КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

МЕЛЬНИЧУК Ольга Миколаївна

УДК 577.352:612.822

ВПЛИВ РУТИНУ, КВЕРЦЕТИНУ ТА ЇХ КОМПЛЕКСІВ

З АЛЮМІНІЄМ НА ДИНАМІКУ СКОРОЧЕННЯ

СКЕЛЕТНОГО М’ЯЗУ ЖАБИ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біофізики біологічного факультету

Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Мірошниченко Микола Степанович

завідувач кафедри біофізики

Київського національного університету

імені Тараса Шевченка

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Рибальченко Володимир Корнійович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач

відділу цитофізіології Інституту фізіології ім. Петра Богача

біологічного факультету

кандидат біологічних наук

Векліч Тетяна Олександрівна,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

науковий співробітник

відділу біохімії м’язів

Провідна установа: Національний медичний університет імені

О.О. Богомольця МОЗ України, м. Київ.

Захист відбудеться 22 лютого 2006 року о “14” годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 при Київському національному

університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03022, Київ,

проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215

Поштова адреса: 01033, Київ – 33, вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного

університету імені Тараса Шевченка за адресою:

01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий 17 січня 2006р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.В.Цимбалюк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Скелетні м’язи є активною частиною опорно-рухового апарату хребетних. Вкрай важливою їх властивістю є здатність до скорочення. Грунтуючись на перших фундаментальних дослідженнях Хакслі та Хіла [Huxley, 1953, 1958; Hill, 1970], ряд авторів [Edman, 2001; Gordon, 2003] досить детально описали механізми, що визначають їх функціональну активність. Важливим параметром діяльності скорочувального апарату скелетних м’язів є їх динамічні характеристики. Було показано відмінності у розвитку силової відповіді м’язових волокон в фазах дотетанічного та тетанічного скорочення [Мірошниченко і співавт., 2002; Ноздренко і співавт., 2002]. На думку авторів, це обумовлено особливостями молекулярних механізмів взаємодії міозинових та актинових філаментів впродовж фаз досягнення та утримання волокнами стаціонарного стану скорочення.

Ефективними модуляторами процесів скорочення-розслаблення м’язів є біологічно активні речовини природного походження – флавоноїди. За останні 15 років на кафедрі біофізики Київського національного університету імені Тараса Шевченка сформувався новий напрямок наукових досліджень, пов’язаний з вивченням дії таких флавоноїдів як кверцетин та рутин на електричні та механічні властивості гладеньких м’язів шлунково-кишкового тракту [Давидовська і співавт., 1986, 2003], а також на структурно-функціональні властивості скоротливих білків скелетних м’язів [Зима і співавт., 1983, 1988]. Встановлено, що ці речовини змінюють рівень електричної поляризації мембрани гладеньких м’язів, а також їх спонтанну електричну та механічну активність, змінюють гальмівні та збуджуючі потенціали в них. В невеликих концентраціях кверцетин та рутин активують АТФазу міозину скелетних м’язів, тоді як підвищення їх концентрації викликає протилежний ефект.

Показана здатність флавоноїдів концентраційно-залежним способом змінювати провідність Са2+, Cl-, K+ каналів. Флавоноїди регулюють процеси росту та розвитку організмів. Вони ефективні гепато- та кардіопротектори, імуномодулятори, а також антиоксиданти. Флавоноїди також широко застосовують в медичній практиці для лікування різних захворювань, пов’язаних з паталогією вісцеральних органів та тканин (онкологічні захворювання, алергії, астма, пневмонія, псоріаз, катаракта, цукровий діабет, артрити, виразки, а також захворювання серцево-судинної системи).

Враховуючи те, що флавоноїди здатні утворювати комплекси з металами, зокрема, з алюмінієм (які відрізняються кращою мембранною проникністю), було доцільно дослідити вплив флавоноїдів та їх комплексу з алюмінієм, на функціональну активність скелетних м’язів.

Більшість робіт, присвячених вивченню впливу біологічно активних препаратів на м’язове скорочення, досліджують дію даних сполук на кінцеву зміну силової продуктивності м’язів. Але практично недослідженим залишається динамічний розвиток даного процесу. Встановлення рівноважного стаціонарного стану скорочення під дією біологічно активних речовин може варіювати не тільки в досить широких межах в залежності від концентрації реагентів але й в залежності від тривалості експерименту. Цей факт ускладнює як планування експерименту, так і інтерпретацію отриманих дослідником результатів. Скорочення м’язового волокна, що являє собою динамічну структуру не є однорідний та лінійний процес. Часові ділянки поодинокого скорочення являють собою синхронізований процес взаємодії не тільки голівок молекул міозину з глобулами актину, але і інших компонентів в саркомері в строго визначеній часовій послідовності. Тому особливу увагу в роботі ми приділяли встановленню саме змін в часі досягнення рівноважного стаціонарного стану скорочення під впливом використаних речовин.

Отже детальні дослідження впливу флавоноїдів та їх комплексів з алюмінієм, який є активним компонентом багатьох фармакологічних препаратів, об’єктів промисловості і побуту людини, на динаміку скорочення скелетно-м’язових волокон впродовж окремих функціональних фаз є актуальним як в науковому так і в практичному аспектах.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно плану науково-дослідних робіт кафедри біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках теми № ДР0101U001967 “Дослідження та моделювання молекулярних та клітинних процесів в збудливих біологічних системах (м’язи, зір)”.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з’ясування впливу флавоноїдів: кверцетину та рутину, а також їх комплексів з алюмінієм на динаміку м’язового скорочення ізольованих тонких пучків м’язових волокон, викликаного стимуляцією електричними імпульсами.

Для досягнення поставленої мети до завдань роботи входило:

дослідити вплив різних концентрацій рутину на динамічні параметри (сила-довжина) скорочення пучків волокон скелетних м’язів;

дослідити вплив різних концентрацій кверцетину на силу та зміну довжини скорочення пучків волокон скелетних м’язів;

дослідити зміну динамічних параметрів скорочення м’язових волокон при дії розчинів хлориду алюмінію;

дослідити спільну дію комплексів флавоноїдів з хлоридом алюмінію на динаміку скорочення м’язових волокон.

Об’єкт дослідження – нативний препарат ізольованих тонких пучків волокон скелетного м’язу m. tibialis anterior задньої кінцівки Rana temporaria.

Предмет дослідження – динаміка скорочень пучків волокон скелетних м’язів при електричній стимуляції під впливом різних концентрацій використаних флавоноїдів, розчинів хлориду алюмінію та їх комплексів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що речовини рослинного походження – флавоноїди: кверцетин та рутин концентраційно-залежним способом пригнічують розвиток силової відповіді та зміну довжини пучків волокон скелетного м’язу m. tibialis anterior жаби Rana temporaria після стимуляції електричними імпульсами.

Вперше показано нерівномірність змін окремих функціональних фаз скорочення викликаних електричним струмом, під дією флавоноїдів. Мінімальне зниження сили та зменшення вкорочення м’язових волокон відбувається на дотетанічніх ділянках скорочення. Максимальних змін дані параметри набувають впродовж останніх 500 мс дії стимулюючого подразника. При цьому зміни в довжині м’язових волокон були більш вираженими порівняно зі зменшенням силової відповіді м’язових препаратів.

Вперше доведено, що зі збільшенням концентрації кверцетину, спостерігались флуктуації відповідних рівнів генерації сили та зміни довжини пучків волокон скелетних м’язів.

Вперше встановлено, що кверцетин та рутин змінюють свої властивості щодо впливу на функціонування м’язових волокон скелетних м’язів при утворенні комплексів з алюмінієм, що супроводжується посиленням їх інгібіторної дії.

Практичне значення роботи. Одержані результати значно поглиблюють та розширюють уявлення про біофізичні механізми функціонування скелетних м’язів при дії на них речовин флавоноїдної природи та їх комплексів з хлоридом алюмінію. Встановлена в експериментах інгібіторна дія кверцетину та рутину може скласти основу для розробки рекомендацій щодо лікування паталогій скелетної мускулатури, пов’язаних з їх контрактурою. Встановлена властивість комплексу хлориду алюмінію з флавоноїдами пригнічувати силу та зміну довжини скорочень м’язових волокон може бути використана в практичній токсикології.

Одержані результати використовуються у навчальному процесі з нормативного курсу “Біофізика” та спецкурсу “Біофізика м’язів” для студентів біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача полягає у аналізі стану вивчення проблеми на основі здійсненого інформаційного пошуку, підборі літератури та оволодінні методами дослідження, самостійному виконанні експериментальної частини дисертації, статистичній обробці одержаних результатів, їх аналізі, інтерпретації та теоретичному узагальненні. Наукова оцінка отриманих даних та загальні висновки зроблені спільно з науковим керівником доктором біологічних наук, професором М.С. Мірошниченком. Ноздренко Д.М. – допомога у технічному забезпеченні виконання експериментальної частини роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені та обговорені на ІІ міжнародному симпозіумі “Фізіологія та біофізика гладеньких м’язів” (Київ, Україна, 28-31 жовтня 2003); на Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 25-28 квітня 2004); на IV Всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 24-25 квітня 2004); на Міжнародному симпозіумі “Біологічна рухливість” (Пущино, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 наукових праць, з них 3 статті у фахових виданнях, та 4 тези доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 244 найменувань, додатків. Робота викладена на 168 сторінках та ілюстрована 48 малюнками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

Дослідження проводились на пучках волокон м’язу m.tibialis anterior, виділених з задньої кінцівки жаби Rana temporaria. Для експерименту використовували дорослих особин обох статей. Тварин забивали за допомогою методу декапітації. У забитої тварини ампутували задні кінцівки, які розміщували у фізіологічному розчині Рінгера такого складу (у ммоль/л): NaCl – 115,5; KCl – 2; CaCl2 – 1,8; Na2HPO4 + NaH2PO4 – 2; pH 7.0 [Edman, 2001; Radzyukevich, 2004]. М’яз m.tibialis anterior та волокна з фрагментами сполучної тканини на кінцях виділяли механічним шляхом за допомогою набору офтальмологічних мікроінструментів. На виділені препарати накладались лігатури, після чого об’єкт розміщували в дослідницькій камері. Препарат протягом 60 хвилин підлягав адаптації в постійно циркулюючому через камеру фізіологічному розчині Рінгера. Для кожного з м’язових препаратів експериментальним шляхом підбиралась величина L0, що відповідала мінімальній довжині зразка, при якому було зафіксовано криві змін сили скорочення. Після остаточного розміщення та натягу волокна зразок піддавали кінцевій 20-хвилинній адаптації. Натяг готового препарату здійснювали у межах від L0 до Lmax (максимально розтягнутий стан м’язового волокна, при якому можливо зафіксувати зміну силових параметрів у відповідь на електростимуляцію).

У експериментах використовували розчини флавоноїдів в діапазоні концентрацій від 10-8 до 10-3 моль/л. Кверцетин розчиняли в 96 % етиловому спирті, рутин розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО). Перед проведенням кожного досліду з флавоноїдами, обов’язково проводили тестування динаміки скорочення м’язу під впливом розчину з застосованим розчинником. Кінцева концентрація розчинників в омиваючому розчині у всіх дослідах не перевищувала 0,5 %. Хлорид алюмінію розчиняли у фізіологічному розчині Рінгера.

Експерименти проводили в ізотонічному режимі при постійному контролі динамічних параметрів скорочення. В процесі проведення експерименту фіксували силу скорочення, зміну довжини м’язу, температуру омиваючого розчину та параметри стимулючого сигналу. Досліди проводили при постійно циркулюючому розчині Рінгера з періодом релаксації 2 та 3 хвилини. Після використання розчинів флавоноїдів та хлориду алюмінію м’язові препарати відмивали фізіологічним розчином до досягнення вихідних параметрів скорочення. Всі описані досліди проводили при фіксованій температурі. Підтримання температури здійснювали за допомогою термостатичного пристрою.

При обробці отриманих результатів визначали зміни сили та довжини скорочення м’язових волокон впродовж початкової і кінцевої фаз скорочення, а також при досягненні м’язовими волокнами стаціонарного рівня скорочення (тривалість біну 500 мс). Визначали час досягнення динамічними параметрами 50 % та 25 %-вого рівня скорочення.

Для реєстрації сили скорочення та довжини пучків волокон скелетного м’язу використовували тензометричну установку. Даний пристрій являв собою комплекс, що складався з: камери, в якій розміщувався досліджуваний препарат, системи насосів, датчиків сили та довжини, генератора імпульсів, температурного датчика, осцилографів, комплексу АЦП-ЦАП, персонального комп’ютера і системи оптичних пристроїв для візуального спостереження за експериментом та обслуговування і підготовки препарату для досліду. Стимуляцію здійснювали електричними імпульсами прямокутної форми тривалістю 2 мс, що формувались за допомогою генератора імпульсів, керованим АЦП через платинові електроди. Тривалість стимуляції становила 3 с. Електроди нерухомо фіксували безпосередньо в дослідницькій камері, паралельно один до одного, на відстані 8 мм. Характеристики стимулюючого сигналу задавали програмно і передавали з комплексу АЦП-ЦАП на генератор. Модульовані криві, представлені в роботі, будували з врахуванням сигналів входу-виходу перетворювача. Паралельний візуальний контроль здійснювали за допомогою катодного осцилографа.

Статистичну обробку даних проводили методами варіаційної статистики за допомогою програмного забезпечення Оrigin 7.0 з використанням t-критерію Стьюдента. Вірогідними вважалися відмінності між контролем і дослідом при p<0,05.

Результати дослідження та їх обговорення

Динаміка змін генерації сили та довжини м’язових волокон під впливом рутину та кверцетину. Для зручності опису отриманих результатів та їх адекватного трактування нами було проведено розподіл динамічної відповіді активного м’язу на окремі часові ділянки (фази - тривалістю 500 мс), які відповідали різним функціональним та часовим станам процесу скорочення. Силова відповідь м’яза була розділена на три функціональні фази. Фаза F1 – початок силової відповіді м’язу, яка співпадає з початком стимулюючого сигналу; F2 – відповідає виходу силової продуктивності м’язу на стаціонарний рівень, без помітного тренду в той чи інший бік; F3 – кінцева фаза активності м’яза. Зміна довжини м’язових волокон була розбита на дві фази. L1 - початок зміни довжини м’язу (перші 500 мс стимулюючого сигналу), L2 - відповідає часу виходу довжини на стаціонарний рівень скорочення.

Дослідження впливу рутину на динамічні параметри скорочення пучків волокон скелетного м’язу жаби показали, що з підвищенням концентрації флавоноїду спостерігалось зниження інтенсивності динамічних параметрів скорочення. Так, при використанні рутину в концентраціях 10-5 та 10-4 моль/л генерація сили та вкорочення м’язових волокон істотно не змінювались впродовж всього періоду спостереження (р>0,05) порівняно з контролем. Рутин в концентрації 10-3 моль/л викликає зниження розвитку силової відповіді та зменшення вкорочення м’язових волокон впродовж всіх досліджуваних фаз. Наші досліди показали незначне пригнічення сили м’язового скорочення впродовж фази F1. Максимальне зменшення сили скорочення впродовж фази F2 та F3 відбувалось після 14-ї хвилини спостереження і становило 92±1,6 % та 89,4±2 % (р>0,05) від контролю. За даних умов максимальне пригнічення зміни довжини м’язового скорочення спостерігалось на 12-ій хвилині експерименту впродовж фази L1 та фази L2 і становило 87,8±1,2 % та 87,6±2,4 % від контрольного рівня, відповідно. Проте, таке зменшення не було статистично вірогідним.

В результаті досліджень нами встановлено, що при дії розчину кверцетину концентрацією 10-6 моль/л сила та зміна довжини м’язових волокон впродовж всіх фаз скорочення майже не змінювались порівняно з контролем (р>0,05; рис.1).

З наведених даних (рис. 1) видно, що при використанні кверцетину в концентрації 10-5 моль/л відбувалося поступове зниження динамічних параметрів скорочення. Так, за даних умов, впродовж фази F1 не спостерігалося істотного зменшення сили скорочення. Стаціонарний рівень зміни довжини м’язового скорочення встановлювався після 12-ої хвилини впродовж фаз L1 та L2, зменшення показників було статистично невірогідним. Статистично достовірним щодо контролю пригнічення сили м’язового скорочення було після 12-ї хвилини впродовж фаз F2 та F3. Слід зазначити, що у результаті використання розчину кверцетину в концентраціях 10-6 та 10-5 моль/л зміни силової продуктивності та довжини м’язових волокон носили лінійний характер впродовж всіх функціональних фаз.

Так як значне пригнічення сили та зміни довжини скорочення при використанні кверцетину в діапазоні концентрацій від 2·10-5 – 10-4 моль/л відбувалося вже впродовж фаз F1 та L1, використання фазного критерію для аналізу характеристичних кривих за даних умов було недоцільним. Тому для коректного опису отриманих результатів нами було визначено час досягнення м’язових відповідей, що становили 50% та 25 % від рівня контрольного скорочення м’язу.

Підвищення концентрації кверцетину до 10-4 моль/л вело до появи двохфазного характеру сили скорочення (рис. 2). Спочатку спостерігалось стрибкоподібне зростання м’язової сили до максимального значення, після якого відбувалося зниження цього параметру що тривало до кінця стимуляції.

Сила м’язового скорочення і час досягнення м’язових відповідей, що становили 50 % та 25 % від контролю зменшувались з підвищенням концентрації кверцетину. Поряд з цим реєструвались яскраво виражені флуктуації відповідних рівнів генерації сили на тетанічній ділянці скорочення. Довжина м’яза під дією стимулюючого сигналу зі збільшенням концентрації кверцетину змінювалась з значними флуктуаційними зміщеннями. Флуктуації зміни довжини волокон починались раніше, порівняно із флуктуаціями сили м’язового скорочення (рис. 2, а).

При використанні розчину кверцетину 10-4 моль/л м’яз переходив в стан ізометричного скорочення (рис. 2, б). На нашу думку кожен з флуктуаційних піків як для зміни довжини так і для силової відповіді відображає поодинокий процес надходження стимуляційного сигналу та є м’язовою відповіддю на цей сигнал, яка прагне до досягнення тетанічного рівня скорочення на фоні інгібіторної дії флавоноїду. Під впливом цієї речовини м’язові волокна не в змозі утримувати досягнутий стаціонарний тетанічний стан, що спадав до нового значно нижчого рівня. При надходженні наступного стимуляційного сигналу процес повторювався, але, вже з попереднього стаціонарного стану.

Так як вплив розчину кверцетину викликав значне зменшення динамічних параметрів скорочення, вищезгадані флуктуаційні зміни спостерігались на фоні лінійного спадання м’язових відповідей. На нашу думку, відмінності в роботі м’язу впродовж досліджуваних фаз скорочення можна пояснити впливом кверцетину на взаємодію голівок молекул міозину товстого філаменту з глобулами актину тонкого філаменту в фазах тетанічного та дотетанічного скорочення.

Зміни динаміки скорочення в залежності від тривалості дії реагентів не завжди носили лінійний характер. У більшості випадків відбувалася часова затримка в зміні динамічних параметрів з наступним різким виходом досліджуваних параметрів на новий стаціонарний стан. Величина часової затримки залежала від концентрацій кверцетину. На нашу думку, часова затримка може обумовлюватися тривалістю часу насичення м’язових волокон флавоноїдом. Так як проникнення кверцетину через мембранні бар’єри, очевидно, характеризується концентраційною та часовою залежністю. Це підтверджується відсутністю флуктуаційних змін в динаміці скорочення і переходом м’язових волокон в майже неактивний стан при використанні концентрації кверцетину 10-4 моль/л.

Таким чином, результати наших досліджень свідчать, що флавоноїди, зокрема кверцетин та рутин, активно впливають на динамічні параметри скорочення пучків волокон скелетних м’язів жаби. Проте, механізми впливу флавоноїдів на скорочення скелетно-м’язових волокон до кінця не з’ясовано. Описані нами зміни можуть свідчити про зменшення проникності плазматичної мембрани для іонів кальцію. Так, відомо, що функцію перенесення іонів Са2+ в середину волокон скелетних м’язів виконують дигідропіридинові рецептори сарколеми (Са2+ - канали L-типу). Оскільки за даними літератури флавоноїди здатні пригнічувати активність даних каналів [Apisariyakul et al., 1999; Tuncbilek, 1999], то специфічність дії кверцетину та рутину на динамічні параметри скорочення можна пояснити їх зв’язуванням саме з цим типом рецепторів. Це в свою чергу призводить до порушення процесу спряження збудження-скорочення в скелетних м’язах і тим самим зменшує розвиток м’язового напруження.

Встановлено, що кверцетин володіє більш вираженою біологічною дією на м’язове скорочення, порівняно з рутином, що узгоджується з літературними даними [Nijveldt et al., 2001]. На нашу думку, нижчу біологічну активність рутину можна пояснити його хімічною будовою. На відміну від кверцетину, у молекулі рутину в положенні 3 міститься радикал рамно-глюкози, що суттєво змінює розміри молекули, а також її гідрофобність, що, ймовірно, є причиною меншої проникності цього флавоноїду через мембрани, зумовлюючи його нижчу активність.

Отримані нами результати щодо впливу кверцетину і рутину на м’язове скорочення можна пояснити дією флавоноїдів на ферментні системи скелетних м’язів. З літературних джерел відомо [Shoshan et al., 1981; Zyma et al., 1988; Middleton et al., 2000], що флавоноїди концентраційно-залежним способом інгібують активність АТФаз саркаплазматичного ретикулуму та міозину.

Слід зазначити, що зміни динамічних параметрів м’язового скорочення впродовж фаз тетанічного утримання стаціонарного стану та на до- і післятетанічних ділянках відрізнялися. Відмінності в роботі м’язу впродовж досліджуваних фаз скорочення можна пояснити відмінностями у взаємодії філаментів на фазах тетанічного та дотетанічного скорочення і впливом на ці процеси досліджуваних нами речовин.

На підставі літературних даних та отриманих результатів досліджень можна припустити, що інгібіторний ефект флавоноїдів проявляється як на молекулярному рівні, через вплив на актоміозиновий комплекс, так і на більш високому клітинному рівні, задіюючи транспортні системи мембрани.

Вплив хлориду алюмінію на динамічні параметри скорочення скелетного м’язу. В наступних дослідах вивчено вплив хлориду алюмінію на роботу скелетно-м’язових волокон жаби. В організмах тварин та людини алюміній виявляє значну активність, впливаючи на характер протікання життєво важливих процесів. Наші досліди показали, що AlCl3 в концентрації 10-4 моль/л істотно не знижував генерацію сили та зміну довжини м’язових скорочень (рис. 3).

Зі збільшенням концентрації хлориду алюмінію до 5?10-4 моль/л спостерігалося поступове пригнічення динамічних параметрів скорочення. Зменшення сили скорочення впродовж фаз F2 та F3 становило 90,9±1,7 % (р>0,05) та 85,8±2,9 % (р<0,05) від контролю, відповідно. Максимальні зміни довжини м’язових волокон на 14-ій хвилині спостереження дорівнювали для L1 – 88,6±2,3 % та L2 – 89,4±3,2% (р>0,05) щодо контролю.

Представлені результати досліджень впливу 10-3 моль/л розчину хлориду алюмінію на пучки м’язових волокон показали суттєве зниження параметрів м’язового скорочення (рис. 3). Впродовж фази F1 максимальне пригнічення сили скорочення відбувалось після 10-ої хвилини спостереження, проте ці зміни не були статистично вірогідними. Найбільше зниження сили м’язового скорочення відбувалось на 12-ій та 14-ій хвилинах впродовж фаз F2 та F3, максимальні зміни довжини м’язового скорочення відбувались на 12-ій хвилині експерименту впродовж фаз L1 та L2 (рис. 3). При чому такі зміни були статистично вірогідними для F2, F3, L1, L2.

Отримані дані свідчать, що хлорид алюмінію активно впливає на роботу скелетно-м’язових препаратів. В результаті дії на м’язові волокна розчинів хлориду алюмінію сила та вкорочення м’язових волокон у досліджуваному діапазоні концентрацій лінійно зменшувались. Слід зазначити, що вихід динамічних параметрів на стаціонарний рівень скорочення в залежності від тривалості експерименту у досліджуваному діапазоні концентрацій відзначався розбіжністю в часі. Зменшення динамічних параметрів скорочення при використанні розчинів хлориду алюмінію було мінімальним впродовж фаз F1. Зміни силової відповіді та довжини м’язового скорочення при дії хлориду алюмінію дозволяють нам говорити про вибірковий характер його дії на скоротливі елементи. Ми можемо припустити, що іони алюмінію виявляють свій вплив на роботу м’язів на етапі актин-міозинової взаємодії. Іони даного металу, ймовірно, здатні заміщувати іони кальцію або магнію в активному центрі міозину. Ймовірно, іони алюмінію модулюють актин-міозинову взаємодію та змінюють функціональні характеристики актоміозинових комплексів м’язу. Це узгоджується з літературними даними про те, що АТФазна активність міозину при дії іонів алюмінію дозозалежно зменшувалась [Богуцька, 2003].

Cпільна дія розчинів хлориду алюмінію і кверцетину на механіку м’язового скорочення. Відомо, що флавоноїдні сполуки утворюють комплекси з металами, зокрема з алюмінієм [Afanas’eva, 2001; Rubens, 2005], ми вважали за доцільне дослідити вплив даних комплексів на динамічні параметри м’язового скорочення. Це обумовлено, також тим, що утворення комплексу алюмінію з кверцетином або рутином по суті означає утворення нової сполуки, яка за своєю дією на параметри скорочення може суттєво відрізнятись від дії компонентів, що входять до її складу.

Дослідження впливу суміші розчинів кверцетину та AlCl3 в концентраціях 10-6 моль/л показали, що зменшення динамічних параметрів скорочення було незначним впродовж усіх досліджуваних фаз (р>0,05; рис. 4).

У результаті досліджень впливу суміші розчинів 10-6 моль/л кверцетину та 10-5 моль/л AlCl3 було встановлено статистично вірогідне зниження досліджуваних параметрів скорочення впродовж фаз F2, F3, L1, L2. Максимальне зменшення сили м’язового скорочення відбувалось на 14-ій хвилині впродовж фаз F1, F2 та F3. Максимальне пригнічення вкорочення м’язових волокон відбувалось на 14-ій хвилині експерименту впродовж фаз L1 та L2. Варто відмітити, що окремо взяті речовини у вказаних концентраціях не впливали на параметри м’язового скорочення.

Наступним етапом було дослідження дії 10-5 моль/л розчину кверцетину в комплексі з різними концентраціями хлориду алюмінію на динамічні параметри скорочення пучків м’язових волокон.

Наші досліди показали, що при використанні кверцетину в концентрації 10-5 моль/л та 10-6 моль/л AlCl3 зменшення динамічних характеристик м’язового скорочення відбувалось, починаючи з 2-ї хвилини дії стимулюючого сигналу впродовж усіх функціональних фаз (р<0,05). Вихід сили м’язового скорочення на стаціонарний рівень відбувався на 14-ій хвилині експерименту.

Встановлено, що суміш розчинів 10-5 моль/л кверцетину та 10-5 моль/л AlCl3 істотно пригнічувала розвиток сили та зміну довжини м’язового скорочення, починаючи з 2-ї хвилині дії стимулюючого сигналу (рис. 4). Максимальне зменшення сили м’язового скорочення відбувалось на 14-ій хвилині впродовж фази F1 та на 12-ій та 14-ій хвилині впродовж фаз F2 та F3. Мінімальне вкорочення м’язових волокон відбувалось на 16-ій хвилині експерименту впродовж фаз L1 та L2 (рис. 4).

Таким чином, у результаті досліджень нами було встановлено, що комплекси кверцетину з AlCl3 відзначаються більшою інгібуючою дією на динамічні параметри скорочення впродовж усіх досліджуваних фаз у порівнянні з безпосереднім впливом флавоноїду. Найменш виражені зміни сили м’язового скорочення під впливом досліджуваних комплексів спостерігались впродовж фази F1, а найбільш виражені зміни досліджуваного параметра відбувались впродовж фази F3 порівняно з контролем. При використанні суміші розчинів хлориду алюмінію з 10-6 моль/л кверцетином зміни довжини м’язових волокон були найбільшими впродовж фази L1. При використанні суміші розчинів хлориду алюмінію з 10-5 моль/л кверцетином зміни довжини м’язових волокон були найбільшими впродовж фази L2.

Спільна дія розчинів хлориду алюмінію і рутину на параметри м’язового скорочення. При дослідженні суміші 10-4 моль/л рутину та 10-4 моль/л AlCl3 зміни динамічних параметрів м’язового скорочення впродовж всіх досліджуваних фаз були незначними. Зниження параметрів м’язового скорочення носило лінійний характер (рис. 5). Менші концентрації суміші хлориду алюмінію і рутину не впливали на параметри м’язового скорочення.

Результати наших дослідів показали, що суміш розчину 10-3 моль/л рутину та 10-4 моль/л AlCl3 викликала зменшення сили та зміни довжини м’язового скорочення (рис. 5). Зміни динамічних характеристик м’язового скорочення відбувалися починаючи з 2-ї хвилини дії стимулюючого сигналу.

Вихід сили м’язового скорочення на стаціонарний рівень відбувався на 10-ій хвилині експерименту впродовж фази F1 та на 14-ій хвилині експерименту впродовж фаз F2 та F3, однак ці зміни були статистично невірогідними. Статистично значиме пригнічення вкорочення м’язових волокон за даних умов досягало стаціонарного рівня на 14-ій хвилині експерименту впродовж фаз L1 та L2.

У результаті досліджень впливу суміші розчину 10-3 моль/л рутину та 10-3 моль/л AlCl3 було встановлено істотне зменшення динамічних параметрів м’язового скорочення (рис. 5). Зміни динаміки м’язового скорочення відбувались починаючи з 2-ї хвилини дії комплексу впродовж всіх фаз скорочення. Найменше зниження сили м’язового скорочення відбувалось впродовж фази F1, досягнення стаціонарного стану скорочення відбувалося після 12-ої хвилини дії стимулюючого подразника. Максимальне зниження сили скорочення та зміни довжини відбувалось після 14-ої хвилини спостереження За даних умов спостерігались лінійні залежності між змінами динамічних параметрів скорочення та часом дії використаних речовин (рис. 5).

Таким чином, у результаті досліджень нами було встановлено, що комплекси рутину з AlCl3 відзначаються більшою інгібіторною дією на динамічні параметри скорочення впродовж усіх досліджуваних фаз у порівнянні з окремим впливом використаних сполук. Але інгібіторна дія комплексів рутину з алюмінієм проявляється при більш високих концентраціях порівняно з комплексами кверцетину і алюмінію. Суміші розчинів хлориду алюмінію та рутину викликають поступове постійне зниження величин досліджуваних параметрів скорочення.

При дослідженні комплексів хлориду алюмінію з рутином найменш виражені зміни сили м’язового скорочення спостерігались впродовж фази F1, а найбільш виражені зміни відбувались впродовж фази F3 порівняно з контролем. При використанні суміші усіх досліджуваних розчинів хлориду алюмінію з 10-4 та 10-3 моль/л рутином вкорочення м’язових волокон було мінімальним впродовж фази L1. Відмінності динамічних показників впродовж різних функціональних фаз скорочення можна пояснити існуванням різних молекулярних механізмів на до- та післятетанічних ділянках скорочення. Можна припустити, що скорочення м’язових волокон зі стану спокою відбувається інакше порівняно зі скороченням викликаним зі стану напруження волокна. Якщо аналізувати отримані результати в рамках концепції скорочення за рахунок вкручування міозинових філаментів в трубкоподібні структури утворені актиновими філаментами [Мірошниченко, 1982; Мірошниченко, Шуба, 1990], то такий результат є очікуваним. В стані спокою голівки молекул міозину містять АТФ і готові (“заряджені”) для здійснення скорочення. Фаза F2 відповідає принципово іншому стану м’яза, коли вже відбулося взаємне переміщення актинових і міозинових філаментів. Тому підтримка сили на одному рівні є передбачуваною так як між міозиновими і актиновими філаментами вже існує стабільний зв’язок.

Специфічна дія використаних реагентів на різні етапи скорочення свідчить про складний характер ізотонічного скорочення скелетного м’язу, передбачуваний в рамках наведеної вище концепції скорочення.

Таким чином, результати наших досліджень свідчать про те, що флавоноїди, хлорид алюмінію та їх комплекси по-різному впливають на динамічні параметри скорочення скелетного м’язу впродовж всіх функціональних фаз. В дослідженому діапазоні концентрацій використані речовини концентраційно залежно пригнічували генерацію сили та вкорочення м’язових волокон жаби. Зниження показників генерації сили та вкорочення м’язових волокон в часовому інтервалі спостереження та протягом кожного окремого перебігу відбувалося постійно і у більшості випадків носило лінійний характер. Встановлено, що динамічні параметри скорочення зазнавали найменшого впливу впродовж фаз дотетанічного скорочення. Отримані нами експериментальні дані, можна пояснити впливом даних сполук як на примембранні процеси, так і на здатність цих речовин та їх комплексів проникати крізь плазматичну мембрану в клітину і в такий спосіб впливати на АТФазну активність актоміозинового комплексу саркомеру. При цьому важливо зазначити, що кверцетин в усіх описаних випадках проявляв значно більшу активність порівняно з рутином в силу особливостей молекулярної будови даних речовин.

ВИСНОВКИ

Кверцетин, рутин, та їх комплекси з хлоридом алюмінію, а також хлорид алюмінію впливають на динамічні параметри скорочення пучків волокон скелетного м’язу m. tibialis anterior жаби Rana temporaria, викликаючи пригнічення скоротливих процесів. Показано, що кверцетин і його комплекс з алюмінієм є більш активним інгібітором ізотонічних скорочень скелетних м’язів порівняно з рутином.

Встановлено нерівномірний вплив використаних сполук на силову відповідь та характер вкорочення м’язових волокон. Абсолютна величина зміни довжини м’язових волокон під впливом кверцетину, рутину, хлориду алюмінію та їх комплексів є більшою, ніж величина змін силової відповіді м’язових скорочень.

Максимальні зміни силової відповіді м’язових волокон при дії рутину, кверцетину, хлориду алюмінію та їх комплексів відбуваються на післятетанічних фазах скорочення, а найменші - на дотетанічних його етапах.

Кверцетин, рутин, та їх комплекси з хлоридом алюмінію, а також хлорид алюмінію максимально змінюють довжину м’язових волокон на дотетанічних етапах скорочення.

Встановлена взаємопосилююча інгібуюча дія комплексів кверцетину та рутину з хлоридом алюмінію.

Зростання концентрацій хлориду алюмінію при сталих концентраціях флавоноїдів збільшує часову затримку у встановлені рівноважного стаціонарного стану скорочення.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Мельничук О.М., Ноздренко Д.М., Мірошниченко М.С. Вплив різних концентрацій кверцетину на динамічні параметри скорочення м’язових волокон жаби в ізотонічному режимі // Фізика живого. – 2004. – Вип. 12. - № 2. – С. 83-91. (Особистий внесок здобувача – проведення експерименту та статистична обробка результатів, підготовка матеріалів до друку).

Мельничук О.М., Ноздренко Д.М., Мірошниченко М.С. Вплив кверцетину на параметри скорочення м’язових волокон жаби в ізотонічному режимі // Вісник КНУ, Біологія. - 2004. - Вип. 42-43. - С. 69-70. (Особистий внесок здобувача – проведення експерименту, графічне зображення, підготовка матеріалів до друку).

Мельничук О.М., Ноздренко Д.М., Мірошниченко М.С. Динаміка відновлення параметрів скорочення м’язових волокон після дії розчину кверцетину // Вісник КНУ, Біологія. - 2005. - Вип. 45-46. - С. 15-17. (Особистий внесок здобувача – літературний пошук, проведення експерименту, статистична обробка результатів, підготовка матеріалів до друку).

O.M. Melnichuk, Nozdrenko D.M. Effect of Quercetin on dynamic characteristics of the frog muscle fibers contraction under isotonic condition // International symposium of biological motility, Pushchino. – 2004. – P. – 139-140.

O.M. Melnichuk, D.M. Nozdrenko, M.S. Miroshnichenko. Effect of quercetin on the dynamics of isotonic contraction of frog muscle fibres // Proceeding of the Second International Symposium “Smooth Muscle Physiology and Biophysics”/ Neurophysiology. – 2003. - Vol. 35. - № 3/4. – P. 359.

Мельничук О.М., Ноздренко Д.М. Інгібуюча дія кверцетину на скорочення скелетного м’язу жаби в ізотонічному режимі // Установчий з’їзд Українського товариства клітинної біології. – 2004. – С. 171.

Мельничук О.М., Ноздренко Д.М. Зміна параметрів скорочення м’язових волокон в результаті відмивання розчину кверцетину // Матеріали IV всеукраїнської наукової конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні”. – 2004. – С. 37-39.

АНОТАЦІЯ

Мельничук О.М. Вплив рутину, кверцетину та їх комплексів з алюмінієм на динаміку скорочення скелетного м’язу жаби. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2006.

В дисертації викладені результати експериментального вивчення впливу флавоноїдів, зокрема, кверцетину, рутину та їх комплексів з алюмінієм на динаміку скорочення пучків волок скелетного м’язу m. tibialas anterior жаби Rana temporaria. Експерименти виконані з використанням методу тензометрії. В процесі проведення експерименту фіксували силу скорочення, зміну довжини м’язових волокон, температуру омиваючого розчину, а також параметри стимулюючого сигналу. Було досліджено зміни динамічних параметрів м’язового скорочення впродовж фаз тетанічного утримання стаціонарного стану та на до- і післятетанічних ділянках. Встановлено, що досліджувані речовини впливають на розвиток силової відповіді та зміну довжини м’язових волокон. Показано нерівномірний вплив розчинів флавоноїдів, хлориду алюмінію та їх комплексів на силову відповідь та вкорочення м’язових волокон. Встановлено, що кверцетин є більш активним інгібітором ізотонічних скорочень скелетних м’язів порівняно з рутином. Дія розчинів кверцетину та рутину пригнічує зміну довжини м’язових волокон протягом всього скоротливого процесу, в той же час зміни сили скорочення значно відрізнялися впродовж досліджуваних фаз скорочення. Найменший вплив на генерацію силової відповіді м’язових волокон спостерігався впродовж фаз дотетанічного скорочення. Максимальні зміни силової відповіді відбувались на тетанічних та післятетанічних фазах скорочення. Виявлена концентраційна залежність синергетичної інгібуючої дії досліджуваних флавоноїдів в комплексі з алюмінієм.

Ключові слова: кверцетин, рутин, м’язове скорочення, динамічні параметри, скелетний м’яз, тензометрія.

АННОТАЦИЯ

Мельничук О.М. Влияние рутина, кверцетина и их комплексов с алюминием на динамику сокращения скелетной мышци лягушки. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2006.

Диссертация посвящена изучению влияния флавоноидов, в частности, кверцетина, рутина и их комплексов с алюминием на динамику сокращения пучков волокон скелетной мышци m. tibialas anterior лягушки Rana temporaria. Эксперименты производились с использованием метода тензометрии. В процессе проведения эксперимента фиксировали силу сокращения и изменения длины мышечных волокон, температуру омывающего раствора и параметры стимулирующего сигнала. Продемонстрированы характеристические кривые изменений показателей динамических параметров сокращения мышечных волокон в зависимости от концентрации используемых веществ.

Изучены изменения динамических параметров мышечного сокращения на протяжении фаз удержания тетанического стационарного состояния, на до- и послететанических участках. Установлено, что используемые вещества влияют на развитие силового ответа и изменения длины мышечных волокон. Показано, что флавоноиды вызывают угнетение сократительных процессов.

Показано неравномерное влияние растворов флавоноидов, хлорида алюминия и их комплексов на силовой ответ и укорочение мышечных волокон. Изменения длины мышечных волокон при использовании флавоноидов, хлорида алюминия и их комплексов были более выражены по сравнению с изменениями силы сокращения. Установлено, что кверцетин, сравнительно с рутином, более активный ингибитор изотонических сокращений скелетных мышц. Следует отметить, что с увеличением концентрации кверцетина, наблюдались ярко выраженные флуктуации соответствующих уровней генерации силы и длины волокон на тетаническом участке сокращения. Флуктуации изменения длины волокон начинались раньше, по сравнению с флуктуациями изменений силы мышечного сокращения.

Действие растворов кверцетина и рутина угнетает изменение длины мышечных волокон на всем протяжении сократительного процесса, в то же время изменения силы сокращений значительно отличались на протяжении исследуемых фаз. На дотетанических фазах сокращения ингибирование силового ответа мышечных волокон было минимальным. На тетанических и послететанических фазах сокращения происходили максимальные изменения силового ответа. Показана концентрационная зависимость синергетического ингибирующего действия исследуемых флавоноидов в комплексе с алюминием.

Ключевые слова: кверцетин, рутин, мышечное сокращение, динамические параметры, скелетная мышца, тензометрия.

SUMMARY

Melnichuk O.M. Effect of rutin, quercetin and their complexes with aluminum on dynamic characteristics of the frog muscle fibers contraction. – Manuscript.

The dissertation for the scientific degree of candidate of biological sciences in speciality 03.00.02. – biophysics. Taras Shevchenko Kiev National University, Kiev, 2006.

This work