УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

“ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ”

Медвідь Ольга Олександрівна

УДК 619:616.98:616.682-002:579.882.11:615.371

РОЗРОБКА ЗАСОБІВ СПЕЦИФІЧНОЇ ПРОФІЛАКТИКИ

БРУЦЕЛАОВІСНОЇ ТА ХЛАМІДІЙНОЇ ІНФЕКЦІЙ

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків - 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному науковому центрі “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” УААН.

Науковий керівник

доктор ветеринарних наук, професор Бабкін Анатолій Федорович, Національний науковий центр “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” УААН, завідувач лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби.

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки Автономної Республіки Крим Ковальов Василь Львович, Південний філіал “Кримський агротехнологічний університет” Національного аграрного університету, завідувач кафедри епізоотології, паразитології та ветсанекспертизи;

кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник Стеценко Володимир Іванович, Національний науковий центр “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” завідувач відділу вірусології;

Провідна установа

Харківська державна зооветеринарна академія Міністерства аграрної політики України, кафедра епізоотології та ветеринарного менеджменту, смт. Мала Данилівка, Дергачівський район, Харківська область.

Захист відбудеться “23” січня 2007 р. о 9.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01. у Національному науковому центрі “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою: м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного наукового центру “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою: м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “22” грудня 2006 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради

доктор ветеринарних наук,

професор Бабкін А.Ф.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед інфекційних хвороб, які завдають економічних збитків вівчарству, значне поширення мають хламідійна та бруцелаовісна інфекції (Хамадеев Р.Х.,1983, 1986; Ковальов В.А. 1975, 2003, Бабкін А.Ф. і інші, 1986, 1999; Дейнеш А., 1992; Мельніченко В. і інші 1998; Караваев Ю.Д. 1999; Rodolakis A., 1999; Красиков А.П., 2002; OIE, 5 еdition, 2004). Досить часто перебіг цих захворювань проходить, як змішана інфекція, що набагато посилює епізоотичний та інфекційний процеси, збільшує неплідність поголів’я і загибель приплоду, ускладнює діагностику і профілактику захворювань, негативно впливає на ефективність проведення протиепізоотичних заходів. Існують програми боротьби з хламідійною та бруцелаовісною інфекціями з використанням повторних серологічних досліджень і забою реагуючих тварин, але вони пов’язані зі значними економічними витратами і нерідко малоефективні на великих вівцефермах (Руденко А.Ф. 1986; Бабкін А.Ф., 1998; Караваев Ю.Д., 1999; Хамадеев Р.Х., 1999). Разом з тим є повідомлення про використання в системі боротьби з зазначеними хворобами живих та інактивованих вакцин (Фірсова Г.Д., 1981; Попов Г., 1985; Bailly K.M., 1987; Marin C.M. et. al., 1990; Абалхаиров Г.Ш., 1991; Jones C.E. et. al., 1995; Касымов Т.К. 1998; Гнедой С.Н., 1999; Щербань Г.П., 1999; Караваев Ю.Д., 2000; Хамадеев Р.Х., 2002; Бабкін А.Ф. та ін., 2002). Відомо також про розробку комбінованих вакцин для профілактики паратифозної і хламідійної пневмонії у ягнят, бруцельозу та хламідіозу великої рогатої худоби, хламідіозу та Q- лихоманки (Батурина О.Ш., 1986; Жила М.Е., 1990; Нальотов Н.И. 1998; Амирбеков М,А., 1999; OIE, 5 еdition, 2004).

До проведення наших досліджень не було повідомлень про застосування комплексного щеплення моновакцин або виготовлення та випробування бівакцини проти хламідійної та бруцелаовісної інфекцій. Наукове і практичне значення набуває розробка і застосування комплексної системи боротьби з обома хворобами. У зв’язку з зазначеним необхідно було з’ясувати питання нешкодочинності, тератогенності та імунологічних взаємовідносин антигенів збудників після комбінованого щеплення, а також визначити ефективні дози компонентів у біемульсин-вакцині для формування імунної відповіді та захисту тварин від зараження. Вирішенню цих актуальних завдань і присвячена наша робота.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у відповідності до завдань Тематичного плану науково-дослідних робіт Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН: “Удосконалити систему і засоби контролю епізоотичної ситуації по бруцельозу тварин в Україні” (1996 – 2000), держреэстрація № 0197U00757 і “Розробити та впровадити сучасні засоби і методи діагностики й профілактики бруцелаовісної, кампілобактерійної і хламідійної інфекцій” (2001 – 2005), держреэстрація № 0101U001610.

Мета і завдання дослідження. Мета наукових досліджень – теоретично і експериментально обґрунтувати комбіноване щеплення інактивованих емульсин-вакцин проти інфекційного епідидиміту баранів та хламідійної інфекції, розробити і випробувати експериментальні зразки інактивованої біемульсин-вакцини проти бруцелаовісної та хламідійної інфекцій.

Для досягнення поставленої мети на вирішення були поставлені такі задачі:

· провести патентний пошук та вивчення літературних джерел щодо теми дисертації

· провести клініко-епізоотологічні і серологічні дослідження на хламідійну та бруцелаовісну інфекції вівцегосподарств з низьким рівнем відтворення, виділити та ідентифікувати збудника хвороби;

· застосувати полімеразну ланцюгову реакцію для ідентифікації ДНК-хламідій в польових ізолятах збудника хламідіозу овець на жовткових міхурах курячих ембріонів;

· порівняльно дослідити ступінь імуногенності інактивованих вакцин вітчизняного і зарубіжного виробництва проти бруцелаовісної та хламідійної інфекцій в експерименті на морських свинках;

· вивчити сероконверсію на бруцелаовісний і хламідійний антигени в дослідах на морських свинках та вівцях при комплексному введенні вакцин вітчизняного і зарубіжного виробництва;

· виготовити і дослідити антигенність і імуногенність експериментальних серій інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів з штаму Brucella ovis 67/Б;

· виготовити і дослідити на стерильність, нешкодочинність, тератогенність, реактогенність та імуногенність експериментальні зразки інактивованої біемульсин-вакцини проти хламідійної та бруцелаовісної інфекцій;

· застосувати ПЛР для контролювання інактивованих моно - та комбінованих вакцин на ДНК хламідій;

· розробити лабораторний регламент на виготовлення, контроль та застосування інактивованої біемульсин-вакцини проти хламідійної та бруцелаовісної інфекцій.

Об’єкт дослідження. Бруцелаовісна і хламідійна інфекції овець, специфічна профілактика.

Предмет дослідження. Хламідійна та бруцелаовісна інфекції у проблемних щодо відтворення поголів’я овець фермах, ступінь поширення захворювання, виділення та ідентифікація збудника інфекції; антигенність та імуногенність вітчизняних і зарубіжних вакцин проти хламідіозу овець і інфекційного епідидиміту баранів; виготовлення і дослідження експериментальних серій інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів і біемульсин-вакцини проти хламідійної та бруцелаовісної інфекцій.

Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи використано: методи ретроспективного епізоотологічного аналізу і клініко-епізоотологічного обстеження, методи серологічного і бактеріологічного дослідження, метод біологічного експерименту на лабораторних та сільськогосподарських тваринах, методи культивування збудників хламідіозу на курячих ембріонах та збудників бруцелаовісної інфекції на штучних поживних середовищах, полімеразна ланцюгова реакція, метод статистичного аналізу результатів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше теоретично і експериментально обґрунтовано комбіноване щеплення інактивованих емульсин-вакцин проти бруцелаовісної і хламідійної інфекцій, розроблено інактивовану біемульсин-вакцину проти зазначених інфекцій, виготовлено і випробувано з позитивним результатом експериментальні серії біемульсин-вакцини і інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного-епідидиміту баранів у порівнянні з зарубіжними аналогами. Виготовлені експериментальні серії вакцини були нешкодочинними, малореактогенними та імуногенними в дослідах на морських свинках та вівцях. Гуморальний імунітет формувався на 14 – 30 добу після щеплення, протективний імунітет на 30-ту добу проти обох збудників. Захист тварин, щеплених біемульсин-вакциною проти експериментального зараження вірулентною культурою Brucella ovis був в межах 80 – 100 %, при інфікуванні у інтактному контролі 80 – 100 % тварин. Ступінь захисту через 9,5 місяців після щеплення біемульсин-вакциною становив 100 %. Після ревакцинації баранів через 9,5 місяців інактивованою біемульсин-вакциною протективний титр антихламідійних антитіл 1:16 - 1:128 (2,6 ± 0,68 log2) та захист проти експериментального зараження культурою Brucella ovis виявлено у 100 % щеплених тварин.

Імуногенна ефективність інактивованої біемульсин-вакцини забезпечувалася поєднанням інактивованої емульсин-вакцини з елементарними тільцями хламідій в концентрації 106,5 – 10 7,9 ЕЛД50 та інактивованої суспензії клітин збудника Brucella ovis у кінцевій концентрації 5,0 Ч 109 м.к./см3.

Розробка вакцини захищена патентом України на винахід корисної моделі “Інактивована біемульсин-вакцину проти хламідійної та бруцелаовісної інфекцій” №. 8006, 15.07.2005.

Практичне значення одержаних результатів. На підставі клініко-епізоотологічних і серологічних досліджень встановлено роль бруцелаовісної і хламідійної інфекцій у зниженні рівня відтворення в досліджених вівцегосподарствах. Показано стабільність імуногенності штаму Br. ovis в складі інактивованої емульсин-вакцини проти ІЕ баранів у порівнянні з зарубіжним аналогом. Визначено параметри виготовлення і контролю інактивованої біемульсин-вакцини проти хламідійної та бруцелаовісної інфекцій на основі використання інактивованої суспензії культури Brucella ovis штаму 67/Б та інактивованої емульсин-вакцини проти хламідійного аборту ВРХ, овець, кіз та свиней ТУУ 10.02.01.270-91, або інших аналогічних хламідійних вакцин, зокрема фірми “Sanofi”. Розроблено лабораторний регламент на виготовлення і контроль та настанову з застосування інактивованої біемульсин-вакцини проти хламідійної та бруцелаовісної інфекцій, які розглянуті і схвалені методичною комісією ІЕКВМ та затверджені директором ІЕКВМ протокол № 9 від 10.10.2005. Застосування біемульсин-вакцини рекомендується в системі оздоровлення вівцеферм, неблагополучних на поєднану інфекцію з метою зменшення економічних збитків і поліпшення відтворювання поголів’я.

Особистий внесок здобувача полягає у аналізі літературних джерел та патентів, виборі напрямків досліджень, проведенні клініко-епізоотологічних обстежень, серологічних та мікробіологічних досліджень, виготовленні експериментальних зразків біемульсин-вакцини та емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів, в плануванні і проведенні біологічних експериментів на морських свинках та вівцях, бактеріологічних, серологічних досліджень експериментальних тварин, статистичній обробці та аналізі первинних документів, узагальненні отриманих результатів та формулюванні висновків.

Виготовлення і контроль експериментальних серій інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів проведено на підставі “Лабораторного регламенту виготовлення і контролю інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів” (А.Ф. Бабкін., С.М. Орлов, 2004). Дослідження хламідійних вакцин методом ПЛР проведено разом з кандидатом ветеринарних наук Ксьонзом І.М., за що ми йому щиро вдячні.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися й обговорювалися на 5-му з’їзді паразитоцинологів України “Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини (м. Харків. - ХЗВІ, ХДМУ, 2001р.)”; Міжнародних науково-практичних конференціях: “ІЕКВМ – 80 років на передовому рубежі ветеринарної науки” (м. Харків, ІЕКВМ, 2002 р.); “Актуальні проблеми ветеринарної медицини в умовах сучасного ведення тваринництва” (м. Феодосія, 2003 р.); “Ветеринарна медицина – 2004: сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів” (м. Феодосія, 2004 р.); міжнародна науково-практична конференція “Ветеринарна медицина – 2005: сучасний етап та актуальні проблеми забезпечення ветеринарного благополуччя тваринництва” (м. Ялта, 2005 г.), засіданнях і звітних сесіях вченої ради ІЕКВМ УААН в 2000 – 2005 рр.; засіданнях методичної комісії ІЕКВМ УААН; міжлабораторному засіданні наукових співробітників і фахівців ННЦ “ІЕКВМ” 27 липня 2006 р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 наукових праць у фахових виданнях та отримано патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, напрямків, матеріалів та методів дослідження, результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, пропозицій виробництву та додатків. Основний зміст викладено на 160 сторінках комп’ютерного тексту, в 15 таблицях та 2 рисунках і 2 фотографіях. Список використаних джерел включає 263 найменування в тому числі 105 іноземних.

НАПРЯМКИ, МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дисертаційна робота виконана впродовж 2000 – 2005 рр. в лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби Національного наукового центру "Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини", а також у господарствах Полтавської і Харківської області.

Виходячи з поставленої мети та вирішення поставлених задач нами вибрано такі основні напрямки досліджень:

· теоретично та експериментально обґрунтувати комбіноване щеплення інактивованих вакцин проти бруцелаовісної та хламідійної інфекцій,

· розробити технологію виготовлення та випробувати на лабораторних тваринах і вівцях експериментальні серії інактивованої біемульсин-вакцини проти хламідійної і бруцелаовісної інфекцій.

Теоретичне обґрунтування комбінованого застосування щеплень проти хламідійної і бруцелаовісної інфекцій базується на даних літературних джерел та патентах щодо виготовлення комбінованих вакцин, широкого розповсюдження зазначених інфекцій серед вівцепоголів’я у різних країнах світу, зокрема в Україні. Для обґрунтування актуальності та практичної доцільності розробки комбінованого щеплення проти бруцелаовісної і хламідійної інфекцій нами також використано результати епізоотологічного, серологічного, бактеріологічного досліджень на хламідіоз та інфекційний епідидиміт баранів.

Для виконання поставлених завдань в роботі використано:

· виготовлені нами за лабораторним регламентом експериментальні серії інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів (Національний науковий центр “Інститут експериментальної та клінічної ветеринарної медицини”), серії 4, 6, 6.1, 7, 7.1;

· інактивовану емульсин-вакцину “ЕВАК” проти інфекційного епідидиміту баранів (Всеросійський інститут експериментальної ветеринарії), серія 10;

· інактивовану емульсин-вакцину проти хламідійного аборту ВРХ, овець, кіз та свиней ТУ У 10.02.01.270.91 (Сумська державна біофабрика), серії 2, 4;

· вакцину проти хламідіозу ВРХ та ДРХ культуральну інактивовану (Північно-Кавказький зональний науково-дослідний ветеринарний інститут, ООО “БЛИЦ”), серія 4;

· інактивовану культуральну емульсин-вакцину проти хламідіозу тварин (Всеросійський інститут експериментальної ветеринарії, Армавірська біофабрика), серія 6;

· інактивовану вакцину проти хламідіозу овець з масляним ад’ютантом Phylaclam vakcina ad us.vet (inaktivelt, olayjal odjuvalt) (фірма Sanofi), серія Cy.sz: 0103f1;

ад’юванти: Montanide ISA-70 (Франція), масляний ад’ювант “ФГУ ВНИИЗЖ” (Росія, ФГУ “Федеральний центр охорони здоров’я тварин”), штами збудника бруцелаовісної інфекції: B. оvis 67/Б, B. оvis 65939, B. оvis 65 – і, штами хламідій: Chlamydophila abortus Зд 01.10, Зд 01.02, курячі ембріони 6-ти добового віку – 106 шт., лабораторні тварини: морські свинки – 248 гол., білі миші – 20 гол., вівці 41 гол.

Для виготовлення інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів або інактивованої біемульсин-вакцини проти хламідійної та бруцелаовісної інфекції використано вакцинний штам B. оvis 67/Б, що депонований в ДНКІБШМ № 219, патент № 51379 А. Дослідження протективних властивостей вакцин проведено шляхом зараження вірулентними штами B. оvis 65939 – референтний, який отримано з ВДНКІ у 1973 році та штам B. оvis 65 – і епізоотичний, виділений нами в 2000 році від барана. Культурально-біохімічні властивості штамів досліджували згідно методик, рекомендованих ФАО/ВОЗ (1986) та МЕБ (2004).

Морфологічні і тинкторіальні властивості культур B. оvis вивчали під імерсійною системою мікроскопу ( 90) у мазках, пофарбованих за методом Грама, Козловського. Стабільність штаму і характеристику однорідності колоній у популяції вивчали за допомогою стереоскопу МБС-2 на 3 – 4 - добових агарових культурах, пофарбованих за Уайт-Вільсоном 0,05% розчином кристалвіолету протягом 30 секунд в чашках Петрі. Біологічні властивості визначали за такими показникам: продукція сірководню (H2S), ріст на твердих поживних середовищах з основним фуксином (1:50000) або тіоніном (1:50000), аглютинація з 0,2 % розчином трипофлавіну, термоаглютинація суспензії бактерій у концентрації 2 Ч 109 м.к./см3 при 90 0С впродовж 45 хвилин. Антигенні властивості досліджували в пластичній реакції аглютинації (РА) із S- та R- бруцельозними сироватками виробництва НВО “Ріверс” та ДП “Ветмедицина” за “Настановою по діагностиці бруцельозу тварин” К., 1998”. Постановку РА на скельцях з живими культурами проводили за загально прийнятою методикою з візуальним обліком при косому освітленні знизу від освітлювача ОІ-19 або під стереоскопічним мікроскопом МБС-2 із додержанням правил особистої безпеки.

Постановку РІД проводили за методикою згідно “Настанови по застосуванню набору компонентів для серологічної діагностики інфекційного епідидиміту баранів в реакції імунодифузії”, 1996, з використанням “Набору компонентів для серологічної діагностики ІЕ баранів у реакції імунодифузії” (ТУ У 46.15.127 – 96), виробництва ДП “Ветмедицина” ІЕКВМ. РТЗК з бруцелаовісним антигеном ставили за методикою, яка викладена в “Настанові по діагностиці бруцельозу тварин” (1998) з використанням комерційного набору компонентів для серологічної діагностики інфекційного епідидиміту баранів в РТЗК (ТУ У 46.15.059 – 95), виготовленого в ДП “Ветмедицина”. Реакцію зв’язування комплементу у серологічних дослідженнях на хламідійну інфекцію ставили згідно загальноприйнятої методики, яка викладена в “Настанові по діагностиці хламідіозів сільськогосподарських тварин” (1995) з використанням комерційних наборів із ліофілізованими антигенами й контрольними сироватками, виготовленими на Херсонській біофабриці або ВНИТИБТ, Російська академія сільськогосподарських наук (2002). При постановці серологічних реакцій у своїй роботі ми застосовували сухий комплемент морської свинки і гемолітичну сироватку, виготовлену на ЗАО “Біолек”, м. Харків, та ДП “Ветмедицина”, в робочих титрах згідно попередньої титрації.

Полімеразну ланцюгову реакцію проводили разом з І.М. Ксьонзом (Інститут свинарства ім. Квасневского), ряд дослідів проведено спільно з ООО “Виролла” з використанням набору реагентів “Полімік”, призначеного для діагностики хламідіозу людини.

У серологічних реакціях досліджено 5450 проб сироваток крові в 6 - 8 розведеннях з хламідійним, бруцелаовісним та бруцельозним антигенами від тварин різних статево-вікових груп (вівцематок, баранів-плідників, ремонтного молодняку) з 5 господарств. Методики проведення біологічних експериментів на морських свинках та вівцях детально викладені у відповідних розділах результатів власних досліджень.

Статистичну обробку одержаних даних проводили у комп’ютерній програмі “Stat SF”, розробленій в ННЦ “ІЕКВМ”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Клініко-епізоотологічні і серологічні дослідження на хламідійну та бруцелаовісну інфекції вівцепоголів’я ферм. Виділення та ідентифікація збудника хвороби. Проведений ретроспективний аналіз стану відтворення вівцепоголів’я в господарствах Полтавської області за період 2001 – 2005 рр. свідчить про тенденцію різкого зменшення поголів’я овець, на початок 2001 р. поголів’я овець становило 10,4 тис. гол., у 2004 р їх кількість скоротилася на 3,1 тис. гол (29,8 %). Вихід приплоду ягнят на 100 маток в 2001 р. становив 83 %, в 2004 спостерігалося зниження показника отримання приплоду до 68 %.

Нами було досліджено 1360 проб крові з двох вівцегосподарств в Полтавській області на хламідійну та бруцелаовісну інфекцію, які вирощують каракульські породи овець (сокільську та решетилівську). Середній показник отримання ягнят на 100 маток в період з 2001 по 2004 рр. становив в першому господарстві 62 – 68%, в другому 31 – 35%, відповідно. У 2001 р в господарстві № 1 серед дослідженого дорослого поголів’я виявлено позитивно реагуючих на хламідіоз 10,1 % і 9,1 % серед молодняку віком до 1 року, в другому господарстві позитивні результати отримані у 30,5% маточного поголівя та 47,62% молодняку. Серологічним обстеженням 1094 гол. вівцематок та баранів-плідників в господарстві № 3 виявили в РЗК з хламідійним антигеном 204 (25 %) позитивно реагуючих вівцематок, в РТЗК з бруцелаовісним антигеном 45 гол. (4,5 %), одночасно на хламідіоз та інфекційний епідидиміт баранів позитивно реагувало 7,22%. В обстежених отарах протягом багатьох років реєструвалися випадки абортів, народження мертвих і нежиттєздатних ягнят. Проведені нами серологічні дослідження на хламідійну та бруцелаовісну інфекції в 2000 р. вівцепоголів’я (порода прекос) в двох господарства “С” та “І” Харківської області свідчать про поєднаний перебіг цих захворювань: в господарстві “С” з 641 проби від дорослого поголів’я позитивно з бруцелаовісним антигеном в РТЗК реагувало 28 гол. (4,4 %), з хламідійним антигеном в РЗК – 103 гол. (16 %) поєднаний перебіг хламідійної та бруцелаовісної інфекції виявили в 18 гол., в господарстві “І” на інфекційний епідидиміт баранів позитивно реагувало 1,4 %.

Нами виділено культуру хламідій на 6 – 7 - добових курячих ембріонах з абортплоду та лімфатичних вузлів вівцематки, що абортувала з вівцегосподарства № 3. Ізолят Зд 01.02 з абортплоду мав більш високий рівень патогенності. На першому пасажі загибель ембріонів становила 12,5 %, на другому 25,0 % та 83,3 % на третьому. На 4-му пасажі загибель КЕ становила 100 % на 5 – 9 добу після зараження. Ізолят Зд 01.10, виділений з лімфатичного вузла вівцематки, що абортувала, мав дещо нижчі показники патогенності: на першому пасажі загибель ембріонів не відбулася, далі показник загибелі зростав в другому і третьому пасажах 25,0 % та 66,6 %. В четвертому пасажі показник загибелі ембріонів знизився до 20,0%, на п’ятому пасажі загибель досягла 83,3 %. Після зараження білих мишей внутрішньоочеревенно 10 % суспензією інфікованих жовткових міхурів ізоляту Зд 01.02 загинуло 70 %, Зд. 01.10 - 50 % тварин. В мазках-відбитках з селезінки, печінки та нирки, пофарбованих за Романовським-Гімза та Здродовським, виявили внутрішньоклітинні та позаклітинні скупчення елементарних тілець хламідій. При досліджені зразків ізолятів хламідій Зд 01.02 та Зд 01.10 у полімеразній ланцюговій реакції ідентифіковано ДНК хламідій (Chlamydia spp – родинна ДНК) з використанням набору реагентів “Полімік”, призначеного для діагностики хламідіозу людини. З надміхуркової залози баранчика з вівцегосподарства “І” нами виділено культуру Br. ovis 65 – і, яка мала типові морфологічні та культуральні характеристики і ідентифікована в пластинчатій реакції аглютинації з R – родо і видоспецифічними бруцелаовісними сироватками. В дослідах на 12 морських свинках після підшкірного зараження в дозах 2 Ч 106 м.к./см3 - 2 Ч 109 м.к./см3 індекс інфікованості становив 62 - 82,2 %.

Виготовлення і порівняльне дослідження антигенності і імуногенності інактивованих вакцин проти інфекційного епідидиміту баранів. За лабораторним регламентом нами виготовлено 5 експериментальних мікросерій інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів з штаму Br. оvis 67/Б. Виготовлені серії інактивованої емульсин-вакцини були стерильними, нешкодочинними, малореактогенними. В дослідах на 54 морських свинках встановлено слабку реактогенність, на місці підшкірного введення вакцин в дозі 0,5 см3 спостерігали незначний набряк та формування гранульом. Імунна відповідь після вакцинації виявлена при дослідженні через 14 діб: після щеплення серії 4 антитіла виявили у 88,6 % тварин у титрі 6,2 ± 1,33 log2, серії 6 у 2 морських свинок 0,66 ± 0,14 log2, у серій 6.1, 7 та 7.1 у 100 % тварин у титрі 2,0 ± 0,36 log2, 2,77 ± 0,34 log2, 3,44 ± 0,41 log2, відповідно. На 30 добу після щеплення встановлено зростання титру бруцелаовісних антитіл: 4,8 ± 1,03 log2, 2,16 ± 0,38 log2, 3,0 ± 0,53 log2, 3,77 ± 0,45 log2, відповідно. У щеплених морських свинок не виявлено антитіл на бруцельоз в пластичній реакції аглютинації з бруцельозним роз бенгал антигеном (РБП), що являється позитивною характеристикою інактивованої емульсин-вакцини проти ІЕ баранів з штаму 67/Б.

Після експериментального зараження щеплених тварин титр антитіл по групах суттєво не змінився, що свідчило про відсутність інфекційного процесу, в контрольних групах виявлено постінфекційний титр антитіл: 3,2 ± 0,69 log2, 3,33 ± 0,59 log2 і 1,13 ± 0,15 log2. Бактеріологічні дослідження лімфатичних вузлів (шийних, пахових, тазового) та селезінки морських свинок через 35 діб після зараження культурою Br. ovis свідчили, що всі морські свинки, щеплені вакциною серії 4 та серій 7 і 7.1, були імунними. Вакцина серії 6 та 6.1 також забезпечила у 100 % щеплених тварин імунітет проти генералізованої експериментальної інфекції але заражаючу культуру Br. ovis виділено з регіонального лімфатичного вузла на місці введення культури у однієї морської свинки з групи. В першій контрольній групі культура заражаючого штаму Br. оvis 65939 виділена в 5 тварин (100 %), індекс інфікованості 16,7 %; в другій - культуру заражаючого штаму Br.оvis 65-і виділено у 83,3 %, індекс інфікованості 27,8 %, в третій - Br. оvis 65-і виділено у 75 % тварин, індекс інфікованості 26,7 %.

Після щеплення морських свинок зарубіжною емульсин-вакциною “ЕВАК” титр бруцелаовісних антитіл на 14 - 30 добу становив 4,67 ± 1,37 log2. Через 35 діб щеплених та контрольних морських свинок заразили підшкірно вірулентним штамом Br. ovis 65-і в дозі 2 Ч 109 м.к./см3. У групі морських свинок, щеплених вакциною “ЕВАК”, бруцелаовісні антитіла встановили в титрі 1,2 ± 0,6 log2, в контрольній групі – 3,33 ± 0,59 log2. Бактеріологічні дослідження лімфатичних вузлів та селезінки морських свинок свідчать, що всі морські свинки, щеплені інактивованою емульсин-вакциною “ЕВАК”, мали протективний імунітет. В контрольній групі культура заражаючого штаму Br. оvis 65-і виділена у 5 (83,3 %) тварин з індексом інфікованості 27,8 % (Табл. 1).

Дослідження антигенності та імуногенності інактивованих вакцин проти хламідіозу овець. Імуногенні властивості хламідійних вакцин на рівні доклінічних випробувань визначали за серологічними показниками сироватки крові щеплених лабораторних тварин (морських свинок) в реакції зв’язування комплементу. Згідно ТУ У 10.02.01.270.91, хламідійна вакцина вважається імуногенною, якщо на 30 добу після щеплення морських свинок титр хламідійних антитіл ? 1:16 виявлено не менше, ніж у 50 % тварин. Нами проведено дослід на 30 морських свинках з двома серіями комерційної вакцини виробництва Сумської державної біофабрики, однією серією вакцини виробництва ООО “БЛИЦ”, Російська Федерація та однією серією вакцини виробництва фірми “Sanofi”, Угорщина. В групах морських свинок після щеплення ембріональними емульсин-вакцинами проти хламідійного аборту Сумської державної біофабрики та фірми “Sanofi” в дозі по 0,5 см3 підшкірно на 30 добу в РЗК з хламідійним антигеном реагувало 100 % тварин в протективному титрі 1:16, середній титр антитіл 5,8 ± 0,97 log2 та 5,22 ± 0,64 log2, відповідно. Після внутрішньошкірного введення 0,5 см3 вакцини проти хламідіозу ВРХ та ДРХ культуральної інактивованої ООО “БЛИЦ” теж реагувало 100 % тварин у протективному титрі 1:16 з середнім показником 5,8 ± 1,24 log2.

Таблиця 1

Результати випробувань імуногенності експериментальних серій інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів ННЦ “ІЕКВМ” та “ЕВАК” ВІЕВ на морських свинках

Серія вакцини | Кількість тварин | Титр антитіл в РТЗК після щеплення вакциною

M ± m log2 | Титр антитіл в РТЗК через 35 діб після зараження

M ± m log2 | Результати експериментального зараження

Кількість

імунних тварин | Кількість тварин від яких ізольовано культуру Br.ovis | Індекс

Інфікованості %

14 діб | 30 діб

Серія 4 | 5 | 6,2 ± 1,33 | 4,8 ± 1,03 | 3,8 ± 0,82 | 5 | 0 | 0

Контроль | 5 | 0 | 0 | 3,2 ± 0,69 | 0 | 5 (100 %) | 16,7

Серія 7 | 9 | 2,77 ± 0,34 | 3,77 ± 0,45 | 5,6 ± 0,67 | 9 | 0 | 0

Серія 7.1 | 9 | 3,44 ± 0,41 | 3,44 ± 0,41 | 6,0 ± 1,28 | 9 | 0 | 0

Контроль | 8 | 0 | 0 | 1,13 ± 0,15 | 0 | 6 (75 %) | 26,7

Серія 6 | 6 | 0,66 ± 0,14 | 2,16 ± 0,38 | 2,33 ± 0,41 | 6 | 1 (16,7 %)* | 5,6

Серія 6.1 | 6 | 2,0 ± 0,36 | 3,0 ± 0,53 | 3,16 ± 0,56 | 6 | 1 (16,7 %)* | 2,8“

ЕВАК” ВІЕВ

серія 10 | 6 | 4,67 ± 1,37 | 4,67 ± 1,37 | 2,75 ± 0,49 | 6 | 0 | 0

Контроль | 6 | 0 | 0 | 3,33 ± 0,59 | 0 | 5 (83,3 %) | 27,8

Примітка: *регіональна інфекція, збудник B. ovis виділено з лімфатичного вузла місця введення.

Порівняльне дослідження активності бруцелаовісного та хламідійного антигенів при комплексному введенні вакцин. На 57 морських свинках проведено досліди по з’ясуванню взаємовідносин бруцелаовісного та хламідійного антигенів при комплексному введенні відповідних вакцин. Першій групі тварин в різні місця одночасно ввели інактивовану емульсин-вакцину проти хламідійного аборту ВРХ, овець, кіз та свиней (серія 2) виробництва Сумської державної біофабрики в дозі 0,5 см3 і інактивовану емульсин-вакцину проти ІЕ баранів ННЦ “ІЕКВМ” підшкірно в дозі 0,5 см3 кожної. Другій групі морських свинок ввели тільки інактивовану емульсин-вакцину проти хламідійного аборту ВРХ, овець, кіз та

свиней. Четвертій групі комплексно ввели підшкірно в дозах по 0,5 см3 інактивовану емульсин-вакцини “ЕВАК” проти ІЕ баранів (серія 10) та інактивовану культуральну емульсин-вакцину проти хламідіозу ВІЕВ (серія 6) внутрішньошкірно в дозі 0,2 см3. П’яту групу вакцинували інактивованою емульсин-вакциною “ЕВАК” проти ІЕ баранів. Дві групи були інтактним контролем. В групі 1 після комплексного щеплення на 14 добу в РТЗК з бруцелаовісним антигеном реагувало 66,7 % тварин в титрі 1:4 – 1:16 (2,83 0,36 log2), тоді як в групі 2, щепленій моновакциною проти ІЕ баранів, позитивно реагувало 100 % з титром 1:4 – 1:16 (2,6 0,46 log2). Хламідійні антитіла на 14 добу виявили в РЗК у протективному титрі 1:16 у 41,7 % щеплених тварин, середній титр 2,83 0,41 log2, на 30 добу - у 33,5 % щеплених тварин, середній титр 2,83 0,36 log2. Після щеплення тільки однієї інактивованої емульсин-вакцини проти хламідійного аборту ВРХ, овець, кіз та свиней (група 3) хламідійні антитіла в РЗК на 14 добу виявлено у 100 % тварин у титрах 1:32 - 1:64 (5,5 0,6 log2), на 30 добу реагували всі щеплені тварини у титрі 5,2 0,56 log2 з протективним титром 1:16 у 80 %. Після комплексного введення відповідних комерційних вакцин російського виробництва (група 4) на 14 добу з бруцелаовісним антигеном реагувало 100 % тварин у титрі 5,0 0,89 log2, на 30 добу - 100 % тварин у титрі 5,0 0,89 log2 в РТЗК та 50 % тварин в РІД. В групі 5, щепленій інактивованою емульсин-вакциною проти ІЕ баранів “ЕВАК”, на 14 та 30 добу реагувало з бруцелаовісним антигеном 100% тварин в титрі 4,67 0,37 log2, в РІД тільки 2 тварини.

Через 50 діб після вакцинації щеплених і контрольних морських свинок заразили вірулентною культурою Br. ovis 65939 в дозі 2 109 м.к./см3. Бактеріологічними дослідженнями встановлено протективний імунітет у 100 % морських свинок першої, другої та п’ятої групи після комплексного введення вакцин та вакцини “ЕВАК” проти інфекційного епідидиміту баранів. В групі, щепленій інактивованою емульсин-вакциною проти ІЕ баранів ННЦ “ІЕКВМ”, також встановлено протективний імунітет у 6 гол. але у двох випадках (16,7 %) з правого пахового лімфатичного вузла місця зараження виділили культуру Brucella ovis. В контрольних групах після експериментального зараження заражаючу культуру реізольовано в 5 (83,3 %) з 6 морських свинок, індекс інфікованості 27,8 % та у другій контрольній групі - від усіх 4-х тварин, індекс інфікованості – 45,83 (табл. 2).

Розробка і дослідження інактивованої біемульсин-вакцини проти хламідійної та бруцелаовісної інфекцій. В лабораторних умовах нами виготовлено 5 серій інактивованої біемульсин-вакцини проти хламідійної та бруцелаовісної інфекцій. Перша та третя серії біемульсин-вакцини виготовлені шляхом гомогенізації рівних частин інактивованої емульсин-вакцини проти

Таблиця 2

Результати дослідження імунітету у морських свинках після комплексного щеплення вакцин проти хламідіозу та ІЕ баранів

Групи тварин,

вакцини | Показники гуморального імунітету після щеплення, log2 | Результати експериментального зараження

РЗК з хламідійним антигеном

протективний титр ?1:16(%) | РТЗК з бруцелаовісним антигеном | кількість імунних тварин | заразилося

на 14 добу | на 30 добу | на 14 добу | на 30 добу | кількість тварин, від яких ізольовано культуру B.ovis | індекс інфікованості

%

Група 1 Комплексне введення

Інактивована емульсин-вакцина проти ІЕ баранів ННЦ “ІЕКВМ” + інактивована емульсин-вакцина проти хламідійного аборту ВРХ, овець, кіз та свиней (Сумська біофабрика) | 2,83 ± 0,41

(?1:16=41,7 %) | 2,83 ± 0,36

(?1:16=33,5 %) | 2,83 ± 0,36

(66,7 %) | 2,91 ± 0,46

(83,3 %) | 12

(100 %) | 0 | 0

Група 2 Інактивована емульсин-вакцина проти ІЕ баранів ННЦ “ІЕКВМ” | Н/Д | Н/Д | 1,35 ± 0,24

(33,3 %) | 2,6 ± 0,46

(100 %) | 6

(100 %) | 2 (16,7 %)* | 4,2

Група 3 Інактивована емульсин-вакцина проти хламідійного аборту ВРХ, овець, кіз та свиней (Сумська біофабрика) | 5,5 ± 0,6

(?1:16=100 %) | 5,2 ± 0,56

(?1:16=80 %) | Н/Д | Н/Д | Н/Д | Н/Д | Н/Д

Контроль | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 (83,3 %) | 27,8

Група 4 Комплексне введення

Інактивована емульсин-вакцина проти ІЕ баранів “ЕВАК” + інактивована емульсин-вакцина проти хламідіозу (ВІЕВ) | 5,0 ± 0,89

(?1:16=100 %) | 5,0 ± 0,89

(?1:16=100 %) | 5,0 ± 0,89

(100 %) | 4,83 ± 0,38

(100 %) | 6

(100 %) | 0 | 0

Група 5 Інактивована емульсин-вакцина проти ІЕ баранів “ЕВАК” | Н/Д | Н/Д | 4,67 ± 0,37

(100 %) | 4,67 ± 0,37

(100 %) | 6

(100 %) | 0 | 0

Контроль | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 (100 %) | 45,83

Примітка *регіональна інфекція, збудник B. ovis виділено з лімфатичного вузла (місце введення).

інфекційного епідидиміту баранів серія 4, яка мала 10 Ч 109 м.к./см3 бруцел і комерційної інактивованої емульсин-вакцини проти хламідійного аборту ДРХ, ВРХ і свиней серія 2, яка містила 106,5 – 107,5 EID50. Біемульсин-вакцина серія 2 і 4 виготовлена шляхом швидкісної гомогенізації інактивованої вакцини проти хламідійного аборту Сумської біофабрики серія 2 і інактивованої суспензії штаму Br. ovis 67/Б в кінцевій концентрації 5 Ч 109 м.к./см3, серія 5 виготовлена на основі угорської інактивованої масляної вакцини проти хламідіозу в концентрації хламідій 107,9 EID50 (фірма Sanofi Phylaclam) і інактивованої суспензії штаму Br. ovis 67/Б в кінцевій концентрації 5 Ч 109 м.к./см3. За результатами бактеріологічних досліджень шляхом висівів на живильні середовища всі 5 експериментальних серій виготовленої біемульсин-вакцини були стерильними. Виготовлені вакцини були нешкодочинними, малореактогенними препаратами для морських свинок та овець.

Тератогенність інактивованої біемульсин-вакцини проти хламідійної та бруцелаовісної інфекцій серія 2 дослідили на 4-х кітних вівцематках (2 – 2,5 місяці кітності). За вакцинованими тваринами спостерігали до строку окоту (3 – 3,5 місяці) та після окоту за приплодом та вівцематками. Окіт у всіх щеплених вівцематок пройшов в строки без ускладнень, народилися життєздатні ягнята без фізіологічних відхилень, що свідчило про відсутність тератогенних властивостей.

Тварини дослідних груп, щеплені інактивованою біемульсин-вакциною проти хламідійної та бруцелаовісної інфекцій, були негативними при дослідженні на бруцельоз в РБП. Це має практичне значення бо щеплення виготовленою нами біемульсин-вакциною не заважає проводити діагностичні дослідження на бруцельоз вівцепоголів’я.

Досліди на морських свинках. Після введення вакцини серія 1 на 14 добу середній титр хламідійних антитіл становив 3,0 ± 0,64 log2, бруцелаовісних 1,8 ± 0,39 log2, на 30 добу після щеплення титри антитіл до обох інфекцій одночасно зросли в два рази: зокрема протективний титр хламідійних антитіл 1:16 виявлено у 100 % при середньому титрі 5,4 ± 1,16 log2, титр бруцелаовісних антитіл сягав 3,8 ± 0,82 log2. Аналогічна динаміка накопичення хламідійних і бруцелаовісних антитіл була і в групах щеплених біемульсин-вакциною серія 2: на 14 добу бруцелаовісні та хламідійні антитіла виявлені у титрі 4,2 ± 0,9 log2, протективний титр хламідійних антитіл 1:16 виявлено у 80 % тварин, на 30 добу відбулося зростання імунної відповіді: хламідійних антитіл до титру 7,0 ± 1,5 log2 (протективний титр 1:16 = 100 %), бруцелаовісних антитіл - 5,2 ± 1,12 log2. Після щеплення біемульсин- вакциною серія 4 на 14 добу показник хламідійних антитіл 1:16 встановлено у 80 % щеплених тварин з середнім титром по групі 2,66 ± 0,54 log2, на 30 добу титр антитіл сягав 3,83 ± 0,91 log2 (протективний титр 1:16 виявлено у 66,7 % тварин). Титр бруцелаовісних антитіл на 14 добу становив 0,33 ± 0,36 log2 по групі, на 30 добу виявили зростання до 3,5 ± 0,55 log2. Після щеплення вакциною серія 5 на 14 добу в РЗК з хламідійним антигеном реагували в протективному титрі 1:16 100 % тварин з середнім показником 2,11 ± 0,28 log2, на 30 добу - 5,6 ± 1,2 log2. В РТЗК з бруцелаовісним антигеном виявили антитіла в середньому титрі 1,33 ± 0,16 log2, на 30 добу відмічено зростання титру до 2,83 ± 0,05 log2.

Таблиця 3

Результати дослідження імуногенності біемульсин-вакцини на морських свинках

Група тварин

Серія вакцини | Кількість тварин | Показники гуморального імунітету після щеплення | Результати експериментального зараження

титр антитіл в РТЗК з бруцелаовісним антигеном

M ± m log2 | титр антитіл в РЗК з хламідійним антигеном

M ± m log2

титр антитіл в РТЗК з бруцелаовісним антигеном

M ± m log2 | кількість

імунних тварин | кількість тварин, від яких ізольовано культуру

Br. ovis | індекс інфікованості %

на 14 добу | на 30 добу | на 14 добу | на 30 добу

Група 1

Серія 1 | 5 | 1,8 ± 0,39 | 3,8 ± 0,82 | 3,0 ± 0,64

(1:16=80%)* | 5,4 ± 1,16

(1:16=100%)* | 4,8 ± 0,55 | 5 | 0 | 0

Група 2

Серія 2 | 5 | 4,2 ± 0,9 | 5,2 ± 1,12 | 4,2 ± 0,9

(1:16=80%)* | 7,0 ± 1,5

(1:16=100%)* | 5,2 ± 0,89 | 5 | 2** | 2,9

Контроль | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2,8 ± 0,22 | - | 4 (80 %)