АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

НАГОРНА Олена Олександрівна

УДК 615.22+615.274:

616.127-092.9-02:615.33.099

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ Обґрунтування ДОЦІЛЬНОСТІ ЗАСТОСУВАННЯ НІКОТИНАМІДУ ДЛЯ ПОПЕРЕДЖЕННЯ КАРДІОМІОПАТІЇ ДОКСОРУБІЦИНОВОГО ГЕНЕЗУ

14.03.05 – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному медичному університеті імені О.О.Богомольця

Міністерства охорони здоровя України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, член-кореспондент НАН і

АМН України Чекман Іван Сергійович, завідувач кафедри

фармакології з курсом клінічної фармакології

Національного медичного університету

імені О.О.Богомольця МОЗ України

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Войтенко Георгій Миколайович,

Національна медична академія післядипломної освіти ім.. П.Л.Шупика,

завідувач курсу клінічної фармакології кафедри технології ліків та

клінічної фармації

доктор медичних наук, професор Савченкова Лариса Василівна,

Луганський державний медичний університет МОЗ України,

завідуюча кафедри клінічної фармакології і фармакотерапії

Провідна установа: Харківський державний медичний університет Міністерства охорони

здоровя України

Захист відбудеться “ 20 “ вересня 2006 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057 м. Київ, вул. Е.Потьє, 14.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е.Потьє, 14).

Автореферат розісланий “ __18__ “ ___серпня____ 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук І.В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У сучасних схемах лікування злоякісних пухлин та гематологічних захворювань (FAM, FAP – рак шлунка, FAC, AC – рак грудної залози, CAV – дрібноклітинний рак легенів, CAP – недрібноклітинний рак легенів, MAC – рак сечового міхура cisCA(CAP), CYVADIC – саркома м’яких тканин, ABVD – хвороба Ходжкіна, CHOP – неХоджкінські лімфоми) антрациклінові антибіотики є однією з найбільш застосованих груп лікарських засобів (З.П.Булкина, 1991; S.A. Johnson, D.S. Richardson, 1998; Б.Т.Білинський та співавт., 1998; W.P. Tsang et al., 2003; Н.І.Шарикіна, 2004; O.S. Filyak et al., 2005; Р.С. Исмаил Заде, 2005).

Завдяки удосконаленню програм фармакотерапії при включенні в схеми лікування антрациклінових антибіотиків досягнуто суттєве покращення результатів терапії вищезазначених захворювань. Одним з найбільш активних і широко застосовуваних антрациклінових антибіотиків першого покоління вважають доксорубіцин.

Клінічний досвід свідчить, що цей препарат має значну кардіотоксичність, пов’язану з особливостями хімічної будови, механізму дії, фармакодинаміки і фармакокінетики (Н.В. Калинкина, 2001; E.Aldieri et al., 2002; J.P. Bertinchard et al., 2003). У зв’язку з цим, для запобігання токсичному впливу антрациклінів на міокард використовується дексразоксан (кардіоксан). Однак, останніми роками у дексразоксану були встановлені побічні ефекти - мієлотоксичність та апоптогенна дія на кардіоміоцити, що значно обмежує його застосування (T. Sromova et al., 2002).

Встановлено, що не тільки доксорубіцин, а й деякі інші препарати можуть чинити негативну дію на міокард, в першу чергу, це фторвмісні лікарські засоби – натрію фторид, деякі цитостатики ( В.Н.Коваленко и соавт., 2002), в тому числі фторурацил (L.Lemaire et al., 1992; A.J. Anand, 1994; S.A. Aziz et al., 1998; M. Albertsson et al., 2001). Незважаючи на окремі експериментальні дослідження по вивченню кардіопротекторного впливу препаратів при токсичному впливі фторвмісних сполук, засоби для запобігання кардіотоксичному впливу останніх не розроблені і в клініці відсутні.Тому пошук ефективних засобів для попередження негативного впливу на серцево-судинну систему препаратів, які застосовуються для лікування пухлинних захворювань, в першу чергу доксорубіцину та фторвмісних засобів, є актуальною проблемою медицини.

В цьому плані на увагу заслуговує метаболітний препарат нікотинамід, який має антиоксидантні властивості (Л.В. Яніцька та співавт., 2005) та може включатися в більшість енергопродукуючих реакцій, тобто може вплинути одночасно на різні ланки патогенезу доксорубіцинової кардіоміопатії.

Беручи до уваги фармакодинамічні (антиоксидантні, кардіопротекторні) ефекти нікотинаміду, можна очікувати, що препарат буде чинити позитивний вплив на функцію міокарда при лікувальному використанні доксорубіцину, а також фторвмісних засобів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках науково-дослідної тематики кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця МОЗ України за темою: “Вивчення кардіопротекторної дії лікарських засобів за умов токсичного ураження міокарда ( № держреєстрації 0103U005667). Автор є співвиконавцем цієї теми.

Мета дослідження. На основі експериментальних досліджень встановити профілактичну ефективність нікотинаміду щодо формування кардіоміопатії доксорубіцинового генезу, а також фторидної інтоксикації.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

1) визначити ефективні дози нікотинаміду в експериментах на щурах;

2) вивчити вплив нікотинаміду на гостру токсичність доксорубіцину та натрію фториду в експериментах на мишах;

3) дослідити вплив нікотинаміду на показники кардіо- та системної гемодинаміки кролів при експериментальній доксорубіциновій кардіоміопатії та фторидній інтоксикації;

4) вивчити вплив нікотинаміду на показники перекисного окиснення ліпідів та антиоксидантного захисту в міокарді та тканинах печінки щурів при доксорубіциновій кардіоміопатії;

5) визначити вплив нікотинаміду на гістологічну та морфологічну структуру міокарда щурів при доксорубіциновій кардіоміопатії;

6) встановити міжмолекулярні взаємодії нікотинаміду з компонентами біомембран.

Об’єкт дослідження. Білі нелінійні миши з моделями гострих інтоксикацій доксорубіцином та натрію фторидом; щури лінії Вістар з моделлю доксорубіцинової кардіоміопатії, кролі породи “Шиншила” з моделлю доксорубіцинової кардіоміопатії та інтоксикації натрію фторидом.

Предмет дослідження. Кардіопротекторна дія нікотинаміду при доксорубіциновій кардіоміопатії та інтоксикації натрію фторидом.

Методи дослідження. Для розв’язання поставлених завдань були застосовані фармакологічні, токсикологічні, біохімічні, фізико-хімічні, гістологічні, морфологічні та статистичні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлена захисна дія нікотинаміду при гострій інтоксикації доксорубіцином і натрію фторидом, що проявляється дозозалежним зменшенням токсичності даних препаратів. Вперше досліджено захисний вплив нікотинаміду на стан кардіо- та системної гемодинаміки у кролів з доксорубіциновою кардіоміопатією та фторидною інтоксикацією. Показано, що при доксорубіциновій кардіоміопатії вірогідно зменшуються робочий ударний індекс, максимальний тиск в лівому шлуночку, системний артеріальний тиск. Встановлений виражений захисний вплив нікотинаміду на показники скоротливості міокарда при доксорубіциновій кардіоміопатії, препарат запобігає зниженню показників кардіо-і системної гемодинаміки. Вперше встановлена захисна дія нікотинаміду щодо показників перекисного окиснення ліпідів (вмісту спонтанного та ферментативнозалежного малонового діальдегіду) та антиоксидантного захисту ( активності супероксиддисмутази і каталази) в міокарді і тканинах печінки щурів, а також щодо морфологічної і гістохімічної структури міокарда при доксорубіциновій кардіоміопатії.

Показано, що одним із важливих механізмів пошкоджуючої дії доксорубіцину на кардіоміоцити є пригнічення енергетичного обміну, що торкається ензимів усіх метаболічних шляхів. Доксорубіцин веде до розвитку грубих структурних змін міокарда лівого шлуночка серця з появою у деяких ділянках цитолізу. Нікотинамід при внутрішньом’язовому профілактичному введенні обумовлює зменшення інтенсивності енергетичних і структурних порушень кардіоміоцитів. При цьому найбільш ефективно підсилюється активність НАД-Н ДГ і НАДФ-Н ДГ.

Вперше встановлені константи стійкості нікотинаміду з катіонами біометалів та елементами біомембран. Показано, що комплексоутворюючі властивості нікотинаміду з залізом сприяють меншому внеску іонів заліза в стимуляцію перекисного окиснення ліпідів.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження є експериментальним обґрунтуванням доцільності використання нікотинаміду для запобігання розвитку доксорубіцинової кардіоміопатії.

Окремі фрагменти дисертаційної роботи впроваджені в учбовий процес кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця, кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології Івано-Франківського державного медичного університету, кафедри фармакології та клінічної фармакології Дніпропетровської державної медичної академії, кафедри експериментальної та клінічної фармакології з клінічною імунологією та алергологією Української медичної стоматологічної академії, кафедри фармакології Тернопільского державного медичного університету ім.І.Я.Горбачевського.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз наукової літератури за темою дисертації, визначена мета і завдання досліджень, опрацьовані моделі, проведені експериментальні дослідження, здійснено статистичну обробку отриманих даних та оформлення їх у вигляді таблиць і рисунків, проаналізовано результати досліджень, сформульовані висновки дисертації, опубліковані основні положення дисертації. Біохімічні дослідження проведені в біохімічній лабораторії (зав.лаб.канд.біол.наук Н.М.Юрженко) НДЛЦ Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця, а також на кафедрі фармакології з курсом клінічної фармакології Івано-Франківської медичної академії при консультативній допомозі доктора мед.наук професора Я.С.Гудивок. Гістологічні та морфологічні експерименти в лабораторії метаболічного та структурного аналізу (зав.лаб. – доктор мед.наук, професор Н.А. Колесова). Дисертант висловлює вдячність за методичну та консультативну допомогу вищезазначеним співробітникам.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації оприлюднені на ІІ науково-практичній медичній конференціі “Сучасна клінічна фармакологія, імунопрофілактика та імунотерапія” (м. Київ, 4 грудня 2000 р.), Науковій конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця з міжнародною участю, (м. Київ, 17-20 квітня 2001 р.), ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (м. Харків 2003 р.), Науковій-практичній конференції з міжнародною участю “Актуальні питання тканинної терапії та перспективи застосування природних біологічно активних речовин у сучасній медицині” (м. Одеса, 2003 р.), Міжнародній науковій конференції, присвяченій 100-річчю створення фармацевтичного факультету Запорізького державного медичного університету “ Історія та перспективи розвитку фармацевтичної науки і освіти” (м. Запоріжжя, 10 – 11 березня, 2004 р.), ХІ Российском национальном конгрессе “Человек и лекарство” (м. Москва, 2004 р.), IV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології. (м. Вінниця, 7 - 8 жовтня 2004 р.), Міжнародному медико-фармацевтичному конгресі “Ліки та життя”. Тези доповідей. – Київ, 2005. – С. 125.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 23 роботи, серед яких 9 у фахових наукових журналах, акредитованих ВАК України (з них 3 самостійних) і 13 тез доповідей, отримано 1 Деклараційний патент.

Обсяг і структура дисертації. Матеріали дисертації викладені на 162 сторінках машинописного тексту. Робота складається зі вступу, огляду літератури, методів дослідження, 6 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, загальних висновків, практичних рекомендацій і списку використаних джерел. Покажчик літератури містить 327 джерел, із яких 180 іноземних. Робота ілюстрована 30 рисунками і 24 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Для проведення досліджень застосовували препарати: доксорубіцин-КМП (“Київмедпрепарат”, Україна), натрію фторид (“Гріндекс”, Латвія), нікотинамід (“Біостимулятор”, Україна), для вивчення міжмолекулярних взаємодій нікотинаміду з компонентами біомембрани – біоліганди (БЛ): амінокислоти, аденозинмонофосфат, аденозиндифосфат, аденозинтрифосфат, нікотинаміддинуклеотид (НАД), нікотинаміддинуклеотид відновлений (НАДФ-Н), холестерин, лецитин, глюкозамін, а також солі магнію, кальцію, перехідних і важких металів (х.ч.).

Досліди проведені на 127 білих щурах обох статей лінії Вістар масою 150 - 180 г, 64 білих нелінійних мишах масою 20 - 24 г, на 47 кролях породи “Шиншила” масою 2,5 - 3,5 кг, які утримувалися в стандартних умовах віварію при вільному доступі до води і їжі.

Визначення гострої токсичності доксорубіцину та натрію фториду проводили за методом В.Б.Прозоровського (1998) при внутрішньоочеревинному введенні мишам при попередньому розчиненні в воді для інєкцій. В окремій серії досліджень за 1 год до застосування доксорубіцину і натрію фториду вводили внутрішньовенно нікотинамід. Спостереження за тваринами проводили протягом 14 діб. В перший день після введення тварини перебували під безперервним наглядом. Брали до уваги їх зовнішній стан, особливості поведінки, інтенсивність і характер рухової активності та інші показники, які можуть бути застосовані для оцінки токсичного ефекту відповідно до “Методичних рекомендацій” ДФЦ МОЗ України (2002). Реєстрували час розвитку інтоксикації та загибелі тварин, масу тіла, серця, легенів, печінки в день введення, масу тіла та органів виживших тварин на 3, 7, 14-й день спостереження.

Вибір доз доксорубіцину та натрію фториду базувався на результатах визначення умовно-терапевтичних доз, наведених в літературі (В.Ю.Дяченко, 1990; В.И.Капелько и соавт., 1996; V.Shan et al,1996). Дози нікотинаміду були також визначені співшукачем на підставі виявлених вірогідних змін рівня нікотинамідних коферментів у міокарді щурів під впливом препарату.

У гострому експерименті (наркоз – уретан 1 мг/кг) після катетеризації лівого шлуночка серця (ЛШС) реєстрували головні параметри кардіо- та системної гемодинаміки – максимальний тиск лівого шлуночка (Рмакс), системний артеріальний тиск (САТ), частоту серцевих скорочень (ЧСС) уд/хв. Хвилинний об’єм крові визначали методом термодилюції. Усі показники реєстрували на приладі HP VIRICUA Component Monitoring System. (Hewlet Packard, Німеччина), розраховували серцевий індекс (СІ мл/м2/хв), систолічний індекс (СиІ мл/м2), ударний об’єм крові (УОК мл), загальний периферичний опір (ЗПО дин/сек/см3), робочий ударний індекс лівого шлуночка (РУІЛШ кгм/м2), робочий індекс лівого шлуночка (РІЛШ кгм/м2/хв), дебіт серця (Д мл/с).

Доксорубіцинову кардіоміопатію моделювали на кролях шляхом внутрішньовенного введення доксорубіцину-КМП протягом 5 тижнів у дозі 5 мг/кг (В.И. Капелько, М.И.Попович, 1990; И.В.Ниженковская, 1999). В окремій серії досліджень за 1 годину до введення доксорубіцину внутрішньовенно одноразово вводили нікотинамід у дозі 50 мг/кг.

Гостру інтоксикацію натрію фторидом в експериментах на кролях моделювали внутрішньовенним введенням натрію фториду в дозі 20 мг/кг та визначенням показників гемодинаміки через 40 хвилин (В.Ю.Дяченко,1990). Нікотинамід у дозі 50 мг/кг вводили внутрішньовенно одноразово за 1 годину до застосування натрію фториду.

Моделювання доксорубіцинової кардіоміопатії на щурах здійснювали внутрішньом’язовим введенням доксорубіцину 1 раз на тиждень протягом 1 місяця в дозі 5 мг/кг. Нікотинамід вводили щоденно внутрішньом’язово в дозі 50 мг/кг за 1 годину до доксорубіцину.

Біохімічні дослідження проведені на інтактних щурах, а також на тваринах при моделюванні доксорубіцинової кардіоміопатії і при попередньому введені нікотинаміду на фоні патології.

У міокарді та тканинах печінки тварин визначали рівень малонового діальдегіду, активність супероксиддисмутази та каталази, а також вміст нікотинамідних коферментів.

Малоновий діальдегід (МДА) є вторинним продуктом перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), який визначають за реакцією з тіобарбітуровою кислотою ТБК-активні продукти безпосередньо в біологічному субстраті за умов індукції ПОЛ в середовищі певного складу. Вивчали спонтанне та ферментативне аскорбатзалежне ПОЛ. Розраховували вміст МДА у ммоль вологої тканини за 1 хвилину. Визначення проводили спектрофотометричним методом (Г.Г. Гацко и соавт., 1977).

Активність супероксиддисмутази (СОД) (пероксид: пероксид оксиредуктаза. КФ 1, 15, 1,1) визначали за реакцією відновлення нітротетразолію синього в присутності феназину метасульфату та ідентифікували спектрофотометричним методом (Р. Доусон и соавт., 1991).

Активність каталази (пероксид водню: пероксид водню оксидоредуктаза-КФ 1.11.1.6) – ферменту, що руйнує пероксиди та запобігає їх акумуляції, визначали в міокарді та печінці фотометричним методом. Розраховували за калібровочною кривою (І.Ф. Мещищен, 1998).

Визначення вмісту окислених нікотинамідних коферментів (нікотинаміддинуклеотиду та нікотинаміддинуклеотиду фосфату (НАД + НАДФ) та їх відновлених форм проводили за загальноприйнятим флюорометричним методом. Принцип методу заснований на властивості -метилнікотинаміду та піримідинових похідних НАД і НАДФ утворювати при обробці ацетоном стабільну сполуку, кількість якої визначається спектрофотометрично в мкмоль/кг вологої тканини (J.M. Huff, W.A. Perlzweig, 1947).

Виходячи з даних літератури про те, що при клініко-інструментальному обстеженні хворих, які приймали антрациклінові антибіотики, виявляються порушення переважно систолічної і діастолічної функцій лівого шлуночка, провели гістохімічне і патоморфлологічне дослідження саме цього відділу серця щурів.

Внутрішньом'язове введення білим щурам доксорубіцину в дозі 5 мг/кг маси 1 раз на тиждень протягом 1 місяця поєднувалося з профілактичним щоденним введенням їм нікотинаміду в дозі 50 мг/кг маси протягом 1 місяця. Тварин декапітували під легким ефірним наркозом через 1 тиждень після останнього введення доксорубіцину і через 1 добу після останньої ін'єкції нікотинаміду.

Для патоморфологічного дослідження міокард фіксували в 10% нейтральному формаліні, проводили через батарею спиртів висхідної концентрації, хлороформ, хлороформ-парафін і заливали в парафін. Серійні парафінові зрізи товщиною 7 мкм виготовляли на санному мікроскопі, забарвлювали гематоксиліном та еозином за ван Гізоном.

Вивчення основних закономірностей процесів оксидоредукції було проведено на кріостатних зрізах серця товщиною 10 мкм. Оцінка змін показників енергетичного обміну в міокарді лівого шлуночка проведена за допомогою виявлення активності комплексу ферментів:

а) для визначення продукції енергії в циклі Кребса визначали активність сукцинатдегідрогенази (СДГ) – за Нахласом та малатдегідрогенази (МДГ) – за Гесс, Скарпеллі і Пірс;

б) для визначення сумарної активності ферментів, що використовують як кофермент НАД, вивчали активність НАД-Н дегідрогенази – за Фарбером;

в) для оцінки гліколітичного шляху утворення енергії вивчали активність: цитоплазматичної -гліцерфосфатдегідрогенази і лактатдегідрогенази (ЛДГ) – за Гесс, Скарпеллі і Пірс;

г) вивчення енергозабезпечення синтетичних процесів було проведено шляхом визначення активності: глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-Ф ДГ) -пентозний цикл, за Гесс, Скарпеллі і Пірс; а також НАДФ-Н ДГ - як показника активності всієї НАДФ-Н генеруючої системи дегідрогеназ – за Фарбером. Дослідження виконані при застосуванні гістохімічних методик за Е.Пірс (1962), а патоморфологічних – за Б.Ромейс (1954).

У даній роботі вивчали особливості міжмолекулярних взаємодій нікотинаміду з компонентами біомембрани – біолігандами (БЛ): амінокислотами, АМФ, АДФ, АТФ, НАДФ, НАД-Н, холестерином, лецитином, глюкозаміном, а також солями магнію, кальцію, перехідних і важких металів з метою визначення первинної фармакологічної реакції препарату. За допомогою методів математичної статистики визначали залежності між параметрами комплексоутворення і властивостями речовин.

Субстанція препарату відповідає вимогам фармакопеї. Кількісні показники комплексоутворення: Кст – константа стійкості комплексу і Е = Екомп – Енік – Ебл – різниця між екстинкцією комплексу (Екомп) та екстинкціями нікотинаміду (Енік) і біоліганду (Ебл) визначали методом спектрофотометричного титрування на спектрофотометрі “SPECORD М-40” за методом (N.J.Rose, R.S.Drego, 1959). Про наявність утворення комплексу при змішуванні двох речовин свідчило відхилення значення оптичної щільності (Д) від правила адитивності Д = Дексп – Днік – Дбл. Експеримент проводили у водному розчині. Аналітична довжина хвилі (262 нм) відповідала довгохвильовому максимуму поглинання світла препаратом. Концентрація нікотинаміду була сталою: Снік = 2,1 * 10-4 моль/л, а концентрація біоліганду змінювалась від 2*10-4 до 20*10-4 моль/л. Для кожної пари речовин проводили п’ять вимірів оптичної щільності Д при різних співвідношеннях початкових концентрацій Снік і Сбл.(М.И.Загородный и соавт., 1997; І.С.Чекман та співавт., 2001)

За п'ятьма експериментальними даними Снік, Сбл і Д програма підбирала оптимальні значення Кст та Е, які краще відповідають математичному рівнянню, що звязує всі параметри.

Оцінку отриманих результатів проводили за допомогою статистичної обробки методом варіаційної статистики. Вірогідність різниць між досліджуваними показниками оцінювали за критерієм "t” Стюдента. Різницю між показниками вважали статистично вірогідною при Р 0,05.

Крім того, усі статистичні розрахунки проводили на персональному комп’ютері за допомогою спеціалізованої програми “STATISTICA вер. 5.0” F- критерій Фішеру; р – рівень значущості, Ккор – коефіцієнт кореляції.

Результати досліджень та їх обговорення

Перед дослідженням кардіопротекторних і антиоксидантних властивостей нікотинаміду при доксорубіциновій кардіоміопатії та фторидній інтоксикації метою проведення першого етапу наших досліджень було встановлення умовно-терапевтичних ефективних доз нікотинаміду з урахуванням ролі нікотинаміду при утворенні нікотинамідних коферментів, які відіграють провідну роль в окисно-відновних процесах. Досліди з визначення впливу цього засобу на вміст нікотинамідних коферментів у міокарді проводили при внутрішньоочеревинному введенні щурам в дозах 10 мг/кг, 25 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг.

У дозах 10 мг/кг, 25 мг/кг нікотинамід вірогідно не змінює вміст нікотинамідних коферментів. Нікотинамід в дозі 50 мг/кг вже через 1 годину після введення підвищує вміст піридинових нуклеотидів у серці: окиснених форм відповідно на 8,6%, відновлених – в серці на 25%. Поступово ці зміни стають значнішими. Так, сума нуклеотидів підвищується в серці через 3 год на 35,9%, через 6 годин на 34,9%, при цьому рівномірно збільшуються окиснені та відновлені форми, через що їх співвідношення не відрізняється від контролю. В крові через 6 год вміст окиснених форм нуклеотидів підвищується майже вдвічі. Через 12 годин після введення нікотинаміду вміст НАД нормалізується.

Нікотинамід у дозі 100 мг/кг та 200 мг/кг значно підвищує рівень нікотинамідних коферментів у досліджуваних органах. Ці зміни зростають від 1 до 6 годин після введення препарату; сума нуклеотидів через шість годин становить в серці 158,7 - 159% від вихідних даних. Через 6 годин вміст окисненних форм нікотинамідних коферментів підвищується на 20 - 21%. Через 12 годин в серці рівні окисненних форм ще залишаються збільшеними на 18,3%, в той час як відновлених нормалізується; через 1 годину на 21,1 та 24%, через 3 год – на 40 - 42%. Через 24 години після введення нікотинаміду в серці нормалізується вміст і розподіл НАД.

У зв’язку з цим при визначенні впливу нікотинаміду на гостру токсичність доксорубіцину і натрію фториду були виділені, для подальшого дослідження, як більш ефективні, дози 50 мг/кг, 100 мг/кг та 200 мг/кг.

ДЛ50 доксорубіцину визначали в експериментах на мишах при внутрішньоочеревинному введенні. ДЛ50 доксорубіцину становила 12,5 (6,5 20) мг/кг. При попередньому внутрішньовенному введенні нікотинаміду в дозі 50 мг/кг ДЛ50 доксорубіцину зростала у 2,2 рази і становила 28,2 (14 41) мг/кг. При попередньому впливі нікотинаміду в дозі 100 мг/кг ДЛ50 доксорубіцину зростала в 3,7 рази і дорівнювала 44,7 (39 51)мг/кг. При введенні нікотинаміду в дозі 200 мг/кг ДЛ50 доксорубіцину зростала в 4,6 рази і дорівнювала 60,0 (20 107) мг/кг.

Таким чином, нікотинамід знижував токсичний ефект доксорубіцину в експериментах на мишах. Вищезазначений ефект мав дозозалежний характер.

Гостра токсичність натрію фториду при внутрішньоочеревинному введенні склала 51,5 (29,7 76,7) мг/кг, нікотинамід при попередньому внутрішньовенному введенні в дозі 50 мг/кг збільшив ДЛ50 у 1,3 рази: ДЛ50 складала 65 (34,8 98,6) мг/кг.

При введенні нікотинаміду в дозах 100 мг/кг та 200 мг/кг внутрішньовенно спостерігалося зростання ДЛ50 до 81,5 (46,2 123,5) мг/кг та 129 (31,56 233,16) мг/кг тобто в 1,5 та 2,5 рази відповідно.

Таким чином, проведені дослідження також показали, що протекторний ефект нікотинаміду при фторидній інтоксикації мав дозозалежний характер.

Токсикологічні дослідження стали підставою для подальшого вивчення захисної дії нікотинаміду відносно діяльності серця, гемодинаміки при інтоксикації доксорубіцином і натрію фторидом. Тваринам вводили внутрішньовенно нікотинамід у найменш ефективній дозі, при якій препарат проявляв антитоксичну дію.

Кролі були поділені на 5 груп: I група – контрольні тварини; II група – тварини з моделлю доксорубіцинової кардіоміопатії; III група – тварини, яким одночасно з доксорубіцином вводили нікотинамід; IV група – тварини з гострою фторидною інтоксикацією; V група – тварини, яким за 1 годину до натрію фториду вводили нікотинамід.

Проведеними дослідженнями встановлені зміни кардіо- і системної гемодинаміки у кролів при доксорубіциновій кардіоміопатії, що характеризують скоротливу активність міокарда: зниження робочого індексу лівого шлуночка на 29,5% та робочого ударного індексу лівого шлуночка на 26,5%. Вірогідно знижуються також системний артеріальний тиск та максимальний тиск в лівому шлуночку міокарда кролів. Інші показники, які характеризують кардіо- і системну гемодинаміку, мають тенденцію до зниження і стверджують порушення скоротливості міокарда. Показано, що нікотинамід при попередньому введенні проявляє кардіопротекторну дію при доксорубіциновій кардіоміопатії стосовно зазначених показників скоротливої активності міокарда (таблиця 1).

Таблиця 1

Вплив нікотинаміду на показники кардіо- та системної гемодинаміки у кролів при доксорубіциновій кардіоміопатії (М m)

Умови досліду | Рмакс,

мм рт.ст. | САТ,

мм рт.ст. | РІЛШ,

кгм/м2/хв | РуІЛШ,

кгм/м2

Інтактні кролі ( n=12) | 157,5 6,6 | 135 8,5 | 7203 256 | 25,7 1,3

Кролі після введення доксорубіцину ( n=6)

125,3 6,8* |

113 9,6* |

5120,0 223,3* |

18,91,1*

Кролі після введення доксорубіцину

на фоні нікотинаміду (n =6) |

165,8 9,3** |

143,6 9,0** |

7023,6 7,63** |

23,41,8**

Примітки: у цій та наступних таблицях:

1. * р 0,05 відносно групи інтактних тварин;

2. ** р 0,05 відносно доксорубіцину.

При гострій фторидній інтоксикації змінюються показники, які характеризують скоротливу активність серця через 40 хвилин, рівень загального периферичного тиску. Артеріальний тиск і частота серцевих скорочень не змінюються. Рmax та ХОК зменшуються на 23%, УОК – на 22%, СІ – на 23%, СиІ – на 24%, ЗПО зростав на 30%. Нікотинамід при попередньому внутрішньовенному введенні не запобігав змінам показників кардіо- та системної гемодинаміки у кролів.

У зв’язку з цим дослідження механізму кардіопротективного впливу нікотинаміду на біохімічні і морфологічні показники проводили лише при доксорубіциновій кардіоміопатії.

Тригерна роль активації перекисного окиснення ліпідів при різних ушкодженнях міокарда, в тому числі порушеннях функції серця, які виникають при застосуванні цитостатиків, є підставою для вивчення впливу нікотинаміду на процеси перекисного окиснення ліпідів у міокарді та тканинах печінки щурів.

Тварини були розділені на три групи по 10 тварин. Контролем були інтактні щури (І група). Модель серцевої патології створювали внутрішньомязовим введенням доксорубіцину 1 раз на тиждень протягом 1 місяця у дозі 5 мг/кг (ІІ група).

Тваринам III групи щоденно протягом місяця внутрішньом’язово вводили нікотинамід у дозі 50 мг/кг маси експериментальних тварин на фоні моделювання доксорубіцинової кардіоміопатії. По закінченню досліду тварин декапітували. Об’єктами для біохімічних досліджень були гомогенати міокарда і печінки щурів.

Аналіз отриманих даних показав, що моделювання кардіоміопатії за допомогою доксорубіцину, спричиняє різку активацію ліпопероксидації як в міокарді, так і в печінці щурів шляхом підвищення вмісту МДА. При цьому вірогідно зростає інтенсивність як спонтанного неініційованого ПОЛ: у печінці – на 26%, у міокарді щурів – на 21%, так і ферментативнозалежного ліпопереокиснення на 22% - в печінці і на 64% - у міокарді щурів.

Курсове введення нікотинаміду, як видно з табл. 2, сприяло нормалізації вільнорадикального окислення ліпідів в печінці щурів. У міокарді щурів вірогідне зниження рівня МДА (на 31%) нікотинамід чинив тільки при ферментативнозалежному ліпопереокисненні. При спонтанній ліпопероксидації спостерігається зниження рівня МДА лише на 15% (табл. 2, 3).

Таблиця 2

Вплив нікотинаміду на показники ферментативнозалежного ліпопереокиснення в міокарді щурів при доксорубіциновій кардіоміопатії (M m, n = 10)

Умови експерименту | МДА, ммоль/г тканини

Інтактні щури | 138,7 7,29

Доксорубіцин | 227,3 7,06*

Нікотинамід + доксорубіцин | 156 6,29**

Таблиця 3

Вплив нікотинаміду на показники спонтанної ліпопероксидації у міокарді щурів при доксорубіциновій кардіоміопатії (M m, n = 10)

Умови експерименту | МДА ммоль/г тканини

Інтактні щури | 66,2 1,27

Доксорубіцин | 80,3 3,02*

Нікотинамід + доксорубіцин | 69 1,83**

Аналіз отриманих даних свідчить, що в міокарді і тканинах печінки щурів під впливом доксорубіцину при тривалому введенні пригнічується активність супероксиддисмутази (СОД) та каталази (Рис.1; 2).

Рис.1. Вплив нікотинаміду на активність

супероксиддисмутази (у. о.) і каталази

(мкмоль/хв) у міокарді щурів при

доксорубіциновій кардіоміопатії | Рис 2. Вплив нікотинаміду на активність

супероксиддисмутази (у. о.) і каталази

(мкмоль/хв) у тканинах печінки щурів при

доксорубіциновій кардіоміопатії

Підвищення вмісту МДА при різноманітних патологічних станах супроводжується координованим зниженням активності ферментів антиоксидантного захисту, що підтверджується дослідженнями з моделювання доксорубіцинової кардіоміопатії.

Нікотинамід, введений за 1 годину до доксорубіцину, запобігав порушенням показників антиоксидантного захисту (активності супероксиддисмутази і каталази).

На підставі проведених досліджень можна відзначити, що нікотинамід має здатність відновлювати збалансовані зв’язки між оксидантною та антиоксидантною системами в печінці і міокарді щурів з моделлю доксорубіцинової кардіоміопатії.

Таким чином, одержані в роботі дані відносно захисного впливу нікотинаміду відносно антиоксидантних систем міокарда і тканин печінки при одночасному введенні з доксорубіцином підтверджують здатність препарату нормалізувати процеси вільнорадикального окиснення в тканинах організму, а також запобігати ушкодженню мітохондрій і порушенню антиоксидантних систем вищезазначених органів.

Виходячи з даних літератури (В.И.Капелько и соавт.,1987; Н.В.Калинкина, 2004) про те, що при клініко-інструментальному обстеженні хворих, які приймали антрациклінові антибіотики, виявляються порушення переважно систолічної і діастолічної функцій лівого шлуночка, проведено гістохімічне і патоморфологічне дослідження саме цього відділу серця щурів.

Внутрішньом'язове введення білим щурам доксорубіцину в дозі 5 мг/кг маси 1 раз на тиждень протягом 1 місяця поєднувалося з профілактичним щоденним введенням їм нікотинаміду в дозі 50 мг/кг маси протягом 1 місяця. Тварин декапітували через 1 тиждень після останнього введення доксорубіцину і через 1 добу після останньої ін'єкції нікотинаміду.

Морфологічні дослідження базуються на вивченні міокарда лівого шлуночка щурів 3-х груп: 1-ша група – контроль;

2-га група – введення доксорубіцину;

3-тя група – застосування доксорубіцину на тлі застосування нікотинаміду.

Вивчення препаратів під мікроскопом показало, що введення щурам доксорубіцину веде до розвитку в міокарді лівого шлуночка виражених патоморфологічних змін, частина з яких має переважно розповсюджений характер, інші – локальний.

Про стан циклу трикарбонових кислот, що є одним з основних регуляторів метаболізму й універсальною енергетичною системою клітин взагалі, ми судили на підставі визначення морфологічними методами активності МДГ і СДГ і виявили вірогідне їх пригнічення. З урахуванням відомої чутливості МДГ до зниження парціального тиску кисню це можна розцінювати як один з показників кисневої недостатності і тканинної гіпоксії. Разом з тим пригнічення активності МДГ, що каталізує оборотну реакцію перетворення яблучної кислоти на оксалоацетат, вказує також на зниження її можливої ролі як окиснювача цитоплазматичного НАД-Н (у реакції перетворення щавелеоцтової кислоти на малат).

Вивчаючи показники метаболічних шляхів дихання і гліколізу загалом, відзначили різноспрямованість змін активності СДГ і МДГ (зниження), а також ЛДГ і цитоплазматичної -гліцерофосфат-дегідрогенази (підвищення). Це може свідчити про можливе роз’єднання процесів дихання і фосфорилювання в міокарді піддослідних тварин і вести до зниження вироблення макрофагів.

У ході досліджень також встановили порушення енергозабезпечення синтетичних процесів. Воно виявляється зниженням активності Г-6-Ф ДГ і НАДФ-Н ДГ. Падіння активності Г-6-Ф ДГ, що є ферментом пентозофосфатного шляху, у якому утворюються пентози – джерела синтезу нуклеїнових кислот, нуклеотидів та інших речовин, є одним з факторів порушення синтетичних процесів, розвитку дистрофічних і деструктивних змін у міокарді. Про це також свідчить і пригнічення активності НАДФ-Н дегідрогенази, як комплексного показника активності НАДФ-Н-генеруючої системи дегідрогеназ.

Профілактичне введення піддослідним тваринам нікотинаміду обумовило зниження ступеня обмінних і структурних змін у міокарді лівого шлуночка. При цьому встановлена тенденція до підвищення активності ферментів дихання (СДГ і МДГ), пентозного циклу (глюкозо – 6 – фосфатдегідрогеназа) при одночасному зниженні (порівняно з тваринами, яким тільки вводили доксорубіцин) активності ензимів гліколізу (ЛДГ і цитоплазматичної -гліцерофосфат-дегідрогенази). Активність ферментів термінального окиснення НАД-Н дегідрогенази і НАДФ-Н дегідрогенази була вірогідно вищою. Активність усіх ферментів щурів, яким також вводили нікотинамід, проте не досягала контрольного рівня.

Патоморфологічні зміни у тварин, які отримували доксорубіцин з нікотинамідом, були гетерогенними і менш вираженими, ніж у щурів, яким вводили лише доксорубіцин.

Таким чином, отримані результати з вивчення кардіопротекторних властивостей нікотинаміду при антрацикліновій кардіоміопатії за допомогою морфологічних показників дозволяють зробити узагальнення:

- одним з важливих механізмів ушкоджувальної дії доксорубіцину на кардіоміоцити є пригнічення енергетичного обміну, що торкається ензимів усіх метаболічних шляхів;

- доксорубіцин при введенні за зазначеною схемою обумовлює розвиток грубих структурних змін міокарда лівого шлуночка серця, що доходить у деяких ділянках до стадії цитолізу;

- нікотинамід при внутрішньом’язовому профілактичному введенні обумовлює зменшення інтенсивності енергетичних і структурних порушень кардіоміоцитів. При цьому найбільш ефективно підсилюється активність НАД-Н ДГ і НАДФ-Н ДГ (рис.3-5).

Рис. 3. Міокард лівого шлуночка серця щура 1-ї групи.

Висока активність НАД-Н ДГ у кардіоміоцитах.

Метод Фарбера. Зб.: 200.

Рис.4. Міокард лівого шлуночка серця щура 2-ї групи.

Різко знижена активність НАД-Н ДГ у кардіоміоцитах.

Метод Фарбера. Зб.: 200.

Рис.5. Міокард лівого шлуночка серця щура 3-ї групи.

Підвищена (порівняно з 2-ю групою рис.4) активність

НАД-Н ДГ у кардіоміоцитах.

Метод Фарбера. Зб.: 200.

Взагалі аналіз отриманих результатів патоморфологічного світлооптичного дослідження не виключає, що в процесах деструкції кардіоміоцитів при доксорубіциновому ушкодженні має значення посилення апоптозу, про що свідчать результати досліджень ряду авторів.

Результати морфологічних (гістохімічних і патоморфологічних) досліджень дозволяють вважати, що одним з важливих шляхів кардіопротекції нікотинаміду при доксорубіциновій кардіоміопатії є поліпшення енергозабезпечення міокарда.

Разом з вивченням фізіологічних, біохімічних і гістохімічних механізмів протекторної дії нікотинаміду необхідно визначити молекулярні аспекти лікувального впливу цього медикаменту. Продовжуючи дослідження фізико-хімічних механізмів дії різноманітних лікарських засобів, вивчали комплексоутворення нікотинаміду з біолігандами, що входять до складу біомембрани.

Фізико-хімічні дослідження дозволили також виділити НАДФ як одну із сполук, яка виражено реагує з нікотинамідом. Нікотинамід утворює комплекси з цАМФ, холестерином, орнітину гідрохлоридом, аспарагіновою, глутаміновою кислотою. Нікотинамід активно утворює комплекси з катіонами біометалів, що є модуляторами обмінних процесів в організмі.

Міжмолекулярні взаємодії біолігандів з нікотинамідом розрізняються не лише за міцністю утворених комплексів, але, також і за ознаком зміни екстинкції Е. Негативні та позитивні значення цього показника свідчать про особливості перерозподілу електронної щільності в процесі комплексоутворення в залежності від того, за якими фрагментами реагуючих молекул такий розподіл відбувається.

Щоб виявити додаткові чинники, які можуть впливати на процес комплексоут---ворення вивчаємого медикаменту з біолігандами, був проведений кореля---ційний аналіз між їх комплексоутворюючими та певними фізико-хімічними, електронними і енергетичними властивостями.

Нековалентний зв'язок між нікотинамідом і рецептором здійснюється, мабуть, за допомогою двовалентного металу, що полегшує створення конформаційного стану рецептора та іонних каналів (У.Д.Гольдберг, В.В.Новицкий, 1986). Величини констант стійкості комплексів нікотинаміду з елементами біомембран і біометалами дозволяють припустити рецепторно-індуковану перебудову біомембран і можливість дистанційної регуляції енергетичних процесів в органах і тканинах під його впливом (Н.А. Горчакова, 1986). Рецептори нікотинаміду полегшують підтримку гомеостазу і сприяють нормальному функціонуванню й адекватному реагуванню на зміни зовнішнього і внутрішнього середовища.

Комплексоутворюючі властивості нікотинаміду сприяють, з одного боку, меншому внеску іонів заліза в стимуляцію перекисного окиснення ліпідів при введенні препарату, з іншого – сприяють захисту металоферментів, тобто створюють підтримку енергозабезпечення міокарда для кращого поєднання процесів збудження і скорочення серцевого м’яза.

Таким чином, проведені дослідження, наведені експериментальні власні результати та дані літератури є підставою для ствердження можливості включення нікотинаміду до схем лікування антрацикліновими антибіотиками онкологічних, гематологічних захворювань з урахуванням його протекторної і адаптаційної дії.

ВИСНОВКИ

В роботі наведено теоретичне узагальнення і нове рішення наукової проблеми, що визначається експериментальним обгрунтуванням доцільності застосування нікотинаміду для запобігання розвитку кардіоміопатії, спричиненої цитостатиком доксорубіцином.

1. При внутрішньоочеревинному введені білим щурам нікотинаміду в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг в міокарді через 3 години вірогідно підвищується вміст переважно окисненних форм нікотинамідних коферментів на 39%; 43% та 45%, відповідно.

2. ДЛ50 доксорубіцину і натрію фториду при внутрішньоочеревинному введенні в експериментах на білих мишах становить: доксорубіцину 12,5 мг/кг та натрію фториду 51,5 мг/кг. Нікотинамід при попередньому внутрішньовенному введенні білим мишам у дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг дозозалежно зменшує гостру токсичність доксорубіцину - ДЛ50 = 28,2 мг/кг; 44,7 мг/кг; 60,0 мг/кг відповідно) і натрію фториду - ДЛ50 = 65 мг/кг; 81,5 мг/кг; 129 мг/кг відповідно.

3. В умовах доксорубіцинової кардіоміопатії у кролів (введення доксорубіцину внутрішньовенно в дозі 5 мг/кг протягом 5 тижнів) порушується скоротлива активність міокарда, що проявляється вірогідним зменшенням максимального тиску в лівому шлуночку РІЛШ на 29,5% та РУІЛШ на 26,5%, зниженням системного артеріального тиску на 20 %, максимального тиску в лівому шлуночку на 21 %. Нікотинамід, уведений внутрішньовенно в дозі 50 мг/кг за 1 годину до доксорубіцину, запобігає виникненню порушень показників кардіо- і системної гемодинаміки.

4. При гострій фторидній інтоксикації (внутрішньовенно в дозі 20 мг/кг) у кролів значно змінюються показники, які характеризують насосну функцію серця: вірогідно знижується максимальний тиск в лівому шлуночку (на 23%), хвилинний ( на 23%) і ударний ( на 22%) об’єм крові, серцевий ( на 23%) і систолічний індекс ( на 24%), робочий та ударний індекс лівого шлуночка ( на 19% - 20%), дебіт крові ( на 20%) і зростає загальний периферичний опір ( на 30%). Нікотинамід при фторидній інтоксикації, не справляє кардіопротекторного впливу і не запобігає виникненню порушень діяльності серця і гемодинаміки.

5. При доксорубіциновій кардіоміопатії у міокарді і тканинах печінки щурів (внутрішньом’язове введення доксорубіцину 1 раз на тиждень протягом 1 місяця у дозі 5 мг/кг), підвищується рівень ферментативнозалежного і спонтанного перекисного окиснення ліпідів за рахунок вірогідного зростання вмісту малонового діальдегіду на 21% - 26%, а також зменшується активність ферментів антиоксидантного захисту (в міокарді активність супероксиддисмутази на 26 %, каталази на 39 %; у печінці активність супероксиддисмутази та каталази на 35% - 36%;). Нікотинамід при внутрішньом’язовому введенні в дозі 50 мг/кг 1 раз на тиждень разом з доксорубіцином запобігає виникненню змін вищезазначених показників.

6. Гістоморфологічні дослідження свідчать, що доксорубіцинова кардіоміопатія у щурів спостерігається зниженням активності ферментів тканьового дихання (СДГ, МДГ), термінального окиснення (НАД-Н ДГ в НАДФ-Н ДГ), пентозного циклу (Г-6-ФДГ) та зростанням активності гліколітичних ферментів (ЛДГ та цитоплазматичної альфа-гліцерофосфатдегідрогенази). Щоденне введення нікотинаміду внутрішньом’язово в дозі 50 мг/кг маси протягом 1 місяця виразно підсилює активність НАД-Н ДГ та НАДФ-Н ДГ, що свідчить про поліпшення енергозабезпечення міокарда.

7. Нікотинамід утворює функціонально значимі комплекси з іонами заліза, (Кст = 8,5 л/м). Комплексоутворюючі властивості нікотинаміду сприяють, з одного боку, меншому внеску іонів заліза в стимуляцію перекисного окиснення ліпідів при введенні препарату, з іншого – сприяють захисту металоферментів, тобто створюють підтримку енергозабезпечення міокарда для кращого поєднання процесів збудження і скорочення серцевого м’яза.

СПИСОК РОБІТ ОПУБЛІКОВАНИХ