АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

МАКАРЕНКО ОЛЬГА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК: 615.212.3/.4:615.07]–092.9

ФАРМАКОЛОГІЧНИЙ АНАЛІЗ АНТИЦИКЛООКСИГЕНАЗНОЇ АКТИВНОСТІ НОВИХ НЕОПІОЇДНИХ АНАЛЬГЕТИКІВ

(експериментальне дослідження)

14.03.05. – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

КИЇВ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Дніпропетровській державній медичній академії МОЗ України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

МАМЧУР Віталій Йосипович,

Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри фармакології, клінічної фармакології та технології лікарських засобів

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

ВІКТОРОВ Олексій Павлович,

Інститут кардіології ім. ак. М.Д. Стражеска АМН України,

завідувач відділу клінічної фармакології з лабораторією функціональної діагностики

доктор медичних. наук, професор,

Заслужений діяч науки та техніки України

ЛУК’ЯНЧУК Віктор Дмитрович,

Луганський державний медичний університет МОЗ України,

завідувач кафедри фармакології

Провідна установа:

Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, кафедра фармакології з курсом клінічної фармакології, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “_20__” вересня_ 2006 року о “13_” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Пот‘є, 14. Д.26.550.01 в Інституті фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е14)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Пот‘є, 14. Д.26.550.01 в Інституті фармакології Інституту фармакології та токсикології АМН України (007, Автореферат розісланий “18_” __серпня__________ 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01,

кандидат біологічних наук І.В. Данова

загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Нейрофармакологія болі та медикаментозне знеболювання, залишаються однією з актуальніших проблем медицини. Серед лікарських засобів, яким притаманна болезаспокійлива активність, найчастіше лікарями призначаються, провізорами рекомендуються, пацієнтами з метою самолікування приймаються так звані ненаркотичні анальгетики, а саме нестероїдні протизапальні засоби (НПЗЗ).

У Об’єднаному Королівстві Великої Британії щорічно виписується біля 24 мільйонів рецептів на НПЗЗ. Приблизно 15% літніх людей приймають НПЗЗ. Розраховано, що середня частота призначень складає 426 рецептів на 1000 населення в рік (В.Н. Цибуляк, 2003, Е.Л. Насонов, 2000, П.Л. Жарков, 2001).

Дана група лікарських засобів найбільш численна. Таким обставинам, без сумнівну, сприяв прогрес фармацевтичної промисловості та фармацевтичної науки, завдяки яким стало можливим одержання вивчення та освоєння великої кількості нових сполук (на сьогодні біля 70 різних по хімічній структурі). А це, в свою чергу, дозволяє лікарю призначати НПЗЗ з урахуванням їхньої ефективності й індивідуальної переносимості (В.А. Насонова, 2003).

Протизапальна, жарознижуюча, анальгезуюча, антиагрегаційна, ульцерогена, нефро- та гепатотоксична, а також іммунодепресивна та іммунотоксична дії – всі ці види активності НПЗЗ в тому чи в іншому ступеню виразності характерні майже для всіх засобів цієї фармакологічної групи (О.П. Вікторов, 2002).

В 1971 р. J. Vane, J. Smith і A. Willis встановили механізм дії НПЗЗ, котрий пов’язан з гальмуванням синтезу циклооксигенази (ЦОГ), ферменту, що забезпечує метаболізм арахідонової кислоти, яка є попередником простагландинів (ПГ). Таким чином, J. Vane висунув гіпотезу, що механізм дії аспіриноподібних препаратів обумовлений інгібіцією синтезу ПГ, котрий відноситься до числа важливих медіаторів запалення (Needleman P., 1986).

Пізніше, в 90-х роках ХХ століття, встановлено, що циклооксигеназа має дві ізо-форми - ЦОГ-1 і ЦОГ-2, що відповідальні за синтез простагландинів, які підтримують фізіологічні функції. Проте синтез прозапальних простагландинів обумовлений тільки ізоферментом ЦОГ-2. Протизапальний, анальгетичний ефект НПЗЗ є наслідком блокування цього ферменту (ЦОГ-2). Одночасне пригнічення активності ЦОГ-1 впливає на захисні властивості гастродуоденальної слизової оболонки та агрегацію тромбоцитів, що призводить до появи таких побічних явищ НПЗЗ, як гастропатії, нефропатії, кровоточивість та інш. (Verburg K.M., 2001, Mastbergen S., 2002).

У зв’язку з цим при вивченні нових перспективних засобів, яким притаманна болезаспокійлива та протизапальна активність, виникає питання: який саме вони мають рівень співвідношення антиЦОГ-1 і антиЦОГ-2 активності? Так, якщо для класичних НПЗЗ від ацетилсаліцилової кислоти, диклофенаку натрія, німесуліду до целекоксибу співвідношення антиЦОГ – 1 до антиЦОГ – 2, а саме токсичних і терапевтичних ефектів достатньо вивченні (Mastbergen S. C., et al. 2002), то для нових неопіоїдних анальгетиків (анальбен, бензофурокаїн, пірадозол, вінборон), а також для абсолютно нових хімічних сполук з анальгетичною і протизапальною активністю ряду норборнену співвідношення різних видів антиЦОГ активності не встановлено. Таким чином, проведення досліджень у вказаному напрямку дозволить раціоналізувати знеболюючу терапію запальних станів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Результати досліджень, наведених у дисертаційній роботі, є фрагментом науково-дослідних робіт “Експертна оцінка співвідношення антициклооксигеназних та антиоксидантних властивостей вітчизняних болезаспокійливих засобів (амізон, анальбен, пірадозол, бензофурокаїн, вінборон)” , номер держреєстрації - 0103U004100, та “Розробка системи методичних підходів вивчення в експерименті селективності антициклооксигеназної активності вітчизняних і нових нестероїдних протизапальних засобів (НПЗЗ)”, номер держреєстрації - 0104U006269.

Мета роботи та завдання дослідження. Метою роботи було визначити характер антициклооксигеназної активності класичних та нових неопіоїдних анальгетиків шляхом порівняння їх знеболюючої, протизапальної та ульцерогеної активності на підставі дослідження біологічних, біохімічних, гістоморфологічних та гематологічних досліджень.

У відповідності до мети було визначено основні задачі дослідження:

1. Встановити ЛД50, провести пошук знеболюючих, протизапальних ефектів у сполук ряду норборнена;

2. Порівняти знеболюючі та протизапальні властивості нових (анальбен, бензофурокаїн, вінборон та пірадозол) та класичних неопіоїдних анальгетиків (непрямий метод вивчення антиЦОГ-2 активності);

3. Визначити можливу ульцерогенну дію класичних та нових неопіоїдних анальгетиків (непрямий метод вивчення антиЦОГ-1 активності);

4. Дослідити вплив неопіоїдних болезаспокійливих засобів на активність простагландинсинтетази (циклооксигенази) у тромбомассі, слизовій оболонці шлунка та мозку тварин.

5. Встановити прогностичне значення визначення співвідношення прямої та непрямої антициклооксигеназної активності для цільового скринінгу нових біологічно активних речовин з знеболюючими та протизапальними властивостями.

Об’єкт дослідження – білі миші, щури з “ад’ювантним артритом”, тканини мозку, слизова оболонка шлунка, кров.

Предмет дослідження – антициклооксигеназні ефекти нових, традиційних НПЗЗ, та вперше синтезованих сполук з ряду норборнену.

Методи дослідження – фармакологічні, токсикологічні, нейрохімічні, фізіологічні, гематологічні, патоморфологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. В роботі вперше проведений порівняльний аналіз антициклооксигеназної активності різного характеру як нових анальгетиків (анальбен, бензофурокаїн, вінборон та пірадозол), так і орігінальних хімічних сполук ряду норборнену у порівнянні з відомими класичними НПЗЗ (ацетилсаліцилова кислота, диклофенак натрію, німесулід, целекоксиб) та ННА (парацетамол, метамізол).

Дослідження забезпечують оптимізацію в призначенні ефективних болезаспокійливих засобів, що виявляється в збільшені терапевтичного ефекту при зниженні побічних проявів, таким чином досягнення максимально безпечного терапевтичного втручання.

Теоретичне та практичне значення роботи. Робота є експериментально-теоретичним дослідженням, яке поглиблює уявлення про знеболюючі та протизапальні ефекти анальгетиків. Таким чином, пов’язана з визначенням найбільш оптимальних шляхів синтезу нових ефективних болезаспокійливих засобів, що дає можливість для подальшої розробки раціональної терапії больових та запальних синдромів та забезпеченню адекватного вибору препарату, враховуючі його терапевтичні та токсичні ефекти.

Результати дослідження впроваджені в навчальний процес на кафедрах фармакології Національного медичного університету ім.. О.О. Богомольця, Тернопільського державного медичного університету ім.. І.Я. Горбачовського, Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Одеського державного медичного університету та Львівського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто було здійснено патентно-інформаційний пошук, проведено аналіз даних літератури за темою дисертації, відпрацьовано моделі, виконано експериментальні дослідження, а також проведено аналіз, систематизацію та статистичну обробку отриманих результатів і оформлено їх у вигляді таблиць та рисунків тексту дисертації, сформульовані основні положення та висновки роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації опрелюдненні в матеріалах Російській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Клинические и теоретические аспекты острой и хронической боли” (Ніжний Новгород, 2003), VIII міжнародної науково-практичної конференції „Наука і освіта ’2005” (Дніпропетровськ, 2005), ІХ Міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2005), VII міжнародного симпозіуму “Інсульт: діагностика, профілактика, лікування” (Судак, 2005), ІV міжнародної науково-практичної конференції “Динаміка наукових досліджень – 2005” (Дніпропетровськ, 2005), VI Національного з’їзду фармацевтів України „Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України” (Харків, 2005), ІІ міжнародної науково-практичної конференції “Науковий потенціал світу – 2005” (Дніпропетровськ, 2005), ІІ науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 наукових робіт, у тому числі 4 статті (3 з них в журналах, ліцензованих ВАК України), 9 тез в матеріалах докладів конференцій, конгресів, з’їздів.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 217 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків та списку літератури, який містить 241 літературне джерело, з них 113 іноземних. Робота проілюстрована 25 таблицями, 65 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження виконані на 372 білих статевозрілих нелінійних мишах масою 18-25 г та 696 білих статевозрілих безпородних щурах масою 150 - 230 г. Тварини належали до обох статей, утримувалися на стандартному раціоні харчування.

Об‘єктами токсикологічних та фармакологічних досліджень були: 1) вітчизняні оригінальні засоби: анальбен (1 мг/кг) фарм. фірма “НЕОФАРМ” сумісно з фірмою “ЗДОРОВ’Я”, бензофурокаїн (5 мг/кг), вінборон (3мг/кг), пірадозол (2,5 мг/кг) (експериментальні субстанції); 2) нестероїдні протизапальні засоби: ацетилсаліцилова кислота (200 мг/кг) (табл. 0,5 г, ЗАО Фармацевтична фірма “Дарница” м. Київ), диклофенак натрію (10 мг/кг) (табл. 0,05 г, ВАТ “ХФЗ “Червона зірка”, м. Харків), німесулід (80 мг/кг) (табл. 0,1 г, “ФАРМАК®”, м. Київ), целекоксиб (50 мг/кг) (Фармація Лімітед, Великобританія); 3) ненаркотичні анальгетики: парацетамол (300 мг/кг) (капс. 325 мг, ВАТ “Концерн Стирол”, м. Горлівка), метамізол (200 мг/кг) (табл. 0,5 г, ВАТ “Лубнифарм”); 4) похідні норборнену в дозі 1/10 ЛД50, ряд речовин, що вміщують біциклічний норборненовий та норборнановий каркаси, які були створені на кафедрі органічної хімії Дніпропетровського Національного Університету під керівництвом заслуженого діяча науки та техніки, професора Л.І. Касьян.

Гостру токсичність похідних норборнену вивчали при одноразовому введенні внутрішньошлуночно мишам у зростаючих дозах згідно з Методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України з експериментального вивчення токсичної дії потенційних лікарських засобів (Київ, 2000).

Скринінг знеболюючих та протизапальних властивостей похідних норборнену здійснювали на білих мишах згідно з “Доклінічними дослідженнями лікарських засобів” (методичні рекомендації) за ред. О.В. Стефанова (Київ, 2002). Анальгетичну активність досліджували у тесті “гаряча пластинка”; антиексудативну активність на моделі карагенінового набряку. Анальгетичну активність, а саме центральний компонент формування больової реакції перспективних похідних норборнену, нових анальгетиків у порівнянні з відомими класичними НПЗЗ досліджували на моделі електрошкірного подразнення хвоста у щурів згідно етичних вимог до дослідження болю у тварин із збереженням свідомості, затверджених Комітетом з експериментальних досліджень та етичних проблем Міжнародної Асоціації з вивчення болю (LASP) (M.N. Caroll et al., 1960). Критерієм больової чутливості була реакція вокалізації, яка опосередковується залученням як сегментарного, так і супрасегментарного рівнів замикання аверсивних сигналів. На моделі “оцтовокислих” корчів досліджувалась болезаспокійлива здатність до хімічного стимулу формування больового реагування (“Доклінічні дослідження лікарських засобів” (методичні рекомендації), 2002).

Принцип методу по вивченню можливої ульцерогенної дії вивчали, завдяки макроскопічній оцінці стану слизової оболонки шлунка щурів, які одержували досліджувані засоби на фоні голодування, та відображали у балах та виразковому індексу (В.А. Виноградов, 1982, І.Ф. Мещишен, 2004). Морфологічні дослідження проводились на базі кафедри гістології людини ДДМА під керівництвом завідуючого кафедри д.м.н., професора І.В. Твердохліба.

Поведінкові реакції вивчалися з використанням методу „відкрите поле” (Я. Буреш и соавт., 1991) та бліц-тесту “підвішування за хвіст”. До уваги брали показники горизонтальної і вертикальної рухової активності, дослідницьку активність (кількість обстежених норок), емоційну напругу (кількість болюсів і актів грумінгу), а також по часу іммобілізації при підвішуванні за хвіст.

Поглиблене вивчення антипроліферативних властивостей засобів проведено на моделі “ад’ювантного” артриту у щурів (“Доклінічні дослідження лікарських засобів” (методичні рекомендації), 2002). В сироватці крові наприкінці експерименту визначали рівень сіроглікоїдів, сіалових кислот та глікозаміногліканів та вміст оксипроліну у сечі (С. Камышников, 2000, А.М. Горячковский, 1998).

Для з’ясування механізмів впливу досліджуваних засобів на рівень циклооксигенази у різних тканинах в гострій стадії “ад’ювантної” хвороби відзначали рівень простагландинсинтетази у тромбоцитарній масі, слизовій оболонці шлунка та тканинах мозку (W.B. Cambell et al., 1996, A.T. Mevkh, et al. 1984).

У роботі використовували арахідонову кислоту, адреналін, фосфат калію, трис HCl та ТВІН-20 (USA). PGH – синтетазну активність ферменту визначали спектрофотометричним методом за допомогою СФ-56 ЛОМО-спектр. В кювету, котра вміщує 1 мл буфера додавали розчин 2мкМ геміну (“Сінбіас”), донор електронів (0,99 мМ розчин адреналіну (“ALDRICH”, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Riedstr. 2, D-89555 Steinheim, Germany)) та солюбілізований препарат ферменту (Кузнецова Ю.А. и соавтор., 1998). Гомогенат тромбомаси, мозку та слизовій оболонці шлунка готували з допомогою буферного розчину 0,05М трис- HCl, рН 8,0, та центрифугували 20 хвилин при 13 об/хв. Надосадочну рідину зберігали при температурі от -18°С до -25°С. Солюбілізований препарат ферменту готували за допомогою ТВІН – 20 (USA).

Реакцію ініціювали додаванням спиртового розчину 0,19 мМ арахідонової кислоти (“ALDRICH”, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Riedstr. 2, D-89555 Steinheim, Germany), можливе також використання спиртового розчину метилового ефіру арахідонової кислоти. Довжина хвилі складала 480 нм, час реєстрації показників через 1 хвилину після додавання арахідонової кислоти.

Питому активність виражали в мікромолях арахідонової кислоти, окислених 1 мг білка на протязі 1 хвилини. Ферментативну активність солюбілізованого препарату визначали спектрофотометричним методом, як початкову швидкість накопичення окисленої форми адреналіну за допомогою СФ-56 ЛОМО-спектр (Виноградова Р.П., 2001).

Для визначення концентрації білка в дослідних пробах нами використаний колориметричний метод Лоурі (Л.А. Данилова, 2003).

Отримані результати досліджень оброблялись статистичним методом досліджень з використанням t-критерію Ст’юдента. Всі розрахунки проводили за спеціально розробленими програмами на ПЕОМ.

Результати та їх обговорення. Скринінг нових оригінальних препаратів – похідних норборнену. Дослідження взаємозв’язку між анальгетичним та протизапальним ефектами. Для виконання досліджень в ряду карбоксамідів, їх епоксидних похідних екзо- та ендо-5-амінометілбіцикло[2.2.1.]гепт-2-енов, нами були вибрані переважно n-нітрофенілпохідні, так як речовини, що вміщують цей фрагмент молекул сульфонамідів, виявили високу активність. Предмет нашого дослідження складали 10 сполук сульфанілової кислоти у яких вивчались гостра токсичність за методом Litchfield, Wilcoxon в модифікації В.П. Прозоровського. Вивчення знеболюючої активності проводили за допомогою методу термічного подразнення (“hot plate”), критерієм больового порогу були перші ознаки захистної реакції – вилизування задніх лапок. У процесі пошуку антиексудативної дії ми користувались моделлю асептичного запалення у мишей, викликаючи карагеніновий набряк введенням 1% розчину карагеніну. Отримані дані відображенні у таблиці 1.

Таблиця 1.

Гостра токсичність та специфічна активність похідних норборнену

Шифр | Хімічна формула | Гостра токсичність ЛД50, мг/кг | Анальгетична активність, % у порівнянні з показниками вихідного стану | Протизапальна активність, % у порівнянні з показниками контрольної групи

1 | 2 | 3 | 4 | 5

С-4 |

949±54,0 |

52,37* |

17,28

С-16 |

838±42,0 |

60,46* |

19,77

Продовження табл. 1.

1 | 2 | 3 | 4 | 5

С-20 |

300±21,0 |

84,50* |

21,11

С-39 |

500±7,6 |

45,70* |

15,62

С-43 |

191±22,0 |

33,45* |

23,60

С-45 |

868±74,0 |

134,33* |

75,32**

С-54 |

335±28,9 |

70,28* |

37,33**

С-58 |

123±42,0 |

164,91* |

63,97**

С-62 |

700±47,2 |

25,79 |

17,28

С-63 |

870±54,0 |

166,34* |

70,02**

Примітка: * Р <0,05 – по відношенню до показників вихідного стану

** Р<0,05 – по відношенню показників контрольної групи

Більшість речовин мали середні показники анальгетичної активності від 25,79% (С-62) (Р<0,05) до 84,20% (С-20) (р<0,05). Але деякі сполуку проявили високі показники знеболюючої активності, так С-45 – 134,33% (Р<0,05), С-58 – 164,91 (Р<0,05) та С-63 – 166,34 (Р<0,05). Нами показано, що загалом дані сполуки, поряд з анальгетичними здібностями, характеризувались помірними показниками ослаблення ексудативного процесу. Зокрема, протизапальна активність коливалась в межах від 15,62% (Р>0,05) для С-39 до 23,60% (Р>0,05) для С-43, однак ці дані були не вірогідними по відношенню до контролю. Слід відзначити, що деякі похідні поєднували виражені анальгетичні властивості і протизапальну дію. Так, сполука С-45 знижувала інтенсивність карагенінового набряку на 75,32% (Р<0,05), С-58 - на 63,97% (Р<0,05), С-63 – на 70,02% (Р<0,05). Таким чином, в подальшому ми вважаємо доцільним вивчати такі перспективні похідні норборнену, як засіб С-45, С-58 та С-63 з високими показниками протизапальної активності в поєднанні із знеболюючим ефектом.

Метою наступного фрагменту дослідження було подальше вивчення цих засобів в умовно-терапевтичній дозі 1/10 ЛД50 в порівнянні з відомими класичними НПЗЗ (диклофенак натрію, ацетилсаліцилова кислота, німесулід та целекоксиб) та ННА (метамізол та парацетамол). Крім того, ми вважаємо доцільним дослідити знеболюючі та протизапальні властивості та їх здатність впливати на рівень простагландинсинтетази таких нових засобів, як анальбен, бензофурокаїн, вінборон та пірадозол.

Порівняльна оцінка болезаспокійливої та протизапальної властивостей нових та традиційних неопіоїдних анальгетиків (непрямий метод вивчення антиЦОГ-2 активності). Для оцінки антиноцицептивної активності неопіоїдних анальгетиків використаний метод електричного подразнення кореня хвоста щурів. Оцінку больової чутливості здійснювали по реакції вокалізації в початковому стані та через 30, 60, 90 та 120 хвилин після одноразового внутрішньошлуночного введення препаратів (рис. 1).

Нами встановлено, що у багатьох нових сполук після перорального введення пік анальгетичного ефекту спостерігався на 60 хвилині: у вінборона він складав 84,94% (P<0,05), у пірадозолу - 97,50% (P<0,05), у похіднх норборнену: С-45 – 123,42% (P<0,05), С-58 – 86,82% (P<0,05), відносно показників вихідного стану. Варто зазначити, що анальгетична активність засобу С-45 на 60 хвилині (123,42% (Р<0,05)) була зареєстрована як максимальний результат серед засобів, котрі вивчались, для цього часу експерименту.

Так показано, що на 60 хвилині максимальну болезаспокійливу активність виявили також ацетилсаліцилова кислота 33,54% (Р>0,05), диклофенак натрію 82,74% (P<0,05) та целекоксиб 111,16 % (P<0,05) порівняно з параметрами вихідного стану. Крім того, зазначено, що інші засоби виявили виражений антиноцицептивний ефект на 90 хвилині, до того ж він виявився більш тривалим. Знеболюючий ефект для парацетамолу складав 146,63% (P<0,05), для анальбену 132,73% (P<0,05), для метамізолу - 126,70% (P<0,05), а також для С-63 – 108,22% (P<0,05).

Звертає на себе увагу той факт, що анальгетичний потенціал більшості засобів значно послабився до 120 хвилини досліду, але у деяких засобів залишався ще досить високим. Зокрема для нових засобів він знаходився в межах від 19,89% (Р>0,05) для вінборону; 43,75% (Р<0,05) для пірадозолу; 51,61% (Р<0,05) для бензофурокаїну до 73,21% (Р<0,05) для анальбену. Традиційні анальгетикі також показали суттєве ослаблення болезаспокійливого потенціалу до 120 хвилини експерименту. Так, у диклофенака натрію він знизився до 39,59% (Р>0,05), у целекоксибу - до 54,88 % (Р<0,05).

Найбільш цікавим був результат при вивченні нових похідних норборнену: засоби С-45 та С-58 з піком аналгезії на 60 хвилині 123,42% (Р<0,05) та 86,82% (Р<0,05) відповідно, значно знизили свою болезаспокійливу дію до 120 хвилини для С-45 –49,71% (Р<0,05) і для С-58 – 48,29% (Р>0,05) відносно показників вихідного стану, причому цей результат співставимий із динамікою показників нових анальгетиків, зокрема, як пірадозолу, вінборону та бензофурокаїну. Засіб С-63 на 90 хвилині мав максимальний анальгетичний ефект 108,22% (Р<0,05), а на 120 хвилину 97,78% (Р<0,05). Слід зазначити, що це був найбільш високий показник аналгезії серед всіх засобів, які вивчались на цей час експерименту.

Рис.1. Динаміка змін порогу больового реагування (реакція вокалізації) при електроподразненні кореня хвоста інтактних щурів під впливом нових анальгетиків, похідних норборнену та класичних НПЗЗ

Примітка: * - Р <0,05 – по відношенню до порогу больової чутливості у вихідному стані

Для вивчення механізмів периферичної анальгетичної дії препаратів ми скористались класичною скринінговою моделлю “оцтовокислі корчі”, яки викликались 0,6% розчином оцтової кислоти Згідно отриманих результатів серед нових вітчизняних засобів певну перевагу в болезаспокійливій дії має бензофурокаїн: його анальгетична активність склала 61,44% (Р<0,05), у анальбена та пірадозола вона була дещо нижчою - 59,04% (Р<0,05) і 58,50% (Р<0,05) відповідно. До того ж, вінборон сприяє зменшенню кількості корчів під впливом 0,6% оцтової кислоти на 56,49% (Р<0,05). Як показано нами, більш суттєвий результат показали нові похідні норборнену. Так, анальгетична активність для засобу С- 45 склала 68,86% (Р<0,05), для засобу С–62,88% (Р<0,05), а для засобу С– 64,95% (Р<0,05) – відносно контролю. Так, по здатності зменшувати кількість корчів при введенні 0,6% розчину оцтової кислоти досліджені засоби можна розташувати таким чином: парацетамол 81,86% (Р<0,05) > німесулід 80,05% (Р<0,05) > метамізол 75,82% (Р<0,05) > целекоксиб 69,68% (Р<0,05) > С-45 68,86% (Р<0,05) > диклофенак натрію 65,35%(Р<0,05) > С-63 64,95% (Р<0,05) > С-58 62,95% (Р<0,05) > бензофурокаїн 61,44% (Р<0,05) > анальбен 59,04% (Р<0,05) > пірадозол 58,50% (Р<0,05) > ацетилсаліцилова кислота 57,53% (Р<0,05) > вінборон 56,59% (Р<0,05).

В процесі пошуку інгібіторів ЦОГ на скринінговому етапі вивчення анти- ексудативних властивостей ми використали з флогогенів карагенін, а з лабораторних тварин – білих мишей. Нами встановлено що, згідно отриманих результатів, всім засобам притаманні протизапальні властивості. Зокрема, на рис. 2 показано, що всі засоби проявляють виражену дію послабляти прояви ексудативного набряку.

Рис. 2. Протизапальна активність на моделі карагенінового набряку під впливом внутрішньошлункового введення нових анальгетиків, похідних норборнену та класичних НПЗЗ.

Примітка: * - Р <0,05 – по відношенню до показників контролю

Згідно отриманих нами результатів анальбен, вінборон, бензофурокаїн та пірадозол мали практично однакову антиексудативну здатність, що проявлялось ослабленям ступеню карагенінового набряку на 61,47% (Р<0,05), 62,30% (Р<0,05), 64,49% (Р<0,05) та 58,21% (Р<0,05) відповідно. Нові похідні норборнену мали дещо вищий потенціал в знижені ексудативного набряку: так, С-58 і С-63 володіють протизапальною активністю на 63,97% (Р<0,05) та 70,02% (Р<0,05) відповідно. Цікаво зазначити, що по параметрах протизапальної активності С-63 не поступається такому класичному НПЗЗ, як диклофенак натрію у дозі 10 мг/кг 70,02% (Р<0,05). Нами встановлено, що своєрідним лідером при вивченні протизапальної активності виявився засіб С-45, який ослабляв карагеніновий набряк на 75,32% (Р<0,05) у порівнянні з контрольною групою, та мав перевагу над такими класичними засобами, як диклофенак натрію - 70,02% (Р<0,05), німесулід 67,75%Р<0,05) та целекоксиб 68,13% (Р<0,05).

Таким чином, нами вивчена протизапальна активність нових засобів та похідних норборнену у порівнянні з класичними НПЗЗ. На основі отриманих результатів відмічаємо - всі засоби ослабляли прояви ексудативного набряку: так, по здатності зменшувати набряк, викликаний 1% розчина карагеніну (потенційним флогогеном при вивчені потенційних інгібіторів ЦОГ), досліджені засоби можна розташувати настурним чином: С-45 75,32% (Р<0,05) > С-63 70,02% (Р<0,05) = диклофенак натрію 70,02% (Р<0,05) > целекоксіб 68,13% (Р<0,05) > німесулід 67,75% (Р<0,05) > бензофурокаїн 64,49% (Р<0,05) > С-58 63,97% (Р<0,05) > ацетилсаліцилова кислота 63,88% (Р<0,05) > вінборон 62,30% (Р<0,05) > анальбен 61,47% (Р<0,05) > пірадозол 58,21% (Р<0,05) > парацетамол 40,87% (Р<0,05) > метамізол 31,11% (Р>0,05)

Визначення ульцерогенної дії нових анальгетиків (непрямий метод вивчення антиЦОГ-1 активності). Одним з основних побічних ефектів практично всіх НПЗЗ є ульцерогена дія на слизову оболонку шлунку. При лікуванні протизапальними засобами у 30-40% хворих відмічаються диспепсичні явища, у 10-20% - ерозії і виразки шлунка та дванадцятипалої кишки, у 2-5% - кровотеча та перфорації. Тому ми скористались однією з методик по вивченню можливої гастротоксичної дії досліджуваних засобів. Принцип методу полягає на макроскопічному дослідженні слизистої оболонки шлунків щурів, які одержували засіб на фоні голодування. Оцінку ульцерогенного ефекту проводили візуально по кількості виразкових дефектів, що відображали у балах та виразковому індексу (ВІ).

Використана 4-х бальна шкала: 0 – відсутність змін; 1 – ерозія; 2 – поодинокі виразки; 3 – множинні виразки; 4 – проривні виразки.

Примітка: * - Р <0,05 – по відношенню до показників контролю (голодування)

Рис. 3. Виразковий індекс під впливом дослідних засобів.

Нами встановлено, що група тварин, котра знаходилась на голодуванні мала незначні зміни у слизовій оболонці шлунка (рис. 3). Зокрема на фоні голодування та отримання анальбену 1 мг/кг та бензофурокаїну 5 мг/кг, нами були відзначені зміни у слизовій оболонці при перерахування по формулі в 2,16 балів, що у порівнянні з контрольної групою в 1,44 разів більше та в 3,31разів менше ніж у диклофенаку натрію. Під впливом вінборону 9 мг/кг та пірадозолу 2,5 мг/кг виразковийстан зміни слизової оболонки шлунка оцінювались у 1,66 та 3,16 балів відповідно. Якщо порівнювати ці зміни з показниками групи контролю, то ми відмічаємо зміни у 0,90 разів більше для вінборону та у 2,10 разів більше для пірадозолу.

При оцінки макроскопічних змін при застосуванні похідних норборнену найбільш виразні зміни спостерігались під дією С-63 (87,0 мг/кг), в цьому випадку відмічали появу поодиноких виразок, прояви ерозій та гіперемії, що при перерахуванні відобразилось у 3,83 балах. Після отримання тваринами С-45 (86,7 мг/кг) та С-58 (12,3 мг/кг) зміни у слизовій оболонці оцінювались як помірні та відобразились у 1,83 та 2,33 балах відповідно.

Таким чином, треба відмітити, що нові засоби, похідні норборнену, більш безпечні по відношенню до слизової оболонки шлунку у порівнянні з диклофенаком натрію та АСК.

Дослідження впливу неопіоїдних болезаспокійливих засобів на активність циклооксигенази в умовах проліферативного запалення - ад’ювантний артрит. Найзручнішою для вивчення протизапальних властивостей у щурів є модель так званого “ад’ювантного” артриту, яка вважається найбільш адекватною ревматоїдному артриту (РА) людини. Артрит моделювали згідно з методикою, (“Доклінічні дослідження” за ред. О.В. Стефанова, 2002) в вихідному стані у тварин оцінювали масу тіла, антропометричні розміри суглобів (ширина та товщина), поріг больового реагування при термоподразненні хвоста, показники локомоторної та емоційної поведінки в тесті “відкрите поле”, а також відповідну реакцію при бліц-тесті – “підвішування” за хвіст. Крім того, вказані параметри реєструвались по мірі розвитку артриту та після проведення терапії. По завершенні лікування тварин виводили з експерименту (з обов’язковим виконанням всіх існуючих методичних прийомів). Для більш об’єктивної оцінки протизапального ефекту проводили аналіз периферичної крові, а саме: визначали рівень гексозамінів, серомукоїду та вміст сіалових кислот у сироватці крові та вміст оксіпроліну в сечі.

Перед моделюванням патологічного стану у тварин оцінювався їх вихідний стан, а саме - стан волосяного покрову, маса тіла та розміри суглобів, котрі вимірювали за допомогою інженерного мікрометра. До початку моделювання тварини мали білий, блискучий волосяний покров, слизові оболонки очей чисті, маса тіла коливалась від 152,50±7,58 г (група целекоксибу) до 190,0±20,07 г (група похідного норборнену С-58). Розміром суглобів вважали середнє значення між шириною та товщиною суглоба в см, котрі коливалися від 0,649±0,031 (в групі похідного норборнену С-63) до 0,730±0,043 (група похідного норборнену С-58). На 2-3 день після введення ад’юванту в праву задню лапу у всіх тварин спостерігалось погіршення стану, виражений набряк всієї ступні, інтенсивна гіперемія шкіри. На 14 добу експерименту у всіх групах було відмічено значне збільшення розмірів суглобів в межах від +23,82% (Р<0,05) (група целекоксибу) до +33,28% (Р<0,05) (група похідного норборнену С-63) по відношенню до вихідного стану.

Крім того, нами спостерігалось погіршення стану волосяного покрову: у більшості тварин він потускнів, набув жовтуватого відтінку; до того ж, відмічалась сухість шкіри. У 14,8% тварин зареєстровані прояви кон’юнктивітів. Наприкінці 2 тижнів експерименту тварини схудли в межах від -6,56% (Р>0,05) (група контролю) до -2,52% (Р>0,05) (група похідного норборнену С-58) по відношенню до показників вихідного стану. Після 12-дневного курсу тварини більшості груп практично перестали худнуть; в групі анальбену спостерігався дефіцит маси тіла на 2,55% (Р>0,05), німесуліду - 2,49% (Р>0,05), целекоксібу – 3,82% (Р>0,05) та метамізолу 3,70% (Р>0,05) по відношенню до параметрів вихідного стану, але під впливом ацетилсаліцилової кислоти та С-58 тварини дещо більше схуднули на -5,54% (Р>0,05) і -6,93% (Р>0,05) відповідно.

По закінченні курсу застосування в деяких групах розмір суглоба повернувся майже до показників вихідного стану, що можна вважати проявом протизапального ефекту. Так, в групах, котрі отримували пірадозол 2,5 мг/кг, анальбен 1 мг/кг, вінборон 9 мг/кг та бензофурокаїн 5 мг/кг, після курсу лікування суглоби залишались дещо збільшеними в порівнянні з показниками вихідного стану на +15,0% (Р>0,05), +10,13% (Р>0,05), +11,17% (Р>0,05) та +12,11% (Р>0,05) відповідно. Заслуговують уваги щодо результатів терапії похідними норборнену: за час лікуванням С-58 розмір суглоба зменшився на 18,51% (Р>0,05), але ще залишався збільшеним по відношенню до показників вихідного стану на 14,5% (Р>0,05). Терапія АА засобом С-63 показала: якщо на 14 день розвитку захворювання суглоби в цій групі збільшились на 33,28% (Р>0,05) (це найвищий показник серед всіх дослідних груп), то після 12-денного застосування суглоби були практично того ж розміру, що й у вихідному стану, збільшення залишалось незначне на 8,62% (Р>0,05). Такі ж результати спостерігалися при застосуванні диклофенаку натрію. Нами показано, що С-45 виявився своєрідним лідером: так, після 12-денного курсу лікування розмір суглобів повернувся до показників вихідного стану. Тоді як на піку захворювання розмір суглобів збільшився на 28,92% (Р>0,05), то після курсу терапії вказаним засобом він практично не мав приросту (+2,34% (Р>0,05). Нами встановлено, що в групах, котрі отримували курс лікування традиційними НПЗЗ реєструвалось більш виразне зменшення розміру суглобів порівняно з показниками 14 доби захворювання. Так для целекоксибу, німесуліду та диклофенаку натрію в порівняні з вихідними станом вказані параметри складали +5,29% (Р>0,05), +4,75% (Р>0,05) та +7,47% (Р>0,05) відповідно, тобто суглобі майже повернулись до своїх початкових розмірів.

В групах, які отримували курс лікування парацетамолом та метамізолом, суглоби після курсу терапії залишились дещо збільшеними та з інтенсивною гіперемією, їх розміри складали 0,800±0,030 см та 0,902±0,027 см відповідно, що в порівняні з показниками вихідного стану становило на 17,30% (Р>0,05) і 29,48% (Р>0,05) збільшення відповідно.

Таким чином, при вивченні інтегративних показників тварин в процесі розвитку та лікуванні АА, нами встановлено, що всі засоби, в тій чи іншій мірі виявляють здатність ослаблювати проліферативний процес, котрий викликався ад’ювантом Фрейда. Проте з метою більш об’єктивної оцінки протизапальних властивостей досліджуваних засобів ми вважали доцільним оцінити їх здатність впливати на показники локомоторно-емоційної активності, больової чутливості, та також параметри біохімічних змін (серомукоїдів, сіалових кислот та глікозаміногліканів у сироватці крові та вміст оксіпроліну в сечі) при лікуванні АА. Практично у всіх дослідних групах поліпшилась рухова та дослідна активність (крім груп парацетамолу та метамізолу), у деяких вона майже повернулась до показників вихідного стану (групи диклофенаку натрію, С-45 та німесуліду). Емоційний стан на при кінці прийому дослідних засобів показав дещо суперечливі дані: у деяких групах стан тварин можливо охарактеризувати, як неспокійний (групи С-45, пірадозолу та анальбену).

Як відомо, найчастіше біль при артриті виникає при рухах чи надавлюванні на запалені структури, але інколи можлива і в стані спокою. Ці спостереження підтверджують, що ноцицептори при артриті скоріше сенсибілізовані, ніж стимульовані. Ноцицептори суглобів неадекватно чутливі до стимулів, котрі в звичайних умовах не викликають болю. Це пов’язано зі зниженням порогу чутливості та активацією так званих “мовчазних” ноцицепторів. Тому надсегментарний механізм формування больової відповіді важливий для розуміння ефективності НПЗЗ при лікуванні артритів. В зв’язку з цим нами проведено дослідження впливу термічного подразнення на реакцію тварин в процесі формування артриту та його лікування (рис. 4)

Нами показано, що на початку формування експериментальної патології у тварин час латентного періоду при термоподразненні коливався в наступних межах: найменший показник реєструвався у тварин груп анальбену (3,92±0,58 с) та пірадозолу (3,92±0,45 с), максимальний у тварин групи бензофурокаїн (5,21±0,59 с), інші групи мали проміжні значення.

Примітка: * - Р <0,05 – по відношенню до показників контролю

Рис. 4. Вплив на поріг больового реагування досліджуваних засобів в умовах “ад’ювантного” артриту.

Нами показано, що на початку формування експериментальної патології у тварин час термоподразнення коливався в наступних межах: найменший показник реєструвався у тварин груп анальбену (3,92±0,58 с) та пірадозолу (3,92±0,45 с), максимальний у тварин групи бензофурокаїн (5,21±0,59 с), інші групи мали проміжні значення.

Слід зазначити, що через 14 днів на піку захворювання поріг больового реагування значно зменшився. Зокрема, мінімальні зміни реєструвались у групі метамізолу: зменшення на 9,44% (Р>0,05) відповідної реакції на термічне подразнення у порівнянні з показниками вихідного стану. Проте у тварин групи целекоксибу поріг больового реагування знизився на 20,0% (Р>0,05) у порівнянні з параметрами вихідного стану.

Згідно отриманих нами результатів, на 14 добу захворювання час відповідної реакції на подразнення гарячою водою (t= 60°С) зменшився на 13,52% (Р>0,05) для групи анальбену, на 13,05% (Р>0,05) для групи бензофуракаїну, на 17,11% (Р>0,05) для групи вінборону та на 12,50% (Р>0,05) для групи пірадозолу.

По закінченні курсу терапії цими засобами, були відзначені наступні зміни. Так, під дією анальбену поріг больового реагування збільшився на 12,24% (Р>0,05) у порівнянні з параметрами вихідного стану та на 23,24% (Р<0,05) у порівнянні з показниками контрольної групи (АА без лікування). На фоні 12-деного застосування бензофурокаїну тварини на 8,06% (Р>0,05) довше витримували термоподразнення у порівнянні з показниками вихідного стану та на 57,70% (Р<0,05) у порівнянні з групою контролю. Аналогічні зміни відмічалися в групах вінборону та пірадозолу. Так на фоні терапії цими засобами поріг больового реагування збільшився на 13,33% (Р>0,05) та 14,28% (Р>0,05) відповідно у порівнянні з інтактними тваринами, та на 42,85% (Р<0,05) та 25,49% (Р<0,05) у порівнянні з параметрами контролю.

Нами показано, що на 14 добу формування АА поріг больового реагування знизився на 19,66% (Р>0,05) для тварин групи С-45, на 12,64% (Р>0,05) для групи С-58 та на 11,13% (Р>0,05) для групи С-63 у порівнянні з показниками вихідного стану. Наприкінці 12-деного застосування засобів цієї групи були зафіксовані наступні зміни. Так, під впливом С-45 в дозі (86,6 мг/кг) поріг відповідної реакції на термоподразнення збільшився на 9,24% (Р>0,05) у порівнянні з інтактними тваринами та на 29,13% (Р<0,05) у порівнянні з групою контролю. По закінчені курсу лікування С-58 збільшення часу на термоподразнення ставило 11,26% (Р>0,05) у порівнянні з показниками вихідного стану та 35,57% (Р<0,05) в порівнянні з параметрами контролю. Проте, щодо сполуки С-63, нами були показано, що, латентний період на 14 добі експерименту (3,91±0,47 с) збільшився до 4,85±0,43 с, це відповідає зниженню на 11,13% (Р>0,05) та +10,22% (Р>0,05) у порівнянні з параметрами вихідного стану (4,40±0,58 с) відповідно.

Як зазначає ряд авторів (Dingle J.T., 1990), традиційні НПЗЗ у хворих на РА є потенційно шкідливі щодо хрящової тканини. Однак, натепер невідомо, чи пов’язаний хоч один з описаних раніш побічних ефектів протизапальних засобів по відношенню хрящової тканини з пригніченням ЦОГ? У якості можливого механізму припускають пригнічення синтезу глікозаміногліканів, котрі є компонентом екстрацелюлярного матриксу. При зниженні концентрації протеогліканів опірність хряща механічним навантаженням різко зменшується та хрящова тканина стає більш схильною до пошкоджень. Характерними маркерами запального процесу у суглобі є показники вмісту сіалових кислот, сіроглікоїдів (сіромукоїдів) та глікозаміногліканів (ГАГ) у сироватці крові та вміст оксипроліну у сечі. Дослідження амінокислоти оксипроліну в біологічних рідинах, згідно з даними деяких авторів (О.Н. Надашкевич, 2001), надає інформацію про стан обміну колагену при захворюваннях, що супроводжуються деструктивними процесами в сполучній тканині (ревматоїдний артрит та ін.). Вважається, що вміст оксипроліну, зв’язаного з колагеноподібним білком у плазмі, показує інтенсивність синтезу колагену, тобто свідчить про активність запального процесу. Проведеним аналізом отриманих даних нами встановлено, що практично всі досліджувані засоби знижують вміст сіроглікоїдів та сіалових кислот у порівнянні з показниками контрольної групи (табл. 2). При цьому слід зазначити, що рівень сіромукоїдів у контрольної групи тварин (АА без лікування) перевищував показники інтактних тварин у 4,94 разів, а вміст сіалових кислот у 2,57 разів. Як відомо, протеоглікани, які складаються з різних глікозаміногліканів та зв’язуючих білків, при розпаданні формують відповідні фрагменти, концентрація яких може бути визначена за допомогою біохімічних методів. При артриті глікозаміноглікани із зруйнованих протеогліканів надходять до синовіальної рідини у збільшеній кількості, причому підвищення їх концентрації у біологічних рідинах є ознакою деструкції хряща.

Таблиця 2

Зміна концентрації сіалових кислот, сіромукоїдів та глікозаміногліканів у сироватці крові та

вміст оксипроліну у сечі під впливом досліджуваних засобів в умовах “ад’ювантного” артриту

Препарат | Доза,

мг/кг | Сіалові

кислоти,

ммоль/л | Сіроглікоїди,

г/л | ГАГ,

ммоль/л | Оксипролін,

г/л

Контроль (АА + фізіол. розчин) | 0,1 мл / 100