Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна

О л і й н и к

І р и н а Я р о с л а в і в н а

УДК 577.3

Енергетичні характеристики хемілюмінесценції сироватки крові

03.00.02—біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків-2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному університеті “Львівська політехніка.”

Науковий керівник доктор технічних наук,

професор Готра Зенон Юрійович,

Національний університет “Львівська політехніка”,

завідувач кафедри “Електронні прилади.”

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник,

Горбенко Галина Петрівна, Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна, професор кафедри біологічної та медичної фізики;

кандидат фізико-математичних наук, старший науковий співробітник,

Нардід Олег Анатолійович, Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАН України, завідувач. відділу кріобіофізики (м. Харків)

Провідна установа:

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біофізики, м. Київ

Захист відбудеться 13 січня 2007 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті ім. В. Н. Каразіна, 61077, м. Харків, пл.. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна. 61077, м. Харків, пл.. Свободи, 4.

Автореферат розісланий 12 грудня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Гаташ С. В.

Актуальність теми Незважаючи на багаточисельні дослідження хемілюмінесценції (ХЛ) біооб’єктів, на сучасному етапі існує невизначеність у багатьох питаннях пов’язаних з явищем ХЛ. Зокрема відсутні експериментальні дані впливу середовища ініціювання на ХЛ сироватки крові (СК) та модельні системи, а також залежність температурних кривих ХЛ від середовища. Останні використовуються в дослідженні енергії активації. Висновки, які робляться з експериментів носять переважно хіміко –біологічний характер.

Вважається, що благородні або інертні гази, до яких належить аргон, фактично не впливають на фізичні та хімічні процеси. Але останнім часом неодноразово з’являються дані по впливу аргону на сонолюмінесценцію–свічення води в ультразвуковому полі за рахунок кавітаційних процесів, а також стимулювання аргоном люмінол залежної ХЛ у водному розчині хлористого натрію та перекису водню відповідно. Це показує, що не існує фізично обґрунтованих моделей ХЛ біооб’єктів, не пояснено існування інверсії збудженого стану, а відповідно і ХЛ. Пояснення впливу інертних газів і аргону зокрема, на процеси ХЛ є необхідним, оскільки його дія схожа на дію широко розповсюдженого ферменту міелопероксидази, який каталізує реакцію окиснення хлориду перекисом водню, а відомо, що ця реакція відіграє важливу роль в імунному захисті організму.

Незважаючи на те, що спектральний аналіз є одним з найінформативніших аналізів сучасної науки, у літературі не вказано, що проводилися аналізи спектрів ХЛ СК стимульованої лазерним випромінюванням при патологічних станах (в даній роботі досліджувалися спектри при онкозахворюваннях та туберкульозі в порівнянні з нормою). Дослідження спектральних ХЛ СК характеристик таких як розподіл фотонів по частотам не проводилося, не порівнювалися квантові виходи стимульованої та спонтанної ХЛ біооб’єктів. На нашу думку, аналіз цих характеристик дозволить глибше осмислити явище ХЛ та призведе до суттєво інших підходів у вивченні ХЛ.

Аналіз кінетичних характеристик, кривих ініційованої ХЛ СК не проводився з боку дослідження швидкісних характеристик спаду свічення. Хоча є чимало кінетичних моделей, які достатньо точно висвітлюють поведінку системи окислення, та застосування їх при патологічних станах є дуже важким, оскільки важко спрогнозувати зміну усіх початкових параметрів системи. Не проводилося порівняння вище згадуваних швидкісних характеристик при таких патологічних станах як туберкульоз, саркоїдоз та онкозахворювання в порівнянні з нормою на стадії першого (короткого) спалаху свічення.

Оскільки хемілюмінометрію вже досить тривалий час використовують у медичній діагностиці, стає все більш очевидною необхідність дослідження вищевказаних параметрів для пошуку нових діагностичних можливостей та всебічного фізико-хімічного обґрунтування процесів ХЛ, які протікають в біооб’єктах

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами , темами.

Дисертація виконувалася згідно з плановою науковою програмою досліджень Львівського науково-дослідного інституту епідеміології і гігієни, відділу туберкульозу Ф1 98 „Вивчити особливості перебігу ускладнених форм туберкульозу органів дихання та розробити сучасні методи діагностики і лікування” 1998-2001рр.

Мета і задачі дослідження: метою роботи було вивчити і експериментально дослідити явище ХЛ СК, вплив на неї середовища та температури. Побудувати модель, що дасть змогу передбачити поведінку такої системи як ХЛ СК. Провести спектральний аналіз ХЛ СК та аналіз ініційованої ХЛ. Дослідити кінетичні криві ініційованої ХЛ. Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі:

1. Дослідити вплив середовища на процеси ХЛ СК. Дослідити вплив та при різних концентраціях. Вивчити поведінку системи при критичних концентраціях. Визначити оптимальні концентрації для проведення експериментів ініційованої ХЛ.

2. Вивчити вплив температури на процеси ХЛ СК. Дослідити вплив температури на СК при різних патологіях, а також вплив температури на ХЛ СК при додаванні в СК та різних концентрацій.

3. На основі температурних та концентраційних залежностей обчислити енергію активації хемілюмінесцентних процесів в СК, та на основі рівняння Штерна –Фольмера обрахувати час життя збудженого стану.

4. Дослідити спектральні характеристики ХЛ СК та провести фізико–математичний аналіз квантового виходу ХЛ та спектрального випромінювання.

5. На основі проведених експериментів проаналізованих з літературних джерел побудувати квантово–електронну модель випромінювання ХЛ в процесах окиснення. Провести узагальнення побудованої теорії на ХЛ біологічних об’єктів.

6. Дослідити кінетику явища ініційованої ХЛ СК при різних патологіях та розробити клініко –діагностичний тест паталогічних станів організму.

Об’єкт дослідження –сироватка крові здорових людей та людей з такими патологіями як онкологічні (різних форм раку та стадійності), легеневих форм туберкульозу та саркоїдоз. Незначна кількість експериментів проводилася на яєчному жовтку.

Предмет дослідження –неініційована та ініційована ХЛ СК, як інтенсивність випромінювання та хемілюмінесцентні характеристики СК такі як спектр, максимальний спалах свічення, інтегральна світлосумма, енергія активації збудженого стану, час життя збуджених молекул, кінетика спадання ІХЛ.

Методи дослідження: швидкісні оптикоспектральні методи, засновані на реєстрації спектрів випромінювання, загальної кількості квантів випромінювання усіх частот, зміни кількості квантів випромінювання протягом певного відліку часу; обробка, аналіз та узагальнення експериментального матеріалу; статистичні методи обробки експериментальних результатів, комп’ютерний експеримент; квантово-електронне моделювання процесів, що протікають в біологічних об’єктах, дифузійні методи.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Вперше в експерименті та теорії проведено комплексне дослідження процесів ХЛ СК. Досліджено вплив середовища (каталізаторів та ініціаторів) на процеси ХЛ, що протікають в СК. Показано різнохарактерний вплив на інтенсивність ХЛ та . Робота вперше вивчає енергію активації СК в нормі та патологічних станах. Виявлено вплив середовища на енергію активації. Досліджено показники спрямлення кінетичних кривих ІХЛ, вивчено спектр ХЛ ініційованої лазерним випромінюванням довжиною хвилі 337,1 нм. Вперше експериментально досліджується комплексний вплив температури та середовища на процеси ХЛ СК.

2. На основі отриманих залежностей досліджувалася енергія активації ХЛ. Встановлено злам арреніусівських прямих при температурі 25-26. Виявлено, що на першому проміжку температур (20-25) концентрація не впливає на енергію активації, а на другому (25-42) лінійно зменшує енергію активації. Визначено час життя збудженого стану.

3. В роботі вперше запропонований квантово-електронний підхід до пояснення ХЛ біооб’єктів, який ґрунтується не лише на хімічних характеристиках, а безпосередньо на аналізі квантово –електронних переходів та пошуку умов необхідних для існування свічення. Зокрема, даний підхід дозволив узагальнити, спрогнозувати та пояснити вплив на ХЛ багатьох факторів середовища. Показано, що на інтенсивність ХЛ впливають квантово-електронні характеристики розчинника. Досліджено спектр ХЛ СК і проаналізовано квантові виходи стимульованого та стаціонарного випромінювання.

4. Всебічно досліджено кінетику ініційованої ХЛ. Крім вивчення таких параметрів, як максимальна інтенсивність спалаху та інтегральна світлосума свічення, вираховувалися та досліджувалися коефіцієнти спрямлення кінетичних кривих. Удосконалено методи діагностики таких захворювань як туберкульоз, саркоїдоз та онкологічні захворювання.

Практичне значення одержаних результатів. Дисертаційна робота дає практичні рекомендації у використанні метода ініційованої ХЛ при діагностиці захворювань на рак, туберкульоз та саркоїдоз. Запропоновані оптимальні умови проведення експерименту. Матеріали цього дослідження охоплюють різнопланове вивчення інтенсивності ХЛ, а саме: дослідження впливу середовища та температури на ХЛ, всебічно аналізується енергія активації ХЛ, дослідження значення часу життя збуджених молекул дає можливість говорити про електронний перехід з якого відбувається випромінювання. Проводилися також дослідження спектрів ХЛ СК. Для більш ґрунтовного осмислення процесів ХЛ розроблена та запропонована квантово - електронна модель, що пояснює отримані результати, а також обґрунтовує результати отримані іншими дослідниками. Модель зокрема дає можливість прогнозувати та передбачати результати інтенсивності ХЛ.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача в одержанні наукових результатів, викладених у дисертації, полягає в особистому обґрунтуванні механізмів впливу зовнішніх чинників (температури, середовища каталізаторів, окисників, та окиснювальної речовини) на зміну інтенсивності хемілюмінесценції індукованої в сироватці [7-9] і побудови багатофункціональної моделі на їхній основі [5,6,10,12,13]. Здобувачем особисто встановлено взаємозв’язок між фізичними параметрами такими як кількістю центрів активації та енергією активації хемілюмінесценції [4,8,9] досліджено та проаналізовано спектри хемілюмінесценції [4,6,11] розроблено диференційно діагностичний тест онкопатологій та туберкульозу [1-3]. Усі висновки і положення, що складають суть дисертації, сформульовані автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, представлених у дисертації, доповідались та обговорювались на наступних конференціях: ІІІ З’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002),“Physics of disordered systems” of II international conference (Lviv, 2003), International scientific and practical conference “Spectroscopy in special applications” (Kyiv, 2003), І Українській науковій конференції “Проблеми біологічної та медичної біофізики” (Харків 2004)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць, в тому числі 9 статей у фахових наукових журналах і 5 тез доповідей на міжнародних і національних наукових з’їздах та конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 166 сторінках і складається із вступу, 6 розділів, висновків, списку використаних літературних джерел, який містить 150 бібліографічних описів –20с. та додатку-8с. Дисертація містить 24 рисунки та 16 таблиць. Об’єм основної частини складає 138 сторінок.

Основний зміст роботи

У вступі обґрунтовується актуальність, наукова та практична значущість роботи, формулюється мета та задачі дисертації що виносяться на захист.

У першому розділі наведено огляд літератури, який стосується ролі перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) та вільних радикалів (ВР) у процесах метаболізму та ХЛ біооб’єктів. Аналізуються підходи при вирішенні задач про випромінювання світла біооб’єктами та впливу на випромінювання різних факторів середовища. Аналізується стан питання про уявлення ХЛ з точки зору квантово-електронних процесів, розглядається питання вивчення енергії активації та впливу на неї каталізаторів свічення. Встановлено, що на теперішній час відсутня інформація про вплив на ХЛ біооб’єктів інертних газів. На основі проведеного літературного огляду сформульовані мета і задачі роботи.

У другому розділі дисертації наведені методики приготування робочого матеріалу, реактивів та методи проведення експериментів. Пояснено використання на певних етапах дослідження яєчного жовтка. Розділ містить 6 базових методик, зокрема представлені методики які використовують як окремо так і одночасно активатори та ініціатори ХЛ СК. Описані функціональні схеми та характеристики установок для проведення експериментів по ХЛ СК та вивчення спектрів.

У третьому розділі представлені результати експериментів по дослідженню ХЛ та впливу на її інтенсивність середовища та температури.

Після проведення експериментів були отримані наступні залежності впливу ініціаторів та активаторів на ХЛ.

При додаванні як перекису водню так і значно збільшується рівень ХЛ. Якщо при додаванні навіть незначних концентрацій відбувається різке збільшення рівня ХЛ, то при додаванні є набагато повільніше зростання. Це вказує на різний вплив цих хімічних компонентів. Оскільки не є безпосереднім учасником окиснення, а лише призводить до розгалуження реакції можна припустити, що збільшує кількість центрів реакції і тому навіть найменше додавання буде збільшувати інтенсивність ХЛ.

а) | б) | Рис. 1. Залежність інтенсивності ХЛ від концентрації

а) сульфату заліза

б) перекису водню

Додавання концентрацій 3% і нижче умовно - лінійно збільшує інтенсивність ХЛ. При більших концентраціях ця лінійність порушується. Що вказує на присутність гасіння інтенсивності ХЛ при високих концентраціях .

Збуджені молекули мають дезактивуватися на молекулах . Лінійності інтенсивності ХЛ при додаванні не спостерігається на жодному проміжку. При великих концентраціях так само спостерігається дезактивація. Оптимальними концентраціями для проведення експериментів є 0,02мМ розчин та 5% розчин .

Залежність інтенсивності ХЛ від концентрації окиснювальної речовини (досліди проводилися на яєчному жовтку) показало, що існує насичення свічення, тобто критична концентрація речовини після якої інтенсивність ХЛ вже не змінюється.

а) | б) | Рис. 2.Температурні залежності:

а) залежність інтенсивності ХЛ від температури;

б) залежність інтенсивності ХЛ від концентрації при різних температурних умовах:1-20, 2-22, 3-24, 4-26, 5-36 , 6-42.

Вплив температури на інтенсивність ХЛ носить логарифмічний характер. (див. рис. 2). Інтенсивність випромінювання за весь проміжок температур при усіх дослідженнях змінюється на 0,2-0,6 mV. Вплив температури на інтенсивність ХЛ СК при туберкульозі є більш виразнішим ніж при онкологічній патології та нормі..

Ми можемо констатувати (див. рис. 2 б) , що по відношенню до однієї й тої самої реакції при заданій температурі може виступати, як активатор так і як дезактиватор.

В четвертому розділі дисертації ми досліджували енергію активації СК при різних патологіях, та вплив на неї та різної концентрації. На даний момент в літературі існує обмежена кількість досліджень енергії активації окиснення біологічних об’єктів і повністю відсутнє дослідження енергії активації ХЛ СК. Виявилося, що енергія активації зразка СК як при патологіях так і при додаванні мала два значення, оскільки відмічався злам температурної кривої. Злам відмічався при температурі 25 °С. Енергія активації СК температурного проміжку 25-42°С зокрема залежить від патології і змінюється в залежності від важкості захворювання. На температурному проміжку до 25 °С залежність енергії активації від патології не спостерігалося, значення були не корельовані. Енергія активації на температурному проміжку до 25 °С є значно більшою за енергію активації на проміжку 25-42°С, це означає не лише можливе сповільнення окисних реакцій, а й конкурування безвипромінювальних процесів над процесами ХЛ на температурному проміжку до 25 °С (див. рис. 3). Крім цього не можна виключати активацію вторинних процесів на цьому проміжку температур. На енергію активації кожного проміжку впливає додавання .

а) |

б) | Рис. 3. Арреніусівські прямі при додаванні різної концентрації для різних температурних проміжків а) 20-25°, б) 25-42°С.

являючись активатором по відношенню до певних реакцій (окиснення при малих концентраціях), при достатньо великих концентраціях виступають по відношенню до тих самих реакціях дезактиватором (гасієм). Цей ефект можна спостерігати з Рис. 3, на якому зображені експериментально отримані Арреніусівські прямі ( як функції ) для різноманітних зразків (Арреніусівські прямі зразків, що відрізняються концентрацією доданої домішки міняються місцями).

Тобто можна очікувати, що з двох зразків, які відрізняються від складом концентрації домішки, зразок більш активний при даній температурі може виявитися менш активним при іншій.

Встановлено, що отримана енергія активації носить узагальнений характер, оскільки не може впливати на швидкість окиснюючих процесів, так як не приймає прямої участі в окисненні. Метали змінної валентності () при усіх температурах зменшують узагальнену (експериментально визначену енергію активації) не зважаючи на відсутність їхнього впливу на швидкість окиснення. Узагальнена енергія активації зменшувалася в кілька сотень разів. Для проміжку 20-25°С при зміні концентрації корельованого впливу на енергію активації не спостерігалося.

Зміна узагальненої енергії активації пояснюється зміною кількості центрів реакції окиснення, які залежать від енергії активації за експоненційним законом . Кількість центрів залежить від енергії активації оскільки в біосистемах окиснюються достатньо великі поверхні (мембрани клітин, макромолекули) і для збереження цілісності цієї системи необхідно, щоб кожний наступний центр вступав в реакцію з більшою енергією активації.

Дослідження часу життя збуджених молекул показало, що ~10-6c, а це означає, що кетони знаходяться у триплетному стані. Основний вклад у процес ХЛ СК вносить реакція рекомбінації кетонів, у CК відбувається квадратичний обрив ланцюга.

У п’ятому розділі проведено вивчення спектрів ХЛ СК при нормі та при паталогічних станах та здійснено побудову квантово-електронної моделі.

Рис. 3. Спектри ХЛ при патологіях. | Характер спектру при нормі та патологіях має однаковий характер. Експериментально отримані спектральні ХЛ СК криві мають куполоподібний вигляд. Спектр має один пік в області 500 нм, напівширина смуги становила 150 нм. Паталогічний стан не вніс змін у область піку, а він не вплинув і на напівширину смуги, проте відчутні зміни проявилися у зміні інтенсивності випромінювання в області піку: при туберкульозі вона в 1.5-2р. більша від свічення СК норми, при онкозахворюваннях в 1.4-1.8р. менша.

Для дисперсійного середовища, яким являється СК, коли довжина вільного пробігу фотону значно менша розмірів області, та значно вища за довжину випромінювання: , з математичних міркувань отримано, що в режимі генерації квантовий вихід стимульованої ХЛ значно вищий ніж квантовий вихід спонтанної.

З послідовних фізико-математичних перетворень випливає, що при генерації випромінювання маємо наближено лоренцівський розподіл з півшириною набагато меншою ніж при спонтанному випромінюванні . Тобто відбувається звуження спектра при ініціюванні.

На основі відомих експериментальних досліджень, наступним кроком, будувалася квантово-електронна модель

Основним її моментом було те, що особливістю ВРО є заселення збудженого і основного станів молекули в ході протікання реакцій. Радикали, що приймають участь у ВРО, приймають участь і в переході коливальної енергії в поступальну ( релаксація). При процесах дезактивації збудженого стану заселяється група коливних рівнів , яка знаходиться вище рівнів , на яких закінчуються фотопереходи . Кетони являються кінцевими продуктами процесу реакції і накопичуються в робочому об’ємі. На даний факт вказує те що після тривалого окиснення ХЛ майже не спостерігається. Отже для часу, що є більшим за час розпаду збудженого стану кетонів, кількість продукту в основному стані є значно більшою ніж в збудженому.

Розглянемо схематично перетворення люмінісціюючого продукту, під час збудження та спустошення рівнів (див. рис. 4).

Рис. 4. Сема хімічної реакції двох електронних станів молекул з накопиченням продуктів: кривим стрілками вказані напрямки хімічних перетворень, прямими—радіаційні і безвипромінювальні переходи. |

Нехай наслідком хімічної реакції є заселення основного і збудженого електронних станів.

Умовою заселеності основного стану є

(1)

де і кетони в збудженому і основному станах відповідно, а - кратність виродження відповідного електронного стану. |

При процесах дезактивації збудженого стану заселяється група коливних рівнів , яка знаходиться вище рівнів , на яких закінчуються фотопереходи .

Концентрація на довільному коливному рівні визначається (використовуючи квазістаціонарний розподіл по коливним рівням): (4)

де – енергія стану, що задається сукупністю квантових чисел

Розглянувши усі випадки виконання нерівності та ввівши ймовірність збудження рівня з якого відбувається випромінювання: та узагальнені константи швидкостей: , , і враховуючи що , а (енергія стану значно більша теплової енергії руху молекул рідини) провівши певні перетворення отримаємо наступні умови випромінювання:

(5)

(6)

(7)

(8)

Умова (6) відображає явну залежність між швидкістю коливної релаксації і швидкістю гасіння електронного збудження молекули емітера на компонентах середовища. Швидкість - релаксації має бути значно більша за швидкість гасіння (конверсії в основний стан). За рахунок того, що швидкість накачки однозначно визначається концентрацією, всі отримані нерівності являють собою вимогу на концентрації реагентів, продуктів і склад суміші, що впливають на швидкість гасіння.

Отримані співвідношення залежать від структури спектру молекули емітера ХЛ, кінетичних параметрів і властивостей розчину. Відповідно, для ефективного спустошення рівнів ,, в розчині необхідна присутність компоненту, який слабо гасить молекулу емітер, але приймає ефективну участь в процесах - релаксації. Таким компонентом можуть бути легкі інертні гази Що підтверджено експериментально.

З нерівностей (7) випливає обмеження нижньої границі концентрації молекул дезактиваторів (молекул субстрату). Існування нижньої границі концентрації молекул, а отже розведеності субстрату, також зумовлене швидкістю - релаксації: необхідна швидша дезактивація нижніх рівнів () в порівнянні з швидкістю радіаційного розпаду стану .

Адаптація теорії до ХЛ ліпідів плазматичних мембран призводить до наступної залежності (9). З (9) видно, що співвідношення концентрацій реагентів в середовищі сильно впливає на інтенсивність свічення. Також вклад в процес вносить і саме середовище. Чим сильніше розбавлений розчин, тим більше гасіння на молекулах середовища і тим відповідно нижчий рівень ХЛ.

(9)

де – ймовірність утворення збудженої молекули при зіткненні з ліпідним комплексом,–

поперечний перетин ліпідних комплексів одного й того самого розміру, –

концентрація ліпідних комплексів одного й того самого розміру

де – середня швидкість реакцій окиснення.

Інтенсивність збільшується як при збільшенні концентрації окисника , так і сумарного поперечного січення ліпідних комплексів.

Необхідно звернути увагу, що при певних співвідношеннях концентрацій залежність інтенсивності від концентрації окисника або сумарного поперечного січення ліпідних комплексів являє собою прямо пропорційну залежність. Але зауважимо що не може бути скільки завгодно великим, так як визначає обернену довжину пробігу атомів по відношенню до захоплення на фрагментах.

Шостий розділ присвячено дослідженню кінетики ініційованої ХЛ (ІХЛ). В даній роботі ми намагалися зробити аналіз кінетичних кривих при таких захворюваннях як онкологічні, туберкульоз та саркоїдоз у дорослих людей не лише з точки зору величин, що знімаються безпосередньо в експерименті (інтенсивності, площі під графіком інтенсивності, рівню максимального спалаху), а й фізично оцінюючи кінетику процесу. Даний розділ містить експериментальні кінетичні криві ІХЛ СК при нормі та паталогічних станах, а також результати аналізу цих кривих проведених за методами дослідження констант швидкостей квадратичного обриву ланцюга

Аналіз процесу ІХЛ призводить до того, що кінетичні криві мають випрямлятися в координатах , де - час з моменту введення перекису водню; - величина інтенсивності свічення в момент часу ; - інтенсивність свічення в момент часу, коли інтенсивність стає стаціонарною (в момент часу ).

Результати показують, що кінетика ініційованої ХЛ дійсно має експоненціальний вигляд (див. рис.5.). Патологія вносила зміни у кут нахилу(див. табл. 1).

Табл.1

Залежність тангенсу кута нахилу прологарифмованих

кінетичних кривих від патології.

патологіяконтрольрак І ст.рак ІІ ст.рак ІІІ-IV ст.туберкульозсаркоїдоз0,094320,17040,158720,136130,090910,08275

а) б)

Рис. 5. Залежність від часу для СК в порівнянні з нормою:

а) 1-контрольна група, 2-І ст. онкозахворювань, 3-ІІ ст. онкозахворювань, 4-ІІІ- IV ст. онкозахворювань;

б) 1-контрольна група, 2-саркоїдоз, 3- туберкульоз.

Результати свідчать про різноплановість протікання захворювань. Тангенс кута нахилу становить , тобто не зважаючи на те, що інтенсивність ІХЛ на всіх стадіях онкозахворювнь є меншою за інтенсивність ІХЛ при туберкульозі та саркоїдозі цей добуток (швидкості ініціювання на константу швидкості рекомбінації перекисних радикалів) є більшим за норму, а при таких запальних захворюваннях як туберкульоз та саркоїдоз несуттєво меншими за норму.

Відмінності були пояснені за рахунок можливих відмінностей у кількості центрів хімічних реакцій, різних квантових виходах та різними концентраціями металів змінної валентності у СК.

Практичні рекомендації цього розділу дають можливість використовування методу ІХЛ в клінічній біохімічній лабораторії для виявлення патологічного стану та в процесі контролю за інтенсивністю ХЛ.

Висновки

Квантово-електронна модель, що побудована у роботі встановлює явну залежність між швидкістю коливної релаксації і швидкістю гасіння електронного збудження молекули емітера на компонентах середовища. Швидкість - релаксації має бути значно більша за швидкість гасіння (конверсії в основний стан). За рахунок того, що швидкість накачки однозначно визначається концентрацією, всі отримані нерівності являють собою вимогу на концентрації реагентів, продуктів і склад суміші, що впливають на швидкість гасіння. Отримані квантово-електронні співвідношення залежать від структури спектру молекули емітера ХЛ, кінетичних параметрів і властивостей розчину. Відповідно, для ефективного спустошення рівнів ,, в розчині необхідна присутність компоненту, який слабо гасить молекулу емітер, але приймає ефективну участь в процесах - релаксації. Залежності отримані при моделюванні повністю підтверджуються експериментами. Зокрема, інертні гази дійсно підсилюють процеси ХЛ, інтенсивність свічення залежить від концентрації останніх.

З моделі випливає обмеження нижньої границі концентрації молекул дезактиваторів (молекул субстрату). Існування нижньої границі концентрації молекул, а отже розведеності субстрату, також зумовлене швидкістю - релаксації: необхідна швидша дезактивація нижніх рівнів () в порівнянні з швидкістю радіаційного розпаду стану . Проведені досліди також підтверджують цей факт, в дуже концентрованих розчинах відбувається суттєве зменшення інтенсивності ХЛ.

Енергія активації визначена з температурних характеристик зразків СК мала два значення, оскільки відмічався злам арреніусівської кривої. Злам відмічався при температурі 25 °С. Енергія активації на температурному проміжку до 25 °С є значно більшою за енергію активації на проміжку 25-42°С, це означає не лише сповільнювання окисних реакцій, а й конкурування безвипромінювальних процесів над процесами ХЛ на температурному проміжку до 25 °С. Енергія активації СК температурного проміжку 25-42°С залежить від патології і змінюється в залежності від важкості захворювання. На температурному проміжку до 25 °С залежність енергії активації від патології не спостерігалося. Метали змінної валентності () зменшують узагальнену (експериментально визначену енергію активації) не зважаючи на відсутність впливу на швидкість окиснення. Введено поняття узагальненої енергії активації. Зменшення узагальненої енергії активації від концентрації є лінійним до 0,6 мМ на температурному проміжку 25-42°С, потім вона зростає. Зміна узагальненої енергії активації пояснюється зміною кількості центрів реакції рекомбінації перекисних радикалів.

Встановлено випрямлення кривих ІХЛ в координатах . Аналіз проведений для різних патологій дає змогу стверджувати, що цей показник знаходиться в залежності від захворювання. На основі відомих біофізичних даних активності СК зроблено висновок про пригнічування реакційних процесів при деструктивних змінах. Що викликано попаданням в кров, із тканин, продуктів некрозу які саме і пригнічують реактивність в процесі контролю за інтенсивністю ХЛ.

Метод ІХЛ можна використовуватися в клінічній біохімічній лабораторії для виявлення патологічного стану (онкозахворювань туберкульозу та саркоїдозу).

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Іванків О. Л., Андрусик І. Я., Дзюпин О. Л. Про вивчення плазми крові методом хемілюмінесценції // Фізичний збірник НТШ. –2001. –Т. 4.-С.394–399.

2. Андрусык И. Я. Хемилюменометрия в дифференциальной диагностике органов дыхания.// Проблемы эклолгии и охраны природы техногенного региона: Межведомственный сборник научных работ.- Донецк:Дон НУ. 2002.- Вып 1. С. 193-197.

3. В. А. Пайкуш, О. Л. Іванків, І. Я. Андрусик Оцінка стану ліпідної пероксидації плазми крові у дітей з онкологічними захворюваннями методом хемілюмінесценції.// Практична медицина2003-№1,том 9,.-С.133-135.

4. I. Andrusyk. The study of the kinetic and thermodynamic of the blood serum properties free-radical oxidation lipids applying the method of chemiluminescence //Вісник Національного університету “Львівська політехніка”. Сер. “Елементи теорії та прилади твердотільної електроніки”. – 2002. - №458. - С. 159 -164.

5. Андрусик І. Моделювання процесу надслабкого свічення (хемілюмінесценції), яке виникає в результаті вільно радикального окислення ліпідів в біооб’єктах. //Вісник Національного університету “Львівська політехніка”. Сер. “Елементи теорії та прилади твердотільної електроніки”. – 2002. - №459. - С. 226 -230.

6. Готра З.Ю., Олійник І.Я. Дослідження спектральних характеристик хемілюмінесценції сироватки крові. //Вісник Національного університету “Львівська політехніка”. Сер. “Елементи теорії та прилади твердотільної електроніки”. – 2005. - №542. - С. 84-88.

7. З.Ю. Готра, І.Я. Олійник Дослідження кінетики ініційованої хемілюмінесценції сироватки крові // Вiсн. Харк. ун-ту, № 716. - Бiофiзичний вiсник. - Вип. 2 (16). 2005. - С. 92-96.

8. І.Я. Олійник, З.Ю. Готра Вивчення енергії активації хемілюмінесценції сироватки крові та впливу на неї іонів Fe2+ // Вiсн. Харк. ун-ту, № 716. - Бiофiзичний вiсник. - Вип. 2 (16). 2005. - С. 37-39.

9. Zenon Hotra, Iryna Oliynyk “The investigation of FeSO4 and temperature influence on an activation energy of blood serum”// Proc. IXth international conference "Modern Problem of radio engineering, telecommunications and computer science".-(Ukraine)2006.-P.677-678.

10. Андрусик І. Я. Математичне моделювання процесів ініційованої хемілюмінесценції//Тези доповідей III з’їзду українського біофізичного товариства.-2002.-С. 154-155.

11. Iryna Andrusyk The study of blood serum chemiluminescence characteristics//International scientific and practical conference “Spectroscopy in special applications’’.- 2003.-P.69.

12. Олійник І. Я. Генерація світла яка виникає в процесах перекисного окиснення ліпідів//Матеріали ІІ міжнародної наукової конференції “Фізика невпорядкованих систем”.-2003.-С. 134.

13. Готра З. Ю., Олійник І. Я. Квантово-електронне моделювання процесу перекисного окиснення ліпідів// І Українська наукова конференція “Проблеми біологічної та медичної фізики”.-2004.-С.107.

14. Олійник І. Я., Готра З. Ю. Вивченння динаміки свічення хемілюмінесценції плазми крові// І Українська наукова конференція “Проблеми біологічної та медичної фізики”.-2004.-С.212.

АНОТАЦІЯ

Олійник І. Я. Енергетичні характеристики хемілюмінесценції сироватки крові.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02-біофізика.-Харьківський національний університет ім. В. Н. Каразіна, м. Харків. 2007.

Встановлена роль квантово-електронних та енергетичних закономірностей у процесі ХЛ СК. Показано, що в процесі випромінювання на інтенсивність крім концентрації окисника та окиснювальної речовини впливають ще і такі фактори як, ефективне спустошення рівнів ,, в розчині та присутність компоненту, який слабо гасить молекулу емітер, але приймає ефективну участь в процесах - релаксації. Проведено кількісний та якісний аналіз впливу середовища та температури на випромінювальні процеси. Показано та пояснено вплив на енергію активації . Доведено експоненційний вплив енергії активації на множник пропорційності в рівнянні Арреніуса. Досліджено спектри ХЛ при паталогічних захворюваннях. Досліджено кінетичні криві ІХЛ. Встановлено їх спрямлення у координатах , та показано використання ІХЛ у діагностичних цілях. На основі отриманих результатів зроблено висновок, що реактивність СК при різних захворюваннях є різною.

Ключеві слова: хемілюмінесценція, квантово - електронна теорія, спектри хемілюмінесценції, квантовий вихід, енергія активації, рівняння Арреніуса, активатори (дезактиватори), час збудженого життя молекул, рівняння Штерна- Фольмера, патологічні стани.

Аннотация

Олийнык И. Я. Энергетические характеристики хемилюминесценции сыворотки крови.-Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02-билфизика.-Харьковский национальный университет им. В. Н. Каразина, г. Харьков, 2007.

Установлена роль квантово-электронных и энергетических закономерностей в процессе ХЛ СК. Показано что в процессе излучения на интенсивность кроме концентрации окислителя и окисляемого вещества влияют еще и такие факторы как, эффективное опустошение уровней , в растворе и присутствие компонента, который слабо гасит молекулу эмиттер, но принимает эффективное участие в процессах -релаксации. Проведен количественный и качественный анализ влияния среды и температуры на излучательные процессы. Показано и дано объяснение влияния на энергию активации . Доказано экспоненциальное влияние энергии активации на множитель пропорциональности в уравнении Аррениуса. Исследовано спектры ХЛ при патологических заболеваниях. Исследовано кинетические кривые ИХЛ. Установлено их спрямление в координатах , и показано использование в диагностических целях. Основываясь, на полученных результатах сделано вывод, что реакционность СК при различных заболеваниях является разной.

Ключевые слова: хемилюминесценция, квантово-электронная теория, спектры хемилюминесценции, квантовой выход, энергия активации, уравнение Аррениуса, активаторы (дезактиваторы), время возбужденной жизни молекул, уравнение Штерна- Фольмера, патологическое состояние.

Abstract

I. Ya. Oliynyk. Energy characteristics of blood serum chemiluminescence –Manuscript.

Thesis for a Candidate’s degree of Physical and Mathematical Sciences in Biophysics- Speciality 03.00.02, V. N. Karazin Kharkov National University, Kharkov, 2007.

The role of quantum electron and energy regularities in the process of blood serum chemiluminescence was determined. The derived quantum electron regularities depend on the structure of chemiluminescence molecule emitter spectrum, kinetic parameters and solution properties. Experimentally derived spectral curves of blood serum chemiluminescence have a dome-shaped form. Spectrum has one peak in the region of 500 nm, band half-width was 150 nm. Mathematical calculations showed that quantum output of stimulated chemiluminescence is considerably higher than quantum output of spontaneous one. The distribution of chemiluminescence radiation intensity has approximately Lorential shape with the half-width far less than at spontaneous radiation. The intensity in the radiation process was shown to be influenced by oxidant concentration and oxidizable substance and also by such factors as efficient emptying of levels, in the solution and availability of the component subtly quenching molecule emitter but effectively participating in the -relaxation processes. From the model follows the limitation of the lower limit of molecule-deactivator concentration (substratum molecule). The existence of the lower limit of molecule concentration and thus of substratum dissolution, is also predetermined by relaxation velocity: the faster deactivation of lower levels is necessary () in comparison to velocity of radiative decay of state.

The quantitative and qualitative analysis of environmental and temperature effect on radiation processes was conducted. When adding both hydrogen dioxide and , chemiluminescence level significantly increases. If at adding even insignificant concentration of the drastic increase of chemiluminescence level occurs, then at adding this increase is slower. The temperature influence on the intensity of chemiluminescence is of exponential character. Activation energy of each of the samples of blood serum, determined by temperature curves, had two values, as there was a kink of a temperature curve. The kink of a curve occurred at 25 °С. Impurity being an activator in relation to certain oxidation reaction at low concentrations, acts as a deactivator (quencher) at quite high concentrations in relation to the same reactions. In other words sample activity and respectively the luminescence intensity are not monotonous function of concentration, present there. Transition metals () lessen generalized (experimentally determined) activation energy regardless the absence of influence upon the oxidizing rate. effect upon the activation energy was shown and explained. Exponential effect of activation energy on proportionality factor in Arrhenius equation was proved. The study of exited molecules life span shows that it lasts ~10-6c, and it means that cetones are in triplet state. The main contribution into the process of blood serum chemiluminescence is made by cetones recombination; there is quadratic chain interruption in blood serum. chemiluminescence spectra at pathological diseases were studied. Immuno-chemiluminescence kinetic curves were studied. Their straightening in coordinate was determined and use in diagnostic was shown. Basing on the obtained results the conclusion was derived that blood serum reactivity at different diseases is different. Experiment data on maximal luminescence burst showed clear differences between control and II degree of oncological diseases, as well as plausible increase of relative to the norm at tuberculosis and sarcoidosis. Some increase of was observed at initial and final stages of cancer. The significant difference among pathologies on integral light sum is observed. Introduced parameter (product of integral light sum and maximal intensity) allows more profound analysis of pathological diseases. The technique of initiation chemiluminescence application showed information capacity, objectivity, reliability both at differential cancer and tuberculosis diagnostics and at detection of pre-pathologic and incipience of oncological diseases as well as at screning preventive examination of practically healthy people.

Key words: chemiluminescence, quantum electron theory, chemiluminescence spectra, quantum output, activation energy, Arrhenius equation, activator (deactivator), exited molecules life span, Stern-Folmer equation, pathological states.

Підписано до друку 7.12.2006р.

Формат 6084 1/16. Папір офсетний.

Друк на різографі. Умовн. Друк. Арк. 1,4. Умрвн. Фарб.-відб. 1,34

Тираж 100 прим. Зам. 187.

Роздруковано в НУ “Львівська політехніка”

вул. С. Бандери 12, 79013, Львів