УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ

МЕДИЦИНИ

НИЧИК СЕРГІЙ АНАТОЛІЙОВИЧ

УДК 619:616.98:578.842.11:615.371

РОЗРОБКА ТА ЗАСТОСУВАННЯ ЗАСОБІВ СПЕЦИФІЧНОЇ ПРОФІЛАКТИКИ СКАЗУ ТВАРИН

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора ветеринарних наук

Харків-2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Державній Сумській біологічній фабриці і Білоруському науково-дослідному інституті експериментальної ветеринарії ім. Вишелеського С.М.

Наукові консультанти:

доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Стегній Борис Тимофійович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, директор;

доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН,

Головко Анатолій Миколайович, Державний науково-дослідний контрольний

інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів, директор.

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН Красніков Геннадій Андрійович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії;

доктор ветеринарних наук, професор Скибицький Володимир Гурійович, Національний аграрний університет Кабінету Міністрів України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології;

доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Мандигра Микола Станіславович, Інститут епізоотології УААН, директор.

Провідна установа - Одеський державний аграрний університет МАП України, кафедра епізоотології та паразитології, м. Одеса.

Захист відбудеться “4” квітня 2006 року о 900 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий“ 2 ” березня 2006р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої доктор ветеринарних наук, професор

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сказ – одна з найбільш поширених у світі зооантропонозних нейроінфекцій свійських і диких тварин. На сьогодні благополучними щодо сказу залишаються лише Австралія і декілька острівних країн та держав Європи (Нова Зеландія, Японія, Норвегія, Швеція, Іспанія, Португалія). Щорічно від сказу гинуть понад 1 млн. тварин (Недосеков В.В. з співавт., 2003), 50000 людей (Шестопалов А.М. з співавт., 2001), серед яких частка дитячої смертності сягає 30-50% (Rotavel J. і ін., 1998).

Боротьба зі сказом залишається однією з найскладніших проблем, котра може бути вирішеною тільки загальними зусиллями адміністративно-господарчих служб, органів державної ветеринарної та гуманної медицини, спрямованими на упорядкування утримання свійських тварин, перш за все, собак і кішок, своєчасну вакцинацію, відловлювання бездоглядних тварин, регуляцію чисельності популяції диких м’ясоїдних у природних умовах.

Однією з важливих складових проблеми контролю сказу є специфічна профілактика, особливо серед диких тварин, індивідуальне застосування вакцин котрим неможливе. У зв’язку з цим важко переоцінити досягнення з оральної імунізації диких м’ясоїдних тварин, яка була запропонована наприкінці 70-х років минулого сторіччя. Досвід, накопичений за час впровадження оральної імунізації, свідчить про її ефективність при викорененні сказу навіть в умовах росту популяції диких тварин, якщо проводиться системна їх вакцинація впродовж декількох років (Aubert М.Т., 1999).

Останнім часом епізоотична ситуація щодо сказу ускладнюється зростанням ролі диких тварин у поширенні хвороби, серед яких лисиця займає провідне місце, особливо в країнах Європи, у тому числі в Україні. Аналізуючи проблему так званої “європейської моделі” рабічної інфекції, Макаров В.В. з співавт. (2002) також пов'язують зростання за останнє десятиріччя на території пострадянських країн кількості неблагополучних пунктів із розширенням ареалу мешкання диких тварин, особливо лисиці, яких вважають хазяїном-резервуаром і переносником інфекції.

Ситуація, що склалася внаслідок поширення сказу серед диких м’ясоїдних, сприяє залученню в епізоотичний процес свійських тварин, перш за все, собак і, що особливо турбує, кішок. Ріст популяції бездоглядних собак і кішок, скупчення цих тварин у великій кількості на околицях міст та смітниках, з одного боку, і процес синантропізації диких м’ясоїдних тварин внаслідок доступності корму в цих місцях, з іншого боку, робить неминучим контакт цих тварин і можливість інфікування. В зв’язку з цим виникає проблема щодо організації заходів боротьби з бездоглядними собаками і кішками та дикими м’ясоїдними тваринами шляхом скорочення популяції.

Другим аспектом у системі боротьби зі сказом є вакцинопрофілактика. Нині для імунотерапії і профілактики цієї хвороби запропоновані досить ефективні засоби вітчизняного і зарубіжного виробництва. В багатьох країнах світу застосовуються як живі, так й інактивовані вакцини, проте, їхня якість, як відзначають Недосеков В.В. і Хухоров И.Ю. (2003), не завжди забезпечує необхідний рівень стійкості до зараження вірусом сказу, що негативно відбивається на ефективності системи антирабічних заходів. Успіхи і невдачі при щепленні диких тварин залежать в значній мірі від імуногенності вакцин. Проте є ряд причин загально-організаційного порядку, що негативно впливають на профілактичну ефективність застосування антирабічних препаратів.

Одним із факторів, що впливають на ступінь захисту при вакцинації тварин, є знижена імунобіологічна реактивність організму. Як відомо, на фоні вторинних імунодефіцитів у тварин, що супроводжуються порушенням клітинного імунітету і в більшості випадків залишаються не діагностованими, вакцинація буває недостатньо ефективною, оскільки не забезпечує формування напруженого імунітету (Красочко П.А. з співавт., 2001). Підвищення ефективності вакцинації у таких випадках можливе при використанні засобів, підсилюючих протективну імунну відповідь організму на введений препарат. У зв’язку з цим існує необхідність не тільки у розробці більш ефективних в імуногенному відношенні вакцин, а й в пошукові та застосуванні нових імуномодуляторів.

Розробка специфічних засобів боротьби зі сказом зараз спрямована на створення інактивованих вакцин для щеплення свійських м’ясоїдних і сільськогосподарських тварин, а також живих антирабічних вакцин для імунізації диких м’ясоїдних. Загальними вимогами до цих біопрепаратів є їхня небезпечність та імуногенна ефективність. Небезпечність залежить від біологічних властивостей виробничих штамів вірусу сказу, на основі яких виготовляється вакцина, дози і кратності застосування (Жестерев В.И., Лаптева О.Г., 2004). Оптимізація цих показників, що має важливе значення у плані розробки науково обґрунтованих технологій виготовлення і застосування вакцини проти сказу, дозволяє конструювати біопрепарати із заданими властивостями. Сучасна технологія виготовлення антирабічних вакцин тісно пов’язана з процесом культивування клітин і вірусу (Жестерев В.И., Юрков С.Г., 2003). Інтенсивний розвиток і широке застосування клітинних систем обумовлюються станом і можливостями ринку біопрепаратів. На підставі цього є доцільною розробка та удосконалення наукових основ технологій культивування виробничих штамів вірусу сказу і виготовлення високоефективних антирабічних вакцин.

Актуальність і перспективи розвитку цих досліджень зумовлені рядом технологічних аспектів виготовлення специфічних засобів профілактики сказу. Визначальною умовою виконання цієї роботи було, зокрема, вибір виробничих штамів, вивчення технології їхнього культивування, репродуктивної активності в різних клітинних культурах, способів очистки, інактивації, розробка препаративних форм вакцин, доз і кратності застосування та імуногенності.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є складовою науково-технічної програми 04 "Розробити на основі прогресивних технологій ефективну систему діагностики, терапії та профілактики хвороб, спільних для різних видів тварин", № державної реєстрації 0101U001616 (2001-2005 роки), а також виконувалась за договором творчої співдружності з Білоруським НДІЕВ ім. Вишелеського С.В. та ініціативної науково-виробничої діяльності на Державній Сумській біофабриці.

Мета і завдання досліджень. Мета досліджень – розробка живої антирабічної культуральної та удосконалення технології виготовлення інактивованої антирабічної сухої культуральної вакцини на основі виробничих штамів вірусу сказу, репродукованих в культурі перещеплюваних клітин, та засобу, підсилюючого імуногенну ефективність інактивованого біопрепарату.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі завдання:

- вивчити особливості та тенденції розвитку епізоотичного процесу щодо сказу в Україні;

- випробувати і дати оцінку продуктивності в залежності від способів вирощування та визначити перспективну клітинну систему для культивування виробничих штамів вірусу сказу;

- вивчити біологічні властивості виробничих штамів вірусу сказу в умовах інтенсивної технології напрацювання біомаси;

- розробити живу антирабічну культуральну вакцину, провести лабораторне і виробниче випробування імуногенних властивостей;

- удосконалити спосіб виготовлення інактивованої антирабічної культуральної вакцини і вивчити її імуногенні властивості;

- визначити теоретичні і практичні основи використання імуномодулятора для корекції поствакцинального імунітету при щепленні тварин з імунодефіцитним станом;

- розробити і видати регламенти промислового виготовлення живої та інактивованої антирабічних культуральних вакцин.

Об’єкт дослідження: сказ тварин, контроль епізоотичної ситуації, специфічні засоби профілактики.

Предмет дослідження: культури клітин, виробничі штами вірусу сказу, способи культивування, біологічні властивості, жива та інактивована вакцина проти сказу, імуногенність, дози і кратність застосування, принади, стимуляція імунітету при вакцинації.

Методи досліджень. Роботу виконували із застосуванням епізоотологічного, вірусологічного, патогістологічного, імунологічного, біохімічного та статистичного методів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведених досліджень розроблена нова жива антирабічна культуральна вакцина (Рабівак ХТТ), для виготовлення якої використаний новий атенуйований штам НФ-2 вірусу сказу, репродукований у моношаровій культурі перещеплюваних клітин ВНК-21, клон 13/04, вирощуваної на суміші живильних середовищ 199 та Ігла з подвійним набором амінокислот. Створена препаративна форма вакцини, що являє собою блістер-принади, які вміщують атенуйований вірус сказу, технологічно придатна для біофабричного виробництва та застосування у мисливських угіддях для імунізації диких м’ясоїдних. Вакцина у дозі 5 мл (одна-дві принади) забезпечує утворення напруженого імунітету впродовж 8 місяців.

На клон 13/04 перещеплюваних клітин ВНК-21, виробничий штам НФ-2 вірусу сказу, спосіб одержання вакцини проти сказу тварин „Рабівак ХТТ” та спосіб виробництва принади для пероральної імунізації м’ясоїдних тварин проти захворювання на сказ отримані деклараційні патенти на корисну модель: № 6015 від 15.04.2005 р., № 3248 та № 3245 від 15.10.2004 р., №5296 від 15.02.2005 р. та №7544 від 15.06.2005 р.

Запропоновано новий спосіб виготовлення інактивованої антирабічної сухої культуральної вакцини, що включає накопичення біомаси виробничого штаму Щелково-51С вірусу сказу при ролерному культивуванні заражених у процесі висіву клітин ВНК-21, клон 13/04, інактивацію 0,025% в-пропіолактоном при 4-10 оС впродовж 24 годин і ліофільне висушування під захистом сахарозо-желатино- (або пептоно-) агарової суміші. Вакцина не містить живого вірусу, нешкідлива для тварин, має високу імуногенність, безпечна для довкілля.

Вакцина апробована на поголів’ї великої рогатої худоби з різним станом імунної системи. Показана імуногенна ефективність інактивованої антирабічної сухої культуральної вакцини при сумісному щепленні з ліпополісахаридним комплексом, виготовленим на Державній Сумській біофабриці із штаму КМІЕВ-11 Bac.alvei.

Новизна розробок підтверджена деклараційними патентами на корисну модель – "Спосіб одержання антирабічної вакцини" - № 9060 від 15.09.2005 р., "Спосіб стимуляції імунітету у тварин" - № 10104 від 15.11.2005 р. та "Штам Rabdoviridae Щелково-51С для виготовлення вакцини проти сказу тварин" № 9061 від 15.09.2005 р.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Розроблено науково-практичні основи параметрів технологічних процесів при виготовленні живої та інактивованої антирабічних культуральних вакцин із застосуванням економічно ефективної, технологічної лінії перещеплюваних клітин ВНК-21 при ролерному культивуванні виробничих штамів вірусу сказу; запропоновані і реалізовані нові методичні підходи до захисту імунобіологічних властивостей живого атенуйованого вірусу сказу від дії шлункових ферментів за допомогою пектину та інактивованої вакцини при ліофільному висушуванні за допомогою сахарозо-желатино- (або пептоно)-агарової суміші; отримані нові дані про механізм корекції імунітету у тварин з імунодефіцитним станом при щепленні інактивованої антирабічної сухої культуральної вакцини одночасно з ліпополісахаридним комплексом КМІЕВ-11.

Теоретичні положення підтверджені експериментальними даними в лабораторних і виробничих умовах.

За результатами проведених досліджень розроблені і запропоновані для практичного використання:

- жива антирабічна культуральна вакцина (Рабівак ХТТ) для оральної імунізації диких м’ясоїдних тварин, що впроваджена у виробництво на Державній Сумській біофабриці. Реєстраційне посвідчення № 0489-04-059-04 видане Державним департаментом ветеринарної медицини України 27.10.2004 р.;

- інструкція з виготовлення і контролю Рабівак ХТТ. Затверджена директором Державної Сумської біофабрики і узгоджена в Державному науково-дослідному контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів 20.06.2004 р.;

- ТУ У 24.4.00483004-668-2002 на Рабівак ХТТ. Затверджені Головним державним інспектором ветеринарної медицини України 30.09.2004 р.;

- настанова із застосування Рабівак ХТТ. Затверджена Головним державним інспектором ветеринарної медицини України 30.09.2004 р.;

- вакцина антирабічна інактивована суха культуральна із штаму Щелково-51. Реєстраційне посвідчення № 0589-04-0098-04 видане Державним департаментом ветеринарної медицини України 24.12.2004 р.;

- інструкція з виготовлення і контролю вакцини антирабічної інактивованої сухої культуральної із штаму Щелково-51. Затверджена директором Державної Сумської біофабрики 15.01.2002 р. Доповнення № 1 і № 2 до інструкції затверджені 12.09.2002 р. і 07.07.2003 р.;

- ТУ У 46.15.254-97 на вакцину антирабічну інактивовану суху культуральну із штаму Щелково-51. Затверджені Головним державним інспектором ветеринарної медицини України 28.10.1997 р. Повідомлення № 1 про внесення зміни до ТУ У 46.15.254-97 на вакцину. Затверджені Головним державним інспектором ветеринарної медицини України 30 січня 2006 р.;

- технологічний регламент з виготовлення та контролю імуностимулятора КМІЕВ-11. Затверджений директором Державної Сумської біофабрики 30 січня 2006 року.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто виконав, проаналізував та узагальнив увесь обсяг експериментальних досліджень. Частина результатів отримана разом із завідуючою вірусологічним відділом Центральної Державної лабораторії ветеринарної медицини Троценко З.Р. (визначення за серологічними тестами напруженості імунітету у поствакцинальний період при оральній імунізації диких м’ясоїдних тварин живою культуральною Рабівак ХТТ), доктором ветеринарних наук, професором, завідувачем відділу вірусних і пріонних інфекцій БілНДІЕВ Красочкою П.А. та доктором ветеринарних наук, професором, головним науковим співробітником цього відділу Ковальовим М.О. (вивчення патогенності і патотропності культуральних виробничих штамів вірусу сказу, питань імуногенезу при пероральній імунізації, обмінних процесів та імунобіологічних змін в організмі щеплених тварин) та кандидатом ветеринарних наук, завідувачем лабораторії епізоотології ІЕКВМ УААН Бабкіним М.В. (проведення епізоотологічного моніторингу сказу в Україні).

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на засіданнях вчених рад Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Білоруського науково-дослідного інституту експериментальної ветеринарії імені Вишелеського С.В., науково-технічній раді Державної Сумської біофабрики та конференціях різного рівня:

1. Міжнародній науково-практичній конференції: “Ветеринарна медицина: сучасні аспекти розробки, маркетингу i виробництва ветеринарних препаратів”. 24-31 травня 2004 р., Феодосія.

2. II-му Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини, 3-4 серпня 2004 р., Київ.

3. Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 80-річчю ФГУП “Щелковский биокомбинат”. 21-23 вересня 2004 р., Щелково.

4. III-й Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених і аспірантів: “Молоді вчені – майбутнє вітчизняної ветеринарної медицини”, 27 вересня-1 жовтня 2004 р., Суми.

5. Міжнародній науково-практичній конференції: “Забезпечення ветеринар-но-санітарного благополуччя тваринництва, якості і безпеки продукції”, 27-29 жовтня 2004 р., Одеса.

6. Міжнародній науково-практичній конференції: “Ветеринарна медицина 2005: сучасний стан та актуальні проблеми забезпечення ветеринарного благополуччя тваринництва”, 30 травня - 4 липня 2005 р., Ялта.

7. Міжнародній науково-практичній конференції: “Актуальні проблеми ветеринарної медицини в умовах сучасного тваринництва”, присвяченій 75-річчю НДІЕВ ім. С.В. Вишелеського ІАН Білорусі, 2005 р., Мінськ.

8. Simpozijum: Scotarstvo, veterinarstvo, agroekonomia utrazikonim procesia. Herceg-Novi, 19-24 jun. 2005.

Публікації. Основні положення дисертації опубліковані у 30 наукових працях, з яких 1 брошура, 21 стаття (13 одноосібно) у фахових виданнях, перелік яких затверджений ВАК України; 8 патентів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 299 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована 62 таблицями та 32 рисунками, складається з вступу, огляду літератури, розділів: матеріали і методи досліджень, результати власних досліджень та їх аналізу, висновки та пропозиції виробництву, список використаних джерел літератури і додатки. Список літературних джерел включає 424 найменування, у тому числі 188 зарубіжних авторів.

ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

Матеріали і методи досліджень. Робота виконувалась впродовж 2000-2005 років на базі цеху противірусних препаратів Державної Сумської біофабрики, лабораторій епізоотології та біотехнології Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Центральної та обласних і районних лабораторій ветеринарної медицини, а також Білоруського науково-дослідного інституту експериментальної ветеринарії імені Вишелеського С.В. за договором з творчої співдружності.

Епізоотичний стан щодо сказу в Україні і суміжних країнах вивчали за даними Міжнародного епізоотичного бюро та Державного департаменту ветеринарної медицини України і Центральної Державної лабораторії ветеринарної медицини, а також шляхом особистого аналізу епізоотичної ситуації зі сказу в Полтавській та Сумській областях.

У процесі розробки антирабічних вакцин використали фіксований вірус сказу, зокрема, штам РБ-71 (БілНДІЕВ-ВГНКІ), адаптований до ембріонів курей і культур первинно трипсинізованих клітин нирки свиней та фібробластів ЕК, вірулентність якого для мишей при інтрацеребральному зараженні складала 3,63-5,47 lg ЛД50/0,03 мл; штам Щелково-51, що підтримується на білих мишах і кролях, титр вірулентності – 4,8-5,2 lg ЛД50/0,03 мл та штам CVS (Challеnqe virus standart) – надійшов у 1971 році із лабораторії профілактики сказу Інституту полімієліту і вірусних енцефалітів РАМН, підтримується на білих мишах, кролях, собаках і вівцях, титр вірулентності – 4,6-5,4 lg ЛД50/0,03 мл.

Штами РБ-71 і Щелково-51 вірусу сказу культивували у первинних і перещеплюваних клітинних системах. Первинні культури клітин отримували за модифікованим Younqner J. (1954) методом Dulbecco R.(1954). Вихідним матеріалом для трипсинізації були нирки плодів собак та ембріони курей і перепілок. Із перещеплюваних клітин використовували лінії Vero, Frhk, ВНК-21/13, ПС, МДСК.

Культури клітин вирощували в 1,5-літрових матрасах та ролерних бутлях ємністю 0,5 і 3-5 л на живильних середовищах 199, Ігла МЕМ і ДМЕМ та їх суміші з додаванням 5-10% сироватки крові великої рогатої худоби. Живильні середовища готували з імпортних наборів компонентів на Державній Сумській біофабриці. Перещеплювані клітини підтримували шляхом серійних пересівів та зберігали в замороженому стані у рідкому азоті. Життєздатність клітинної популяції у процесі культивування, а також після дефростаціі визначали фарбуванням трипановим синім. Ступінь життєздатності клітин оцінювали за проліферативною активністю, а репродуктивну спроможність - за приростом їхньої біомаси на визначеній площині культуральних посудин та терміном формування моношару.

Штами РБ-71 і Щелково-51 вірусу сказу адаптували до нових умов культивування шляхом послідовно зростаючих пасажів. В якості вихідного вірусовміщуючого матеріалу штаму РБ-71 використали мозок заражених ним овець, а штаму Щелково-51 – клітино-культуральну суспензію. Вірулентність виробничих штамів НФ-2 і Щелково-51 та імуногенність вакцин вивчали на мишах, кролях, собаках, вівцях і великій рогатій худобі. У дослідах використано більше 12000 білих мишей - масою 18-20 г і мишей-сисунів масою 6-8 г, 180 кролів породи Шиншила масою 1,8-2,0 кг, 60 морських свинок, 340 безпорідних собак віком 4-24 місяців, 57 лисиць, 66 овець 1,5-2-річного віку та 146 голів великої рогатої худоби. Інфекційність культурального вірусу сказу визначали титруванням на білих мишах, для чого готували десятикратні розведення, що вводили інтрацеребрально, а імуногенність – за титром вірусонейтралізуючих антитіл в сироватках крові щеплених вакцинами тварин. Реакцію нейтралізації вірусу сказу проводили на білих мишах за загальноприйнятною методикою з робочими двократними розведеннями досліджуваних сироваток з постійною дозою вірусу (30 ЛД50/0,03 мл). Радіоактивне мічення культурального вірусу для оральної імунізації при вивченні патотропності здійснювали 5Н3-уридином у БілНДІЕВ. Вірусовміщуючу культуральну суспензію очищали за допомогою природної седиментації та центрифугування. Одержаний вірус інактивували фенолом, формальдегідом, теотропіном, етанолом, в-пропіолактоном при 3-х температурних режимах (4-10 єС, 20-22 єС і 37±0,5 єС).

Після завершення кожного технологічного циклу напівфабрикати перевіряли на стерильність та залишкову інфекційність, яку визначали шляхом 3-разового послідовного інтрацеребрального зараження білих мишей, стерильність контролювали за ГОСТ 28085-89 ("Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности") висіванням на МПБ, МПА, тіоглікольове середовище та середовище Сабуро. Нешкідливість та авірулентність вакцини контролювали внутрішньом’язовим введенням мишам (по 30-40 голів на кожен зразок або серію) у дозі 0,5 мл/гол з подальшим наглядом за тваринами впродовж 14 діб. Імуногенність визначали кількісним методом, випробовуючи захисні властивості нерозбавлених і в розведеннях вакцин при контрольному інтрацеребральному зараженні імунізованих тварин штамом CVS вірусу сказу у дозі 30 ЛД50/0,03 мл/гол. Оцінку стану клітинного імунітету проводили за методикою Чеботкевича М.Н. і Лютинского С.И. (Методы оценки состояния иммунной системы и факторов неспецифической резистентности в ветеринарии, С.-П.-1998).

Статистичний аналіз даних здійснювали за допомогою редактора електронних таблиць Microsoft Excel XP (2002) та пакету програм Statistika v 6.1 (Rus). Щодо статистичної обробки даних експериментальних досліджень продуктивності клітинних систем варіаційний знак досліджуваних тканин (числа клітин, одержаних при трипсинізації, або кількості знятих із посудин при пересівах перещеплюваних клітин) визначали, використовуючи елементи математичного аналізу (Меркур’єв Є., 1964). Квадратичні відхилення і середнє арифметичне вираховували для сукупності поставлених дослідів. За таблицею Стьюдента знаходили рівень вірогідності (р).

Дані з вивчення інфекційності вірусу та імуногенності вакцин піддавали статистичній обробці за методом Кербера у модифікації Ашмаріна І. (1962).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Епізоотологічний стан щодо сказу в Україні. У соціальному відношенні сказ залишається однією із найважливіших медико-ветеринарних проблем, з якою людство стикається на п’яти материках планети. Вивченням проблеми поширення, діагностики, профілактики та розробки заходів боротьби зі сказом займались і продовжують займатися багато дослідників як за кордоном, так і в країнах пострадянського простору (Ведерников А.А. з співавт., 1974; Селимов М.А., 1978; Stцhr K. et al, 1990; Прискока В.А. з співавт., 1996; Котенко М. з співавт., 1997; Павленко М., Троценко З.Р., 2000; Груздев К.Н., Недосеков В.В., 2001; Гришок Л.П. з співавт., 2002; Макаров В.К., 2002; Скибицький В.Г., 2003 та ін.).

В Україні захворювання на сказ має значне поширення, проте заходи боротьби поки що проводяться безсистемно, тільки в неблагополучних осередках. Між тим в багатьох країнах світу розроблено національні програми з ліквідації сказу на таких принципах, як всебічний епізоотологічний моніторинг та керування епізоотичним процесом на основі постійного нагляду, аналізу і оцінки епізоотичної ситуації та оперативного комплексного впливу на нього шляхом розриву усіх ланок епізоотичного ланцюга, з подальшим блокуванням і повним знешкодженням на рівні популяції, епізоотичного осередку, конкретної адміністративної території.

Нами встановлено, що епізоотичний стан щодо сказу в Україні продовжує залишатися напруженим і обумовлено це в першу чергу збільшенням кількості неблагополучних пунктів. На сьогодні сказ зареєстровано в усіх природно-географічних зонах України, у т. ч. і в АР Крим, в той час як до 2004 року неблагополучними були лише 23 області.

При аналізі сучасної епізоотичної ситуації щодо сказу в Україні за одиницю епізоотичного обліку нами обраний неблагополучний пункт, а не хвора тварина, оскільки у нашій країні сказ характеризується низьким індексом вогнищевості. Так, за період 1994-2004 рр. він дорівнював 1,2 (11121:9332). За останні десять років виявлено 9332 неблагополучних пункти із сказу. Особливо значне збільшення спостерігали у 2002 році, коли кількість їх досягла – 1312, що перевищило у 5,1 рази рівень 1994 року.

Як у 1994, так і у 2004 роках загальна кількість неблагополучних територій в цілому по країні не змінилася, а абсолютне зростання неблагополучних пунктів досягло 819, тобто збільшилось на 318,6%, в той час як на долю неблагополуччя серед сільськогосподарських тварин приходиться 208,7% (з 386 до 768 випадків). Таке просторове поширення сказу характерне для ензоотичного неблагополуччя і відсутності єдиного первинного вогнища. При аналізі розподілу кількості випадків сказу по географічних зонах України виявлені значні відмінності (рис.1).

Рис.1 Зони поширення сказу з 1994 по 2004 роки (кількість неблагополучних пунктів)

Так, середньостатистична кількість 502±135,5 неблагополучних пунктів щодо сказу усіх видів тварин у лісостеповій зоні перевищувала цей показник у 2 рази в поліссі (227±120,5) і в 1,4 рази в степовій зоні (355±87,2). Відповідно кількість уражених тварин (580) була вищою, ніж у 2 рази в поліссі і в 1,4 рази в степовій зоні (459).

Результати визначення взаємозв’язку між кліматичними та ландшафтними особливостями природно-географічних зон і напруженістю епізоотичного процесу підтверджують важливість співвідношення свійських і диких тварин у підтриманні епізоотичного процесу сказу в Україні. Результати порівняння видової структури тварин, котрі захворіли на сказ в різних зонах, переконливо свідчать, що питома вага свійських і диких тварин у неблагополучних пунктах степу і лісостепу істотно не відрізняються, де кількість захворілих на сказ диких м’ясоїдних була в межах - 33%, сільськогосподарських - 21-23% і свійських м’ясоїдних – 43-45%. У зоні полісся кількість випадків сказу серед диких тварин досягала – 60% від загальної кількості виявлених. Отримані дані вказують, що основним резервуаром рабічної інфекції є звичайна лисиця, яка мешкає не тільки в місцях дикої природи, а й в культурних ландшафтах, включаючи околиці міст і сіл. Це також пояснює різницю у співвідношенні неблагополучних пунктів щодо сказу диких і свійських тварин у поліссі, степу та лісостепу, де концентрація поголів’я лисиць вище.

Між тим, позитивна кореляція між випадками сказу лисиць і свійських м’ясоїдних складає всього – 0,85, а коефіцієнт кореляції сказу лисиць і сільськогосподарських тварин – 0,37, на підставі чого можна припустити, що у даному ланцюзі передачі сказу лисиці не відіграють провідної ролі. Це підтверджується високим коефіцієнтом – 0,86 кореляції випадків захворювання на сказ свійських м’ясоїдних і сільськогосподарських тварин. Отримані дані свідчать, що проміжною ланкою передачі вірусу сказу від лисиць сільськогосподарським тваринам є свійські м’ясоїдні, контроль за якими і проведення своєчасної профілактичної імунізації сприяло б забезпеченню значного зниження захворюваності сільськогосподарських тварин.

Порівнюючи динаміку поширення сказу в Україні за останні 11 років (рис.2), ми встановили, що загальний тренд неблагополуччя і тренди за видами тварин збігаються за спрямованістю (виражене наростання кількості неблагополучних пунктів у 2000, 2001 і 2003 роках), але розрізняються за вираженістю кореляції, яка складає – 0,58 для диких і свійських м’ясоїдних і 0,86 для свійських м’ясоїдних і сільськогосподарських тварин. Таким чином, останні дані вказують на провідну роль у поширенні сказу свійських м’ясоїдних (кішки, собаки).

Що стосується сезонності сказу, яка вивчалась в Полтавській та Сумській областях, нами встановлено її зв’язок з життєвою активністю диких тварин (рис.3). Максимальна кількість випадків сказу у цих тварин припадає на листопад-березень (період гону і виплоду) і мінімальна на літній період. Серед свійських тварин максимум напруженості епізоотичного процесу спостерігається в травні-червні, що співпадає з пасовищним періодом.

Рис. 2 Динаміка виявлення неблагополучних пунктів в Україні за період з 1994-2004 роки

Коефіцієнт між піковими значеннями (березень) і спадом (липень) досить значний – 21 (мін./макс.)

Рис. 3 Сезонність епізоотії сказу на прикладі Сумської і Полтавської областей в 2003-2004 роках.

На благополуччя щодо сказу в Україні суттєво впливав епізоотичний стан у суміжних з Україною країнах. При аналізі епізоотичної ситуації щодо сказу встановлено, що в Росії епізоотія сказу теж мала два піки підйому (1999 і 2003 роки), у розвитку яких найбільше значення належало диким тваринам. Показник кореляції кількості неблагополучних пунктів щодо сказу диких і свійських м’ясоїдних складав – 0,98, сільськогосподарських і свійських м’ясоїдних тварин – 0,91, сільськогосподарських і диких м’ясоїдних тварин – 0,92. Він свідчить, що в Росії, як і в Україні, епізоотичний процес сказу мав аналогічний характер.

В Білорусі в епізоотичному процесі домінують дикі м’ясоїдні, а серед сільськогосподарських тварин не встановлено зростання випадків захворювання на сказ. Не виключено, що це обумовлено системним широкомасштабним щепленням проти сказу. Показник кореляції між кількістю неблагополучних пунктів щодо сказу диких і свійських м’ясоїдних складав – 0,94, сільськогосподарських і диких м’ясоїдних тварин – 0,43, а сільськогосподарських і свійських м’ясоїдних тварин – 0,63.

В Молдові також основні піки епізоотії сказу припадали на 1999 і 2003 роки, проте на відміну від України там відбулося значне зниження кількості випадків захворювання на сказ у 2000 році. Кореляція між кількістю неблагополучних пунктів щодо сказу диких і свійських м’ясоїдних становила – 0,99, сільськогосподарських і диких тварин – 0,97 та сільськогосподарських тварин і свійських м’ясоїдних – 0,99.

За видовим складом тварин, що захворіли на сказ, показники були фактично однаковими в Україні та суміжних країнах пострадянського простору. Кількість випадків сказу серед диких тварин знаходилась у межах 39-46% і лише в Білорусі – 68%, а сільськогосподарських тварин в Україні – 21%, Росії – 29%, Молдові – 24%, в Білорусі лише 9%. Встановлена також відмінність щодо участі в епізоотичному процесі свійських м’ясоїдних (собак і кішок), кількість яких в Україні становила – 40%, Росії – 31%, Молдові – 23%, тобто коефіцієнт співвідношення цих тварин - 1,8; 0,8; та 0,7 відповідно. В Україні та Росії кількість випадків захворювання на сказ кішок майже у 2 рази перевищувала цей показник у собак, а в Білорусі та Молдові навпаки переважала кількість випадків сказу серед собак.

Порівнюючи динаміку епізоотичного процесу зі сказу в Україні та в Словаччині, Румунії, Польщі і Угорщині, ми встановили аналогічну тенденцію щодо його розвитку, хоча вона відрізнялась за термінами реєстрації. В Словаччині пік епізоотії сказу припадав, як в Україні і Росії, на 1999 і 2003 роки, коли кількість неблагополучних пунктів складала 354 і 237, відповідно, а показник кореляції між їхньою кількістю серед диких і свійських м’ясоїдних був на рівні - 0,51, сільськогосподарських і диких тварин – 0,21 та сільськогосподарських і свійських м’ясоїдних тварин – 0,67.

В Румунії пік епізоотії сказу приходився на 2001 рік (324 неблагополучних пункти), що перевищує в 6,9 разів цей показник 1999 року (47 пунктів). Проте, показник кореляції між кількістю неблагополучних щодо сказу пунктів у Румунії серед диких і свійських м’ясоїдних порівняно з Україною становив 0,56, сільськогосподарських і свійських м’ясоїдних тварин – 0,96.

В Польщі, незважаючи на її природно-географічні особливості території, динаміка епізоотичного процесу в період з 1996 по 2000 роки характеризувалася зниженням напруженості. І тільки в 2001-2004 роках кількість неблагополучних щодо сказу пунктів зросла з 1148 до 2569, причому в основному за рахунок захворювання серед диких тварин. Це підтверджується показником кореляції між кількістю неблагополучних пунктів щодо сказу серед диких і свійських м’ясоїдних тварин, який складав 0,91, сільськогосподарських і диких тварин – 0,56, а сільськогосподарських і свійських м’ясоїдних – 0,54.

В Угорщині напруженість епізоотичного процесу щодо сказу на відміну від України в останні 10 років менша, але динаміка та тенденція його розвитку дещо схожа. Як і в Україні, в Угорщині спостерігалося збільшення кількості неблагополучних пунктів щодо сказу у 2000 році. Проте, показник кореляції цих пунктів захворювання диких і свійських м’ясоїдних був на рівні – 0,85, сільськогосподарських і свійських м’ясоїдних тварин – 0,68, а сільськогосподарських і диких м’ясоїдних тварин лише 0,23.

За видовим складом тварин, які уражались у Словаччині, питома вага сільськогосподарських тварин знаходилась на рівні 1%, Румунії – 12%, Польщі – 8%, Угорщині – 5%, свійських м’ясоїдних (кішок і собак) – 10 та 7%, 11 та 12%, 6 та 4% і 11 та 4% відповідно. В той же час, як і в Україні, в цих країнах найвища питома вага у підтриманні епізоотичного процесу щодо сказу належала диким тваринам, зокрема, в Словаччині вона складала – 81%, Румунії – 64%, Польщі – 82% та Угорщині – 80%.

Таким чином, можна припустити, що в період спаду напруженості епізоотичного процесу свійські м’ясоїдні та сільськогосподарські тварини перестають включатися в епізоотичну ланку і збудник сказу знаходиться в своїй природній екологічній ніші – популяції диких тварин. У зв’язку з цим однією з проблем контролю сказу є постійний облік і аналіз ситуації в неблагополучних пунктах та проведення профілактичної вакцинації. На підставі зазначеного ми зосередили свої зусилля на розробці живої антирабічної культуральної вакцини для імунізації диких м’ясоїдних та удосконаленні технології виготовлення інактивованої культуральної вакцини проти сказу сільськогосподарських і свійських м’ясоїдних тварин.

Вибір і вивчення репродуктивних властивостей виробничих штамів вірусу сказу. При розробці нових вакцин наші дослідження були спрямовані, перш за все, на вибір клітинних систем для культивування і накопичення біомаси виробничих штамів, оскільки вони є головною ланкою біотехнологічного процесу виготовлення біопрепаратів.

На сьогодні в практичній вірусології та біотехнології набули широкого застосування дві клітинні системи: первинно трипсинізованих та перещеплюваних клітин. Розмаїття засобів отримання та культивування створюють сприйнятливі умови для їхнього використання.

Отримані нами дані стосуються порівняльної оцінки цих систем, в результаті якої встановлена залежність накопичення клітинної біомаси від способу культивування і вихідної концентрації. При вивченні культуральних властивостей первинно трипсинізованих клітин, зокрема, нирки собак та фібробластів ембріонів курей і перепілок встановлено, що вони зберігають характерну для них в організмі морфологію і є придатною тест-системою для накопичення вірусу сказу. Разом з тим, недовгочасний термін життєздатності і необхідність поповнення донорської тканини для трипсинізації обмежують їхнє використання в біотехнології виготовлення біопрепаратів. Перещеплювані клітини Vero, Frhk, ПС та ВНК-21, клон 13/04, МДСК мають значні переваги. На відміну від первинних культур клітин вони не потребують складних умов отримання і культивування. У серії дослідів з вивчення умов культивування первинних і перещеплюваних клітин показано, що як при стаціонарному (в матрасах), так і ролерному (в бутлях) культивуванні зі збільшенням висівної концентрації підвищується щільність клітин від 105 до 5х105/см2 ростової поверхні культуральних посудин. Скорочуються терміни формування моношару з 5-6 до 2-3 діб. Проте подальший приріст клітинної біомаси зменшується не тільки за рахунок підвищеної концентрації, але також внаслідок контактної інгібіції росту і пригнічення функціональної життєдіяльності клітин продуктами метаболізму, що накопичуються навколо них у середовищі, особливо в матрасах.

Продуктивна активність клітин також залежала від складу живильного середовища. На цей час застосовують високоякісні живильні середовища, що збалансовані за амінокислотним складом, вітамінами, ферментами, котрі стимулюють ріст клітин in vitrо. Проте вітчизняна біотехнологія клітинних культур відчуває їх дефіцит, оскільки в Україні відсутнє виробництво вихідних для їхнього виготовлення компонентів. Ми використали комерційні набори сухих компонентів середовищ, що надходять із далекого зарубіжжя, котрі відрізняються за складом і якістю амінокислот, що впливає на ріст клітин. Проведені дослідження з культивування перещеплюваних клітин у різних комбінаціях живильних середовищ показали, що збагачені амінокислотами середовища, зокрема з подвійним їхнім вмістом, підвищують репродуктивну здатність клітин і вихід біомаси для зараження вірусом сказу. Вирощування клітин у суміші живильних середовищ 199 і Ігла ДМЕМ забезпечувало однорідність клітинного моношару, придатного для зараження вірусом сказу.

Найбільш оптимальні умови накопичення клітинної біомаси забезпечувало ролерне культивування. При порівняльному випробуванні перещеплюваних клітин показана можливість їхнього використання в промисловому напрацюванні вихідної біомаси клітин. Разом з тим селекціонований нами клон 13/04 перещеплюваних клітин ВНК-21 виявився більш продуктивним. Вихід клітин у бутлях порівняно з культурою в 1,5-літрових матрасах складав – 324 млн., що відповідає – 3,36х105 клітин/см2 ростової поверхні і 7,2х105 клітин/мл живильного середовища, а в матрасах відповідно 86 млн., тобто 2,86х105 клітин/см2 і 4,3х105 клітин/мл середовища. Окрім того, в ролерних бутлях на добу раніше формувався моношар клітин порівняно з матрасами, а накопичення біомаси первинних було у 3 та перещеплюваних у 3,6 рази вищим на одиницю об’єму живильного середовища.

Отримані результати з накопичення клітинної біомаси слугували підґрунтям для використання лінії перещеплюваних клітин ВНК-21, клон 13/04, у подальших експериментах з розробки живої та інактивованої антирабічних культуральних вакцин.

Адаптація і вивчення імунобіологічних властивостей виробничих штамів вірусу сказу. При конструюванні живої та удосконаленні технології виготовлення інактивованої антирабічних культуральних вакцин була приділена значна увага вивченню їхніх властивостей. Відомо, що клітинна система впливає на антигенність, імуногенність та патогенність репродукованого в ній вірусу. Обрані нами селекціоновані з фіксованого вірусу сказу "Овечий-ВГНКИ" штами РБ-71 і Щелково-51, для виготовлення вакцин при культивуванні в клітинних культурах, репродукували без проявлення цитопатичних змін, у зв’язку із чим інфекційна активність визначалася за вірулентністю для білих мишей при інтрацеребральному зараженні.

Встановлено, що у процесі адаптації до нових умов культивування дещо змінювалася репродуктивна активність обох штамів. В перших пасажах вона знижувалась, а потім підвищувалась і фактично стабілізувалась, починаючи з 3-4 пасажів. Зокрема, репродуктивна активність штаму РБ-71 у першому пасажі як у первинних, так і перещеплюваних культурах клітин була на 1,0-1,5 lg МЛД50/0,03 мл нижчою порівняно з вихідним титром (5,0 lg МЛД50/0,03 мл). У культурах перещеплюваних клітин Vero, МДСК, Frhk і ВНК-21 титр інфекційності стабілізувався на рівні 5,5-6,8 lg МЛД50/0,03 мл, а в первинних культурах клітин ФЕК і ФЕП, за винятком НС, -3,5-4,5 lg МЛД50/0,03 мл. В культурі первинних клітин нирки собаки (НС) титр штаму РБ-71 становив 5,1-5,5 lg МЛД50/0,03 мл. З перещеплюваних клітин культури ВНК-21 та Frhk, в яких вірус накопичувався у титрі 6,2-6,8 lg МЛД50/0,03 мл, виявилися найбільш чутливими до штаму РБ-71. Досить стабільні, проте дещо нижчі, титри вірусу забезпечували культури клітин МДСК (5,5-6,3 lg МЛД50/0,03 мл) і Vero (5,5-5,8 lg МЛД50/0,03 мл) впродовж послідовних 15 пасажів.

При порівняльному вивченні репродуктивних властивостей штаму Щелково-51