УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ЗЕМЛЕРОБСТВА І БІОЛОГІЇ ТВАРИН

ІСКРА РУСЛАНА ЯРОСЛАВІВНА

УДК 591.111.1:612.419:577.15:577.17:577.118

ГОРМОНАЛЬНО-СУБСТРАТНІ МЕХАНІЗМИ РЕГУЛЯЦІЇ

ВУГЛЕВОДНОГО ОБМІНУ ТА АНТИОКСИДАНТНОЇ СИСТЕМИ

В МІЄЛОЇДНИХ КЛІТИНАХ І ЛЕЙКОЦИТАХ СВИНЕЙ РАННЬОГО ВІКУ

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Львів-1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті землеробства і біології тварин УААН ( м. Львів )

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент УААН,

Заслужений діяч науки і техніки України

СНІТИНСЬКИЙ Володимир Васильович,

Львівський державний Аграрний університет, ректор

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

СОЛОГУБ Леонід Ілліч,

Інститут землеробства і біології тварин УААН,

завідувач лабораторією обміну речовин;

доктор біологічних наук

ЛУЦИК Максим Дмитрович,

Відділення регуляторних систем клітини Інституту

м. О.В. Паладіна, провідний науковий співробітник

відділу регуляції клітинної проліферації

Провідна установа: Харківський зооветеринарний інститут

Міністрерства агропромислового комплексу України,

кафедра біохімії

Захист відбудеться “ 16 ” липня 1999 р. о 10-00 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01. в Інституті землеробства і біології тварин УААН за адресою 290034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Інституту землеробства і біології тварин УААН за адресою 290034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

Автореферат розісланий “ 28 ” травня 1999 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Чаркін В. А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Однією з актуальних наукових і практичних проблем тваринництва є з'ясування молекулярних механізмів неонатальної адаптації новонароджених тварин. Вирішення цього питання неможливе без глибокого пізнання біохімічних процесів, які лежать в основі лейкоцитопоезу і детермінують рівень реакцій клітинного і гуморального імунітету в організмі тварин раннього віку.

Згідно до даних літератури, ранній постнатальний період онтогенезу у ссав-ців характеризується певними особливостями, серед яких - підвищена чутливість до патогенних впливів, що зумовлюється низькою імунною реактивністю організму новонародженого [Девис М.Б., Готефорс Д.,1987; Burgio G.R. et al, 1987]. Причи-нами слабкого імунітету в ранньому віці є низький рівень мієло- і лімфоцитопоезу при народженні, а також недостатня функціональна активність нейтрофільних гранулоцитів, що проявляється у низькій здатності до хемотаксису, дегрануляції та бактерицидної дії [Михайлова З.М. и др., 1981; Hill H.R., 1987]. Незважаючи на ряд досліджень, механізми, що лежать в основі зниженої реактивності нейтрофільних гранулоцитів новонароджених, з'ясовані недостатньо [Пигаревский В.Е.. и др., 1988; Торубарова Н.А., 1991; Антоняк і сп., 1996]. Разом з тим відомо, що в реак-ціях клітинного і гуморального імунітету важлива роль належить процесам енерге-тичного обміну в лейкоцитах крові та їх попередниках в органах гемопоезу [Masters C., 1992; Cai T.Q., Wright S.D., 1995; Антоняк Г.Л. і сп., 1997]. Інтенсивність катаболізму вуглеводів детермінує, з однієї сторони, рівень енергозабезпечення клітин при грануло- і лімфоцитопоезі, а з іншої - швидкість утворення відновлених форм молекул кофактора NADPH-оксидази, необхідних для підтримання бактерицидної активності зрілих нейтрофілів [Thomas P.D. еt al, 1993; Theron A.J. et al., 1994].

Відповідний рівень енергетичного метаболізму має важливе значення і для забезпечення функціональної активності антиоксидантної системи в клітинах мієло-їдного ряду та в лімфоцитах. Каталітична активність ферментів антиоксидантної системи, яка регулює рівень процесів вільнорадикального окиснення в клітинах, за-безпечує підтримання стабільності їх плазматичних мембран і внутрішньоклітинних структур в умовах оксидаційного стресу, характерного для раннього періоду після народження [Владимиров Ю.А., 1989; Меньшикова Е. Б., Зенков Н. К., 1993].

Особливості протікання енергетичних процесів і метаболічний зв'язок остан-ніх з функціональним станом антиоксидантної системи, а також участь гормональ-них і аліментарних факторів у регуляції метаболізму в мієлокаріоцитах гемопоетичної тканини і лейкоцитах крові тварин при переході від пре- до постнатального онтогенезу вивчені недостатньо [Strauss R.G., Mauer A.M, 1978; Снитинский В.В. и др., 1995; Антоняк і сп., 1997, 1998]. Зокрема, це стосується ролі гідрокортизону, одного з адаптаційних гормонів, у функціонуванні системи лейкоцитопоезу та в змінах співвідношення між інтенсивністю протікання окремих шляхів катаболізму вуглеводів в лейкоцитах свиней в ранньому постнатальному періоді онтогенезу.

Важливе значення для формування в організмі адаптаційних механізмів та підтримання імунного гомеостазу має адекватне забезпечення тварин раннього віку мінеральними речовинами, зокрема, іонами заліза і селену. В ряді досліджень показано, що залізо є компонентом багатьох метаболічних систем, входить до складу ферментів, що каталізують окисно-відновні процеси [Белоус А.М., Конник И.П.,1991; Лубянова И.П., 1998]. Цей мікроелемент забезпечує функціональну активність лейкоцитів та їх здатність до бактерицидної дії і бласттрансформації [Genrke M., 1989; Kemp J.D., 1993]. Селен - структурний елемент антиоксидантної системи, приймає участь у багатьох життєвонеобхідних процесах в організмі ссавців і є одним із регуляторів реакцій клітинного і гуморального імунітету [Spallholz J.E., 1990; Wendel A., 1992; Снітинський В.В., Антоняк Г.Л., 1994].

В зв'язку з цим, значний інтерес становлять дослідження, скеровані на з'ясу-вання онтогенетичних особливостей лейкоцитопоезу та впливу гідрокортизону і мікроелементів (Fe, Se) на регуляцію метаболічних процесів в мієлоїдних клітинах гемопоетичної тканини і лейкоцитах крові поросят в ранньому періоді постнатального онтогенезу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом теми UA № 0196И010486, шифр “Вивчити молекулярні механізми формування системи регуляції метаболізму, гемопоезу та імунної функції у свиней і великої рогатої худоби на ранніх етапах постнатального розвитку”, виконана в лабораторії ендокринної регуляції Інституту землеробства і біології тварин УААН.

Мета і завдання дослідження. Дослідити інтенсивність лейкоцитопоезу, енергетичного метаболізму, протеолізу і стан антиоксидантної системи в клітинах мієлоїдного ряду кісткового мозку, нейтрофільних гранулоцитах і лімфоцитах периферійної крові свиней в періоді від народження до 10-добового віку та з'ясувати вплив гідрокортизону і мікроелементів (Fe, Se) на регуляцію метаболізму в клітинах вказаних популяцій.

Для вирішення даної проблеми були поставлені наступні завдання:

·

·

·

·

·

Наукова новизна одержаних результатів. Вивчено вікову динаміку популяцій мієлоїдних клітин кісткового мозку свиней в ранньому постнатальному періоді онтогенезу. Досліджено зміни інтенсивності окремих ланок катаболізму моносахари-дів та стан антиоксидантної системи в клітинах мієлоїдного ряду кісткового мозку і лейкоцитах свиней в періоді від народження до 10-добового віку. Вперше встановлено зміни активності окремих цитоплазматичних і мітохондріаль-них ферментів енергетичного обміну, протеолізу та антиоксидантної системи під впливом гідрокортизону, залізодекстранового препарату “Декстрофер-100 ” і селе-ніту натрію.

Практичне значення одержаних результатів. Робота присвячена вивченню онтогенетичних особливостей лейкоцитопоезу і метаболізму мієлоїдних клітин і лейкоцитів та скерована на з'ясування біохімічних механізмів, які лежать в основі забезпечення життєздатності новонародженого організму і його адаптаційних можливостей в ранньому постнатальному періоді розвитку. Результати досліджень можуть бути теоретичною основою для розробки адаптогенних технологій та імуномодуляторів з метою підвищення збереження та інтенсифікації росту молодняка протягом критичних періодів онтогенезу.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем власноручно проведено всі експериментальні дослідження, а також здійснено статистичну та аналітичну обробку одержаних результатів.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на: науковій конференції “Актуальные проблемы биологии в животноводстве” (Боровск, 1995);

науковій конференції, присвяченій 100-річчю кафедри фізіології Львівського ме-дичного інституту (Львів, 1995); міжнародному симпозіумі “ Біологічні механізми старіння” (Харків, 1996); міжнародній науковій конференції молодих вчених (Харків, 1997); VII біохімічному з'їзді (Київ, 1997); XVII conf. “Dni fyziologie hospo-darskych zvierat” (Kosice, 1997); ХV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998); міжнародній конференції “Біологічні основи живлення сільсько-господарських тварин” ( Львів, 1998).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 20 наукових робіт, з них - 10 статей.

Структура і об'єм роботи. Дисертація написана на 169 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, матеріалу і методики досліджень, власних досліджень, обговорення результатів досліджень, висновків та списку літератури, який включає 424 джерела. У дисертації міститься 14 таблиць, 10 рисунків та 1 додаток.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експериментальна частина роботи виконана з використанням 60 поросят віком до 10 діб від народження з живою масою 1-3 кілограми, отриманих від свиноматок великої білої породи в спецгосподарствах Бучацького радгоспу-технікуму Тернопільської області. Поросята утримувалися під свиноматками, годівля яких здійснювалася згідно деталізованих норм [Калашников А.П. и др., 1985].

При дослідженні впливу гідрокортизону на інтенсивність лейкоцитопоезу і метаболізму мієлоїдних клітин і лейкоцитів 7-добовим поросятам дослідної групи внутрішньом'язово вводили гідрокортизон (40 мг/кг маси тварин кожні 12 годин протягом 3-х діб).

Дослідження, скеровані на вивчення впливу заліза і селену на метаболізм мієлоїдних клітин і лейкоцитів проводились на 3-х групах поросят 1-10-добового віку, по 15 тварин у кожній. Тваринам 1-ї дослідної групи через 48 годин після народження внутрішньом'язово вводили 2 мл залізодекстранового препарату “ Декстрофер-100”, 1 мл якого містить 100 мг Fe3+, з розрахунку 2мл/кг маси тіла. Тваринам 2-ї дослідної групи - через 24 години після народження внутрішньом'язово вводили розчин селеніту натрію з розрахунку 0,075 мг селену/кг маси, а через 48 годин після народження - 2 мл декстроферу. Поросятам контрольних груп замість вищевказаних препаратів вводили відповідний об'єм 0,9 % розчину NаСl.

Матеріалом для досліджень були периферійна кров і гемопоетична тканина кісткового мозку свиней, отримані протягом 1-ї години після народження і на 1-, 3-, 5- 10-у доби життя. Кров отримували шляхом пункції передньої порожнистої вени. Кістковий мозок виділяли після декапітації та обезкровлення тварин. Фракціо-нування клітин кісткового мозку і крові проводили в градієнті густини фікол-веро-графіну [Boyum A.A., 1968; Harrison F.L. et al., 1981].

Цитологічний аналіз клітин проводили шляхом фарбування фіксованих метанолом висушених мазків за допомогою бензидину і розчину Гімза-Романовського. Класифікацію мієлоїдних елементів проводили згідно загальноприйнятої методики [Базарновой М.А., Воробьева А.И., 1991].

В плазмі крові досліджували концентрацію гормонів інсуліну, тироксину, трийодтироніну та гідрокортизону радіоімунологічним методом з використанням наборів фірми "ХОПИБОК - МЕНСК" (Беларусь).

Вміст інсуліну в крові визначали з використанням набору РИО-ИНС-ПГ-125І, вміст гідрокортизону - СТЕРОН-К- 125І-M, 3,3',5-трийодтироніну - РИО-Т3-ПГ, тироксину - РИО-Т4-ПГ. Концентрацію гормонів в крові визначали на лічильнику g-випромінювання "COMPI-GAM-MA 1282". Розрахунки здійснювали в координатах "logit-log".

Активність гексокінази (КФ 2.7.1.1), піруваткінази (КФ 2.7.1.40), лактатдегід-рогенази (КФ 1.1.1.27), фосфофруктокінази (КФ 2.7.1.11), ізоцитратдегідрогенази (КФ 1. 1. 1. 40), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (КФ 1.1.1.49) визначали спектрофотометричними методами, що базуються на використанні спряжених систем окислення або відновлення нікотинамідних коферментів [Астауров Б.Л., 1974; Снитинский В. В., Янович В. Г., 1984]. Активність цитохромоксидази (КФ 1. 9 3. 1) визначали за методом, який базується на визначенні швидкості окислення цим ферментом відновленого цитохрому-с [Cooperstein S.J., Lazarow A., 1951]. Активність глутатіонпероксидази (КФ 1.11.1.9) визначали за швидкістю окислення глутатіону в присутності гідроперекису третинного бутилу [Моин В. М., 1986], глутатіонре-дуктази ( КФ 1.6.4.3.) - за швидкістю відновлення глутатіону в присутності NADPH [Власова С. и др. 1990]. Активність супероксиддисмутази (КФ 1.15.1.11) визначали модифікованим методом, враховуючи рівень інгібування відновлення нітросиньо-го тетразолю в присутності NADH і феназинметасульфату [Антоняк Г.Л., Бучко О.М., 1998]. Активність калпаїнів (Са2+- залежних нейтральних протеїназ) і катепсинів (кислих протеїназ) визначали за інтенсивністю утворення кислоторозчинних продуктів ферментативного гідролізу білкових субстратів [Орехович Н.В., 1977; Kevin K.W. et al., 1988]. Концентрацію білку в лізатах мієлоїдних клітин кісткового мозку і лейкоцитів крові визначали за методом Лоурі (1951). Отримані дані опрацьовували статистично за методом Ойвіна (1960).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Зміни популяційного складу лейкоцитів крові і клітин кісткового мозку свиней в ранньому періоді після народження. Результати проведених досліджень вказують на те, що в ранньому періоді постнатального онтогенезу відбуваються значні зміни у функціональній активності кровотворної системи. Так, периферійна кров новонароджених поросят характеризується значним вмістом клітинних компонентів лейкоцитопоезу. Проте, протягом перших діб життя відсотковий вміст нейтрофілів, особливо, їх незрілих форм у периферійній крові тварин значно зменшується, досягаючи найнижчого рівня у 10-добових поросят. Вміст лімфоци-тів у циркуляції тварин вірогідно зростає протягом перших 10-ти діб постнатального життя.

В гемопоетичній тканині новонароджених поросят спостерігається низький вміст клітин мієлоїдного ряду, що свідчить про низьку інтенсивність гранулоцитопоезу. Проте, починаючи з 3-добового віку в кістковому мозку поросят відбуваєть-ся активація цього процесу. У 10-добових поросят співвідношення між вмістом клітин мієлоїдної і еритроїдної ліній в гемопоетичній тканині становить 2 : 1 і ли-ше в незначній мірі змінюється впродовж подальшого розвитку.

Таким чином результати досліджень вказують на те, що в періоді від народження до 10-добового віку у свиней значно змінюється функціональна активність кровотворної системи, яка полягає у поступовій інтенсифікації процесів мієло- і лімфоцитопоезу.

Метаболізм в мієлоїдних клітинах та лейкоцитах свиней в ранньому постнатальному періоді онтогенезу. Для забезпечення високої інтенсивності процесів проліферації мієлоїдних клітин та їх термінальної диференціації в кістковому мозку і циркуляції тварин необхідне підтримання в цих клітинах адекватного рівня енергетичного обміну. Енергетичним процесам належить важлива роль і в реакціях клітинного і гуморального імунітету [Strauss R.G., Mauer A.M., 1978].

В процесі досліджень встановлено, що лейкоцити крові, а також їх попередники у гемопоетичній тканині кісткового мозку свиней характеризуються високою інтенсивністю катаболізму глюкози.

- мієлокаріоцити - лімфоцити - нейтрофіли

Рис.2.Активність ферментів енергетичного обміну в мієлокаріоцитах, нейтрофільних гранулоцитах і лімфоцитах свиней (М±m, n=5): А-гексокіназа (нмоль NADPH/хв х мг білка), Б-піруваткіназа (нмоль NAD+/хв х мг білка), В-глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа (нмоль NADPH/хв х мг білка), Г-цитохром с-оксидаза (ум.од./хв х мг білка).

Разом з тим, інтенсивність окремих ланок енергетичного метаболізму різко знижується при диференціації мієлокаріоцитів до зрілих гранулоцитів, зокрема, це стосується гексокінази і глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (рис. 1).

Згідно до результатів досліджень протягом 10-добового періоду після народження у клітинах мієлоїдного ряду кісткового мозку і лейкоцитах крові поросят активується процес анаеробного розщеплення глюкози і зростає інтенсивність використання глюкозо-6-фосфату в пентозофосфатному шунті гліколізу (див. рис. 1). Така метаболічна ситуація має важливе значення не лише в гранулоцитопоезі, але і в забезпеченні функціональної активності зрілих лейкоцитів крові. Адже відомо, що такі функції лейкоцитів як хемотаксис, дегрануляція, фагоцитоз забезпечуються енергією, головним чином, за рахунок анаеробного розщеплення моносахаридів [Вrown E.J., 1995]. Разом з тим, у зв'язку з незначною здатністю клітин мієлоїдного ряду до синтезу пуринів основна роль пентозофосфатного шляху і, зокрема глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної реакції в мієлокаріоцитах полягає у підтриманні адекватного рівня NADPН, що з однієї сторони є донатором водню при біосинтезі жирних кислот, а з іншої - кофактором NADPH - оксидазної і глутатіонредуктазної систем [Strauss R.G., Mauer A.M., 1978; Theron A.J., 1994]. Тому перебудова метаболізму в мієлоїдних клітинах у напрямку інтенсифікації процесу окислення глюкози в пентозофосфатному шляху є важливою для становлення бактерицидної функції крові в організмі тварин раннього віку.

Поряд з активацією пентозофосфатного шляху в ранньому постнатальному періоді в клітинах мієлоїдного ряду і лімфоцитах тварин спостерігається активація NADP-ізоцитратдегідрогеназної реакції, що, очевидно, супроводжується підви-щенням рівня використання відновних еквівалентів водню системою мітохонд-ріальних цитохромів. Так, активність цитохром с-оксидази - каталізатора останньої ланки ланцюга окисно-відновних процесів у мієлокаріоцитах та лейкоцитах крові тварин значно зростає протягом перших діб життя, збільшуючись в клітинах 3-добових поросят у 2 - 3 рази порівняно з рівнем, характерним для новонароджених (див.рис. 1). Висока функціональна активність ферменту підтримується в клітинах досліджуваних популяцій і протягом подальшого розвитку.

Таким чином, експериментально встановлено, що протягом раннього постнатального періоду в мієлокаріоцитах кісткового мозку і лейкоцитах периферійної крові відбувається перебудова окремих ланок обміну речовин, яка в значній мірі скерована на забезпечення функціональної активності зрілих лейкоцитів. Адаптаційні зміни енергетичного метаболізму в iмунокомпетентних клiтинах полягають, головним чином, в інтенсифікації окисних процесів, зокрема пентозофосфатного шляху перетворень моносахаридів та активації мітохондріальних цитохромів. Разом з тим підвищення активності ферментів гліколізу в нейтрофільних гранулоцитах, очевидно, є важливим фактором в енергозабезпеченні клітинних функцій та становлення захисної здатності лейкоцитів при переході тварин до постнатального способу життя.

Відомо, шо інтенсифікація окисних процесів у клітинах супроводжується під-вищенням концентрацій продуктів неповного відновлення кисневих молекул [Осипов А. Н. и др., 1990; Yu B.P., 1994]. В зв'язку з цим важлива роль у захисті від окислення білкових компонентів внутрішньоклітинних і плазматичних мембран та інших клітинних структур належить системі антиоксидантного захисту клітин, зокрема ферментам глутатіонової системи і супероксиддисмутазі [Дубинина Е.Е., 1993; Меньшикова Е. Б., Зенков Н. К., 1993].

Експериментально встановлено, що рівень каталітичної активності антиоксидантих ферментів є низьким у новонароджених тварин (рис.2), проте після народження їх активність в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і лейкоцитах крові

поросят зростає.

- мієлокаріоцити - лімфоцити - нейтрофіли

Рис.2 Активність ферментів антиоксидантної системи в мієлокаріоцитах і лейкоцитах крові свиней (М±m, n=5): А-супероксиддисмутаза (ум.од./хв х мг білка), Б-глу-татіонпероксидаза (нмоль окисленого глутатіону/хв х мг білка), В-глутатіонредук-таза (нмоль NADP+/хв х мг білка).

Таким чином, результати досліджень вказують на те, що протягом раннього постнатального перiоду вiдбувається формування антиоксидантної здатностi клi-тин кровi та їх попередникiв у гемопоетичнiй тканинi, становлення функцiональної активностi cупероксиддисмутази i ферментів глутатiонової системи.

Експериментально встановлено, що в процесі постнатальної адаптації зміню-ється активність протеолітичних ферментів в клітинах системи гемоцитопоезу. При цьому активність катепсинів в мієлокаріоцитах і лейкоцитах поросят зростає в пе-ріоді з 3-ї по 5-у добу постнатального розвитку, а активність калпаїнів вірогідно збільшується в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і лімфоцитах 10-добових поросят у порівнянні до значень, характерних для 3-добових тварин. Дані літератури вказують на те, що ферменти, які належать до Са2+- залежних нейтральних протеї-наз відіграють значну роль у функціональній активності клітин, приймаючи участь у трансдукції сигналів ростових факторів та інших біологічно активних речовин [Melloni E. et al, 1986; Сологуб Л.І. та сп., 1992]. В зв'язку з цим активація калпаїнів у мієлокаріоцитах гемопоетичної тканини та лімфоцитах може свідчити про зростання чутливості клітин до дії біорегуляторів і відігравати певну роль у механізмах становлення захисної функції крові в організмі тварин після народження.

Вплив гідрокортизону на лейкоцитопоез і метаболічну активність в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і лейкоцитах крові свиней. Важлива роль в реалізації адаптаційного синдрому належить гормонам кори наднирників, оскільки перехід від пре- до постнатального розвитку є сильним стресовим фактором. В ряді досліджень встановлено, що концентрація гідрокортизону в крові свиней досягає значного рівня протягом перших годин після народження [Снітинський В.В. і сп., 1994; Antonyak H.L., 1996]. В зв'язку з цим проводились дослідження впливу гідрокортизону на інтенсивність лейкоцитопоезу та метаболізм в лейкоцитах крові і клітинах кісткового мозку поросят.

Експериментально встановлено, що гідрокортизон відіграє регуляторну роль в кровотворних процесах, а при застосуванні у високих концентраціях цей гормон пригнічує інтенсивність гранулоцитопоезу. Таким чином, гормональна ситуація в організмі новонароджених тварин, зокрема, високий вміст гідрокортизону в значній мірі зумовлює характер гемоцитопоезу в ранньому постнатальному періоді розвитку.

Після тривалого введення гідрокортизону в лейкоцитах і їх попередниках в кістковому мозку поросят відбувається перебудова окремих ланок енергетичного метаболізму (табл.1). Так, після ін'єкцій гормону швидкість гексокіназної реакції в мієлокаріоцитах і нейтрофільних гранулоцитах поросят знижується відповідно на 32% (Р<0,001) і 20% (Р<0,01) (див. табл.1), що свідчить про пригнічення інтенсив-ності початкових стадій гліколізу і пентозофосфатного шляху.

Разом з тим активація піруваткіназної реакції, що спостерігається в клітинах при низькій інтенсивності початкових стадій гліколізу і пентозофосфатного шляху може вказувати на залучення в процес гліколітичного розщеплення інтермедіатів ліпідного метаболізму.

При дослідженні функціональної активності цитохром с-оксидази встановлено значне зниження активності ферменту в лімфоцитах при відносній стабільності швидкості цитохром с-оксидазної реакції в нейтрофільних гранулоцитах після введення гідрокортизону (див. табл.1). Це можливо зумовлюється нижчою чутливістю ферменту гранулоцитів до дії регуляторних факторів в зв'язку з меншим функціо-нальним значенням в цих клітинах системи клітинного дихання у порівнянні до імунокомпетентних клітин [Strauss R.G., Mauer A.M., 1978].

В той самий час у нейтрофілах та їх попередниках в кістковому мозку поросят дослідної групи різко знижується активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (див. табл.1). Очевидно, низький рівень утворення в клітинах NADPH- кофактора глутатіонредуктази є одним з факторів, що зумовлюють зменшення активності фер-ментів глутатіонової системи, яке спостерігається в лейкоцитах тварин після тривалого введення гідрокортизону. Разом з тим в клітинах усіх досліджуваних популя-цій вірогідно знижується активність супероксиддисмутази.

Таблиця 1 - Вплив гідрокортизону на активність ферментів енергетич-

ного обміну в мієлокаріоцитах і лейкоцитах крові свиней (М±m; n=5)

Групи тварин Клітини Контрольна група Дослідна група

Гексокіназа (нмоль NADPН / хв х мг білка)

Мієлокаріоцити Нейтрофіли Лімфоцити 16,50±1,20 7,74±0,41 10,20±0,92 11,23±0,24*** 6,14±0,32** 11,90±0,68

Фосфофруктокіназа ( нмоль NAD+ / хв х мг білка )

Мієлокаріоцити Нейтрофіли Лімфоцити 154,4±21,7 133,2±5,16 282,5±18,3 134,0±16,5 151,5±11,2 241,2±16,3

Піруваткіназа ( нмоль NAD+ / хв х мг білка )

Мієлокаріоцити Нейтрофіли Лімфоцити 39,8±2,4 25,4±1,3 33,0±1,9 65,89±4,58*** 72,35±8,31*** 119,4±12,4***

Лактатдегідрогеназа ( нмоль NAD+ / хв х мг білка )

Мієлокаріоцити Нейтрофіли Лімфоцити 78,5±6,8 166,5±10,0 124,3±12,9 37,7±2,0*** 76,3±5,6*** 125,4±7,6

Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа ( нмоль NADPН / хв х мг білка )

Мієлокаріоцити Нейтрофіли Лімфоцити 64,9±4,6 8,15±0,68 7,45±0,38 28,5±1,8*** 2,32±0,11*** 5,16±1,3

NADP-ізоцитратдегідрогеназа ( нмоль NADPН / хв х мг білка )

Мієлокаріоцити Нейтрофіли Лімфоцити 4,78±0,21 3,80±0,46 9,42±0,60 7,30±0,65** 6,98±0,24*** 14,22±0,78***

Цитохром с-оксидаза ( ум. од / хв х мг білка )

Мієлокаріоцити Нейтрофіли Лімфоцити 3,58±0,32 4,35±0,51 10,08±0,41 2,98±0,34 5,56±0,54 8,98±0,26*

Примітка. В цій і наступних таблицях *,**,*** - вірогідність відмінностей

у значеннях показників між дослідною і контрольною групами тварин

(*- РЈ0,05; **- РЈ0,01; ***- РЈ0,001).

В процесі досліджень встановлено, що крім енергетичного обміну, іншою чутливою до впливу гідрокортизону ділянкою метаболізму в лейкоцитах і мієлоїдних кліти-нах кісткового мозку є протеолітична система. При цьому виявлено, що дія гормону є неоднозначною відносно функціональної здатності нейтральних і кислих протеїназ (табл.2). Так після ін'єкцій гормону активність калпаїнів знижується в усіх досліджу-ваних клітинах, а катепсинів - зростає в гранулоцитах і лімфоцитах крові тварин.

Таблиця 2 - Вплив гідрокортизону на активність протеолітичних

ферментів в мієлокаріоцитах і лейкоцитах крові свиней (М±m; n=5)

Групи тварин Клітини Контроль Дослід

Катепсини (нг субстрату / хв х мг білка)

Мієлокаріоцити Нейтрофіли Лімфоцити 12,84±1,50 4,20±0,31 3,00±0,15 14,1±1,08 6,93±0,72** 8,60±1,10***

Калпаїни (нг субстрату / хв х мг білка)

Мієлокаріоцити Нейтрофіли Лімфоцити 15,60±0,91 10,28±0,79 13,51±0,76 11,58±1,30* 6,95±0,87* 5,25±0,56***

Таким чином експериментально встановлено участь гідрокортизону в регуляції окремих ланок метаболізму в лейкоцитах і їх попередниках в кістковому мозку поросят. Після тривалого введення гормону в мієлокаріоцитах, нейтрофілах і лімфоцитах знижується інтенсивність початкових стадій гліколізу і пентозофосфатного шляху та пригнічується активність мітохондріальної цитохром с-оксидази. Разом з тим в клітинах досліджуваних популяцій знижується активність ферментів антиоксидантної системи. Такі ефекти гідрокортизону значною мірою зумовлюють пригнічення функціональної активності лейкоцитів та імунних реакцій в організмі тварин в неонатальному періоді розвитку [Маянский Д.Н., Макарова О.П.,1989; Meier C. A., 1996], а з високим вмістом глюкокортикоїдів у крові новонароджених, очевидно, зв'язана низька інтенсивність мієло- і лімфоцитопоезу у ссавців при переході від пре- до постнатального онтогенезу.

Вплив іонів заліза і селену на метаболізм в лейкоцитах і мієлоїдних клітинах кісткового мозку свиней в ранньому постнатальному періоді. Адекватне забезпечення тварин раннього віку мінеральними речовинами, зокрема, іона-ми заліза і селену, має важливе значення для формування в організмі адаптаційних механізмів та підтримання клітинного гомеостазу [Burgio G.R., 1987, Schrauzer G.N., 1991; Антоняк Г.Л., 1997].

Встановлено, що застосування залізодекстранового препарату “Декстрофер-100” приводить до інтенсифікації аеробних процесів енергетичного обміну. У лейкоцитах поросят підвищується активність цитохром с-оксидази та ізоцитратдегід-рогенази, проте, знижується активність ферментів гліколізу (табл. 3). Разом з тим у всіх досліджуваних типах клітин поросят 1-ї дослідної групи підвищується каталітична активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (див. табл. 3).

Таблиця 3 - Вплив декстроферу і селеніту натрiю на активність ферментів в лімфоцитах поросят (M±m, n=5)

Фермент Умови досліджень Гексокіназа (нмоль NADН /хв х мг білка) Фосфофрук-токіназа (нмоль NAD+ /хв х мг білка) Глюкозо-6-фосфатде-гідрогеназа (нмоль NADН /хв х мг білка) NADP+- ізоцитратде- гідрогеназа (нмольNADPН/хв х мгбілка) Цитохром с-оксидаза (ум. од. / хв х мг білка)

3-денні К 9,50±0,78 233±10,5 7,96±0,48 8,03±0,55 7,50±0,92

Д1 4,88±0,39*** 133 ±11,9 14,1±1,5** 9,47±0,12* 13,96±1,10***

Д2 8,03±0,72 143±11,5 19,2±1,7*** 7,12±0,85 10,71±1,50

5-денні К 7,53±0,45 357±14,8 11,2±2,2 7,45±0,26 15,14±0,73

Д1 8,50±1,2*** 306±27,6 18,6±1,67* 8,68±0,48* 15,90±1,12

Д2 10,02±1,1 385±36,3 19,3±2,12* 8,51±1,32* 11,08±1,33*

10-денні К 10,23±0,9 282±18,3 7,45±0,38 9,42±0,60 10,08±0,71

Д1 9,82±1,17 223±29,1 10,9±1,3 9,82±0,78 9,28±0,57

Д2 16,10±1,4** 320±21,5 29,3±1,8*** 10,2±1,2 14,72±1,20*

Активація окисних процесів у клітинах, як відомо, веде до інтенсифікації утворення реакційноздатних форм кисневих молекул. Активація перекисного окислення ліпідів, яка зумовлена введенням залізодекстранового препарату, приводить до зниження в лейкоцитах активності ферментів антиоксидантної системи - супероксиддисмутази і глутатіонпероксидази (табл. 4). Проте слід відмітити, що актив-ність глутатіонредуктази у лейкоцитах тварин 1-ї дослідної групи в окремі терміни експерименту зростає (див. табл. 4), що очевидно, зумовлюється підвищенням вмісту в клітинах NADPH, у зв'язку з активацією в цей період ферментів пентозо-фосфатного шунту.

З метою підвищення ефективності залізодекстранових препаратів у плані стимуляції функціональної активності імунокомпетентних клітин важливе значення має комплексне застосування препаратів заліза і антиоксидантів. Експериментально встановлено, що застосування залізодекстранового препарату у комплексі з селені-том натрію у лейкоцитах приводить до нормалізації, а в окремі терміни експерименту до зростання активності гексокінази, фосфофруктокінази і глюкозо-6-фос-фатдегідрогенази (див.табл. 3). Разом з тим, введення селеніту натрію в значній мірі сприяє підвищенню функціональної активності супероксиддисмутази і глутатіон-пероксидази та нормалізації глутатіонредуктази (див.табл. 4). Отримані результати дають підставу вважати, що участь селену в регуляції каталітичної здатності ферментних антиоксидантів в значній мірі сприяє стабілізації плазматичних і внутріш-ньоклітинних мембран лейкоцитів і, відповідно, відіграє важливу роль у забезпеченні функціональної активності клітин в умовах активації окисних процесів.

Таблиця 4 - Вплив декстроферу і селеніту натрiю на активність антиоксидант-них ферментів в нейтрофільних гранулоцитах поросят (M±m, n=5)

Фермент Умови досліджень Супероксиддисму-таза ( ум.од / хв х мг білка ) Глутатіонперокси-даза ( нмоль окисленого глутатіону / хв х мг білка ) Глутатіонредуктаза ( нмоль NADP+ / хв х мг білка)

3-денні К 12,76±0,91 18,80±0,75 15,42±1,12

Д1 12,18±0,57 17,16±1,12 23,00±1,29***

Д2 13,73±1,65 21,95±0,96* 20,82±0,70***

5-денні К 12,82±1,10 21,45±1,47 21,58±2,05

Д1 8,58±0,95* 23,66±2,45 23,40±2,61

Д2 13,84±0,82 24,68±2,60 22,79±2,16

10-денні К 13,30±0,65 19,45±1,16 18,02±1,92

Д1 10,78±0,74* 10,82±0,48*** 16,78±1,39

Д2 12,85±1,20 26,42±1,85** 16,84±1,13

Таким чином, внутрішньоклітинні метаболічні ефекти іонів заліза і селену створюють умови для становлення захисної функції лейкоцитів тварин, підвищення імунної реактивності та адаптаційних можливостей організму в ранньому постнатальному періоді онтогенезу.

ВИСНОВКИ

1. Встановлені гормонально-субстратні механізми регуляції метаболізму в мієлоїд-них клітинах кісткового мозку та лейкоцитах крові свиней раннього віку. Одержані результати можуть бути теоретичною основою для розробки адаптогенних технологій та імуномодуляторів з метою підвищення резистентності і профілак-тики захворювань новонароджених тварин.

2. В періоді від народження до 10-добового віку в кістковому мозку свиней відбу-вається інтенсифікація процесів мієло- та лімфоцитопоезу. У периферійній крові 10-добових тварин вдвічі зростає вміст лімфоцитів ( P<0,001 ).

3. В мієлоїдних клітинах кісткового мозку і лейкоцитах крові свиней після народження підвищується активність окремих ферментів гліколізу, зокрема, в мієлокаріоцитах 3-добових поросят активність гексокінази зростає в 1,3 рази (P<0,05), піруваткінази - в 1,2 рази (P<0,05) у порівнянні з активністю ферментів в новонароджених тварин. У 3-добових поросят активність глюкозо-6-фосфат-дегідрогенази підвищується в мієлокаріоцитах в 1,6 разів (P<0,05), в нейтрофільних гранулоцитах - в 1,2 рази (P<0,05), а в лімфоцитах - в 3 рази (P<0,001). Активність цитохром с-оксидази у лімфоцитах на 3-ю добу життя зростає майже в 5 разів (P<0,001).

4. В ранньому періоді постнатального онтогенезу в мієлоїдних клітинах кісткового мозку та лейкоцитах крові свиней спостерігається активація ферментів антиоксидантної системи, зокрема, в нейтрофільних гранулоцитах 3-добових поросят активність супероксиддисмутази зростає в 7,7 рази (P<0,001), активність глута-тіонпероксидази - в 3,2 рази (P<0,001), а глутатіонредуктази - 1,4 рази (P<0,001).

5. Протягом раннього постнатального періоду в клітинах кісткового мозку і лейкоцитах поросят відбуваються зміни активності протеолітичних ферментів, а саме, активність катепсинів у мієлокаріоцитах 10-добових тварин зростає в 4 рази (P<0,001), в нейтрофільних гранулоцитах - в 2 рази (P<0,01), активність калпаїнів в мієлокаріоцитах зростає в 3 рази (P<0,001), а в нейтрофільних гранулоцитах - в 1,2 рази (P<0,05).

6. Після тривалого ведення гідрокортизону знижується інтенсивність гранулоцитопоезу, а в лейкоцитах і клітинах кісткового мозку поросят відбувається перебудова окремих ланок енергетичного метаболізму. В мієлокаріоцитах і нейтрофільних гранулоцитах активність гексокінази знижується відповідно на 32 % (P<0,001) і 20 % ( P<0,01), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази на 57 % і 70 % (P<0,001). У всіх типах клітин підвищується активність піруваткінази ( P<0,001 ). В лімфоцитах тварин зменшується активність цитохром с-оксидази (P<0,05 ).

7. Під впливом гідрокортизону в клітинах кісткового мозку і лейкоцитах знижується активність ферментів глутатіонової ситеми і супероксиддисмутази (P<0,05-0,001). У лейкоцитах крові під впливом гормону змінюється активність ферментів протеолізу, зокрема, знижується активність калпаїнів в 1,5-2,5 рази та зростає активність катепсинів в 1,6-2,8 рази (P<0,05-0,001).

8. Після введення залізодекстранового препарату “Декстрофер-100” у лейкоцитах свиней відбувається активація аеробних процесів енергетичного обміну та зни-ження активності ферментів антиоксидантної системи - суперокиддисмутази і глутатіонпероксидази. При застосуванні залізодекстранового препарату у комп-лексі з селенітом натрію в лейкоцитах свиней підвищується активність ферментів антиоксидантної системи та нормалізується інтенсивність енергетичних процесів.

Пропозиції виробництву.

Поросятам протягом перших 10-ти діб життя з метою підвищення імунної реактивності організму, рівня збереження та інтенсифікації росту тварин протягом критичного періоду онтогенезу і профілактики оксидаційного стресу рекоменду-ється поєднане внутрішньом'язове введення в 2-добовому віці селеніту натрію (в дозі 0, 075 мг селену / кг маси тіла), а на 3-ю добу життя – декстроферу (з розра-хунку 1,5 – 2 мг / кг маси тіла).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Іскра Р.Я., Демчук О.М., Антоняк Г.Л., Снітинський В.В., Кухта І.В. Зміни активності ферментів енергетичного обміну та антиоксидантної системи в лейкоцитах і клітинах кісткового мозку свиней в ранньому постнатальному періоді // Наук. - техн. бюлетень Інституту фізіології і біохімії тварин. - 1997. - Вип. 19 (1). - С.8-11.

(Здобувачу належить виконання експериментальних досліджень, аналіз і узагальнення результатів та написання праці).

2. Антоняк Г.Л., Іскра Р.Я., Снітинський В.В., Снітинська І.В., Антоняк Н.О. Вікові зміни активності дегідрогеназ в лейкоцитах та їх попередниках у кістковому мозку свиней // Наук.- техн. бюлетень Інституту фізіології і біохімії тварин. - 1996. - Вип. 18 (1). - С. 20-23. (Здобувачу належить виконання експериментальних досліджень, статистична обробка, аналіз та узагальнення одержаних результатів).

3. Антоняк Г.Л., Снітинський В.В., Бабич Н.О., Іскра Р.Я., Бучко О.М. Роль селену в регуляції функціональної активності лейкоцитів крові тварин у неонатальному періоді // Вісник аграрної науки. - 1999. - № 5. - С. 36-38. (Здобувачу належить виконання експериментальних досліджень, статистична та аналітична обробка одержаних результатів).

4. Іскра Р.Я., Антоняк Г.Л., Снітинський В.В. Вплив кортизолу на вміст популяцій мієлоїдних клітин кісткового мозку і лейкоцитів поросят // Вісник проблем біології і медицини. – 1998. - №16 - С. 45-47. (Здобувачу належить проведення цитологічних досліджень, аналіз результатів та написання праці).

5. Антоняк Г.Л., Снітинський В.В., Іскра Р.Я., Бабич Н.О. Динаміка активності ферментів енергетичного метаболізму в мієлоїдних клітинах і лейкоцитах свиней у неонатальному періоді // Медична хімія. - 1999. - №1 - С. 52-56. (Здобувачу належить виконання експериментальної частини, статистична та аналітична обробка результатів).

6. Антоняк Г.Л., Снітинський В.В., Бершадський В.І., Іскра Р.Я., Бальковський В.В., Кухта І.В. Характеристика окремих ланок метаболізму глюкози в клітинах кісткового мозку свиней в ранньому періоді постнатального розвитку // Наук.- техн. бюлетень Інституту фізіології і біохімії тварин. - 1997. - Вип. 19 (1). - С.16-19. (Здобувач виконала експериментальну частину, статистичну обробку результатів та їх аналіз).

7. Антоняк Г.Л., Снітинський В.В., Бершадський В.І., Іскра Р.Я., Бальковський В.В. Зміни популяційного складу еритроїдних клітин кісткового мозку і крові свиней в неонатальний період розвитку // Наук.- техн. бюлетень Інституту фізіології і біохімії тварин. - 1996. - Вип. 18 (1). - С. 14-17. (Здобувачу належить виконання цитологічних досліджень, статистична та аналітична обробка одержаних результатів).

8. Антоняк Г.Л., Снітинський В.В., Данчук В.В., Бабич Н.О., Іскра Р.Я., Бальковський В.В., Кректун Б.В., Бучко О.М. Вплив екзогенних гормонів на функ-ціональну активність ендокринних залоз поросят у неонатальному періоді онтогенезу // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету. - 1998. - Вип.5, част.1. - С. 150-153. (Здобувачу належить виконання частини експериментальних досліджень, статистична обробка результатів та аналіз і інтерпретація результатів).

9. Іскра Р.Я., Антоняк Г.Л., Бучко О.М. Бальковський В.В., Ігнатенко Ю.В., Снітинський В.В. Вплив мікроелементів на деякі ланки метаболізму в мієлоїдних клітинах тварин // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 1998. - №12. - С. 112-115. (Здобувачу належить виконання експериментальних досліджень, статистична обробка та аналіз одержаних результатів).

10.Антоняк Г.Л., Іскра Р.Я., Бучко О.М., Снітинський В.В. Роль селену в регуляції метаболізму в імунокомпетентних клітинах свиней тварин // Науковий вісник Національного аграрного університету. -1998. - №12. - С. 109-112. (Здобувачу належить виконання експериментальних досліджень та аналіз одержаних результатів).

11.Снітинський В.В., Антоняк Г.Л., Іскра Р.Я., Бучко О.М., Кректун Б.В., Данчук В.В., Бальковський В.В. Видові особливості гормонального статусу великої рогатої худоби і свиней в період неонатальної адаптації / Матеріали ХV з'їзду українського фізіологічного товариства. – Донецьк. - 1998 / Фізіологічний журнал. – 1998. – Т. 44, № 3. – С. 239.

12.Іскра Р.Я. Активність ферментів енергетичного обміну в лейкоцитах крові і клітинах кісткового мозку свиней в неонатальний період // Праці VII українського біохімічного з'їзду. - Київ. - 1997. – С. 17-18.

13.Snitinsky V.V., Antoniak H.L., Iskra R.Y. The role monodeiodine processes in mechanims of mechanisms of influence of thyreoid hormones upon metabolism in cells // Abstrakty “Dni fyziologie hospodarskych zvierat”. XVII. – Kosice (Slovenska Republika ). – 1997. – C. 65.

14.Антоняк Г.Л., Бершадський В.I., Демчук О.М., Iскра Р.Я., Снiтинський В.В. Гормональна регуляцiя метаболічної активності в еритроцитах свиней в неона-тальному періоді // Праці I Українського симпозіуму по ендокринології тварин. - Львів. - 1994. - С. 7-8.

15.Снитинський В.В., Антоняк Г.Л., Искра Р.Я., Демчук О.М. Гормональная регуляция метаболической активности в клетках крови и костного мозга свиней // Труды второй международной конференции “ Актуальные проблемы биологии в животноводстве”. - Боровск. - 1995. – С. 159.

16.Антоняк Г.Л., Снітинський В.В., Кичун І.В., Іскра Р.Я. Вікові особливості процесу зв'язування 125І-інсуліну еритроїдними клітинами крові свиней // Експериментальна і клінічна фізіологія. Збірник наукових праць до 100-річчя кафедри фізіології Львівського медичного університету. Львів. - 1995. - С. 89-90.

17.Данчук В.В., Іскра Р.Я., Демчук О.М. Метаболізм в еритроцитах свиней в ранній період після народження // Праці міжнародного симпозіуму “ Біологічні механізми старіння”. – Харків. - 1996. - 44 с.

18.Іскра Р.Я. Вікові зміни активності дегідрогеназ у клітинах крові і кістко-вого мозку свиней в неонатальний період // Праці міжнародної науково - практичної конференції молодих вчених “ Наукові досягнення в галузі ветеринарної медицини ” – Харків. – 1997. – С. 93-95.

19.Антоняк Г.Л., Снітинський В.В., Іскра Р.Я., Бучко О.М., Бальковський В.В. Деякі показники метаболізму в лейкоцитах та клітинах кісткового мозку свиней в періоді постнатальної адаптації // Праці ІІІ міжнародного симпозіуму “ Біологічні механізми старіння ”. – Харків. – 1998. – С. 84.

20.Снітинський В.В., Aнтоняк Г.Л., Кректун Б.В., Іскра Р.Я., Бучко О.М., Бальковський В.В. Деякі аспекти мінерального живлення тварин у неонатальному періоді // Праці міжнародної конференції “ Біологічні основи живлення сільсько-господарських тварин ”. - Львів. - 1998. - С.21.

Іскра Р.Я. Гормонально-субстратні механізми регуляції вуглеводного обміну та

антиоксидантної системи в мієлоїдних клітинах і лейкоцитах свиней раннього віку.

- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата