НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

МАЛЯРЕВСЬКИЙ ПАВЛО ЮРІЙОВИЧ

УДК 612.822:616-005.4:57.086.83

МОДЕЛЮВАННЯ ІШЕМІЧНОГО УШКОДЖЕННЯ МОЗКУ НА ОРГАНОТИПОВІЙ КУЛЬТУРІ ГІПОКАМПУ ТА ВИВЧЕННЯ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЇ ДІЇ L-ФЕНІЛАЛАНІНУ

14.03.04 – Патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

КИЇВ 2006 р.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі цитології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук,

Скибо Галина Григоріївна

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

завідувач відділом цитології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук,

членкор НАН України та

АМН України

Рєзніков Олександр Григорійович

Інститут ендокринології та

обміну речовин ім. В.П.Комісаренко

доктор медичних наук, професор

Ткачук Світлана Сергіївна,

Буковинський державний медичний

університет МОЗ України,

завідувач кафедри фізіології

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця МОЗ України , кафедра патологічної фізіології

Захист відбудеться “___”_____________2006 р. о “___” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26. 198. 01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України (01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4).

Автореферат розісланий “___”_____________2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Мозковий інсульт є одним з найважчих захворювань в усіх країнах світу. Згідно з даними ВООЗ, він щорічно уражує в світі біля 20 млн. людей, з яких 5 млн. вмирають внаслідок цієї патології. В Україні, за даними Центру медичної статистики МОЗ, щорічно реєструються біля 120 тис. інсультів. Рівень смертності від цієї хвороби в економічно розвинутих країнах становить 50-100 випадків на 100 тис. населення за рік, в Україні ця цифра в 2,3 рази більша. Досі не знайдені ефективні засоби корекції нейродегенеративних станів, спричинених ішемією мозку, що визначає очевидну потребу у розробці нових фармакологічних препаратів. При дослідженні специфічних особливостей реакцій нервових клітин на ішемічне пошкодження та вирішенні складних питань виявлення тонких механізмів його патологічної дії на клітинному та молекулярному рівні, широко використовуються моделі in vitro, тобто дослідження, що проводяться на ізольованих органах, тканинах та клітинах (Harry G.J., 1998).

Основними механізмами пошкодження нервової тканини при ішемії вважаються: глутаматна ексайтотоксичність, порушення іонообміну в клітинах, гіперактивація перекисного окиснення ліпідів. Вплив на ці ланки патологічного каскаду є важливим напрямком в розробці нейропротекторів. Найбільш перспективними вважаються речовини, які впливають на розвиток ураження нервових клітин декількома шляхами (Culmsee C., 2004; Kagiyama, 2004; Yam P.S., 2000; Akins P.T., 2002). Зокрема, відомо про множинність дії ароматичних амінокислот, і саме, L-фенілаланіну. Електрофізіологічні дослідження, проведені на дисоційованих культурах гіпокампу, показали, що в ішемічних умовах L-фенілаланін здатний послаблювати вивільнення глутамату, бути конкурентним антагоністом глутаматних рецепторів та, припустимо, має антиоксидантні властивості (Glushakov., 2002, 2003; Kagiyama., 2004; Yarotskyy., 2005). Однак невідомо, як L-фенілаланін впливає на морфо-функціональний стан нейронів в умовах ішемічного ушкодження та механізми його дії, що створює потребу додаткового вивчення впливу L-фенілаланіну. Для вирішення цих питань слушним є моделювання ішемічного ушкодження мозку за допомогою киснево-глюкозній депривації (КГД) на органотиповій культурі гіпокампу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертації пов’язана з дослідженнями, які виконуються відділом цитології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України:

- пошук ефективних засобів впливу на молекулярні механізми, що обумовлюють збудливість клітин;

- дослідження молекулярних механізмів проявів функціонування геному, що зумовлюють специфічність діяльності фізіологічних систем організму в нормі та при патології (№ державної реєстрації 0102U002472).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було розробити модель ішемічного ушкодження мозку in vitro та виявити нейропротекторну дію L-фенілаланіну в цих умовах. Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

1. одержати органотипову культуру гіпокампу та охарактеризувати її життєздатність та морфологічний стан;

2. розробити модель ішемічного ушкодження мозку на органотиповій культурі гіпокампу та визначити критерії її оцінки;

3. вивчити деякі механізми, які задіяні у розвитку ішемічного ушкодження мозку на органотиповій культурі гіпокампу;

4. вивчити дію L-фенілаланіну при моделюванні ішемічного ушкодження мозку;

5. вивчити окремі механізми дії L-фенілаланіну при моделюванні ішемічного ушкодження на органотиповій культурі гіпокампу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексні дослідження по вивченню морфо-функціонального стану культивованих зрізів гіпокампу при КГД різної тривалості.

Розроблена система оцінки морфо-функціонального стану культивованих зрізів гіпокампу за характеристикою їх життєздатності (вимірювання кількості цитозольного ферменту лактатдегідрогенази, визначення концентрації малонового діальдегіду в культуральному середовищі, забарвлення клітин вітальним барвником трипановим синім) та морфологічного аналізу органотипової культури гіпокампу.

Вперше запропоновано можливість застосування моделі короткотривалої КГД на органотиповій культурі гіпокампу для вивчення механізмів нейропротекторних властивостей хімічних речовин.

Вперше виявлено протекторний вплив ароматичної амінокислоти L-фенілаланіну в дослідах на органотиповій культурі гіпокампу в умовах КГД.

Вперше продемонстровано, що L-фенілаланін здійснює свою нейропротекторну дію при ішемічному ушкодженні на органотиповій культурі гіпокампу за рахунок своїх антиглутаматних властивостей.

Вперше показано, що в умовах короткотривалої КГД на моделі органотипової культури гіпокампу у пошкодженні клітин задіяні вільно-радикальні механізми, а механізм протективного впливу L-фенілаланіну пов’язаний з його антиоксидантною дією.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження мають фундаментальне значення для поглиблення відомостей про ішемічне ушкодження мозку. В прикладному аспекті одержані дані вказують на наявність нейропротекторних властивостей у L-фенілаланіну, розширюють уяву про механізми його дії на клітини гіпокампу та припускають потенційну можливість використання ароматичних амінокислот у медичній практиці з метою запобігання ішемічних ушкоджень мозку.

Особистий внесок здобувача. При виконанні роботи здобувачем проведені науковий пошук та обґрунтування вибраного напрямку досліджень. Розроблена модель для тестування та вивчення механізмів дії різноманітних хімічних речовин при ішемічному ушкодженні мозку. Виконані експерименти по вивченню дії L-фенілаланіну в умовах моделювання ішемічного ушкодження мозку. Проведено аналіз одержаних результатів. Виявлені антиглутаматний та антиоксидантний механізми дії L-фенілаланіну. Експериментальна робота по культивуванню органотипової культури гіпокампу проведена спільно з співробітниками відділу цитології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації слухали та обговорювали на: 2nd INMED (The Mediterranean institute of neurobiology) сonference (La Ciotat (France), 2003); VI Міжнародній науково-практичній конференції морфологів України (Львів, 2004); науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження М.І.Зазибіна (Київ, 2004); IBRO (international brain research organization) advanced school of neuroscience (Ялта, 2004); 8-th ECNP (European college of neuropharmacology) Regional meeting (Moscow, 2005); науковій конференції молодих вчених присвяченої пам’яті академіка В.В.Фролькіса (Київ, 2005); 5th international symposium on experimental and clinical neurobiology (Tatranska Lomnica, 2005).

Публікації. Результати дисертації викладені в 11 публікаціях: статті – 5, тези конференцій, симпозіумів – 6.

Структура та об’єм дисертації. Дисертація викладена на 125 сторінках і містить список скорочень, вступ, огляд літератури, розділ матеріалів і методів досліджень, розділ результатів досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновки та список використаних джерел. Робота ілюстрована 18 рисунками, серед яких 7 мікрофотографій. Перелік використаної літератури включає 176 посилання.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Для отримання зрізів гіпокампу використовували щурів 7-денного віку. Після декапітації, гіпокамп обережно видаляли та перекладали в попередньо охолоджене середовище виділення. Далі робили перпендикулярні зрізи гіпокампу використовуючи спеціальний прилад для нарізання тканинних зрізів - чопер (McIlwain tissue chopper, Англія). Товщина зрізів становила 300-400 мкм. За допомогою обрізаної пастерівської піпетки зрізи переносилися до чашки Петрі з середовищем виділення. Під візуальним контролем за допомогою мікроскопа ретельно відбиралися зрізи, що не мали ніяких ознак ушкодження для подальшого культивування. Культивування проводили у 6-лункових планшетах, використовуючи додатково спеціальні вкладиші з проникною мембраною, яка забезпечує проходження через неї розчинних речовин. Один мілілітр середовища культивування (50% МЕМ, 25% збалансованого сольового розчину Хенкса, 25% інактивованої кінської сироватки, рН 7.3) додавався в кожну лунку. Стерильні проникні вкладиші діаметром 30 мм та з розмірами пор 0,4 мкм (Millicell-CM, Millipore) були розташовані в кожній лунці та змочувалися середовищем культивування. Планшет залишали в СО2 інкубаторі (суміш атмосферного повітря з 5% СО2) не менш ніж на 1 годину для стабілізації температури (370С) та рН середовища культивування, до того часу, коли на них будуть розташовані зрізи. Середовище культивування змінювалось наступного дня та надалі двічі на тиждень. Розвиток культивованих зрізів контролювався з допомогою інвертованого світлового мікроскопа Zeiss Telaval 31. На 12-14 день зрізи були готові для проведення експерименту(Stoppini, 1991; Fedoroff S., 2001).

Для моделювання ішемічних умов використовували киснево-глюкозну депривацію (КГД), яка створювалась у спеціальній камері, де газове середовище містило 95 % азоту (N2) і 5 % СО2, а рідке середовище – HBSS (H-8264, Sigma), 12,5 ммоль Hepes (Cat. 15630-056, Gibco) з додаванням сахарози (15 ммоль D-сахарози, AppliChem) замість глюкози (сахароза не може бути використана нервовими клітинами для енергетичних потреб, але утримує осмолярність розчину). Температура підтримувалась на рівні +35оС. Після необхідного періоду КГД (10, 30 та 60 хвилин) зрізи поверталися до нормальних умов культивування в середовище для експерименту на 1, 4 або 24 години (нормоксична реоксигенація).

Загальну життєздатність культивованих зрізів гіпокмапу оцінювали за зміною кількості лактат-дегідрогенази (ЛДГ) у культуральному середовищі колориметричним методом за допомогою kit G1780 (“Promega”, USA). Зміни кількості ЛДГ у культуральному середовищі виражали в % від максимального пошкодження клітин органотипової культури гіпокампу. Для визначення максимального пошкодження клітини культивованих зрізів гіпокампу лізували, розміщуючи їх на 10 хвилин в чашці Петрі з 1 мл лізуючого розчину, який входить до складу kit G1780. Для дослідження відбирали 50 мкл культурального середовища.

Життєздатність нейронів СА1 зони гіпокампу оцінювали за методом виключення вітального барвника трипанового синього (Noraberg J., 1999). Кількість забарвлених клітин підраховували у СА1 ділянці в межах прямокутної зони фіксованого розміру.

Активність перекисного окислення ліпідів оцінювали по накопиченню в культуральному середовищі одного з його кінцевих продуктів – малонового діальдегіду (МДА) – колориметричним методом в мікромодифікації. Зміни кількості МДА у культуральному середовищі виражали в одиницях екстинції.

Для морфологічної оцінки культивовані зрізи, зафіксовані у суміші 2,5% формальдегіду та 2,5% глютаральдегіду, заключали у епоксидну смолу за загальноприйнятою методикою. Напівтонкі зрізи (1-2 мкм завтовшки) забарвлювали метиленовим синім. Морфологічний аналіз проводили за допомогою світлового мікроскопу Zeiss Jena (збільшення Ч1000). Підраховували кількість нормальних, конденсованих та набряклих нейронів у СА1 зоні культивованих зрізів гіпокампу з розрахунку сто клітин на кожний зріз.

Статистичну обробку даних проводили за t-критерієм Стьюдента, відмінності вважалися достовірними при p<0,05. Представлені дані є результатом, що найменше, трьох незалежних експериментів, з врахуванням даних по 3-4 зрізам в кожному.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Об’єктом наших досліджень була обрана органотипова культура гіпокампу оскільки, як відомо, гіпокамп є дуже чутливий до нестачі кисню та глюкози, що виникає при ішемії. В умовах цієї культури зберігається цитоархітектоніка тканини, типи клітин та шарів, первинні міжклітинні зв’язки, синаптична організація, розташування рецепторів, які сформовані в природних умовах (Stoppini L., 1991; Buddle M., 2003). Крім того, присутній прямий доступ до позаклітинного простору, що дозволяє, з одного боку, легко контролювати умови життєдіяльності тканини (склад солей та метаболітів, pH, газове насичення та т.п.), а з іншого – надає можливість прямого впливу на тканину хімічними речовинами потрібної концентрації. Протягом 12-14 днів культивування зрізи гіпокампу повністю очищувалися від клітин, пошкоджених під час виділення, та досягали стабільного стану. Оцінка органотипових зрізів гіпокампу проводилась шляхом визначення ферменту ЛДГ, забарвлення зрізів вітальним барвником трипановим синім та з допомогою морфологічного аналізу напівтонких зрізів. Морфо-функціональна оцінка, як усіх нервових клітин культивованих зрізів гіпокампу, так і СА1 нейронів гіпокампу, продемонструвала високу якість та життєздатність органотипових культур гіпокампу, що дозволяло нам використовувати цей об’єкт у подальших дослідженнях.

Найчастіше для моделювання ішемічних умов in vitro використовують КГД (Lipton P., 1999). У своїй роботі для визначення оптимального терміну КГД, що дозволило б проводити тестування та дослідження механізмів дії ароматичної амінокислоти L-фенілаланіну, ми окремою серією експериментів визначили вплив КГД різної тривалості (10, 30 та 60-хвилин) на життєдіяльність органотипової культури гіпокампу. Динаміку розвитку ішемічного пошкодження спостерігали відразу після завершення КГД, через 1, 4 та 24 години. Життєздатність нервових клітин культивованих зрізів оцінювали за допомогою цитозольного ферменту ЛДГ та вітального барвника трипанового синього. Відразу після КГД рівень ЛДГ у культуральному середовищі достовірно не відрізнявся від контролю. Через одну годину реоксигенації кількість ЛДГ в культуральному середовищі від зрізів, що піддавалися впливу 10-хвилинної КГД був несуттєво вищий у порівнянні з контрольними. Протягом 4 та 24 годин розвивалося ушкодження і рівень ЛДГ досягав 32,1±8,2 % (р<0,05) та 60,1±1,5 % (p<0,001), відповідно. Вплив 30- та 60-хвилинної КГД проявлявся вже протягомпершої години. Рівень ЛДГ складав 45,4±9,6 % (p<0,01) і 62,1±9,9 % (p<0,01), відповідно. Через 4 та 24 години показники кількості ферменту значно збільшувалися: до 60,8±12,4 і 90,5±1,9 % (p<0,001) після 30-хв КГД; та до 64,2±8,7 і 98,6±1,4 % (p<0,001) після 60-хв (рис. ).

Аналогічні тенденції мали і результати підрахунку числа ушкоджених нейронів СА1 зони, які були забарвлені трипановим синім.

Дані результати засвідчили залежність ступеню життєздатності нейронів культивованих зрізів гіпокампу від тривалості КГД та часу, який минає з моменту її припинення. Короткотривала 10-хвилинна КГД здійснює пошкоджуючий вплив на органотипову культуру гіпокампу м’яко та поступово, що дає можливість проводити дослідження механізмів, які приймають участь у розвитку ішемічного ушкодження, та вивчати нейропротективну дію L-фенілаланіну.

Оцінка культур за допомогою забарвлення трипановим синім та за відносною кількістю ферменту ЛДГ у культуральному середовищі, враховує зміни, які пов’язані з порушеннями цілісності клітинних мембран. Для більш детального вивчення морфологічних змін органотипової культури гіпокампу в умовах короткотривалої (10 хвилин) КГД, нами був проведений аналіз напівтонких зрізів після заключення тканини у смолу. Оцінювали стан нейронів СА1 зони за такими критеріями: нормальні клітини (нейрони з незміненими ядром та цитоплазмою), конденсовані клітини (гіперхромні нейрони, з конденсованими ядрами та цитоплазмою) та набряклі клітини (нейрони, які мали просвітлену цитоплазму та світле набрякле ядро).

Рис. . Відносна кількість ферменту ЛДГ в культуральному середовищі органотипових зрізів гіпокампу в умовах КГД різної тривалості (10, 30 та 60 хв.) та подальшої реоксигенації (1, 4 та 24 год.).

За сучасними даними визначають два основні типа загибелі клітин унаслідок ішемічного ушкодження мозку: апоптоз та некроз (Lipton P., 1999).

При цьому, для клітин, що гинуть шляхом апоптозу, характерна конденсація ядра та цитоплазми зі збереженням цілісності зовнішньої мембрани. Однією з основних характеристик некрозу клітин є пошкодження плазматичної мембрани. Клітини втрачають здатність зберігати свій гомеостаз, виникають порушенню іонного обміну, що призводить до набухання клітини. Наші спостереження дають змогу, в деякій мірі, проводити аналогію між ознаками, характерними для апоптозу та некрозу та вибраними нами критеріями для оцінки деструктивних змін унаслідок КГД. Можна припустити, що конденсовані клітини – апоптичні, а набряклі – некротичні. Для обґрунтування припущень щодо апоптозу і некрозу, недостатньо оцінювати особливості морфологічних змін, необхідні детальні дослідження на молекулярному рівні (Лушніков, 2001; Miyazaki K.,2001; Holler N., 2000; Hetz C.A., 2002). Оскільки нашою метою було створення адекватної моделі ішемічного ушкодження та виявлення нейропротекторної дії L-фенілаланіну, а не вивчення процесів апоптозу і некрозу, ми обмежувалися характеристикою морфологічних ознак ушкодження клітин, тобто кількості конденсованих та набряклих клітин.

При морфологічному аналізі контрольних зрізів СА1 зону гіпокампу складали неушкоджені клітини. Через одну годину після проведеної 10-хвилинної КГД нами виявлена наявність ушкоджених СА1 нейронів: приблизно 20 % від загальної кількості нейронів – конденсованих, та незначна кількість набряклих. Через чотири години - кількість ушкоджених клітин досягала 75 %. Треба відмітити, що в умовах, використаної нами моделі переважна кількість ушкоджених клітин була конденсованими. Оцінка забарвлених трипановим синім СА1 нейронів, як було описано вище, не виявляла значних змін через 1 годину після 10 хвилинної КГД, тоді як результати мікроскопічного аналізу вже через одну годину після КГД виявили значну різницю у співвідношенні різних типів ушкодження СА1 нейронів в умовах КГД, а саме в збільшенні кількості конденсованих клітин.

Таким чином, для подальших досліджень нами була обрана експериментальна модель ішемічного ушкодження гіпокампу за такою схемою: 1) КГД - 10 хвилин; 2) культивування в нормальних умовах; 3) тестування культур через 1 та 4 години. Така модель є слушною для виявлення можливої нейропротекторної дії фармакологічних речовин при ішемічному ушкодженні мозку.

Відомо, що розвиток пошкодження мозку при ішемії пов’язаний з дією глутамату та вільних радикалів. Щоб оцінити вплив глутамату в нашій моделі ішемічного ушкодження на життєздатність клітин органотипової культури гіпокампу нами був використаний антагоніст глутаматних рецепторів МК-801. Він, як показано в літературі, блокує глутаматні NMDA-рецептори та зменшує деструктивні зміни нейронів в ішемічних умовах (Sullivan B.L., 2002; Nikonenko I., 2003 Jones P.A., 2004; Woo R.S., 2002). Оцінку участі вільних радикалів в умовах нашої моделі проводили за допомогою U-74389G, речовини, яка належить до групи лазароїдів (21-аміностероїдів) та здатна знижувати перекисне окиснення ліпідів. Механізм дії лазароїдів пояснюється перешкоджанням окисненню полієнових ліпідів мембран, подібно до природного антиоксиданту б-токоферола. Лазароїди мають великий мембрано-стабілізуючий ефект, завдяки власній високій спорідненості до ліпідного бішару та здатності вбудовуватись у клітинну мембрану, знижуючи тим самим її плинність (Kavanagh R.J., 2001). За літературними даними U-74389G використовувався на моделях нейронального ушкодження in vitro з метою інгібування процесів перекисного окиснення ліпідів (Durmaz, 1999; Vlkolinsky, 1999). В наших дослідженнях МК-801 (10 мкМ) та U-74389G (25 мкМ) додавалися до культурального середовища за 30 хвилин до КГД. Оцінка життєздатності проводилась через 4 години після 10 хвилинної КГД.

Рівень ферменту ЛДГ у культуральному середовищі в умовах КГД зростав з 3,8±0,2 % у контролі до 14,9±2,1 % (p<0,001) через 4 години. У присутності МК-801 та U-74389G ці показники становили 7,6±1,4% (p<0,05) та 8,1±1,5% (p<0,05) відповідно (рис. ).

Рис. 2. Відносна кількість ферменту ЛДГ в культуральному середовищі органотипових зрізів гіпокампу в умовах КГД (10 хв.) та подальшої реоксигенації (4 год.) в присутності U-74389G та МК-801.

Аналогічні тенденції мали результати обчислення СА1 нейронів, забарвлених трипановим синім та визначення в культуральному середовищі МДА. Дані результати свідчать, що глутамат і вільні радикали задіяні у пошкодження клітин в умовах нашої моделі.

В роботах останніх років з’явилися дані про наявність у деяких ароматичних амінокислот (фенілаланіну, тирозину) та їх похідних (наприклад, дійод-, дібромтірозіну) нейропротекторних властивостей (Glushakov., 2002, 2003; Kagiyama., 2004; Yarotskyy., 2005). В електрофізіологічних дослідженнях на гіпокампальній та цереброкортикальній диссоційованих культурах в умовах моделювання ішемічного ушкодження мозку автори використовували L-фенілаланін в концентраціях від 50 мкМ до 10 мМ. В наших пілотних дослідженнях був вивчений вплив різних концентрацій L-фенілаланіну (від 5 до 500 мкМ) на органотипову культуру гіпокампу в умовах короткотривалої КГД. Оцінку проводили з допомогою вітального барвника трипанового синього. Виявлено, що найбільш виражений, достовірний нейропротекторний ефект L-фенілаланіну в умовах нашої експериментальної моделі проявляється у концентрації 100 мкМ. Таким чином, у подальших дослідженнях для детального вивчення нейропротекторної дії L-фенілаланіну в умовах КГД, ми використовували 100 мкМ L-фенілаланін. Виходячи з наших результатів і даних літератури, така концентрація є ефективною та не має негативних наслідків.

Для вивчення нейропротекторної дії L-фенілаланіну використовувалась наступна схема: 1) внесення L-фенілаланіну в концентрації 100 мкМ до культурального середовища за 30 хвилин до КГД; 2) 10 хвилинна КГД; 3) повернення зрізів до культурального середовища з 100 мкМ L-фенілаланіну; 4) морфо-функціональна оцінка зрізів (ЛДГ, трипановий синій, морфологія) через 1 та 4 години (рис. .).

Рис. 3. Схема експерименту вивчення дії L- фенілаланіну в умовах моделювання ішемічного ушкодження мозку.

Результати оцінки життєздатності культивованих зрізів гіпокампу (за даними ЛДГ) та зокрема СА1 нейронів (за даними забарвлення трипановим синім) продемонстрували, що присутність L-фенілаланіну у культуральному середовищі в значній мірі запобігає ушкодженню та загибелі клітин в умовах КГД. У контролі кількість ЛДГ була незначною. Через 1 годину рівень ферменту у культуральному середовищі зрізів, які знаходились в умовах КГД, становив 10,0±2,9 % (2,7±0,7 % у контролі), а через 4 години – 25,8±4,4 % (у контролі цей показник був 3,5±0,5 %). В присутності L-фенілаланіну показники вмісту ЛДГ у культуральному середовищі були значно меншими - 5,5±2,1% та 14,6±2,4% відповідно (p<0,01) (Рис. 4.).

Рис. 4. Відносна кількість ферменту ЛДГ в культуральному середовищі органотипових зрізів гіпокампу при дії L-фенілаланіну в нормальних умовах та після КГД (10 хв.) і реоксигенації (1 та 4 год.).

В результаті оцінки життєздатності нейронів СА1 зони органотипової культури гіпокампа при забарвленні трипановим синім виявлено, що у контрольних зрізах їх кількість була незначною та становила 1,3±0,4. Через 4 години після 10-хвилинної КГД цей показник збільшувався до 28,9±2,7 (p<0,001). У присутності в середовищі 100 мкМ L-фенілаланіну, кількість СА1 нейронів, забарвлених трипановим синім в умовах КГД, було значно меншою - 15,3±2,0 (p<0,001).

Мікроскопічний аналіз напівтонких зрізів органотипових культур гіпокампу при дії L-фенілаланіну виявив позитивні зміни у співвідношенні нормальних, конденсованих та набряклих клітин у СА1 зоні культивованих зрізів в умовах КГД. Показано, що за першу годину після 10 хв. КГД кількість нормальних СА1 нейронів становила 79,6±0,3 відносно загальної кількості клітин у зоні підрахунку (97,4±0,9 у контролі, р<0,001), кількість конденсованих клітин збільшувалася з 2,7±0,9 у контролі до 18,0±0,3 після КГД (р<0,001), з’являлася незначна кількість набряклих клітин. Після 4 годин зміни у співвідношенні різних типів клітин були ще більш виражені: 25,5±3,6 - нормальні (р<0,001), 58,8±1,6 - конденсовані (р<0,001) та 15,7±1,6 – набряклі (р<0,01) СА1 нейрони (рис.5.).

Рис. 5. Співвідношення нормальних, конденсованих та набряклих СА1 нейронів культивованих зрізів гіпокампу при дії L-фенілаланіну після КГД (10 хв) і реоксигенації (1 та 4 год).

Обробка культур L-фенілаланіном за 30 хв. до КГД призвела до того, що після 1 години реоксигенації неушкоджених, нормальних нейронів виявляється більше - 88,1±1,6 (p<0,001); а ушкоджених (конденсованих і набряклих) менше – 10,4±1,1 (p<0,001) та 1,6±0,8 (p<0,01).

Аналіз співвідношення різних типів клітин через 4 години реоксигенації продемонстрував збільшення кількості нормальних нейронів до 52,2±3,6 (p<0,001); разом з цим стає менше конденсованих і набряклих - 46,3±4,1 (р<0,05) та 1,5±1,5 (р<0,01).

Нейропротекторний вплив L-фенілаланіну виявлений також при додаванні його у середовище на різних стадіях ушкодження. Показано, що L-фенілаланін, внесений у середовище культивування під час КГД та відразу після 10 хв. КГД, проявляє протективну властивість.

Як видно на рис. при внесенні його під час КГД співвідношення клітин у СА1 зоні було: нормальних нейронів - 50,9±6,7 (р<0,01), конденсованих – 45,4±4,9 (р<0,05), набряклих – 3,7±1,9 (p<0,001). Результатом додавання відразу після закінчення КГД було наступне співвідношення: нормальних - 48,4±4,7 (p<0,001), конденсованих - 46,5±4,1 (р<0,05) та набряклих - 5,1±1,9 (р<0,01). Таким чином, результати морфологічного аналізу СА1 нейронів показали, що нейропротекторна дія L-фенілаланіну проявляється при додаванні його на різних стадіях патологічного процесу.

Для виявлення можливих механізмів дії L-фенілаланіну в умовах КГД, та враховуючи ключову роль нейромедіатора глутамата в цьому процесі, ми співставили результати впливу L-фенілаланіну, отримані при КГД з результатами його впливу при дії глутамату, припускаючи, що при розвитку ушкодження в умовах КГД L-фенілаланін може діяти на глутаматну ланку. Виходячи з даних літератури (Culmsee C., 2004) та на основі емпірично-підібраної концентрації глутамату, яка здійснювала на органотипову культуру гіпокампу ушкодження, адекватне тому, що ми спостерігали при КГД та маючи намір виявити ефекти L-фенілаланіну в умовах глутамату, ми провели дослідження по такій схемі: 1) L-фенілаланін у концентрації 100 мкМ додавали до культурального середовища на 30 хвилин; 2) 500 мкМ глутамату вносили у середовище на 30 хвилин; 3) повернення зрізів до культурального середовища, яке містило 100 мкМ L-фенілаланіну; 4) фіксування органотипової культури через 1 і 4 години; 5) морфологічний аналіз культивованих зрізів. Через одну годину після впливу глутамату кількість нормальних нейронів становила 55,2±2,1 (р<0,001) (97,4,9 у контролі), конденсованих клітин - 44,9,2 (р<0,001) (2,7,9 у контролі). Через 4 години виявлені зміни співвідношення клітин були ще більш виражені: 30,6,1 - нормальні (р<0,001) та 69,4±3,0 - конденсовані (р<0,001). Таким чином, ефекти глутамату, у відношенні кількості нормальних та конденсованих клітин подібні до тих, які спостерігаються при КГД. Показано, що протягомпершої години після вилучення глутамату присутність L-фенілаланіну призводить до того, що кількість неушкоджених нейронів стає більшою (72,1±3,3 (р<0,001)) на 31 %, а конденсованих меншою (27,9±3,3 (р<0,001)) на 48 %, по відношенню до дії глутамату. У 4-годинний термін L-фенілаланін продемонстрував ще більш виражений ефект: нормальних нейронів 56,6±6,6 (p<0,01); конденсованих - 43,4±6,6 (p<0,05), на 85 та 48 % відповідно у порівнянні з дією глутамату (рис. .).

Рис. . Співвідношення нормальних та конденсованих СА1 нейронів культивованих зрізів гіпокампу при дії L-фенілаланіну через 4 год після впливу глутамату (500 мкМ).

Співставляючи ці дані з отриманими при КГД, можна припустити, що в умовах використаних моделей L-фенілаланін здійснює свій нейропротекторний вплив, частково через конкурентне зв’язування глутаматних рецепторів, але, враховуючи, що ушкодження у деякій мірі розвивається, напевно задіяні й інші механізми.

Як було показано вище у пошкодженні клітин в умовах нашої моделі задіяний не тільки глутамат, а й вільні радикали. З літератури відомо, що L-фенілаланін має, крім антиглутаматних, антиоксидантні властивості (Kagiyama., 2004). З цією метою нами проводилася оцінка рівня перекисного окиснення ліпідів за даними кількості малонового диальдегіду у культуральному середовищі при дії L-фенілаланіну в нормі та в умовах КГД. Рівень МДА в контролі дорівнював 12,8±0,8 одиниць екстинції. Після КГД та 4-х годин реоксигенації цей параметр зростав до 47,6±5,9 (p<0,001). Присутність L-фенілаланіну у культуральному середовищі в умовах КГД запобігало підвищенню перекисного окиснення ліпідів, а рівень МДА був меншим 32,6±2,4 (p<0,05) (рис 7.).

Рис. 7. Рівень МДА в культуральному середовищі органотипових зрізів гіпокампу при дії L-фенілаланіну в нормальних умовах та після КГД (10 хв) і реоксигенації (4 год).

Отже механізм протективної впливу L-фенілаланіну в певній мірі пов’язаний з його антиоксидантною дією.

Таким чином, аналіз впливу L-фенілаланіну на морфо-функціональний стан культивованих зрізів гіпокампу в умовах експериментально викликаної ішемії показав, що L-фенілаланін має нейропротекторну дію, яка здійснюється через антиглутаматні та антиоксидантні механізми. Ці результати припускають потенційну можливість використання ароматичних амінокислот у медичній практиці з метою запобігання ішемічних ушкоджень мозку.

ВИСНОВКИ

1. В дисертаційній роботі короткотривала киснево-глюкозна депривація була використана для моделювання ішемічного ушкодження мозку на органотиповій культурі гіпокампа. Ця модель застосовувалась для дослідження особливостей розвитку та механізмів ураження нервових клітин, а також для тестування нейропротекторних властивостей L-фенілаланіну.

2. На підставі аналізу морфо-функціональних змін нервових клітин органотипової культури гіпокампу в умовах киснево-глюкозної депривації за допомогою оцінки життєздатності зрізів (за рівнем цитозольного ферменту лактат-дегідрогенази у культуральному середовищі та забарвленням зрізів трипановим синім) та морфологічних змін СА1 нейронів гіпокампу (світлова мікроскопія) встановлено залежність життєздатності нейронів культивованих зрізів гіпокампу від тривалості киснево-глюкозної депривації та часу, що минає з моменту її припинення.

3. З’ясовано, що короткотривала (10 хвилин) киснево-глюкозна депривація є найбільш слушною для вивчення особливостей і механізмів ішемічного ушкодження нервової тканини при дефіциті кисню і глюкози та для виявлення нейропротекторної дії L-фенілаланіну.

4. Встановлено, що в умовах короткотривалої киснево-глюкозної депривації, ушкодження клітин культивованих зрізів гіпокампу пов’язане, як з глутаматною ексайтотоксичністю, так і з дією вільних радикалів.

5. Показано, що L-фенілаланін, у використаній концентрації, має виражену нейропротекторну дію в умовах моделювання ішемічного ушкодження на органотиповій культурі гіпокампу при додаванні його як за 30 хвилин до киснево-глюкозної депривації, так і при його введенні у культуральне середовище під час або відразу після киснево-глюкозної депривації.

6. Встановлено, що в умовах киснево-глюкозної депривації L-фенілаланін здійснює свій нейропротекторний вплив, частково через конкурентне зв’язування глутаматних рецепторів, а частково завдяки антиоксидантним властивостям.

Список опублікованих за темою дисертації робіт

Статті:

1. Lushnikova I.V., Voronin K., Malyarevskyy P.Y., Skibo G.G. Morphological and functional changes in rat hippocampal slice cultures after short-term oxygen-glucose deprivation // J.Cell. Mol.Med. – 2004. – Vol. 8, № 2. – Р. 241-248.

2. Лушнікова І.В., Воронін К.Ю., Маляревський П.Ю., Сможаник К.Г., Скибо Г.Г. Вплив киснево-глюкозної депривації різної тривалості на культивовані зрізи гіпокампа щурів // Фізіол. журн., – 2004. – Т.50, № 2, С. 94-100.

3. Лушнікова І.В., Воронін К.Ю., Маляревський П.Ю., Сможаник К.Г., Скибо Г.Г. Характеристика моделі ішемічного ушкодження гіпокампа in vitro // Клінічна та експериментальна патологія. – 2004. – Т. 3, № 2, Ч. 1. – С. 255-257.

4. Лушнікова І.В., Воронін К.Ю., Маляревський П.Ю., Скибо Г.Г. Ефекти короткотривалої киснево-глюкозної деривації у культивованих зрізах гіпокампу щурів // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького. – 2004. – Т. 6, № 1, Ч. 2. – С. 208-213.

5. Маляревський П.Ю., Лушнікова І.В., Воронін К.Ю., Сможаник К.Г., Мартинюк А.Є., Скибо Г.Г. Проективна дія L-фенілаланіну в умовах експериментальної ішемії мозку на моделі культивованих зрізів гіпокампу // Запорожский медицинский журнал. – 2005. - № 6. – С. 102-105.

Тези доповідей:

1. Lushnikova I.V., Voronin K., Malyarevskyy P.Y., Berezin V.A., Bock E., Skibo G.G. Effects of mild ischemia on neuronal and synaptic plasticity in cell and slice cultures // Transmitters and guiding signals in the formation of cortical networks: 2nd INMED Conference (17-21 вересня 2003 р.). – La Ciotat, France: INMED, 2003. – Р.13.

2. Скибо Г.Г., Коваленко Т.Н., Осадченко І.А., Лушнікова І.В., Воронін К.Ю., Маляревський П.Ю. Нейродегенеративні зміни в гіпокампі при експериментальному ішемічному ушкодженні // Гістологія та ембріогенез периферійної нервової ситеми: Матеріали наукової конференції присвяченої 100-річчю з дня народження М.І.Зазибіна. –Київ: Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, 2004. – С. 59.

3. Malyarevskyy P.Y., Lushnikova I.V., Martynyuk A.E., Skibo G.G.. Protective effect of L-Phe in hippocampal slice culture exposed to oxygen-glucose deprivation // IBRO advanced school of neuroscience: abstract book. – Yalta: IASN 2004. – Poster 27.

4. Malyarevskyy P.Y., Lushnikova I.V., Martynyuk A.E., Skibo G.G. The study of protective properties of L-Phenylalanine on the model of stroke (hippocampal slice culture exposed to oxygen-glucose deprivation) // The journal of the European college of Neuropsychopharmacology. – 2005. – Vol. 15, Suppl. 2. – P. S260.

5. Маляревський П.Ю., Лушнікова І.В., Скибо Г.Г. Протективна дія L-фенілаланіну при експериментальній ішемії на культивованих зрізах гіпокампу // Наукова конференція молодих вчених “Актуальні проблеми старіння”: тези доповідей (28 січня 2005 р.). – Київ: Інститут геронтології АМН України, 2005. – С.106-107.

6. Malyarevskyy P.Y., Lushnikova I.V., Voronin K.Y., Martynyuk A.E., Skibo G.G. Neuroprotective action of L-Phenylalanine in rat hippocampal slice cultures // 5th international symposium on experimental and clinical neurobiology (19-22 вересня 2005р.). – Tatranska Lomnica, 2005. – Р. 65.

АНОТАЦІЯ

Маляревський П.Ю. Моделювання ішемічного ушкодження мозку на органотиповій культурі гіпокампу та вивчення нейропротекторної дії L-фенілаланіну. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04. –патологічна фізіологія. – Інститут фізіології

ім.О.О.Богомольця НАН України, Київ – 2006.

Дисертація присвячена розробці моделі ішемічного ушкодження мозку на органотиповій культурі гіпокампу та пошуку нових ефективних засобів нейропротекції. Відомо, що ароматичні амінокислоти, а саме L-фенілаланін, має виражену нейропротективну дію, але механізми цієї дії вивчені недостатньо. Ми досліджували вплив L-фенілаланіну на життєздатність та морфологію СА1 нейронів культивованих зрізів гіпокампу в умовах експериментально викликаної ішемії. Проведена морфо-функціональна оцінка культивованих зрізів після киснево-глюкозної депривації (КГД) різної тривалості через 1, 4 і 24 години. Для тестування L-фенілаланіну була обрана короткотривала (10 хв.) КГД з часом спостереження 1 та 4 години. L-фенілаланін (100 мкМ) був присутнім у культуральному середовищі за 30 хв. до КГД, під час КГД та протягом реоксигенації. Оцінювали життєздатність клітин культивованих зрізів гіпокампа та морфологію нейронів СА1 зоні. Результати показали, що додавання L-фенілаланіну суттєво підвищувало життєздатність клітин, та зменшувало морфологічні ознаки ішемічного ушкодження. Таким чином, L-фенілаланін має протективну дію в умовах експериментально викликаної ішемії, що припускає потенційну можливість використання ароматичних амінокислот у медичній практиці з метою запобігання ішемічних ушкоджень мозку.

Ключові слова: киснево-глюкозна депривація, культивовані зрізи гіпокампу, L-фенілаланін.

АННОТАЦИЯ

Маляревский П.Ю. Моделирование ишемического повреждения мозга на органотипической культуре гипокампа и изучение нейропротекторного действия L-фенилаланина. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04. – патологическая физиология. – Институт физиологии им.А.А.Богомольца НАН Украины, Киев – 2006.

Дисертация посвящена разработке модели ишемического повреждения мозга на органотипической культуре гипокампа и поиску новых эффективних средств нейропротекции. Известно, что ароматические аминокислоты, а именно L-фенилаланин, имеет выраженное нейропротективное действие, однако механизмы такого действия изучены недостаточно. Мы изучали влияние L-фенилаланина на жизнеспособность и морфологию СА1 нейронов культивируемых срезов гиппокампа в условиях экспериментально вызванной ишемии. Проведена морфо-функциональная оценка культивируемых срезов гиппокампа после кислород-глюкозной депривации (КГД) разной длительности через 1, 4 и 24 часа.

Для тестирования L-фенилаланина була выбрана кратковременная (10 мин.) КГД со временем наблюдения 1 та 4 часа. L-Фенилаланин (100 мкМ) присутствовал в культуральной среде за 30 мин до КГД, во время КГД и на протяжении реоксигенации. Результаты оценки жизнеспособности культивируемых срезов гиппокампа в целом (по данным ЛДГ) и СА1 нейронов в частности (по данным окраски трипановым синим) продемонстрировали, что присутствие L-фенилаланина в культуральной среде в значительной мере предотвращает повреждение и гибель клеток в условиях КГД. Выявлено, что в четырех-часовой срок исследования культур, когда повреждение клеток после КГД достаточно выражено, добавление L-фенилаланина приводит к тому, что относительное количество ЛДГ в среде и количество окрашенных СА1 нейронов становиться достоверно меньшим. Морфологические данные тоже продемонстрировали достоверное увеличение неповрежденных СА1 нейронов в случаях, когда L-фенилаланин присутствовал в культуральной середе за 30 минут до проведения КГД. Эти изменения были наглядными уже через один час и становились еще больше выраженными в 4-часовый срок исследования после КГД. Наблюдалось наличие большего числа нормальных СА1 нейронов и меньшего – поврежденных: конденсированных и отечных. Также нами было показано, что нейропротекторный эффект L-фенилаланина проявляется и при внесеннии его в культуры во время и сразу после КГД, но наиболее выраженный результат бул при добавлении L-фенилаланина за 30 минут до КГД.

Анализ влияния L-фенилаланина на морфо-функциональное состояние культивируемых срезов гиппокампа в условиях экспериментально вызванной ишемии показал, что L-фенилаланина оказывает нейропротекторное действие, которое осуществляеться как через антиглутаматные, так и через антиоксидантные механизмы. Эти результаты допускают потенциальную возможность использования ароматических аминокислот в медицинской практике с целью предотвращения ишемических повреждений мозга.

Ключевые слова: кислород-глюкозная депривация, культивируемых срезов гиппокампа, L-фенилаланин.

ANNOTATION

Malyarevskyy P.Y. Modelling the ischemic brain damage on the organotypic hippocampal slice culture and study neuroprotective action of L-phenylalanine. – Manuscript.

The thesis for the defense of PhD degree on speciality 14.03.04. –pathological physiology. – O.O.Bogomolets Institute of Physiology National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv – 2006.

The dissertation is devoted to investigation the model of the ischemic brain damage on the organotypic hippocampal slice culture and the search for new efficacious agents to prevent neuronal cell damage. The recent results indicate that aromatic amino acids, namely L-phenylalanine (L-Phe), reveal neuroprotective action but protective mechanisms were studied insufficiently. We studied the effects of L-Phe on the viability and cell morphology in rat organotypic hippocampal slice cultures during induced experimental ischemia. Morpho-functional estimation was carried out after oxygen-glucose deprivation (OGD) with different duration and post-OGD cultivation (1, 4 and 24 h). Short-term OGD was chosen for testing L-Phe. L-Phe (100 mkM) was present in the culture medium 30 min prior to OGD, during OGD and reoxygenation. Cell viability and morphological cell changes in CA1 area of hippocampal slice cultures were estimated. Our data showed that the treatment with L-Phe cultures, exposed to OGD, resulted