціонування та ефективність соєво-ризобіального симбіозу.

Методи дослідження – мікробіологічні, біохімічні, фізико-хімічні, хімічні, статистичні.

Наукова новизна роботи. Уперше досліджено фізіологічну активність B. japonicum за дії флавоноїдів даїдзеїну і кверцетину та регуляторів росту рослин івіну, емістиму С, енею і агростимуліну. Встановлено, що у високоактивного мікросимбіонта сої за дії даїдзеїну (основного ізофлавоноїду пулу флавоноїдних сполук кореневих ексудатів сої) підвищується накопичення біомаси і продукування екзополімерів, зростає активність ферментів асиміляції амонію (глутамінсинтетази та глутаматдегідрогенази). Уперше визначено, що флавоноїди та регулятори росту рослин суттєво не впливають на компонентний склад екзополімерів B. japonicum.

Розширено уявлення про особливості впливу РРР на формування та функціонування соєво-ризобіального симбіозу. Показано, що підвищення урожаю та покращання його якості можна досягти при оптимальному доборі партнерів симбіозу та РРР. Застосування синтетичного регулятора івіну та природного – емістиму С сприяє підвищенню продуктивності симбіозу за спонтанної інокуляції, а емістиму С та композиційного препарату агростимуліну – за інокуляції ефективним штамом B. japonicum. Виявлено зміни вмісту флавоноїдних сполук у листі та насінні сої за дії РРР.

Практичне значення одержаних результатів. Проведено оцінку впливу сучасних РРР на фізіологічну активність виробничого штаму ризобій сої B. japonicum 71т (УКМ В-6035) – основи нітрагіну. Визначені оптимальні концентрації фіторегулювальних речовин для інтенсифікації росту цих мікроорганізмів та підвищення якості бактеріального добрива.

Розроблені схеми раціонального застосування нітрагіну за синергізмом дії бактеризації та обробки рослин регуляторами росту, що дозволяє більш повно використовувати потенціал препаратів різної природи з метою створення високоефективних бобово-ризобіальних систем.

Отримані дані можуть бути використані як основа заходів щодо підвищення вмісту флавоноїдних сполук у листі та насінні сої, як цінної сировини для одержання флавоноїдів, а також ліків та профілактичного харчування.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором особисто у відділі загальної та ґрунтової мікробіології ІМВ НАНУ. Автором самостійно проаналізовано наукову літературу з тематики досліджень, узагальнено отримані експериментальні дані, проведено їх статистичну обробку та порівняльний аналіз з літературними даними, а також підготовку матеріалів досліджень до публікації. Автором досліджено вплив фіторегулювальних речовин на накопичення біомаси B. japonicum, продукування та компонентний склад екзополімерів. Визначення активності основних ферментів азотного обміну у досліджуваних мікроорганізмів за дії флавоноїдів та регуляторів росту рослин проведено за консультативною допомогою к.б.н. Л.В. Титової, що відображено у спільних публікаціях.

Вегетаційні та польові дослідження з вивчення впливу фіторегулювальних сполук на симбіоз B. japonicum-соя проводили сумісно з д.б.н. А.Ф. Антипчук, к.б.н. Л.В. Титовою та О.В. Танцюренко, які є співавторами відповідних публікацій. Визначення молекулярно-масового розподілу екзополімерів ризобій сої здійснювали спільно з к.б.н. С.К. Воцелко (відділ фітопатогенних бактерій ІМВ НАН України). Вивчення якості зерна сої проводили в лабораторії агроекології і аналітичних досліджень ННЦ “Інститут землеробства УААН”.

Планування напрямку роботи, аналіз результатів та формулювання основних положень і висновків дисертації здобувачем проведено під керівництвом наукового керівника роботи, д.б.н., проф. Г.О. Іутинської.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на Міжнародній конференції молодих вчених “Рослина і середовище (фізіологія, генетика, фітоценологія, агроекологія)” (Харків, 2001); VІ з'їзді товариства ґрунтознавців та агрохіміків України (Умань, 2002); Науковій конференції “Устойчивое развитие агроэкосистем” (Вінниця, 2002); III Міжнародній конференції “Регуляция роста, развития и продуктивности растений” (Мінськ, 2003); 6-й, 8-й і 9-й Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2002, 2004, 2005); XI Міжнародній конференції студентів та аспірантів по фундаментальним наукам “Ломоносов – 2004” (Москва, 2004); Міжнародній науковій конференції “Сучасні проблеми і тенденції розвитку ґрунтознавства” (Чернівці, 2005); І та ІІ Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології” (Львів, 2005, 2006); Міжнародній науково-практичній конференції “Мікробні препарати в землеробстві” (Чернігів, 2006); наукових конференціях-конкурсах молодих вчених ІМВ НАН України (Київ, 2003, 2005).

Публікації. Результати дисертації опубліковані у 13 наукових роботах, з яких 5 – статті у фахових наукових журналах, 8 – матеріали конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, 5 розділів власних експериментальних досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел, який містить 287 першоджерел (з них – 163 англійською мовою). Загальний обсяг роботи становить 147 сторінок тексту комп’ютерного набору. Дисертація ілюстрована 22 рисунками та 16 таблицями.

Огляд літератури

В огляді літератури, який складається з трьох розділів, представлено основні положення щодо формування та функціонування бобово-ризобіального симбіозу у агроценозах; описано біологічні властивості метаболітів рослин – флавоноїдів, їхнє поширення у природі, роль в онтогенезі рослин та формуванні симбіотичних взаємовідносин з мікроорганізмами. Наведено дані щодо хімічної природи та біологічної дії регуляторів росту рослин природного і синтетичного походження. Проаналізовано літературу щодо фізіологічної активності мікроорганізмів за дії фіторегулювальних речовин.

експериментальна частина

розділ 4. матеріали та методи досліджень

Об’єктами досліджень були два штами бульбочкових бактерій сої, що відрізняються за активністю азотфіксації в умовах симбіозу: високоефективний штам B. japonicum 71т (УКМ В-6035), який формує на коренях сої активний азотфіксувальний апарат, сприяє підвищенню урожаю та збільшенню вмісту протеїну в насінні сої (штам з колекції відділу загальної і ґрунтової мікробіології ІМВ НАНУ); малоефективний штам B. japonicum 21110, який формує на коренях сої бульбочки з низькою азотфіксувальною активністю і мало впливає на урожай та його якість (штам з колекції Всеросійського науково-дослідного інституту сільськогосподарської мікробіології РАСГН, Санкт-Петербург, Пушкін). В роботі використовували флавоноїди даїдзеїн та кверцетин (Sigma, Німеччина); регулятори росту рослин івін, емістим С, еней та агростимулін, розроблені в Інституті біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України у Міжвідомчому науково-технологічному центрі “Агробіотех” НАН і МОН України. Тест-культури фітопатогенних бактерій Xanthomonas axanopodis 8609, X. axonopodis pv. glycinea 9075, Pseudomonas savastanoi pv. glycinea 8541 та 8571 надані доктором біологічних наук, професором Р.І. Гвоздяком (відділ фітопатогенних бактерій ІМВ НАН України). Польові досліди проводили з соєю Glycine max L. (Merr.) сортів Київська 98 (ранньостиглий) і Київська 27 (середньоранній), рекомендованих для вирощування в зоні Північного Лісостепу і Полісся України.

Культивування ризобій здійснювали на рідких поживних середовищах Райта та Ісварана (Патент 2901 UA, 1994; Патент 3324 UA, 1994). Концентрація флавоноїдів у поживному середовищі становила від 10-12 М до 10-4 М (0,001 – 100000 нМ). РРР вносили у кількості від 1•10-10 до 1•10-8 мл препарату/мл середовища (0,1 – 10 пл препарату/мл). Біомасу та кількість синтезованих екзополімерів (ЕПМ) визначали ваговим методом. Вміст вуглеводів в ЕПМ визначали колориметричним методом за реакцією з фенолом та сірчаною кислотою (Dubois, 1956), уронових кислот – за реакцією з карбазолом (Dische, 1947; у модифікації Bitter та Muir, 1962), білка – за методом Bradford (Bradford, 1976). Вміст зазначених компонентів виражали у % до маси умовно сухої речовини.

Визначення моноцукридного складу ЕПМ проводили методом газорідинної хроматографії у вигляді ацетатів поліолів на хромато-мас-спектрометричній системі Agilent 6890 N/5973 inert (США). Для визначення молекулярно-масових характеристик досліджуваних ЕПМ використовували метод аналітичного центрифугування в комбінованому градієнті густини розчинів NaCl та CsCl (Votselko, 1993).

Активність глутамінсинтетази (КФ 6.3.1.2) у безклітинних екстрактах ризобій визначали трансферазним методом (Shapiro, Stadtman, 1970). Питому активність ферменту виражали в нмолях г-глутамілгідроксамату за 1 хвилину на 1 мг білка.

Активність НАД+-залежної глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.2) у безклітинних екстрактах ризобій визначали за окисненням НАДН у присутності 2-оксоглутарату та реєстрували при 340 нм на спектрофотометрі Beckman DU-8, США (Nakamura, 1983). Питому активність ферменту виражали в нмолях окисненого НАДН за 1 хвилину на 1 мг білка.

Вивчення впливу РРР на формування проростків сої проводили на природному фоні та при інфікуванні насіння одним із штамів-фітопатогенів, що є збудниками бактеріальних хвороб сої.

Сумісну дію інокуляції і фіторегулювальних речовин на формування та ефективність соєво-ризобіального симбіозу вивчали у польових умовах. Польові досліди проводили впродовж 2001–2002 років у Київській області на темно-сірому опідзоленому легкосуглинковому ґрунті на лесовидному суглинку, орний шар якого характеризувався такими показниками: вміст гумусу (за Тюріним) – 1,8–2,1%; вміст рухомого фосфору (Р2О5) – 40,0 мг/100 г ґрунту; обмінного калію (К2О) – 12,7 мг/100 г ґрунту (за Кірсановим). Загальний вміст азоту – 0,12–0,30 мг/100 г ґрунту. Азотні добрива не вносили, фосфорні та калійні добрива вносили з розрахунку 60 кг діючої речовини на гектар.

Бактеризацію насіння проводили високоефективним штамом B. japonicum 71т (УКМ В-6035) з розрахунку інокуляційного навантаження 2,5-3,5·106 клітин на 1 насінину. Для обробки насіння використовували один з РРР: івін, емістим С, агростимулін або еней; їх концентрації відповідали рекомендованим нормам застосування у рослинництві (Анишин и др., 2001).

Рослини досліджували у фазу бутонізації-початку цвітіння та у фазу стиглості бобів. У фазу бутонізації-початку цвітіння визначали наступні показники: розмірно-вагові, площу листової поверхні, вміст хлорофілів у листі, кількість та масу бульбочок на коренях рослин – за загальноприйнятими методиками. Азотфіксувальну активність бульбочок визначали ацетилен-редуктазним методом (Hardy, 1968), загальний вміст азоту у зеленій масі сої – методом мікро-К’єльдаля, з наступним перерахуванням на “сирий протеїн” (Петербургский, 1968). У фазу стиглості бобів визначали урожай та його якість. Дослідження якості зерна сої (вмісту протеїну, жиру, клітковини, Р2О5 та К2О) проводили методом інфрачервоної спектроскопії на аналізаторі NIR Systems 4500 (Швеція) в ННЦ “Інститут землеробства УААН”. За показниками урожаю та вмісту протеїну у насінні сої для кожного варіанту розраховували збір сирого протеїну з 1 га.

Вміст флавоноїдних сполук у листі та насінні сої визначали спектрофотометрично на Beckman DU-8, США.

Для статистичного аналізу результатів досліджень використовували методи варіаційної статистики (Доспехов, 1985; Лакин, 1990). Дані щодо ферментативної активності бульбочкових бактерій сої оброблені статистично за допомогою пакету програм Microsoft Exсel 2002.

РОЗДІЛ 5. ЗАКОНОМІРНОСТІ РОСТУ B. JAPONICUM

ЗА ДІЇ ФІТОРЕГУЛЮВАЛЬНИХ РЕЧОВИН

Результати дослідження росту бульбочкових бактерій сої за дії метаболітів рослин – флавоноїдів показали, що при внесенні в середовище ізофлавоноїду даїдзеїну, який є основним компонентом флавоноїдного пулу кореневих ексудатів рослин сої, спостерігали значне підвищення накопичення біомаси обох досліджуваних штамів B. japonicum (рис.1). |

Оптимальною для високоефективного штаму 71т була кон-центрація даїдзеїну 1000 нМ, за якої приріст біомаси ста-новив 200% порівняно з контролем.

Найбільший при-ріст біомаси мало-ефективного штаму B. japonicum 21110 (295% порівняно з контролем) спостерігали за вмісту цього флавоноїду в середовищі 0,01 нМ, тобто на п’ять порядків меншому, ніж у ва-ріанті зі штамом 71т.

Рис. 1. Накопичення біомаси ризобіями сої за дії даїдзеїну.

1 – B. japonicum 71 т; 2 – B. japonicum 21110.

За присутності у середовищі культивування кверцетину – еуфлавоноїду, що синтезується переважно у надземних органах рослин, тільки малоефективний штам 21110 відповідав значним збільшенням накопичення біомаси – на 129-338 % порівняно з контролем (рис. 2). Дія кверцетину була переважно пригнічуючою для B. japonicum 71т, лише за концентрацій кверцетину 10-100 нМ накопичення біомаси B. japonicum 71 т було в межах контролю.

Отже, з досліджених речовин лише ізофлавоноїд даїдзеїн стимулював накопичення біомаси ризобіями сої незалежно від їх симбіотичних властивостей.

Вивчення впливу РРР івіну, емістиму С, агростимуліну та енею на накопичення біомаси бульбочковими бактеріями сої показало, що досліджувані штами по-різному реагували на присутність у поживному середовищі зазначених речовин (рис.3). У високоефективного штаму найбільший приріст біомаси, що перевищував показники контролю у 2,2 рази, спостерігали у варіанті з внесенням синтетичного препарату івіну у найменшій із досліджених концентрацій (рис. 3-А). Вплив природного РРР емістиму С на ріст B. japonicum 71т був несуттєвим в

Рис. 2. Вплив кверцетину на накопичення біомаси ризобіями сої.

К – контроль;

1 – біомаса

B. japonicum 71 т;

2 – біомаса

B. japonicum 21110.

усьому взятому діапазоні концентрацій. Такий ефект може бути пов’язаний зі здатністю штаму продукувати власні біологічно активні речовини, які у сумарній з РРР концентрації можуть не тільки стимулювати, але й пригнічувати ріст мікроорганізмів.

Концентрація РРР, пл препарату/ мл середовища

Рис. 3. Накопичення біомаси B. japonicum 71 т (А) та B. japonicum 21110 (Б) за дії регуляторів росту рослин івіну (1), емістиму С (2), агростимуліну (3) та енею (4).

Максимальний приріст біомаси високоефективного штаму за дії композиційного препарату агростимуліну становив порівняно з контролем 57% при розведенні 1,0 пл препарату/мл середовища. У діапазоні досліджуваних концентрацій препарат еней сприяв збільшенню біомаси B. japonicum штаму 71т на 74-91% порівняно з контролем.

Вплив РРР на малоефективний штам B. japonicum 21110 був дещо іншим (рис. 3-Б). За дії емістиму С максимальний приріст біомаси (68% порівняно з контролем) спостерігали за найменшої із застосованих концентрацій, тобто 0,1 пл препарату/мл середовища. За присутності івіну максимальний вихід біомаси, який перевищував контроль на 34%, отримано при концентрації даної речовини 1 пл препарату/мл середовища. При культивуванні малоефективного штаму 21110 з агростимуліном накопичення біомаси було на 22% вищим, порівняно з контролем. За дії енею, навпаки, відмічено пригнічення росту культури на 38-39% порівняно з контролем.

Порівнюючи стимулювальну дію флавоноїдів та регуляторів росту рослин на ріст B. japonicum, слід зазначити, що тільки даїдзеїн у найбільшій мірі активізував накопичення біомаси як ефективного, так і малоефективного штамів. Вірогідно, що у такій взаємодії гомологічних ризобій саме з ізофлавоноїдом сої виявляється еволюційно закріплена специфічність взаємодії цих діазотрофів з метаболітами макросимбіонта.

Отримані результати щодо впливу РРР на ризобії мають також практичне значення, оскільки можуть бути використані у виробництві бактеріальних препаратів під бобові культури. Культивування промислово цінного штаму ризобій сої у присутності івіну або енею дозволить значно підвищити вихід його біомаси.

РОЗДІЛ 6. СИНТЕЗ ЕКЗОПОЛІМЕРІВ РИЗОБІЯМИ СОЇ ЗА УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ З ФІТОРЕГУЛЯТОРАМИ

Відомо, що позаклітинні ЕПМ бульбочкових бактерій відіграють важливу роль у їх життєдіяльності, а також у формуванні бобово-ризобіального симбіозу. Нами вперше проведено вивчення продукування ЕПМ ризобіями сої за дії флавоноїдів. У присутності в поживному середовищі даїдзеїну обидва досліджувані штами B. japonicum підвищували накопичення ЕПМ (рис. 4).

Максимальний синтез цих сполук отримано у варіантах з концентрацією даїдзеїну 0,1 нМ, причому продукування ЕПМ ефективним штамом 71т було на 240%, а малоефективним штамом 21110 – на 52% вищим від контролю. За дії кверцетину у концентраціях 0,001-10000 нМ тільки штам B. japonicum 71т відповідав збільшенням продукування екзополімерів на 83-509%.

Отже, оптимальною для продукування ЕПМ ризобіями сої є концентрація даїдзеїну 0,1 нМ, що збігається з даними літератури про сигнальні функції флавоноїдних метаболітів рослин у наномолярних кількостях (Schmidt, 1994; Pueppke, 1998; Spaink, 2000). |

Накопичення ЕПМ високоефективним шта-мом B. japonicum 71т у присутності івіну та емістиму С знижувалося. Малоефективний штам B. japonicum 21110 збіль-шував накопичення ЕПМ за дії івіну на 270%, а за дії емістиму С – на 45% порівняно з контролем.

Слід зауважити, що у більшості варіантів про-дукування екзополімерів та синтез біомаси для обох штамів бульбоч-кових бактерій мали обернену залежність.

Рис. 4. Продукування екзополімерів бульбочковими бактеріями сої за дії даїдзеїну.

К – контроль; 1 – ЕПМ B. japonicum 71т;

2 – ЕПМ B. japonicum 21110.

Встановлено, що досліджувані ЕПМ обох штамів бульбочкових бактерій схожі за моноцукридним складом (табл. 1).

Таблиця 1

Моноцукридний склад екзополімерів B. japonicum за дії фіторегулювальних речовин (ФРР)

Варіанти досліду | Вміст цукридів (у % до загальної суми площ піків)

Глюкоза | Галактоза | Маноза | Неідентифіковані

цукриди

Високоефективний штам B. japonicum 71т

Контроль | 69,8±0,5 | 13,1±0,2 | 14,7±0,1 | 2,4±0,1

За дії ФРР | Даїдзеїн

Емістим С | 50,5±0,4 | 10,6±0,2 | 17,6±0,3 | 21,3±0,4

Кверцетин | 44,3±0,4 | 3,7±0,1 | 6,9±0,1 | 45,1±0,5

Івін | 63,9±0,5 | 7,0±0,1 | 11,5±0,1 | 17,6±0,3

Емістим С | 40,3±0,3 | 8,8±0,2 | 30,4±0,3 | 20,5±0,4

Малоефективний штам B. japonicum 21110

Контроль | 64,8±0,5 | 9,7±0,1 | 13,9±0,2 | 11,6±0,3

За дії ФРР | Даїдзеїн

Емістим С | 36,4±0,2 | 5,2±0,1 | 13,0±0,1 | 18,2±0,3

Кверцетин | 27,3±0,2 | 6,1±0,2 | 32,2±0,1 | 40,4±0,5

Івін | 56,3±0,4 | 7,7±0,2 | 11,6±0,2 | 24,4±0,4

Емістим С | 54,8±0,3 | 7,5±0,1 | 11,5±0,2 | 26,2±0,4

Культивування B. japonicum за присутності у поживному середовищі флавоноїдів або РРР мало впливало на моноцукридний склад ЕПМ. У всіх препаратах ЕПМ ризобій виявлено нейтральні вуглеводи: глюкозу (27-70%), галактозу (3,7-13%) та манозу (7-30%), а також неідентифіковані цукриди. Це підтверджує дані літератури, що основна олігоцукридна ланка кислого ЕПС повільнорослих бульбочкових бактерій сої складається з нейтральних цукридів глюкози, галактози та манози (Mort, 1980; 1982; Спайнк и др., 2002).

Вміст кислих компонентів – уронових кислот (УК) у ЕПМ досліджуваних ризобій коливався від 0,4 до 4,9%. У контрольному варіанті ЕПМ ефективного штаму містили УК у 4,4 рази більше, ніж малоефективного (табл. 2). У ЕПМ B. japonicum 71т вміст УК дещо збільшувався лише за умов внесення в середовище емістиму С (у 1,2 рази порівняно з контролем), а за дії флавоноїдів кверцетину та даїдзеїну – зменшувався у 2,2 та 10 разів відповідно. У B. japonicum 21110 всі фіторегулювальні речовини підвищували вміст УК у ЕПМ: емістим С та флавоноїди – у 2,2-3,2 рази, івін – у 5 разів.

Таблиця 2

Вміст уронових кислот у складі екзополімерів B. japonicum за дії флавоноїдів та регуляторів росту рослин

Варіанти досліду | Вміст УК (у % від сухої маси)

Високоефективний штам B. japonicum 71т | Малоефективний штам B. japonicum 21110

Контроль | 4,0±0,20 | 0,9±0,02

За дії ФРР | Даїдзеїн | 0,4±0,02 | 2,9±0,08

Кверцетин | 1,8±0,08 | 2,0±0,01

Івін | 3,4±0,10 | 4,4±0,10

Емістим С | 4,9±0,30 | 2,9±0,07

За даними аналітичного центрифугування, досліджені екзополімери B. japonicum характеризуються полідисперсністю і містять компоненти з молекулярними масами (ММ) від 20 до 1000 кДа. У B. japonicum 71т вміст компонентів з ММ більш як 70 кДа складає 37-63%, а у B. japonicum 21110 – 40-68% від загальної маси молекули. Середня молекулярна маса у ЕПМ B. japonicum 71т була у 2,3 рази нижчою порівняно з B. japonicum 21110. Фіторегулювальні речовини сприяли підвищенню середньої ММ ЕПМ B. japonicum 71т. Флавоноїди даїдзеїн та кверцетин збільшували цей показник у 1,5 рази, а івін та емістим С – у 2,2-2,5 рази порівняно з контролем. Середня ММ ЕПМ B. japonicum 21110 коливалась у межах 111-305 кДа, лише за дії кверцетину вона збільшувалась у 1,4 рази порівняно з контролем. Всі інші застосовані речовини зменшували у 2 рази ММ екзополімерів дослідного штаму.

РОЗДІЛ 7. АКТИВНІСТЬ ОСНОВНИХ ФЕРМЕНТІВ АЗОТНОГО ОБМІНУ

B. JAPONICUM ЗА ДІЇ ФІТОРЕГУЛЮВАЛЬНИХ РЕЧОВИН

У ризобій, а також їхніх симбіонтів – рослин основним джерелом азотного живлення є аміак. Первинна асиміляція амонію починається з реакцій, що каталізуються глутамінсинтетазою (ГС; КФ 6.3.1.2), яка у бульбочкових бактерій також бере участь у регуляції синтезу нітрогенази (Ludwig, 1980; Готтшалк, 1982; Спайнк и др., 2002). При збільшеній концентрації амонію в клітинах у його асиміляції бере участь глутаматдегідрогеназа (ГДГ; КФ 1.4.1.2-4) – фермент, асоційований з циклом трикарбонових кислот (Tempest, 1970; Brown, 1975).

Оскільки відомо, що від інтенсивності та напрямку азотного обміну у діазотрофів залежить продуктивність рослинно-мікробних асоціацій та якість урожаю, наші дослідження були спрямовані на вивчення глутамінсинтетазної та глутаматдегідрогеназної активності у ризобій сої.

Глутамінсинтетазна активність. Активність ГС мікроорганізмів, у тому числі і ризобій, проявляється за присутності катіонів двовалентних металів, а найбільш ефективною є дія Mn2+ та Mg2+, які є кофакторами ферменту (Евстигнеева, 1988; Arcondeguy et al., 1996; Bespalova, 1999). У проведених нами дослідах активність ферменту в безклітинних екстрактах ризобій сої за активації як Mn2+, так і Mn2++Mg2+ була високою і коливалась від 280 до 1600 нмоль г-глутамілгідроксамату/(хв•мг білка). ГС активність безклітинних екстрактів ризобій сої за присутності даїдзеїну та кверцетину у ефективного штаму 71т збільшувалася майже вдвічі (рис. 5-А). Реакція малоефективного штаму B. japonicum 21110 була протилежною: за дії досліджуваних флавоноїдів ГС активність зменшувалася у 1,2-1,4 рази порівняно з контролем (рис. 5-Б).

Рис. 5. Глутамінсинтетазна активність B. japonicum 71т (А) та

B. japonicum 21110 (Б) при активації Mn2+ та Mg2+ за дії флавоноїдів.

1 – контроль; 2 – даїдзеїн; 3 – кверцетин.

За дії емістиму С активність ГС B. japonicum 71т зростала порівняно з контролем у 1,2-2,2 рази, за дії енею – у 1,8-2,0 рази (табл. 3). Проте, інші РРР – агростимулін та івін гальмували досліджувану ферментативну активність на 12,2-31,6%.

Таблиця 3

Вплив регуляторів росту рослин на глутамінсинтетазну активність ризобій сої

Регулятори росту рослин | Глутамінсинтетазна активність, % до контролю*

B. japonicum 71т | B. japonicum 21110

за активації | за активації

Mn2+ | Mn2++Mg2+ | Mn2+ | Mn2++Mg2+

Івін | 83,9 | 87,8 | 214,8 | 223,1

Емістим С | 117,7 | 223,1 | 94,5 | 88,7

Агростимулін | 68,4 | 69,7 | 207,4 | 187,9

Еней | 199,6 | 176,0 | 186,0 | 160,3

* Примітка. Контроль – вирощування без РРР

При культивуванні B. japonicum 21110 з РРР показано, що за дії івіну, агростимуліну та енею ГС активність цих мікроорганізмів значно зростала і перевищувала контроль на 60-123%. Емістим С не сприяв збільшенню досліджуваної активності, її значення були на рівні контрольних.

Отже, стимулювальну дію на ГС активність обох штамів ризобій сої відмічено тільки за умов культивування з енеєм.

Глутаматдегідрогеназна активність. У проведених дослідженнях ГДГ активність безклітинних екстрактів ризобій сої вимірювалась в напрямку біосинтезу глутамату і не була виявлена в реакції дезамінування (НАД+-залежна реакція).

Даїдзеїн і кверцетин стимулювали ГДГ активність ефективного мікросимбіонта сої на 133 % та 24 % відповідно (рис. 6-А). У малоефективного штаму 21110 за дії флавоноїдів досліджувана активність суттєво знижувалася.

За наявності у середовищі івіну спостерігали збільшення активності ГДГ обох штамів, але у ефективного штаму 71т питома активність підвищувалася майже у 5 разів, тоді як у неефективного штаму 21110 – лише у 1,4 рази (рис. 6-Б).

Емістим С позитивно впливав на B. japonicum 71т і негативно – на B. japonicum 21110. Так, у першому випадку ГДГ активність зростала у 4 рази, а у другому – спадала на 30%.

Отже, всі досліджувані фіторегулювальні речовини стимулювали ГДГ активність високоефективного мікро симбіонта сої B. japonicum 71т. Отримані результати свідчать, що регулювання синтезу флавоноїдів рослинами і застосування певних РРР може бути використано для активації ферментів азотного обміну ризобій, що дозволить оптимізувати умови засвоєння ними азоту.

Активність ферменту, нмоль НАДН/ (хв • мг білка)

Рис. 6. Глутаматдегідрогеназна активність ризобій сої за дії фіторегулювальних речовин (А – флавоноїдів, Б – регуляторів росту рослин).

1 – B. japonicum 71т; 2 – B. japonicum 21110.

РОЗДІЛ 8. ФОРМУВАННЯ ТА ЕФЕКТИВНІСТЬ СИМБІОЗУ

B. JAPONICUM – СОЯ ЗА УМОВ ЗАСТОСУВАННЯ РЕГУЛЯТОРІВ РОСТУ РОСЛИН

В польових умовах вивчали формування, функціонування та ефективність симбіозу ризобій сої з рослинами за дії регуляторів росту рослин. В літературі до нинішнього часу залишається дискусійним питання про те, чи доцільно поєднувати інокуляцію разом з обробкою РРР.

Проведені польові дослідження виявили наявність сортової специфічності чутливості рослин сої до дії досліджуваних РРР. На фоні спонтанної інокуляції у рослин сої сорту Київська 98 формування симбіотичного апарату спостерігали лише у контролі та на варіанті з енеєм. У рослин сої сорту Київська 27 підвищення нодуляційної та азотфіксувальної активності забезпечували обробки насіння івіном або емістимом С. Під дією цих РРР нітрогеназна активність збільшувалася у 5,8 та 1,3 рази відповідно порівняно з контролем (табл. 4). Інокуляція високоефективним штамом ризобій сої сприяла формуванню високоактивного нодуляційного апарату у рослин сорту Київська 98 та збільшенню азотфіксувальної активності бульбочок у сорту Київська 27 (у 4,5 рази порівняно зі спонтанною інокуляцією).

Таблиця 4

Нітрогеназна активність симбіотичного апарату сої

за дії регуляторів росту рослин

Застосовані РРР | Нітрогеназна активність, мкМ С2Н4, на 1 рослину за годину

За спонтанної інокуляції | За інокуляції B. japonicum 71т

Київська 98 | Київська 27 | Київська 98 | Київська 27

Контроль | 0 | 3,4±0,1 | 19,8±0,8 | 15,4±0,5

Івін | - | 19,6±0,4 | 13,8±0,6 | 5,6±0,1

Емістим С | - | 4,3±0,08 | 17,2±0,6 | 12,6±0,1

Еней | 4,2±0,17 | 2,4±0,06 | 10,9±0,4 | 23,7±0,5

Агростимулін | - | 1,3±0,04 | 17,3±0,5 | 9,1±0,1

Примітка. “-” – бульбочки відсутні.

Використання РРР на фоні інокуляції показало, що порівняно з контролем за бактеризації B. japonicum 71т у дослідах з соєю Київська 27 ефект інокуляції підсилював лише еней, який сприяв збільшенню нітрогеназної активності у 1,5 рази.

Оцінку впливу досліджуваних факторів на продуктивність рослин сої було зроблено на етапі збору урожаю. Встановлено, що за умов спонтанної інокуляції івін та емістим С сприяли найбільшому підвищенню урожаю зерна у рослин сої сорту Київська 98 (на 9,7 і 7,0 ц/га). На фоні бактеризації ці РРР збільшували урожай зерна відповідно на 2,6 та 1,5 ц/га. Прибавку урожаю зерна 1,4 ц/га було одержано і на варіанті з агростимуліном (результати статистично достовірні при НІР05=0,28 ц/га). За умов застосування РРР на сорті Київська 27 зберігалася тенденція до підвищення урожаю зерна, однак достовірну прибавку на рівні 2,6 ц/га було отримано лише у варіанті з івіном на фоні спонтанної інокуляції (результати статистично достовірні при НІР05=0,75 ц/га).

Нами була проведена також оцінка впливу інокуляції та регуляторів росту рослин на показники якості зерна сої (табл. 5). На фоні спонтанної інокуляції всі досліджувані РРР сприяли підвищенню вмісту протеїну в зерні сої сорту Київська 98. Застосування івіну та емістиму С сприяло збільшенню вмісту протеїну на 0,7-0,8%, енею – на 1,4%, агростимуліну – на 2,3%.

За інокуляції B. japonicum 71т вміст протеїну у зерні ранньостиглого сорту Київська 98 був на 2,6% вищим, ніж за спонтанної інокуляції. За обробки РРР та B. japonicum 71т не спостерігали статистично достовірного підвищення вмісту протеїну у насінні.

Стосовно результатів, отриманих на сорті Київська 27, слід зазначити, що за спонтанної інокуляції тільки обробка емістимом С приводила до збільшення вмісту протеїну у зерні на 1,4%. На досліджуваному сорті інокуляція ефективним штамом не сприяла підвищенню цього показника, проте при сумісній обробці B. japonicum 71т з івіном, емістимом С або агростимуліном спостерігали збільшення вмісту протеїну у зерні на 3,0-3,6%.

Таблиця 5

Вплив регуляторів росту рослин на показники якості зерна рослин сої

Застосовані РРР | Показники якості зерна (у % на повітряно суху речовину)

Протеїн | Жир

Київська 98 | Київська 27 | Київська 98 | Київська 27

За спонтанної інокуляції

Контроль | 37,05±0,03 | 39,48±0,03 | 18,20±0,04 | 19,42±0,05

Івін | 37,78±0,05 | 37,73±0,03 | 23,20±0,01 | 20,37±0,08

Емістим С | 37,83±0,04 | 40,89±0,06 | 20,92±0,05 | 20,82±0,06

Еней | 38,46±0,03 | 37,28±0,02 | 21,64±0,06 | 20,91±0,06

Агростимулін | 39,39±0,02 | 37,73±0,06 | 23,15±0,07 | 21,01±0,05

За інокуляції ефективним штамом B. japonicum 71т

Контроль | 39,64±0,03 | 37,91±0,02 | 21,15±0,06 | 21,07±0,05

Івін | 38,93±0,02 | 41,00±0,03 | 21,74±0,06 | 21,89±0,05

Емістим С | 39,85±0,03 | 41,12±0,01 | 21,39±0,04 | 21,04±0,06

Еней | 39,14±0,05 | 37,74±0,03 | 21,47±0,04 | 20,63±0,06

Агростимулін | 39,66±0,03 | 41,50±0,01 | 21,30±0,07 | 20,86±0,07

Вміст жиру – важлива характеристика якості насіння сої, що є зернокормовою культурою. На фоні спонтанної інокуляції обробка РРР суттєво збільшувала цей показник у зерні сорту Київська 98. Івін та агростимулін підвищували вміст жиру на 5%, а інші регулятори – на 2,7- 3,4%. Інокуляція сприяла збільшенню цього показника у зерні сорту Київська 98 майже на 3% порівняно з контролем, а обробка насіння РРР сумісно з B. japonicum 71т достовірно збільшувала його у всіх варіантах.

У насінні сорту Київська 27 вміст жиру у зерні зростав на 1,0-1,6% за дії всіх досліджуваних РРР. Бактеризація ефективним штамом теж приводила до підвищення цього параметра на 1,7%, проте сумісна обробка з РРР тільки у варіанті з івіном забезпечувала його зростання порівняно з варіантом бактеризації на 0,8%.

Зважаючи на виявлений вплив флавоноїдів на ризобії, ми вважали за доцільне при оцінці якості урожаю дослідити накопичення флавоноїдних сполук в листі та насінні сої. Нами уперше встановлено, що шляхом застосування досліджених РРР можна впливати на синтез рослинами флавоноїдів. Так, аналіз фітомаси показав, що збільшення вмісту флавоноїдних сполук у листі на 13-17% спостерігали при застосуванні івіну та енею на фоні інокуляції ефективним штамом у рослин сорту Київська 98 (табл. 6). У листі сорту Київська 27 обробка B. japonicum 71т сумісно з РРР теж підвищувала вміст даних сполук на 10-33% порівняно з контролем.

Таблиця 6

Вплив регуляторів росту рослин на вміст флавоноїдних сполук у листі та насінні рослин сої

Застосовані РРР | Вміст флавоноїдних сполук (у % до контролю)

у листі | у насінні

Київська 98 | Київська 27 | Київська 98 | Київська 27

За спонтанної інокуляції

Івін | 57,8 | 106,8 | 162,6 | 116,1

Емістим С | 61,5 | 100,1 | 95,5 | 111,3

Еней | 37,0 | 93,8 | 141,7 | 126,2

Агростимулін | 83,2 | 98,2 | 103,4 | 136,3

За інокуляції ефективним штамом B. japonicum 71т

Івін | 113,4 | 110,0 | 130,7 | 85,0

Емістим С | 53,4 | 117,4 | 102,8 | 91,5

Еней | 116,6 | 132,9 | 108,7 | 91,0

Агростимулін | 57,4 | 126,0 | 120,2 | 108,0

Примітки: 1. Контроль – варіант з інокуляцією.

2. Середньоквадратична похибка не перевищувала 5,0%.

У насінні ранньостиглого сорту Київська 98 збільшенню загального вмісту флавоноїдних сполук на фоні спонтанної інокуляції сприяли івін та еней (різниця з контролем становила відповідно 63 та 42%). На фоні інокуляції B. japonicum 71т суттєвому збільшенню вмісту флавоноїдів сприяли івін (на 31% до контролю) та агростимулін (на 20%). У середньораннього сорту Київська 27 збільшення вмісту флавоноїдів (на 11-36%) спостерігали на фоні спонтанної інокуляції за дії усіх застосованих РРР.

У дослідах, проведених на штучному інфекційному фоні з використанням фітопатогенних бактерій X. axonopodis pv. glycinea та P. savastanoi pv. glycinea, нами доведено, що насіння сої, яке було отримане з оброблених РРР та бактеризованих рослин і має підвищений вміст флавоноїдних сполук, виявляє більшу опірність до пригнічуючої дії агресивних штамів фітопатогенів. Ці дані можуть бути використані для розробки заходів щодо зменшення ураження бобових рослин фітопатогенами. Листя і насіння сої з підвищеним вмістом флавоноїдів представляє інтерес для фармацевтичної і харчової промисловостей як цінна біологічна сировина для одержання флавоноїдів, а також ліків та профілактичного харчування на їх основі.

Відомо, що інтегральним показником ефективності вирощування бобових культур є збір протеїну з 1 гектару. За спонтанної інокуляції при обробці івіном та емістимом С збір протеїну збільшився для обох сортів на 66-380 кг/га порівняно з контролем. Сумісне застосування штаму-інокулянта з івіном або емістимом С для обробки насіння сої сорту Київська 27 сприяло збільшенню збору протеїну на 96-100 кг/га. На сорті сої Київська 98 ефект застосування виробничого штаму B. japonicum підвищувався при обробці івіном, емістимом С або агростимуліном; збір протеїну у даних варіантах перевищував контроль на 55-88 кг/га.

Отже, інокуляція насіння B. japonicum 71т сприяє формуванню у сої сортів Київська 98 і Київська 27 ефективного нодуляційного апарату, підвищенню вмісту протеїну в зеленій масі та збільшенню збору протеїну з гектара. Доцільність поєднання обробки насіння нітрагіном та РРР при вирощуванні