імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

НЕДЗВЕЦЬКИЙ ВІКТОР СТАНІСЛАВОВИЧ

УДК 576.311.348.4:546.62:616-001.28

СТАН НЕРВОВОСПЕЦИФІЧНИХ БІЛКІВ І МНЕСТИЧНИХ

ПРОЦЕСІВ ЗА УМОВ ВПЛИВУ НЕСПРИЯТЛИВИХ ЧИННИКІВ РІЗНОЇ ПРИРОДИ ТА АНТИОКСИДАНТІВ

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біофізики та біохімії

Дніпропетровського національного університету.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор

Неруш Петро Опанасович, завідувач кафедри нормальної фізіології

Дніпропетровської державної медичної академії.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший

науковий співробітник Нурищенко Наталія Євгенівна,

Інститут фізіології ім. академіка Петра Богача біологічного

факультету Київського національного університету

ім. Тараса Шевченка КМ України;

старший науковий співробітник відділу біофізики;

доктор біологічних наук, професор Плиска Олександр Іванович,

Національний педагогічний університет

ім. М.П. Драгоманова МОН України,

завідувач кафедри анатомії, фізіології та шкільної гігієни;

доктор біологічних наук, професор Бразалук Олександр Захарович,

Дніпропетровська державна медична академія,

завідувач кафедри біохімії, медичної та фармацевтичної хімії.

Провідна установа: Національний медичний університет

ім. О.О. Богомольця МОЗ України, м. Київ.

Захист відбудеться 18.10.2006 2006 р. о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного

університету ім. Тараса Шевченка

(м. Київ, просп. Акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. ___ )

Поштова адреса: 01033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 64

З дисертецією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного

університету ім. Тараса Шевченка (01033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 58).

Автореферат розісланий “ 26 ”09 2006 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження процесів навчання і пам’яті в останні роки привертають особливої уваги. Розкриття молекулярних механізмів мнестичних процесів знаходиться лише на початку складного і тривалого дослідницького шляху. Специфічні білки нейронів і глії визначають особливості функціонування окремих клітинних компонентів нервової системи та їх взаємодію як в нормі, так і при патологічних розладах. На сьогоднішній день функції нервовоспецифічних білків у вищій нервовій діяльності, розвитку патологій нервової системи залишаються вивченими недостатньо для розуміння зв’язку між молекулярними, структурними змінами і модуляцією фізіологічних процесів у нервовій системі (Lariviere et al., 2004).

Міжклітинна адгезія є надзвичайно важливою для процесів розвитку, диференціації і функціонування клітин нервової системи. Молекула адгезії нервових клітин (NCAM) грає важливу роль в ембріогенезі нервової системи, проростанні нейритів, формуванні і функціонуванні синапсів (Hartz et al., 2005).

Гістоспецифічними компонентами проміжних філаментів цитоскелету астроцитів є гліальний фібрилярний кислий білок (ГФКБ), нейронів – триплет білків нейрофіламентів (НФ) (Mielke et al., 2006). Білки проміжних філаментів обумовлюють такі життєво важливі процеси, як аксональний транспорт, забезпечення стабільної морфології астроцитів та їх відростків, проростання нейритів в процесах розвитку та репарації ушкоджень (Hasselmo et al., 2004).

Більшість робіт, присвячених вивченню цитоскелетних і мембранних білків клітин нервової системи, стосуються тільки їх загального вмісту. Характер змін співвідношення окремих субодиниць, їх поліпептидна гетерогенність, участь у нейродегенеративних процесах, когнітивних функціях і відновленні пошкоджень залишаються нез’ясованими (Eng, 2000; Pekny et al., 2004).

Зокрема, не встановлені точно процеси, що здатні поєднувати молекулярні перебудови структурних білків в нервових клітинах зі змінами вищої нервової діяльності. Передбачається, що структурною основою формування умовних рефлексів, процесів навчання і пам’яті є модифікації міжклітинних контактів у центральній нервовій системі (ЦНС) (2004). Цитоскелетні перебудови і модуляція експресії молекули адгезії нервових клітин, можуть бути одними з найважливіших механізмів здатних асоціювати короткочасні зміни активності нейронів та їх ансамблів з довгостроковими змінами структури і функцій синаптичних контактів у межах груп нейронів і окремих структур мозку (Ronn et al., 2003). У зв’язку з цим актуальним є питання комплексної характеристики фізіологічних, біохімічних і молекулярних показників, виявлення зв’язку між ними за умов дії ушкоджуючих чинників, що викликають структурні і функціональні порушення.

Пошкодження фізичної природи, хімічні та метаболічні інсульти призводять до розвитку реактивного астроцитозу, основними ознаками якого є підсилення синтезу ГФКБ і фібрилогенезу у гіпертрофованих астроцитах (Baydas et al., 2005). Несприятливі фактори впливають на процеси нейрональної пластичності, до яких залучаються мембранні адгезивні молекули. У зв’язку з цим актуальним постає питання порівняльної характеристики впливу несприятливих факторів різного походження на експресію нервовоспецифічних білків і функції ЦНС.

Одним з найбільш поширених індукторів структурно-функціональних порушень у клітинах ЦНС є окисний стрес. Окисні ушкодження можуть бути важливою причиною нейродегенеративних змін і прискореного розвитку пізнавального дефіциту. Нез’ясованим залишається питання зв’язку між окисними пошкодженнями, метаболізмом структурних нервовоспецифічних білків і пізнавальною дисфункцією.

Розвиток чутливих методів імунохімії та молекулярної біології дозволив виявити характерні зміни цитоскелетних і мембранних маркерів при різних паталогічних станах. У попередніх роботах (Недзвецький и спіавт., 1990, 1991) детально досліджено ефекти іонізуючого випромінювання на метаболізм нервовоспецифічних білків та їх роль у розвитку пострадіаційного ЦНС-синдрому. Проблема впливу несприятливих факторів на ЦНС залишається дуже гострою у зв’язку з інтенсивним розвитком сучасних технологій. Токсикологічні ефекти іонів металів, промислових розчинників широко досліджуються з оглядом на їх участь у генезі нейродегенеративних розладів (Grant et al., 2002). Стрептозотоцин-індукований діабет розглядається як адекватна модель для дослідження нейропатій при метаболічних розладах (Gispen and Bissels, 2000).

Дослідження клітинної відповіді на дію ушкоджуючих факторів може бути корисним у розкритті механізмів, що підтримують гомеостаз і здатність нервової системи до пластичних змін. Хронічні несприятливі впливи, яких зазнає організм людини в умовах техногенного пресингу, зумовлюють необхідність пошуку адекватних показників ступеня пошкодження нервової тканини. Оскільки специфічні функції нервової системи в значній мірі контролюються нервовоспецифічними білками, можна передбачити зв’язок між порушенням експресії таких білків і розвитком патологічних станів ЦНС. Дослідження протекторних властивостей та тестування препаратів для корекції патологічних станів ЦНС потребує вивчення молекулярних механізмів їх дії. У зв’язку з цим особливу актуальність набуває пошук адекватних маркерів, які дозволяють оцінювати ефективність нейропротекторних заходів.

Комплексний підхід, який полягає в аналізі показників поведінкових реакцій і пізнавальних процесів, окисного стресу, а також вмісту і складу нервовоспецифічних білків може значно розширити уявлення про механізми функціонування нервової системи. Отже, дослідження нервовоспецифічних білків, змін їх експресії і порушення когнітивних процесів за умов дії несприятливих чинників різної природи є актуальним та науково обґрунтованим.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами нуаково-дослідних робіт. Робота виконувалася в рамках договору про науково-технічне співробітництво між кафедрою біофізики та біохімії Дніпропетровського державного університету та кафедрою нормальної фізіології Дніпропетровської державної медичної академії (№ 1145, 2000-2003 рр.), цільового гранта від TUBITAK уряду Туреччини, 2002-2003 рр., (грант SBAG–2551) за темою “Дослідження нейропротекторної дії мелатоніну за умов СТЗ-індукованого діабету” та 2004-2005 рр., (грант FUBAP–1056) за темою “Вплив ліпоєвої кислоти на нейрони і гліальні клітини за умов окисних ушкоджень ЦНС”. Дисертація відповідає основному плану теми “Дослідження механізмів порушень метаболізму з метою діагностики і корекції” (№ 4-075-04) науково-дослідних робіт кафедри біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було визначення ролі нервовоспецифічних білків ГФКБ, НФ, NCAM і S-100 головного мозку щурів у порушенні мнестичних процесів за умов впливу несприятливих чинників різної природи, дія яких супроводжувалась розвитком окисного стресу в нервовій тканині. До мети також входило тестування антиоксидантних сполук для попередження розвитку патологічних станів ЦНС. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

Визначити показники поведінкових реакцій, вміст і склад цитоскелетних (ГФКБ, НФ) і мембранного (NCAM) нервовоспецифічних білків за умов дії несприятливих чинників фізичної природи (постійне освітлення і рентгенівське опромінення у низьких дозах).

Визначити показники поведінкових реакцій, вміст і склад цитоскелетних (ГФКБ, НФ) і мембранного (NCAM) нервовоспецифічних білків за умов впливу несприятливих чинників хімічної природи (толуену та іонів Al3+).

Дослідити астрогліальну реактивну відповідь, зміни складу та вмісту білка проміжних філаментів астроцитів у різних відділах головного мозку щурів за умов сумісного впливу іонів Al3+ і рентгенівського опромінення у низьких дозах.

З’ясувати рівень змін вмісту і складу поліпептидних фрагментів цитоскелетного (ГФКБ), мембранного (NCAM) і цитоплазматичного (S-100) нервовоспецифічних білків у різних відділах мозку щурів за умов експериментального діабету.

Дослідити процеси навчання і пам’яті у щурів за умов експериментального діабету, поведінкові реакції щурів за умов тривалого постійного освітлення та інтоксикації AlCl3 і толуеном.

Оцінити токсичні ефекти несприятливих чинників на ЦНС щурів за наступними критеріями: рівень пероксидації ліпідів у нервовій тканині, вміст і склад поліпептидних фрагментів цитоскелетних (ГФКБ, НФ) і мембранного (NCAM) нервовоспецифічних білків, зміни процесів навчання і пам’яті і поведінкових реакцій щурів.

Оцінити нейропротекторну дію антиоксидантів (мелатоніну, вітаміну Е і б-ліпоєвої кислоти) шляхом визначення показників навчання і пам’яті, реактивної астрогліальної відповіді, вмісту і балансу ізоформ NCAM за умов впливу несприятливих чинників, дія яких супроводжується розвитком окисного стресу.

Оцінити залежність змін процесів вищої нервової діяльності від рівню показників окисного стресу і вмісту та складу нервовоспецифічних цитоскелетного і мембранного білків.

Об’єкт дослідження. Механізми участі нервовоспецифічних білків цитоскелету нейронів і астроцитів, молекули адгезії NCAM у процесах навчання і пам’яті, відповіді клітин нервової тканини на пошкодження чинниками різної природи.

Предмет дослідження. Мнестичні процеси, поведінкові реакції, склад поліпептидних фрагментів і вміст нервовоспецифічних білків проміжних філаментів нейронів і астроцитів, молекули адгезії NCAM і кальційзв’язуючого білку S-100 за умов впливу несприятливих чинників і застосування засобів корекції патологічного стану ЦНС (мелатонін, вітамін Е, б-ліпоєва кислота).

Методи дослідження. Методи оцінки емоційно-поведінкового статусу щурів (тест “відкритого поля”) і оцінки пам’яті і здатності до навчання (тест Мориса, умовного рефлексу пасивного уникнення); фізико-хімічні методи (атомно-абсорбційна спектрофотометрія, фотоколориметрія, ультрацентрифугування, хроматографія, електрофорез у поліакриламідному гелі; імунохімічні методи (імуноелектрофорез, імуноблотинг, імуногістохімія); експериментальні моделі на щурах, статистичні засоби обробки даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Запропоновано використання цитоскелетних і мембранного нервовоспецифічних білків в якості прогностичних маркерів розвитку нейропатії та пізнавального дефіциту.

Уперше встановлено особливості впливу несприятливих чинників різної природи (постійне освітлення, хімічний і метаболічний інсульт) на вміст і склад цитоскелетних (ГФКБ, НФ), мембранного (NCAM) і цитоплазматичного (S-100) нервовоспецифічних білків.

Виявлені загальні закономірності реактивної астрогліальної відповіді на вплив несприятливих чинників – підвищення експресії ГФКБ і фібрилогенезу супроводжується зростанням вмісту поліпептидних фрагментів деградованих за молекулярною масою.

Встановлені відмінності вмісту і складу проміжних філаментів, NCAM за умов впливу несприятливих чинників різної природи, які свідчать про загальні риси клітинної відповіді астроцитів і нейронів на ушкодження.

Показано, що астрогліальна відповідь на інтоксикацію іонами алюмінію або толуеном, крім збільшення вмісту ГФКБ та фібрилогенезу, супроводжується активною реконструкцією мережі проміжних філаментів цитоскелету астроцитів, стабільної за нормальних фізіологічних умов. Встановлено існування прямого зв’язку між розвитком астрогліальної відповіді, інтенсифікацією пероксидації ліпідів у тканині головного мозку та порушенням емоційно-поведінкових реакцій тварин за умов дії несприятливих чинників.

Уперше наводяться дані про зниження експресії ізоформи NCAM180 в гіпокампі і корі великих півкуль щурів в різних експериментальних моделях, для яких характерний розвиток окисного стресу в нервовій тканині. Виявлено, що розвиток пізнавального дефіциту у щурів з діабетом супроводжується дисбалансом основних ізоформ NCAM. Доведений зв’язок між рівнем окисних ушкоджень, вмістом цитоскелетних і мембранного нервовоспецифічних білків і порушенням мнестичних процесів за умов гіперглікемії. Отримані дані про зміни вмісту нервовоспецифічних білків і процесів вищої нервової діяльності за умов впливу ушкоджуючих факторів свідчать про пластичні властивості нервової тканини.

Представлені докази нейропротекторної дії антиоксидантів – мелатоніну, вітаміну Е і б-ліпоєвої кислоти, які ефективно гальмували розвиток окисного стресу і астрогліоз в різних відділах мозку діабетичних щурів. Введення мелатоніну попереджало розвиток пізнавального дефіциту у щурів з діабетом і відновлювало баланс вмісту ізоформ NCAM. Введення вітаміну Е попереджало розвиток окисного стресу, надмірного астрогліозу і порушення поведінкових реакцій тварин за умов інтоксикації толуеном та іонами алюмінію. Таким чином, представлені результати вказують на можливість відновлення структури і функцій ушкодженої нервової тканини.

Практичне значення отриманих результатів. Результати роботи дозволяють доповнити і переглянути відомі для цитоскелету астроцитів функції пасивного механічного інтегратору внутрішньоклітинного простору. Комплексний підхід з використанням імунохімічних методів значно поширює межі прикладного застосування визначення цитоскелетних, мембранного і кальційзв’язуючого нервовоспецифічних білків як маркерів патологічного стану ЦНС. Запропоновано аналіз цих структурних нервовоспецифічних білків для скринінгу і тестування нейропротекторних препаратів. Зміни вмісту та складу поліпептидних фрагментів білка проміжних філаментів астроцитів пропонується використовувати в якості прогностичного маркеру розвитку нейропатії.

Результати досліджень включені до програм курсів лекцій та лабораторних робіт фізіології, біохімії для студентів біолого-екологічного і медичного факультетів ДНУ. Отримані дані оптимальних умов проведення імуноблотинга та імуногістохімії впроваджені в лабораторії патоморфології інституту гастроентерології м. Дніпропетровськ.

Особистий внесок здобувача. Основні ідеї роботи, робоча гіпотеза наукової проблеми висунуті автором самостійно. Дисертантом самостійно проведений аналіз літературних даних, статистична обробка результатів, головна частина експериментальних досліджень, узагальнення одержаних результатів. Обговорення методології, розробка програми та задач дослідження проведені сумісно з науковим консультантом проф., д.м.н. Нерушем П.О. Частина експерименту проведена сумісно з аспірантами Кириченко С.В. (гл. 3), Тихомировим А.О., Корякіною Ж.О. (гл. 4) і проф. Байдаш Г. (гл. 5, 6), що відображено в сумісних публікаціях. Дисертант безпосередньо приймав участь у виконанні усіх завдань роботи. У дисертації не використовувалися ідеї або розробки, які належать співавторам публікацій.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були подані та особисто представлені на наукових семінарах кафедри біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету (Дніпропетровськ, 1991-2006), а також на 20-th, 23-th–26-th Meetings of FEBS (Будапешт, Угорщина, 1990; Базель, Швеція, 1995; Барселона, Іспанія, 1996; Стамбул, Туреччина, 2002, 2006), Meeting of Scandinavian country and the UK “Cytoskeleton: its role in cellular function” (Лофтхус, Норвегія 1991), 6–8-х Українських біохімічних з’їздах (Київ, 1992, 1997, 2002), 4-th, 5-th and 7-th European Meetings of Neuropathology (Берлін, Німеччина, 1992; Париж, Франція, 1996; Хельсінкі, Фінляндія, 2002), 25-th Meeting European society of radiobiology (Стокгольм, Швеція, 1993), 6-th International Symposium “New frontiers in the biochemistry and Biophysics on diagnosis and treatment of stroke, neurotrauma and neurological disease” (Мартін, Словакия, 1993), 16-th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology (Нью Делі, Індія, 1994), 7-th International Congress ”Advances in Biochemistry and Molecular Biology” (Сідней, Австралія, 1995), International Conference on Radiation and Health (Бі Шива, Ізраіль, 1996), II-му Національному з’їзді фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001), ІІ-й конференції Українського товариства нейронаук (Донецьк, 2001), Всеукраїнській конференції “Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології” (Київ, 2002), S. Workshop “Pharmacology of Synaptic transmission in the Nervous System” (Київ, 2002), XVI–XVII-х з’їздах Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002; Чернівці 2006), 3-rd International Symposium “Neuroprotection and Neurorepair” (Магдебург, Німеччина, 2003), Міжнародній конференції „Фізіологічні аспекти адаптації” (Партеніт, 2003), 2-му Російському фармакологічному з’їзді “Фундаментальные проблемы фармакологии” (Москва, Росія, 2003), Международній конференції “Центральные и периферические вегетативные функции” (Донецьк, 2003), VI–VII-х міжнародних симпозіумах “Біологічні механізми старіння” (Харків, 2004, 2006), IBRO Advanced School Of Neuroscience (Ялта, 2004), IV-му Національному конгресі геронтологів і геріатрів України (Київ, 2005), IV-й конференції Українського товариства нейронаук (Донецьк, 2005), EPBS Workshop (Cracow, 2006).

Публікації. Результати досліджень подані у 31 статті (4 із них одноособові) та 44 тезах, які опубліковані у профільних вітчизняних та закордонних журналах і матеріалах з’їздів і конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 288 сторінках друкованого тексту і складається з вступу, основної частини, що містить огляд літератури, розділ матеріалів та методів досліджень, 4-х розділів результатів досліджень та їх обговорення, узагальнення результатів дослідження (1 розділ), висновків та списку використаних джерел. Робота ілюстрована 65-ма рисунками і 17-тю таблицями. Перелік цитованої літератури включає 543 джерела (з них – 490 зарубіжних).

Основний зміст робоТИ

Огляд літератури

Огляд літератури присвячений властивостям і функціям білків проміжних філаментів нейронів і гліальних клітин, молекули адгезії нервових клітин і кальцій-зв’язуючого білку S-100. Викладено сучасний погляд на роль структурних нервовоспецифічних білків у розвитку нейропатій, функціональних розладів ЦНС. Проаналізовані сучасні дані про участь гліальних клітин у забезпеченні функціонування нейронів і відновленні пошкоджень, а також функціональні зв’язки між нервовоспецифічними білками і вищою нервовою діяльністю.

Матеріали та методи досліджень

Біологічні об’єкти. Модельні експерименти були проведені на дорослих (8–12 місяців) щурах лінії Вістар та білих нелінійних щурах, всього 360 тварин. Утримання і використання лабораторних тварин відповідало методам, що рекомендовані національними нормами з боіетики. Об’єктом дослідження були гіпокамп, кора великих півкуль і мозочок щурів.

Експериментальні моделі. 1. Для дослідження впливу постійного освітлення тварин утримували в боксах з безперервним освітленням 250 лк/м2 протягом 7-и діб (Baydas et al., 2000).

2. Дослідження впливу гіперглікемії проводили на щурах з стрептозотоцин-індукованим діабетом. Діабетичний стан викликали одноразовою ін’єкцією стрептозотоцину (СТЗ, 50 мг/кг) (Schnedl, 1984).

3. Дослідження впливу толуену проводили на щурах, які щодня протягом 60 хв. утримувались в скляній камері з 3000 pM випару розчинника (Hass et al., 1999).

4. При дослідженні впливу хлориду алюмінію (AlCl3) щури експериментальної групи отримували з питною водою 0,2%-ий розчин AlCl3 протягом 28-ми діб (Golub at al., 1999).

5. Дослідження впливів хлориду алюмінію (AlCl3), малих доз іонізуючого опромінення та їх сумісної дії проводили в таких експериментальних групах: у групах 1–3 щури отримували сумарну дозу рентгенівського опромінення 12,9 мКл/кг протягом 7, 14 або 21 дня (відповідно 1,89 мКл/кг, 0,92 мКл/кг та 0,61 мКл/кг за сеанс); у групі 4 щури отримували з питною водою AlCl3 (0,2%-ий розчин); у групі 5 – 0,2%-ий розчин AlCl3 у якості питної води і дозу опромінення 12,9 мКл/кг протягом 21 дня. Спричинені радіацією зміни оцінювали після досягнення даної дози.

6. Дослідження протекторної дії мелатоніну при постійному освітленні, СТЗ-індукованому діабеті, інтоксикації толуеном і впливі іонів алюмінію. Щури всіх експериментальних груп одержували перитонеальні ін’єкції розчину мелатоніна 10 мг/кг протягом відповідного експерименту (Baydas at al, 2003).

7. Дослідження протекторної дії вітаміну Е (б-токоферолу) при СТЗ-індукованому діабеті і впливі іонів алюмінію. Щури всіх експериментальних груп одержували щоденні ін’єкції розчину б-токоферолу ацетат у маслиновій олії у розрахунку 10 мг/кг маси тіла.

8. Дослідження впливу б-ліпоєвої кислоти в умовах стрептозотоцин-індукованого діабету. Тваринам першої групи з СТЗ-індукованим діабетом проводили щоденні інтраперитонеальні ін’єкції б-ліпоєвої кислоти в дозі 100 мг/кг протягом 6 тижнів.

Методи. Процеси навчання і пам’яті, розвиток пізнавального дефіциту оцінювали у тестах Мориса (Morris, 1982) і умовного рефлексу пасивного уникання (Буреш, 1991). Тестування емоційно-поведінкових реакцій тварин проводили за методикою “відкритого поля” (Буреш, 1991).

Різні за фізико-хімічними властивостями фракції білків отримували шляхом послідовної екстракції з тканини мозку водорозчинних (трис – 50 мМ рН 7,4, 2 мМ етилендіамінтетраоцетат, 1 мМ 2-меркаптоетанолу, 0,1 мМ фенілметилсульфонілфторид, 5 мМ соєвого інгібітору трипсину), мембранних (тритон Х-100 – 2%) та цитоскелетних білків (сечовина – 4 М). Вміст загального білку визначали двома методами (Miller, 1964; Bradford, 1985).

Дослідження вмісту і складу нервовоспецифічних білків проводили за допомогою електрофорезу у поліакриламідному гелі (Laemmli, 1970), імуноелектрофорезу (Grabar, 1980) та імуноблотингу (Towbin, 1988) з використанням моноспецифічних антисироваток і моноклональних антитіл. Поліклональна антисироватка проти ГФКБ була отримана шляхом імунізації кролів очищеним білком і детально охарактеризована (Недзвецький, 1998). Інші антисироватки і антитіла придбані у Sigma, Santa Cruz Biotechnology (USA). Кількісно вміст специфічних білків визначали через відносну густину і площу імунопреципітатів з використанням програми “LabWork 4.0” (UVP, Велика Британія, 2001). Астрогліальну реактивну відповідь визначали імуногістохімічним методом із використанням кріостатних зрізів (Gentilini, 1975).

Рівень пероксидації ліпідів у тканині мозку експериментальних та контрольних щурів визначали за вмістом кінцевих продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) трьох видів: вільного, NADPH-залежного і Fe2+-залежного (Ohkawa et al., 1979; Чевари и соавт., 1991).

Визначення вмісту алюмінію в тканині мозку проводили методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії (Хавезов, 1983).

Результати досліджень обробляли з використанням параметричних і непараметричних статистичних критеріїв для малих виборок: t-критерію Ст’юдента, U-критерію Уілкоксона-Манна-Уітні та тест Колмогорова-Смірнова (Кокунин, 1975; Лакин, 1990). Розрахунки проводились за допомогою програм “Statistica 6.0” та “Excel 2000”. Зміни показників вважали достовірними при P<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Дослідження поведінкових реакцій, окисного стресу, вмісту і складу нервовоспецифічних білків ГФКБ і NCAM в мозку щурів за умов постійного освітлення. Порушення добового світлового циклу викликає стійкий функціональний розлад у нервовій системі. Функціональні порушення за таких умов можуть бути пов’язані зі структурними перебудовами і модуляцією активності нейронів і гліальних клітин. Найбільш ймовірними причинами нервової дисфункції вважаються розвиток окисного стресу і порушення добових коливань нейроендокринної активності. Синтез і секреція мелатоніну епіфізом є важливою складовою системи регуляції добової активності багатьох біологічних видів.

Результати поведінкових реакцій тварин в тестах “відкритого поля” показали, що порушення природного світлового циклу і коливань концентрації мелатоніну протягом 7-ми діб викликало зміни показників тесту (зростання локомоторної активності у 2,1 рази і пригнічення дослідницької активності у 1,7 разів, Р<0,001 і P<0,01, відповідно). Про розвиток емоційного стресу свідчило зростання кількості актів грумінгу та зниження болюсів. В групі щурів, що знаходились в умовах постійного освітлення і отримували ін’єкції мелатоніну, визначено лише незначні зміни поведінкових реакцій тварин відносно контрольної групи.

Зростання вмісту ГФКБ і його деградованих фрагментів визначено в мозку щурів. Характерний результат імуноблотингу приведений на рис. 1. Відмінностей між контрольною групою і групою щурів, які отримували ін’єкції мелатоніну не було виявлено. На підставі одержаних результатів можна передбачити розвиток астрогліальної відповіді на стрес, що розвивається в несприятливих умовах існування – аномальної світлової циклічності. Утримання тварин в умовах постійного освітлення індукувало інтенсивні цитоскелетні перебудови і проліферацію ГФКБ-позитивних клітин – астроцитів.

Рис. 1. Імуноблотинг філаментної фракції ГФКБ з гіпокампу щурів. 1 – контрольна група; 2 – група щурів, які утримувались за умов постійного освітлення і отримували ін’єкції мелатоніну; 3 - група щурів, які утримувались за умов постійного освітлення (n=14–18).

Таким чином, пригнічення синтезу мелатоніну за умов постійного освітлення може впливати на показники поведінкових реакцій і стан цитоскелету астроцитів.

Рівень кінцевих продуктів перекисного окиснення ліпідів, в тканині мозку щурів, які знаходились в умовах постійного освітлення, був вищий за такий у контрольній групі і групі щурів, які отримували ін’єкції мелатоніну (Р<0,01 і P<0,05, відповідно). Результати кореляційного аналізу з високим рівнем вірогідності вказують на тісний позитивний зв’язок між окисними ушкодженнями і реактивною астрогліальною відповіддю на дію несприятливого фактору (r=0,81 у гіпокампі). Отримані результати узгоджуються з припущенням, що підвищення експресії ГФКБ в умовах постійного освітлення і зниження рівня ГФКБ при введенні мелатоніну є безпосередньою відповіддю астроцитів на окисний стрес.

За умов постійного освітлення визначені також зміни вмісту ізоформи NCAM180 в усіх досліджених відділах головного мозку щурів (Рис. 2-3). Характерний результат імуноблотингу приведений на рис. 2.

Рис. 2. Імуноблотинг мембранних фракцій з гіпокампу щурів. 1 – контрольна група; 2 – група щурів, які утримувались за умов постійного освітлення; 3 – група щурів, які утримувались за умов постійного освітлення і отримували ін’єкції мелатоніну.

Рис. 3. Відносний вміст ізоформи NCAM180 у мозку щурів. 1 – контрольна група; 2 – група щурів, які утримувались в умовах постійного освітлення; 3 – група щурів, які утримувались в умовах постійного освітлення і отримували ін’єкції мелатоніну (n=14–18).

** - P < 0,01; *** - P < 0,001 – достовірність різниці відносно контрольної групи. ^^ - P < 0,01; ^^^ - P < 0,001 відносно групи 2.

Тривале постійне освітлення порушує природні добові ритми активності нервових клітин і секреції нейрогормонів. Введення мелатоніну запобігало підвищенню вмісту продуктів перекисного окиснення, розвитку надмірного астрогліозу і порушенню балансу головних ізоформ NCAM. Баланс експресії головних ізоформ NCAM важливий для забезпечення відповідного рівню міцності адгезивних контактів і може мати велике значення для синхронізації світлового циклу.

Окисні пошкодження фосфоліпідного матриксу виступають однією з причин порушення адгезії, що опосередкована NCAM. Отримані результати показали, що однією з можливих причин порушення поведінкових реакцій є порушення балансу ізоформ NCAM, адгезивних властивостей синаптичних контактів і здатності трансформувати зовнішні сигнали в адекватну клітинну відповідь.

Підвищення експресії NCAM180 при введені мелатоніну за умов пригнічення синтезу цього гормону вказує на те, що мелатонін може бути одним з ендогенних модуляторів нейрональної пластичності. Мелатонін може впливати певною мірою на стабільність нейрональної мережі через попередження втрати ізоформи NCAM180 з одного боку і пригнічення надмірного розвитку астрогліозу з іншого. Отримані дані свідчать на користь того, що мелатонін впливає на регуляцію адгезивної здатності як нейронів, так і гліальних клітин.

Механізм протективної дії мелатоніну на виживанність нейронів опосередкований його дією саме на гліальні клітини. Мелатонін підвищує антиоксидантну здатність клітин і гальмує надмірний розвиток астрогліозу. Нетоксична природа мелатоніну разом з його здатністю перетинати гематоенцефалічний бар’єр дозволяють розглядати цей нейрогормон в якості перспективного нейропротектора від ушкодження вільними радикалами.

Вплив іонів алюмінію на поведінкові реакції, окисні ушкодження, експресію нервовоспецифічних білків в мозку щурів. Відомо, що іони Al3+ характеризуються нейротоксичними ефектами для широкого кола біологічних видів внаслідок порушення окислювально-відновного балансу і стану цитоскелету нервових клітин. Тривалий вплив подібних нейротоксичних факторів може викликати розвиток стійкого стресу, нейропатії, порушення мнестичних функцій, зокрема, навчання і пам’яті. В нашій моделі алюмінієвої інтоксикації досліджували зв’язок між молекулярними змінами нервовоспецифічних білків і порушенням процесів вищої нервової діяльності.

Дослідження стану орієнтовно-дослідницької діяльності в тесті “відкритого поля” показало значні зміни показників поведінкових реакцій у щурів за умов надходження AlCl3 (рис. 4.), що свідчить про підвищену збудженість тварин за умов впливу іонів Al3+ і розвиток емоційного стресу.

Рис. 4. Характеристики поведінкових реакцій щурів у тесті “відкрите поле”. 1 – контроль; 2 – група щурів, які отримували ін’єкції вітаміну Е; 3 – група щурів, які отримували 0,2% розчин AlCl3 у питній воді; 4 – група щурів, які отримували 0,2% розчин AlCl3 у питній воді та ін’єкції вітаміну Е, (n=16–18).

Час збереження пам’яті у тесті умовного рефлексу пасивного уникнення значно відрізнявся в групі щурів, які отримували Al3+ у питній воді, у порівнянні з контролем (рис. 5). Зниження періоду очікування у тесті умовного рефлексу пасивного уникнення (Р<0,01) вказує на погіршення процесу запам’ятовування у щурів за умов інтоксикації іонами Al3+.

Рис. 5. Результати тесту умовного рефлексу пасивного уникнення. 1 – контрольна група; 2 – група щурів, які отримували ін’єкції вітаміну Е; 3 – група щурів, які отримували 0,2% розчин AlCl3 у питній воді; 4 – група щурів, які отримували 0,2% розчин AlCl3 у питній воді та ін’єкції вітаміну Е за той же час (n=14–18).

Ін’єкції вітаміну Е тваринам, які отримували іони Al3+ у питній воді, сприяли поліпшенню показників збереження пам’яті в тесті умовного рефлексу пасивного уникнення (Р<0,05) і показників поведінкових реакцій (Рис. 4-5).

Враховуючи те, що антиоксидантні властивості вітаміну Е незаперечні і його протекторні ефекти активно досліджуються останнім часом, поліпшення показників поведінкових реакцій в тесті “відкрите поле”, а також пам’яті в тесті умовного рефлексу пасивного уникнення в групі щурів, які отримували ін’єкції вітаміну Е, свідчить на користь того, що функціональні порушення можуть бути слідством окисних ушкоджень за умов інтоксикації іонами Al3+.

Для підтвердження такого висновку в мозку щурів визначали вміст ТБК-реактивних продуктів – маркерів прооксидантного стану. Визначення кінцевих продуктів перекисного окиснення ліпідів показало високодостовірне підвищення процесів пероксидації (рис. 6).

Рис. 6. Вміст ТБК-реактивних продуктів в мозку щурів. 1 – контрольна група; 2 – група щурів, яким вводили вітамін Е; 3 – щури, які отримували в питній воді 0,2% розчин AlCl3; 4 – щури, які отримували AlCl3 і вітамін Е.

*** – P<0,001 – достовірність різниці у порівнянні з контролем; ^^ – P<0,01 – у порівнянні з групою AlCl3 (n=16–18).

Введення вітаміну Е інтоксикованим AlCl3 щурам сприяло зниженню вмісту продуктів перекисного окиснення, що також підтверджує індукцію прооксидантного зсуву в нервовій тканині за умов впливу надмірних концентрацій іонів Al3+.

Визначення вмісту ГФКБ показало, що іони Al3+ індукують підвищення вмісту філаментної і розчинної форм, тобто активацію експресії білку гліальних проміжних філаментів і реорганізацію цитоскелету астроглії.

За умов фракціонованого опромінення тварин протягом 7 діб показано достовірне зниження, а в групах з терміном опромінення 14 і 21 доба, навпаки, виявлено зростання вмісту білка гліальних філаментів. Характерні зміни складу деградованих поліпептидних фрагментів ГФКБ приведені на рис. 7. Підвищення вмісту деградованих за молекулярною масою субодиниць ГФКБ вказує на те, що дія фракціонованого іонізуючого випромінювання на гліальні клітини супроводжується активацією протеолізу проміжних філаментів.

Рис. 7. Імуноблотинг філаментної фракції ГФКБ з гіпокампу щурів.

1 – контроль; 2 – опромінення 7 днів; 3 – опромінення 14 днів; 4 – опромінення 21 день; 5 – опромінення 21 день + AlCl3.

Сумісний вплив іонізуючого випромінювання та іонів Al3+ практично не відображався на вмісті філаментного ГФКБ у порівнянні з групою щурів, які були піддані лише опроміненню. З іншого боку, порівняльна характеристика складу деградованих поліпептидних фрагментів ГФКБ виявила значні відмінності. Все це разом свідчить на користь того, що іонізуюче випромінювання і солі алюмінію індукують реорганізацію проміжних філаментів через посередництво різних механізмів і сумісний ефект вищезазначених факторів не є адитивним.

В нашому досліджені вплив іонізуючого випромінювання викликав більш значне зростання вмісту деградованих поліпептидних фрагментів у порівнянні з впливом іонів Al3+. Найбільший вміст таких поліпептидних фрагментів ГФКБ виявлений в мозку щурів, яких опромінювали протягом 14 діб. Цей факт можна пояснити тим, що час поновлення гліальних проміжних філаментів відносно тривалий і складає за звичайних умов декілька тижнів. Вплив ушкоджуючих факторів веде до скорочення цього часу і супроводжується активними цитоскелетними перебудовами. Виявлені зміни ГФКБ свідчать про такі цитоскелетні перебудови в астроцитах у відповідь на іонізуюче випромінювання, інтоксикацію іонами алюмінію та їх сумісну дію.

Так само як для білку гліальних філаментів, зростання вмісту білків нейрофіламентів визначено в групі тварин, які отримували 0,2% розчин AlCl3 протягом трьох тижнів. Зміни стехіометрії субодиниць 210 кДа, 160 кДа і 70 кДа виявлено у всіх досліджених відділах мозку при впливі іонізуючого випромінювання і при комбінованому впливі іонів Al3+ і радіації. Найбільша втрата вмісту визначена для субодиниці 210 кДа в мозку щурів, яких опромінювали 7 діб (рис. 8). Отримані результати підтверджують той факт, що порушення в нервовій тканині в наслідок дії несприятливого фактору залежать не лише від його інтенсивності, але й тривалості впливу.

Сумісний вплив іонів Al3+ і випромінювання викликав більш значне підвищення вмісту білків нейрофіламентів у порівнянні з їх окремою дією. Таким чином, сумісний вплив двох різних за природою несприятливих факторів може бути обумовлений відмінними механізмами, які загалом спрямовані на інтенсифікацію фібрилогенезу в нервових клітинах.

Рис. 8. Імуноблотинг фракцій триплету білків нейрофіламентів з гіпокампу контрольних та експериментальних щурів: К – контроль; 1 – опромінення 7 днів; 2 – опромінення 14 днів; 3 – опромінення 21 день; 4 – опромінення 21 день + AlCl3.

Враховуючи той факт, що проміжні філаменти є високостабільним компонентом цитоскелету можна передбачити, що іони алюмінію мають надзвичайно суттєві ефекти на стан цитоскелету як нейронів, так і гліальних клітин. Реорганізація проміжних філаментів може бути тільки одним з багатьох кроків у розвитку патогенезу, що викликається іонами Al3+. Виявлені цитоскелетні зміни свідчать про те, що проміжні філаменти залучаються до механізмів пластичності після порушень, які індукуються іонами Al3+ і можуть бути морфологічною основою перебудови нейрональної мережі контактів. Порушення стаціонарного перебігу фібрилогенезу викликає цитоскелетну дегенерацію і разом із змінами адгезивної властивості – функціональні порушення у нервовій тканині.

Про реактивну астрогліальну відповідь свідчать також результати імуногістохімічного забарвлення зрізів мозку інтоксикованих щурів (рис. 9).

Контроль AlCl3

Рис. 9. Імуногістохімічне виявлення ГФКБ на зрізах гіпокампу щурів ( Ч 200, стрілками позначені ділянки астрогліозу).

Введення вітаміну Е сприяло зниженню вмісту деградованих поліпептидних фрагментів ГФКБ і запобігало розвитку надмірно інтенсивного реактивного астрогліозу (рис. 10). Слід зазначити, що введення вітаміну Е щурам інтактної групи практично не впливало на вміст ГФКБ. Це свідчить про можливості використання б-токоферолу в якості превентивного нетоксичного засобу за умов впливу несприятливих факторів.

Той факт, що вітамін Е обертав ефекти Al3+ як на біохімічному, так і на фізіологічному рівнях, свідчить про вплив алюмінію на синаптичну пластичність і залучення гліальних проміжних філаментів до процесів нейрональної інтеграції.

Рис. 10. Відносний вміст філаментної фракції ГФКБ в мозку щурів. 1 – контрольна група; 2 – група щурів, які отримували ін’єкції вітаміну Е; 3 – група щурів, які отримували 0.2% розчин AlCl3; 4 – група щурів, які отримували 0.2% розчин AlCl3 та ін’єкції вітаміну Е, (n=14–18).

** - P < 0,01 – достовірність різниці відносно контрольної групи. ^ - P < 0,05; ^^ - P < 0,01 – відносно групи 3.

На користь останнього припущення свідчать результати кореляційного аналізу, проведеного з метою встановлення вірогідності зв’язку між змінами маркеру астроцитозу та порушеннями поведінкової активності інтоксикованих тварин (табл.1).

Таблиця 1.

Кореляційні зв’язки між вмістом філаментної форми ГФКБ у мозку щурів та змінами локомоторної активності щурів у тесті “відкрите поле” (n = 18)

Відділ мозку | Коефіцієнт кореляції ± стандартна похибка, r ± mr | Р

кора великих півкуль | 0,72 ± 0,143 | < 0,01

мозочок | 0,83 ± 0,112 | < 0,001

гіпокамп | 0,64 ± 0,154 | < 0,01

Представлені на рис. 11 результати демонструють, що на додаток до безпосереднього захисного ефекту на нейрони, вітамін Е має також корисну дію відносно ГФКБ-позитивних гліальних клітин через зниження хімічного і/або метаболічного інсульта в мозку.

Рис. 11. Імуноблотинг фракцій ГФКБ з гіпокампу щурів. 1 – контроль; 2 – група щурів, які отримували ін’єкції вітаміну Е; 3 – група щурів, які отримували 0,2% розчин AlCl3; 4 – група щурів, які отримували 0,2% розчин AlCl3 та ін’єкції вітаміну Е.

Отримані результати підтримують точку зору про те, що вітамін Е виявляє нейропротективні властивості через підвищення активності захисної системи гліальних клітин, які оточують нейрони і сприяють їх виживанню.

Нейротоксичні ефекти алюмінію в значній мірі також запобігались курсовими ін’єкціями мелатоніну. Збіжні до впливу вітаміну Е зміни вмісту і складу поліпептидних фрагментів ГФКБ були виявлені в усіх досліджених відділах мозку щурів. Щоденне введення мелатоніну інтоксикованим щурам викликало достовірне зниження загальної кількості ГФКБ (рис. 12) і вмісту його деградованих поліпептидів.

Рис. 12. Відносний вміст філаментної фракції ГФКБ в мозку щурів. 1 – контроль; 2 – група щурів, які отримували ін’єкції мелатоніну; 3 – група щурів, які отримували 0,2% розчин AlCl3; 4 – група щурів, які отримували 0,2% розчин AlCl3 та ін’єкції мелатоніну, (n=14–18).

** - P < 0,01 – достовірність різниці відносно контрольної групи. ^ - P < 0,05 – відносно групи 3.

Підвищення рівню Fe-аскорбат-індукованого і NADPH-залежного перекисного окиснення ліпідів (у 2,1 рази в середньому) свідчить про наявність окисних ушкоджень молекул біомембран. Введення мелатоніну ефективно попереджало розвиток окисного стресу (зниження вмісту ТБК-реактивних продуктів майже у 2 рази) і надмірного астрогліозу в мозку щурів при інтоксикації іонами Al3+.

Функціональні властивості адгезивної молекули NCAM, як і переважаючої кількості мембранних білків, багато в чому залежать від взаємодії з мембранним фосфоліпідним оточенням. В мозку щурів визначено достовірне зниження відносного вмісту ізоформи NCAM180 за умов інтоксикації іонами Al3+ (рис. 13) Найбільш значне, високодостовірне зниження (P<0,01) спостерігали у фракціях з гіпокампу і кори великих півкуль (у 2,3 та 2,2 рази відповідно).

Рис. 13. Відносний вміст ізоформи NCAM180 у мозку щурів. 1 – контроль; 2 – група щурів, які отримували з питною водою 0,2% розчин AlCl3; 3 – група щурів, які отримували 0,2% розчин AlCl3 та ін’єкції мелатоніну, (n=14–18).

** - P < 0,01 – достовірність різниці відносно контрольної групи. ^^ - P < 0,01 - відносно групи 2.

Щоденні ін’єкції мелатоніну щурам, які отримували з питною водою 0,2% розчин AlCl3, сприяли відновленню вмісту NCAM180 майже до рівню контрольної групи.

Враховуючи той факт, що найвища щільність розподілу NCAM спостерігається в зонах синаптичних контактів,