`НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

Ляхов Олексій Михайлович

УДК 57.011+577.352.22+615.01+577.112.824

ВЗАЄМОДІЯ ФІЗІОЛОГІЧНО-АКТИВНИХ РЕЧОВИН З ЛЕНГМЮРІВСЬКИМИ МОНОМОЛЕКУЛЯРНИМИ ПЛІВКАМИ

02.00.10 – біоорганічна хімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі медико-біологічних досліджень Інституту біоорганічної хімії

та нафтохімії НАН України.

Науковий керівник

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Могилевич Сергій Євгенович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу медико-біологічних досліджень

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Кібірєв Володимир Костянтинович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу хімії білка

доктор біологічних наук, доцент

Островська Галина Віталіївна,

Інститут фізіології ім. П.Богача Київського національного

університету ім. Тараса Шевченка,

професор кафедри цитології, гістології та біології розвитку

Провідна установа

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України,

лабораторія сигнальних механізмів клітини

Захист відбудеться 27 жовтня 2006 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

Автореферат розісланий 27 вересня 2006 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Визначення провідної ролі аденілатциклазного каскаду та Cа-залежного каскаду поліфосфоінозитидних ліпідів в біорегуляції клітинних функцій стало основою для з’ясування функціональної спільності ксенобіотиків, що подібним чином впливають на активність основних сигнальних систем клітини (ОССК) [Луйк А.И., Могилевич С.Е., 1992; Луйк А.И., 1998]. Положення про наявність біорегуляторних стереотипів підтверджується дослідженнями на об’єктах, для яких зв’язок біологічних функцій з відповідями ОССК простежується чітко і однозначно. Поряд з цим накопичуються дані про біорегуляторний вплив фізіологічно-активних речовин (ФАР) на об’єкти, біологічні функції яких безпосередньо не пов’язані з ОССК (деякі білки крові, транскрипція ДНК in vitro тощо) [Luik A.I., et al., 1998; Прокопенко В.В., 2001]. Показано, що такі об’єкти можуть якісно по-різному реагувати на наявність ФАР двох біорегуляторних класів.

Особливий інтерес викликає дослідження впливу ФАР на фізико-хімічні та структурні параметри природних і модельних мембран, зокрема, моношарових плівок з фосфоліпідів та білків, що сформовані на поверхні гідрофільних середовищ. Однією з найважливіших характеристик мембран, яка має вирішальне значення для регуляції функціонування мембранних білків та здійснення бар’єрної функції, є їх рідинність, яка описується параметром мікров’язкості. На відміну від інших моделей, техніка отримання та стискування моношарів дозволяє варіювати рідинність ліпідів у дуже широких межах.

З теоретичної та практичної точки зору актуальним є вивчення як самої дії на ленгмюрівські мономолекулярні плівки типових представників двох класів ФАР з різною спрямованістю впливу на ОССК, так і виявлення біорегуляторного стереотипу ФАР на моделі моношарових плівок з фосфоліпідів та сироваткового альбуміну, а також виявлення мембранотропної активності лікарських засобів, яка може мати значення в реалізації їх фармакологічної дії. Зокрема, це стосується препаратів, в прояві лікувального ефекту яких значну роль відіграє взаємодія з біомембраною (наприклад, кардіотонічних лікарських препаратів).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у рамках відомчих тем НАН України „Вплив складу ліпідного моношару та фізіологічно-активних речовин на термодинамічні параметри фосфоліпідних мономолекулярних плівок Ленгмюра” тема 2.1.10.29-97, № Держреєстрації 0100U002323; „Вивчення стереотипів дії фізіологічно-активних речовин на рівні модельних мембран”, тема 2.1.10.29-00, № Держреєстрації 0102U003345 та „Вивчення біорегуляторних ефектів фізіологічно-активних речовин на молекулярних та клітинних моделях, безпосередньо не пов’язаних з головними системами клітинної сигналізації”, тема 2.1.10.18-02, № Держреєстрації 0105U001582, а також частково фінансувалась грантами INTAS (№№ 96-0067 та 00-243).

Мета і задачі дослідження. Мета дисертаційної роботи полягала у виявленні біорегуляторного стереотипу дії ФАР на фізико-хімічні та структурні характеристики моношарових плівок з фосфоліпідів та сироваткового альбуміну бика. Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:–

Дослідити формування мономолекулярних плівок Ленгмюра з фосфоліпідів та сироваткового альбуміну на поверхні гідрофільного середовища.–

Вивчити вплив модуляторів ОССК на ленгмюрівські мономолекулярні плівки з фосфоліпідів та сироваткового альбуміну бика. –

Оцінити прояв біорегуляторного стереотипу дії ФАР при їх взаємодії з мономолекулярними плівками з фосфоліпідів і сироваткового альбуміну за допомогою кластерного аналізу та штучних нейронних мереж.

– Дослідити мембранотропну активність нових кардіотонічних лікарських засобів, актопротекторів та препаратів групи макроергічних сполук. На основі зміни структурних та термодинамічних параметрів моношарів з дистеароїлфосфатидилхоліну під дією ФАР за допомогою кластерного аналізу проаналізувати можливість завбачення біорегуляторного стереотипу цих препаратів.

Об’єкт дослідження – біорегуляторні стереотипи дії ФАР, що виявляються на різноманітних біологічних та модельних системах.

Предмети дослідження – стереотип дії ФАР на фізико-хімічні та структурні характеристики мономолекулярних плівок Ленгмюра з фосфоліпідів та сироваткового альбуміну; мембранотропна активність лікарських засобів.

Методи дослідження – метод рівномірного стискування ленгмюрівського моношару від газоподібної фази до твердотільного стану, електрофорез, кластерний аналіз, метод штучних нейронних мереж (ШНМ), методи математичної обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано збереження стереотипу в дії біорегуляторів на ленгмюрівські моношарові плівки з дистеароїлфосфатидилхоліну (ДСФХ) та його еквімолярної суміші з диміристоїлфосфатидилхоліном (ДМФХ), а також на моношари з сироваткового альбуміну бика (САБ).

Створено ефективний алгоритм, що базується на застосуванні методів кластерного аналізу та ШНМ, за допомогою якого можна розподіляти речовини на класи згідно з притаманним їм біорегуляторним стереотипом дії за впливом ФАР на моношарові плівки з фосфоліпідів та альбуміну. В дослідженнях взаємодії деяких нових лікарських засобів з ленгмюрівськими моношарами з фосфоліпідів встановлена мембранотропна активність, яка може відігравати значну роль в фармакологічній дії вивчених препаратів. Запропоновано віднесення цих ФАР до відповідних біорегуляторних класів на основі впливу препаратів на моношарові плівки з ДСФХ.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати можуть бути використані, головним чином, в двох актуальних практичних напрямках. По-перше, при розробці принципово нової стратегії конструювання лікарських засобів (та інших ФАР), яка враховує існування стереотипних механізмів біорегуляції. Ця стратегія доповнює існуючу на сьогоднішній день методологію, спрямовану на отримання (за окремими ознаками хімічної будови) сполук з максимально специфічною фармакологічною дією. По-друге, результати роботи можуть бути корисними для таких важливих цілей фармакотерапії, як аналіз особливостей побічної (неспецифічної) дії лікарських засобів; розробка нових схем терапії при лікуванні хвороб, що мають багатофакторне походження. Визначення мембранотропної активності препаратів дозволяє більш ефективно застосовувати фармакологічні засоби, зокрема, враховуючи вплив цих ліків на ліпідну складову клітинної мембрани.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно виконав експериментальну частину роботи, обробку, аналіз та узагальнення отриманих результатів. Постановка завдань, обговорення результатів та формування висновків відбувалось спільно з науковим керівником. Результати робіт, що опубліковані у співавторстві та увійшли до дисертації, одержані особисто здобувачем. Автор щиро вдячний к.х.н. В.В. Ковалішину за надання програми та консультативну допомогу при проведенні розрахунків за методом штучних нейронних мереж та Ю.В. Пивоваренку за консультації при проведенні досліджень розчинів сироваткового альбуміну із спиртами.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені на міжнародній конференції “Physics of Liquid Matter: modern problems” (Київ, вересень 2001 р.), II Національному з`їзді фармакологів України “Фармакологія 2001 – крок у майбутнє” (Дніпропетровськ, жовтень 2001 р.), Українській конференції молодих вчених, присвяченій пам`яті академіка В.В. Фролькіса, (Київ, січень 2002 р.), міжнародній конференції „Физико-химический анализ жидкофазных систем”, присвяченій 100-річчю з дня народження Р.В. Мерцліна (Саратов, Росія, червень-липень 2003 р.), ХIV, ХVII та ХIX наукових конференціях з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ, березень 1999, 2002, 2004 рр.).

Публікації. Основні результати дисертації викладено в 7 статтях у фахових наукових виданнях та 4 тезах доповідей.

Структура та об’єм роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, викладу отриманих результатів та їх обговорення, заключної частини і висновків та списку використаної літератури (179 найменувань). Дисертаційна робота викладена на 136 сторінках тексту та містить 11 таблиць та 30 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Біорегуляторні стереотипи дії ФАР найчастіше виявляються на модельних системах, інтегральні відповіді яких безпосередньо та однозначно пов’язані з балансом активностей ОССК. Поряд з цим, останнім часом накопичуються дані про біорегуляторний вплив ФАР на об’єкти, біологічні функцій яких безпосередньо не пов’язані з відповідями ОССК. У багатьох випадках ці моделі якісно по-різному розпізнають активатори аденілатциклазної та/або інгібітори Ca-залежної поліфосфоінозитидної сигнальних систем (клас +І/–ІІ) та інгібітори аденілатциклазної та/або активатори фосфоліпідної сигнальних систем (клас –І/+ІІ). Однією з таких систем є моношарові плівки з фосфоліпідів та білків, які є зручним об’єктом для моделювання ліпідного матриксу біомембран в широкому діапазоні значень мікров’язкості.

Досліджувані речовини класу +І/–ІІ

Ізадрин Теофілін Димедрол Ніфедипін

Празозин Йохімбін Атропін

Досліджувані речовини класу –І/+ІІ

Пропранолол Толбутамід Клонідин

Мезатон Левамізол Карбахолін

Рис. 1. Модулятори аденілатциклазної та поліфосфоінозитидної сигнальних систем клітини

Досліди проводили в з’ємній тефлоновій ванні об’ємом 120 мл. На поверхню субфази (5.10-3 М Трис-HCl, pH 7,4) наносили 5 мкл розчину ліпіду в хлороформі або 5 мкл розчину САБ з н-аміловим спиртом (0,5% за об’ємом). Стискування моношару проводили за допомогою рухомого бар’єру. Обробка ізотерм стискування базувалася на результатах досліджень Si-shen Feng et al., 1994. Розраховували площу, що припадає на одну молекулу ліпіду при нульовому поверхневому тиску (S0); енергетичні коефіцієнти, які відповідають взаємодіям субфаза-субфаза, субфаза-ліпід та ліпід-ліпід (Н11, Н12 та Н22, відповідно) і зміни вільної енергії на межі розділу субфаза-повітря (G), які виникають при появі ліпіду.

Для досліджень були вибрані характерні представники двох класів біорегуляторів: активатор в-адренорецепторів ізадрин, блокатор 2-адренорецепторів йохімбін, 1-адреноблокатор празозин, М-холіноблокатор атропін, блокатор Н1-гістамінових рецепторів димедрол, дигідропіридиновий блокатор кальцієвих каналів ніфедипін, агоніст А1-аденозинових рецепторів теофілін – стереотип дії +I/–II; та антагоніст -адренорецепторів пропранолол, протидіабетичний препарат толбутамід, 2-адреностимулятор клонідин, активатор 1-адренорецепторів мезатон, агоніст М-холінорецепторів карбахолін, імуностимулятор левамізол – стереотип дії –I/+II (рис. 1).

Вплив модуляторів аденілатциклазної та Ca-мобілізуючої поліфосфоінозитидної сигнальних систем клітини на моношарові плівки з ДСФХ. Результати аналізу ізотерм стискування моношарів з ДСФХ під впливом досліджених біорегуляторів наведені в табл. 1.

Таблиця 1

Вплив досліджених ФАР на структурні та термодинамічні параметри моношарів з ДСФХ

Сполука | S0, 2/мол. | Н11, кал. | Н12, кал. | Н22, кал. | G, кал.

Буфер | 641 | 444 | -501 | -39913 | -251

Буфер + ДМСО | 651 | 473 | -592* | -45320* | -291

Ізадрин | 701* | 373 | -722* | -4773* | -402*

Теофілін | 653 | 444 | -536 | -40912 | -311*

Йохімбін+ДМСО | 752** | 222** | -864** | -48612** | -513**

Празозин+ДМСО | 66±3 | 27±9** | -78±10** | -473±25 | -47±8**

Атропін | 684 | 327* | -6610* | -42826 | -368

Димедрол | 674 | 352* | -658* | -43230 | -355*

Ніфедипін+ДМСО | 601** | 234** | -371** | -25916** | -201**

Пропранолол | 641 | 352* | -634* | -46518* | -323*

Толбутамід | 611* | 411 | -453* | -36220* | -222

Клонідин | 641 | 413 | -632* | -4448* | -332*

Мезатон | 622 | 436 | -458 | -37114* | -226

Карбахолін | 651 | 503 | -592* | -45715* | -281

Левамізол | 642 | 4410 | -564* | -42620 | -294

Значення достовірно (р<0,05) відрізняється від значення: * – для буфера; ** – для буфера з ДМСО.

Таблиця 2

Вплив досліджених ФАР на фізико-хімічні параметри моношарів з ДСФХ при 25 та 30С

Сполука | Темпе-ратура, С | S0, Е2/мол. | Н11, кал. | Н12, кал. | Н22, кал. | G, кал.

Буфер (Трис–HCl, pH 7,4) | 25 | 641 | 404 | -697 | -45315 | -324

30 | 671 | 413 | -832 | -4956 | -422

Буфер (Трис–HCl + ДМСО, pH 7,4) | 25 | 621 | 474 | -753 | -4833 | -362

30 | 671 | 321* | -812 | -4615 | -431

Ізадрин | 25 | 651 | 343 | -725 | -46215 | -402*

30 | 701* | 272* | -896 | -46310* | -483*

Теофілін | 25 | 641 | 354 | -847* | -48619 | -443*

30 | 691 | 282* | -867 | -47023 | -475

Йохімбін+ДМСО | 25 | 632 | 384** | -732 | -44513 | -371

30 | 711** | 221** | -772 | -4075** | -421

Празозин+ДМСО | 25 | 692** | 295** | -798 | -45926 | -456**

30 | 722** | 232** | -853 | -4127** | -402

Атропін | 25 | 651 | 382 | -813* | -4686 | -412*

30 | 691 | 324* | -901* | -49811 | -491*

Димедрол | 25 | 651 | 253* | -771 | -4195* | -422*

30 | 693 | 262* | -849 | -45223* | -466

Ніфедипін+ДМСО | 25 | 584 | 313** | -848 | -45816 | -445**

30 | 633 | 204** | -729 | -39324** | -396

Пропранолол | 25 | 663 | 384 | -6812 | -45724 | -347

30 | 704 | 375 | -8211 | -49831 | -458

Толбутамід | 25 | 634 | 353 | -649 | -41624 | -335

30 | 663 | 364 | -7610 | -45127* | -447

Клонідин | 25 | 632 | 413 | -695 | -45018 | -334

30 | 662 | 412 | -833 | -48613 | -433

Мезатон | 25 | 662 | 465 | -617 | -42814 | -373

30 | 651 | 393 | -793 | -48422 | -412

Карбахолін | 25 | 622 | 355 | -706 | -44927 | -324

30 | 642 | 356 | -859 | -49028 | -426

Левамізол | 25 | 671 | 394 | -756 | -46723 | -374*

30 | 672 | 374 | -845 | -50729 | -453

Значення достовірно (р<0,05) відрізняється від значення: * – для буфера; ** – для буфера з ДМСО.

Значний вплив на площу, що припадає на одну молекулу ліпіду, при 20°С виявлено для ізадрину та йохімбіну. Це свідчить про зміну щільності спакування ліпідного моношару завдяки вбудовуванню молекул ФАР між молекулами ДСФХ. Можна припустити, що атропін, димедрол та празозин взаємодіють з фосфоліпідною плівкою схожим чином: в моношар вбудовуються незаряджені угрупування, тоді як з залишками фосфохоліну взаємодіють групи, що можуть нести частковий заряд. На противагу решті ФАР, під впливом ніфедипіну відбувається зменшення значень обчислених параметрів, можливо, внаслідок дегідратації молекул ДСФХ.

За природних умов біологічні мембрани теплокровних тварин існують при більш високій, ніж 20°С, температурі. Тому було досліджено вплив ФАР на моношарові плівки з фосфоліпідів при підвищених температурах, що дозволяє збільшити рідинність плівки та наблизити стан модельної мембрани до фізіологічних (температурних та в’язкорідинних) умов існування ліпідного бішару плазматичних мембран.

Результати впливу ФАР на структурні та термодинамічні характеристики ліпідного моношару при різних температурах наведені у табл. 2.

Суттєва зміна обчислених параметрів виявлена для ізадрину. При підвищенні температури відбувається розрідження плівки, внаслідок чого відбувається краще вбудовування в моношар гетероциклічних груп празозину. Знову треба відмітити зменшення значень параметрів ліпідних плівок під дією ніфедипіну. Для деяких ФАР (йохімбін, празозин, димедрол та теофілін) підвищення температури призводить до посилення їх впливу на фосфоліпідну плівку, тоді як дія пропранололу, клонідину, карбахоліну послаблюється.

Таким чином, значний вплив на обчислені параметри ліпідних моношарів з ДСФХ за різних температур виявлено, головним чином, для ФАР, що інгібують фосфоліпідну та/або активують аденілатциклазну сигнальні системи (найбільш сильний – для ізадрину, йохімбіну, празозину, атропіну та ніфедипіну).

Вплив модуляторів ОССК на моношарові плівки з еквімолярної суміші ДСФХ та ДМФХ. Поряд зі зміною температури, рідинність мембранних ліпідів можна змінювати шляхом зміни складу фосфоліпідної фази. Введення ДМФХ до складу моношару з ДСФХ дозволяє збільшити рідинність моношарової плівки, що наближає стан модельної мембрани до значень мікров’язкості, які характеризують ліпідний бішар плазматичних мембран ссавців. Температура фазового переходу ДМФХ становить 23С, тому при більш високій температурі моношар, до складу якого входить ДМФХ, є механічно нестійким, що унеможливлює дослідження плівок з суміші ліпідів при підвищених температурах.

Результати впливу ФАР на моношарові плівки з еквімолярної суміші ДСФХ та ДМФХ наведені в табл. 3.

Таблиця 3

Вплив досліджених ФАР на параметри моношарів з еквімолярної суміші ДСФХ та ДМФХ

Сполука | S0, 2/мол. | Н11, кал. | Н12, кал. | Н22, кал. | G, кал.

Буфер | 721 | 191 | -321 | -3837 | -271

Буфер + ДМСО | 712 | 212 | -302 | -34015 | -242

Ізадрин | 731 | 191 | -381* | -50113* | -361*

Йохімбін+ДМСО | 722 | 91** | -292 | -42123** | -312

Празозин+ДМСО | 753 | 112** | -326 | -49743** | -355

Атропін | 721 | 92* | -363 | -53746* | -384*

Димедрол | 762* | 161* | -331 | -4327* | -311*

Ніфедипін+ДМСО | 712 | 81** | -293 | -43436** | -323

Пропранолол | 763 | 162 | -344 | -40815* | -294

Теофілін | 711 | 201 | -311 | -3606* | -263

Толбутамід | 711 | 181 | -321 | -39613 | -281

Клонідин | 722 | 182 | -304 | -41520 | -263

Мезатон | 702 | 192 | -314 | -36712 | -303

Карбахолін | 732 | 203 | -325 | -36816 | -264

Левамізол | 741 | 223 | -332 | -3637 | -271

Значення достовірно (р<0,05) відрізняється від значення: * – для буфера; ** – для буфера з ДМСО.

Найбільша зміна величини площі на молекулу ліпіду виявлена для мембранотропних препаратів димедролу та пропранололу. Ймовірно, що ці ФАР вбудовуються в структуру плівки своїми ароматичними залишками, а з фосфохоліновими фрагментами молекул ліпідів взаємодіють азот-вмісні групи. Суттєвим є вплив йохімбіну, празозину, атропіну та ніфедипіну на значення параметру Н11, який характеризує взаємодії субфаза-субфаза. Можливо, що утруднення вбудовування цих ФАР в структуру плівки відбувається внаслідок стеричних ускладнень. Значна зміна параметрів моношарів виявлена під впливом ізадрину, що можна пояснити взаємодією з зарядженими групами ліпіду.

При взаємодії ФАР з ленгмюрівськими моношарами з ДСФХ та з еквімолярної суміші фосфоліпідів зберігається направленість отриманих ефектів: більш сильно впливають на параметри фосфоліпідних моношарів ізадрин, празозин, атропін, димедрол та ніфедипін – сполуки, що відносяться до біорегуляторного класу +І/–ІІ. Вплив на моношарові плівки з суміші ліпідів ФАР з протилежним біорегуляторним стереотипом знов виявився слабкішим.

Взаємодія біорегуляторів з ленгмюрівськими моношарами з сироваткового альбуміну. Оскільки дослідження взаємодій модуляторів ОССК з ліпідними моношаровими плівками продемонструвало, що представники двох класів біорегуляторів по-різному впливають на параметри ленгмюрівських моношарів, метою подальших експериментів було виявлення біорегуляторного стереотипу дії ксенобіотиків на моношарових плівках, що сформовані з сироваткового альбуміну бика (САБ). Вибір цього білка був не випадковим. Встановлено, що вплив біорегуляторів +І/–ІІ та –І/+ІІ класів на динамічне розсіювання світла розчинами САБ є якісно різним [Luik A.I., et al., 1998]. Зміни значень структурних та термодинамічних параметрів моношарів з сироваткового альбуміну під впливом ФАР наведені в табл. 4.

Таблиця 4

Вплив досліджених ФАР на термодинамічні та структурні параметри моношарів з САБ

Сполука | S0, Е2/мол. | Н11, кал. | Н12, кал. | Н22, кал. | G, кал.

Буфер | 310020 | 2996 | -45713 | -274020 | -4548

Буфер+ДМСО | 326010* | 32114 | -41013* | -242010* | -4538

Ізадрин | 330010* | 3353* | -4825* | -292020* | -5546*

Теофілін | 310030 | 27114* | -45717 | -261020* | -4609

Йохімбін+ДМСО | 333020** | 23414** | -3887** | -250020** | -4829**

Празозин+ДМСО | 337020** | 28215** | -4138 | -255030** | -4826**

Атропін | 314020 | 2528* | -4565 | -288010* | -5297*

Димедрол | 310020 | 26023* | -46211 | -277020 | -46012

Ніфедипін+ДМСО | 366530** | 2674** | -4589** | -257124** | -5056**

Пропранолол | 288010* | 27711* | -4498 | -277020 | -4766*

Толбутамід | 312020 | 28211 | -4518 | -262020* | -4819*

Клонідин | 309010 | 30110 | -4609 | -269020 | -47011

Мезатон | 294010* | 2997 | -4387* | -269020 | -4825*

Карбахолін | 302010* | 2887 | -4436 | -271020 | -46012

Левамізол | 318030* | 3109 | -4606 | -235030* | -4794*

Значення достовірно (р<0,05) відрізняється від значення: * – для буфера; ** – для буфера з ДМСО.

Під дією ізадрину збільшуються всі вирахувані параметри, зокрема, площа, що припадає на одну молекулу. Можна припустити, що при цьому відбувається порушення глобулярної структури білка. Зменшення площі на молекулу під впливом пропранололу та ніфедипіну, можливо, відбувається внаслідок згортання молекул альбуміну, які займають меншу площу на поверхні. При цьому послаблюється взаємодія між молекулами води в моношарі. Вплив йохімбіну, празозину та левамізолу, ймовірно, призводить до появи некомпенсованого поверхневого заряду білка, про що свідчить зростання значень деяких з обчислених параметрів.

Отже, знов треба відзначити більш значні зміни параметрів моношарових плівок з сироваткового альбуміну під впливом представників біорегуляторного класу +I/–II.

Виявлення біорегуляторного стереотипу дії ФАР за їх впливом на ленгмюрівські моношарові плівки. Враховуючи подібний вплив ФАР на структурні та термодинамічні параметри ленгмюрівських плівок з фосфоліпідів та альбуміну, для інтегральної оцінки направленості дії речовин на моношари з урахуванням зміни значень всіх вирахуваних параметрів, ми використали метод кластерного аналізу, тобто розбиття множини досліджуваних об’єктів на групи на основі усіх ознак цих об’єктів одночасно.

В результаті аналізу ФАР розділились на дві групи (рис. 2, 3). У випадку моношарів з ДСФХ при 20°С (рис. 2) до першої групи здебільшого потрапили речовини, що активують аденілатциклазну сигнальну систему та/або інгібують фосфоліпідну сигнальну систему – активатор в-адренорецепторів ізадрин, блокатор 2-адренорецепторів йохімбін, 1-адреноблокатор празозин, М-холіноблокатор атропін, блокатор Н1-гістамінових рецепторів димедрол, тобто біорегулятори класу +I/–II. Іншу групу переважно склали речовини з стереотипом дії –I/+II: антагоніст -адренорецепторів пропранолол, протидіабетичний препарат толбутамід, 2-адреностимулятор клонідин, активатор 1-адренорецепторів мезатон, агоніст М-холінорецепторів карбахолін та імуностимулятор левамізол. В той же час дигідропіридиновий блокатор кальцієвих каналів ніфедипін та агоніст А1-аденозинових рецепторів теофілін класифіковані невірно.

Неправильна класифікація теофіліну може пояснюватись незначною взаємодією з фосфоліпідами. Ніфедипін має значну мембранотропну активність. Очевидно, при взаємодії з моношарами з ДСФХ при 20°С значно проявляються лише ліпофільні властивості цього препарату. Нижче буде показано, що притаманний ніфедипіну біорегуляторний стереотип +I/–II зберігається при його взаємодії з іншими ленгмюрівськіми плівками.

За результатами кластерного аналізу впливу ФАР на моношари за підвищених температур до однієї групи потрапили виключно речовини, що відносяться до класу +I/–II – ізадрин, йохімбін, теофілін, атропін, празозин, димедрол та ніфедипін. Іншу групу виключно склали ФАР з протилежним біорегуляторним стереотипом – пропранолол, толбутамід, клонідин, мезатон, карбахолін та левамізол (рис. 3, А).

У випадку суміші ліпідів теж можна спостерігати розділення ФАР за їх біорегуляторними стереотипами методом кластерного аналізу (рис. 3, Б). До першої групи знову потрапили речовини – активатори аденілатциклазної сигнальної системи та/або ФАР, що пригнічують активність фосфоліпідної сигнальної системи – ізадрин, йохімбін, атропін, празозин і ніфедипін, тоді як до іншої групи входять препарати з протилежною дією на ОССК.

За результатами кластерного аналізу впливу ксенобіотиків на моношарові плівки з САБ (рис. 3, В) одну з груп склали ФАР з біорегуляторним стереотипом +I/–II (ізадрин, йохімбін, атропін, празозин, димедрол і ніфедипін), а іншу – з біорегуляторним стереотипом –I/+II (мезатон, левамізол, карбахолін, клонідин та пропранолол).

Виявлення біорегуляторного стереотипу ФАР за допомогою штучних нейронних мереж (ШНМ). Ще одним методом, за допомогою якого було спрогнозовано віднесення ФАР до двох груп за їх впливом на фізико-хімічні параметри ленгмюрівських моношарів з фосфоліпідів та сироваткового альбуміну був метод ШНМ з прямим розповсюдженням сигналу та зворотнім поширенням помилки з використанням навчання “з вчителем”.

За результатами впливу ФАР на моношарові плівки штучні нейронні мережі розділили ФАР на дві групи (рис. 4, А-Г). Відсоток нейронних мереж, що вірно класифікують сполуки, складає 90,6%, причому вісім з тринадцяти сполук класифіковані з 98% точністю. Невірно класифікується лише теофілін внаслідок його неоднозначного впливу на моношарові плівки.

На відміну від розподілу ФАР на групи за їх біорегуляторним стереотипом дії за допомогою методу кластерного аналізу, застосування ШНМ призводить до вірного віднесення ніфедипіну у випадку моношарів з ДСФХ при 20°С та димедролу – у випадку суміші ліпідів.

Таким чином, за допомогою штучних нейронних мереж переконливо показаний прояв біорегуляторного стереотипу при взаємодії ФАР з ленгмюрівськими моношаровими плівками з фосфоліпідів та сироваткового альбуміну.

Дослідження мембранотропної активності деяких лікарських засобів на моношарових плівках з ДСФХ. Важливість урахування впливу ФАР на ліпідну компоненту біомембран в реалізації фармакологічного ефекту лікарських засобів спонукала нас дослідити мембранотропну активність перспективних кардіотонічних засобів суфану та спленозиду (суміш нуклеозидів, що виділена з селезінки великої рогатої худоби) в порівнянні з кардіотоніком строфантином; структурно близьких до компонентів спленозиду аденозину, інозину та гіпоксантину; макроергічних сполук АТФ і АТФ-ЛОНГ (складнокоординована сполука, що містить АТФ, гістидин та хлорид магнію); актопротекторів яктону та бемітилу в порівнянні з речовиною з подібною хімічною будовою дибазолом. Структурні формули досліджених препаратів наведені на рис. 5. Формули загальновідомих речовин не наводяться.

Суфан Бемітил Дибазол

Яктон Строфантин

Рис. 5. Досліджувані лікарські засоби

Значна зміна параметрів моношарів під впливом кардіотоніків виявлена для суфану та спленозиду. Це може свідчити на користь припущення, що в механізмі їх фармакологічної дії суттєву роль відіграє взаємодія з фосфоліпідним компонентом мембран кардіоміоцитів. Строфантин, аденозин, метаболічні попередники пуринів інозин і гіпоксантин та АТФ-ЛОНГ значно слабкіше взаємодіють з моношарами з ДСФХ. Вплив бемітилу на моношарові плівки вищий, ніж у речовини з менш виразними актопротекторними властивостями – яктону. Можливо, що в прояві актопротекторних властивостей бемітилу значну роль відіграє взаємодія з мембранними фосфоліпідами.

Передбачення біорегуляторного стереотипу дії нових лікарських засобів на основі їх впливу на моношарові плівки з ДСФХ за допомогою методу кластерного аналізу. Виявлення біорегуляторної стереотипії ФАР дає можливість передбачати фармакологічні властивості лікарських речовин і поширювати спектри їх ефективного практичного застосування. Вивчення взаємодії модуляторів ОССК з ліпідними плівками показало, що представники двох класів біорегуляторів якісно по-різному впливають на значення параметрів моношарів. Тому такі плівки можуть бути зручною тестовою системою для прогнозування біорегуляторного стереотипу нових ФАР на першому етапі досліджень цих сполук.

За результатами кластерного аналізу даних впливу на моношари з ДСФХ суфану та типових представників двох біорегуляторних класів ФАР можна зробити висновок, що взаємодія цього препарату з функціональними ланками ОССК буде призводити до підвищення рівня активності аденілатциклазної сигнальної системи та/або інгібування Ca-залежної поліфосфоінозитидної системи (рис. 6). Це цілком узгоджується з результатами роботи [Гриневич О.Й., 1995], в якій на основі проведених модельних дослідів на тромбоцитах, поліморфноядерних лейкоцитах та Т-лімфоцитах зроблено висновок, що суфан є активатором аденілатциклазної сигнальної системи.

В літературі нами не знайдено даних щодо прояву біорегуляторного стереотипу інших досліджених препаратів. Результати кластерного аналізу впливу на моношарові плівки з ДСФХ спленозиду та ФАР з різною спрямованістю дії по відношенню до ОССК (рис. 7) можуть свідчити, що цей препарат також відноситься до біорегуляторного класу +I/–II.

Результати прогнозування біорегуляторного стереотипу решти досліджених препаратів свідчать, що АТФ-ЛОНГ, аденозин, гістидин, інозин, гіпоксантин, бемітил, дибазол, строфантин та яктон можуть відноситись до біорегуляторного класу –I/+II.

Таким чином, ленгмюрівські моношари з фосфоліпідів можуть бути зручною тестовою системою для виявлення біорегуляторного стереотипу ФАР, що можливо здійснювати за допомогою штучних нейронних мереж та кластерного аналізу результатів впливу препаратів на фізико-хімічні та структурні характеристики моношарових плівок.

ВИСНОВКИ

1. В дисертації наведене нове вирішення наукової задачі та ряд теоретичних узагальнень відносно визначення прояву біорегуляторного впливу модуляторів основних сигнальних систем клітини на мембрани з фосфоліпідів та сироваткового альбуміну. Вперше показаний біорегуляторний вплив модуляторів ОССК різних фармакологічних груп на моношарові ленгмюрівські плівки з фосфоліпідів та сироваткового альбуміну.

2. Встановлено, що на структурні та термодинамічні параметри фосфоліпідних та білкових моношарів в концентрації 1.10-4 М більш сильно впливають, головним чином, ФАР, що активують аденілатциклазну та/або інгібують фосфоліпідну сигнальні системи клітини: ізадрин, йохімбін, празозин, атропін та ніфедипін. Для біорегуляторів з протилежним типом дії по відношенню до ОССК виявлена більш слабка зміна обчислених параметрів.

3. Показано, що біорегуляторний стереотип дії ФАР на функціональні ланки ОССК зберігається при взаємодії біорегуляторів з мономолекулярними плівками з фосфоліпідів та сироваткового альбуміну. Продемонстрована ефективність застосування штучних нейронних мереж для поділу біорегуляторів у відповідності до загальної спрямованості їх дії на основні клітинні системи трансдукції сигналу на основі обчислених структурних та термодинамічних параметрів впливу ФАР на мономолекулярні плівки. Можливість розділення препаратів на групи за їх біорегуляторним стереотипом дії також підтверджується за допомогою кластерного аналізу.

4. Встановлена мембранотропна активність на рівні фосфоліпідних моношарів з дистеароїлфосфатидилхоліну деяких кардіотонічних засобів, актопротекторів та препаратів похідних АТФ – найбільш сильна для суфану та спленозиду. Отримані дані дозволяють зробити висновок про важливість урахування впливу досліджених ФАР на фосфоліпідний компонент біологічних мембран в з’ясуванні механізму фармакологічного ефекту зазначених лікарських засобів.

5. На моношарових плівках з ДСФХ на прикладі кардіотонічних засобів суфану та спленозиду, актопротекторів бемітилу та яктону, макроергічної сполуки АТФ-ЛОНГ показана можливість прогнозування наявності у ФАР активуючої або блокуючої активності по відношенню до аденілатциклазної та Ca-залежної поліфосфоінозитидної сигнальних систем клітини без вивчення впливу препаратів безпосередньо на ОССК. Згідно з отриманими результатами, суфан та спленозид можна віднести до біорегуляторного класу +І/–ІІ, а бемітил, яктон та АТФ-ЛОНГ – до класу –І/+ІІ.

Список публікацій за темою дисертації

1. Бичко А.В., Ляхов О.М., Прокопенко Р.А., Могилевич С.Є., Порало І.В., Рибальченко В.К. Взаємодія суфану із фосфоліпідними мембранами іn vitro // Вісник Київського Національного Університету. - 1999, вип. 5. - С. 17-23.

2. Олійник Б.В., Олійник С.А. Плиска О.І., Прокопенко Р.А., Ляхов О.М. Кардіотонічні властивості спленозиду - нуклеозидного чинника селезінки великої рогатої худоби // Наукові записки Тернопільского педуніверситету. Серія: біологія. - 2000. - № 4. - С. 43-46.

3. Прокопенко Р.А., Ляхов О.М., Могилевич С.Є., Луйк О.І. Взаємодія модуляторів фосфоліпідної та аденілатциклазної сигнальних систем клітини з фосфоліпідними моношарами // Доповіді НАН України. - 2001. - № 3. - С. 189-193.

4. Ляхов О.М., Прокопенко В.В., Прокопенко Р.А., Могилевич С.Є. Взаємодія модуляторів фосфоліпідної та аденілатциклазної сигнальних систем клітини з фосфоліпідними моношарами при різних температурах // Доповіді НАН України. - 2002. - № 12. - C. 113-118.

5. Ляхов О.М., Прокопенко Р.А., Коршевнюк Д.О., Олійник С.А., Олійник Б.В., Горчакова Н.О., Войціцький В.М. Взаємодія препаратів класу актопротекторів з фосфоліпідними мембранами in vitro // Доповіді НАН України. - 2003. - № 3. - С. 184-186.

6. Ляхов О.М., Прокопенко В.В., Могилевич С.Є., Прокопенко Р.А. Взаємодія модуляторів аденілатциклазної та фосфоліпідної сигнальних систем клітини з моношаровими плівками з альбуміну сироватки людини // Доповіді НАН України. - 2004. - № 4. - С. 179-183.

7. Вдовенко Н.В., Ляхов О.М., Могилевич С.Є. Взаємодія препарату "АТФ-ЛОНГ" з моношаром дистеароілфосфатидилхоліну // Український біохімічний журнал. - 2004. - Т. 76, № 2. - С. 121-123.

8. Lyakhov A.M., Prokopenko R.A., Mogilevich S.E. The thermodynamics of physiologically active compounds interaction with phospholipid Langmuir monolayers. – International Conferences “Physics of liquid matter: modern problems”.Abstracts. – Kyiv, 14-19 September, 2001 y. – p. 185.

9. Ляхов О.М., Прокопенко Р.А., Могилевич С.Є. Фосфоліпідні мономолекулярні плівки як модель для вивчення взаємодії лікарських препаратів з біомембранами. – II Національний з’їзд фармакологів України. Тези доповідей. – Дніпропетровськ, 1-4 жовтня 2001 р. – с. 157.

10. Ляхов О.М. Прокопенко Р.А., Могилевич С.Є. Фосфоліпідні ленгмюрівські плівки як модель для вивчення лікарських препаратів з біологічними мембранами. – III Українська конференція молодих вчених, присвячена пам’яті академіка В.В. Фролькіса. Тези доповідей. – Київ, 28 січня 2002 р. – С. 126-127.

11. Ляхов А.М., Прокопенко Р.А., Прокопенко В.В., Могилевич С.Е. Термодинамика взаимодействия физиологически активных соединений (ФАВ) с фосфолипидными лэнгмюровскими монослоями. – Международная конференция “Физико-химический анализ жидкофазных систем”. Тезисы докладов. – Саратов, 30 июня-4 июля 2003 г. – С. 83.

Ляхов О.М. Взаємодія фізіологічно-активних речовин з ленгмюрівськими мономолекулярними плівками. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 02.00.10 – біоорганічна хімія. Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2006.

Дисертація присвячена виявленню біорегуляторної стереотипії дії фізіологічно-активних речовин на термодинамічні та структурні характеристики мономолекулярних плівок Ленгмюра з фосфоліпідів та сироваткового альбуміну. Показаний біорегуляторний вплив модуляторів основних сигнальних систем клітини на значення параметрів моношарових плівок з фосфоліпідів та білків. На моношарах з дистеароїлфосфатидилхоліну виявлена мембранотропна активність деяких перспективних лікарських засобів. Створено ефективний комп’ютерний алгоритм для розділення речовин на класи за типом їх дії на функціональні ланки аденілатциклазної та Ca-залежної поліфосфоінозитидної сигнальних систем клітини, за допомогою якого спрогнозовано біорегуляторний стереотип нових лікарських засобів.

Ключові слова: біорегуляторний стереотип, фізіологічно-активні речовини, мономолекулярні плівки Ленгмюра, кластерний аналіз, штучні нейронні мережі, мембранотропна активність.

Ляхов А.М. Взаимодействие физиологически-активных веществ с лэнгмюровскими мономолекулярными пленками. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 02.00.10 – биоорганическая химия. Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2006.

Ведущая роль универсальных клеточных сигнальных систем (аденилатциклазной и Ca-зависимой полифосфоинозитидной) в биорегуляции самых разнообразных клеточных функций является основой для определения функциональной общности ксенобиотиков, сходным образом влияющих на активность основных сигнальных систем клетки (ОССК). Это сходство проявляется в наличии в различных в химическом и фармакологическом отношении физиологически-активных веществах (ФАВ) стереотипного компонента в механизмах их биорегуляторного воздействия. К настоящему времени получены весомые свидетельства указанной выше общности, определяющей, очевидно, не только направленность (определяемую понятием “биорегуляторный стереотип”) и характер влияния различных ФАВ на ОССК, но и общий профиль физиологической активности веществ.

Экспериментальное изучение направленности действия ФАВ модуляторов активности ОССК на монослойные лэнгмюровские пленки из фосфолипидов и сывороточного альбумина показало, что вещества, активирующие аденилатциклазную систему и/или блокирующие фосфолипидную сигнальную систему, более сильно влияют на значения термодинамических и структурных характеристик монослоев (в концентрации 1.10-4 М изадрин, йохимбин, празозин, атропин, димедрол, нифедипин изменяют значения таких параметров на 25-75%). Вещества, противоположным образом влияющие на функциональные звенья ОССК, взаимодействуют с монослоями значительно слабее. То есть биорегуляторные стереотипы ФАВ проявляются даже на такой автономной модельной системе, как монослойные фосфолипидные мембраны, которые не имеют никакой прямой связи с внутримембранными клеточными структурами.

Методами кластерного анализа и искусственных нейронных сетей показано, что на основе данных о влиянии препаратов на параметры монослойных пленок из фосфолипидов и сывороточного альбумина ФАВ могут быть разделены на группы в соответствии с присущим им биорегуляторным стереотипам.

На монослойных пленках из дистеароилфосфатидилхолина выявлена мембранотропная активность новых перспективных лекарственных средств, наиболее значительная – для кардиотонических средств суфана и спленозида. Это может служить в пользу предположения, что в механизме фармакологического действия таких препаратов существенную роль играет взаимодействие с фосфолипидным компонентом мембран кардиомиоцитов.

Определение биорегуляторной стереотипии в действии ФАВ дает возможность предсказывать фармакологические свойства лекарственных средств и расширять спектры их эффективного применения. Использование монослойных пленок позволяет прогнозировать наличие у ФАВ активирующей или блокирующей активности по отношению к аденилатциклазной и полифосфоинозитидной сигнальным системам клетки без изучения влияния веществ непосредственно на ОССК, что могло бы значительно ускорить и удешевить поиск новых эффективных лекарственных средств.

Результаты кластерного анализа данных о влиянии на монослои представителей двух классов ФАВ с противоположными биорегуляторными стереотипами и исследованных препаратов могут свидетельствовать, что взаимодействие суфана и спленозида с функциональными звеньями сигнальных систем клетки будет приводить к повышению уровня активности аденилатциклазной системы и/или ингибированию проведения