ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ЮРІЯ ФЕДЬКОВИЧА

ОНЕЩУК НАДІЯ ВІКТОРІВНА

УДК 577.164:576.311.347

РОЛЬ АСКОРБАТУ ТА НІАЦИНУ В РЕГУЛЯЦІЇ

ФУНКЦІОНАЛЬНО-МЕТАБОЛІЧНИХ ПОРУШЕНЬ

МІТОХОНДРІЙ ОПРОМІНЕНИХ ПРОРОСТКІВ

ГІБРИДІВ КУКУРУДЗИ

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Чернівці – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник:

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, профессор Марченко Михайло Маркович,

Чернівецький національний університет

імені Юрія Федьковича,

завідувач кафедри біохімії,

декан біологічного факультету.

член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Григорюк Іван Панасович,

Національний аграрний університет

Кабінету Міністрів України,

професор кафедри екобіотехнології і біорізноманіття;

доктор біологічних наук, професор

Воробець Наталія Миколаївна,

Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького,

професор кафедри фармакогнозії і ботаніки. |

Провідна установа: | Дніпропетровський національний університет, кафедра біофізики та біохімії, Міністерство освіти і науки України,

м. Дніпропетровськ. |

Захист відбудеться „15березня 2006 р. 0 12 годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 в Чернівецькому

національному університеті імені Юрія Федьковича за адресою: 58012, м.

Чернівці, вул. Лесі Українки, 25, корпус 3, біологічний факультет, ауд. 81.

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці

Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича за

адресою: м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 23.

Автореферат розісланий „11лютого 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Копильчук Г.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з актуальних проблем сучасної біохімії є теоретичне обґрунтування та розробка шляхів спрямованої регуляції метаболічних порушень, що виникають внаслідок уражуючої дії іонізуючих випромінювань. В теперішній час визнано, що пошкодження структури і функціонування мітохондрій за умов дії іонізуючої радіації відіграє ключову роль в розвитку програмованої клітинної загибелі (Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1983; Єгорова А.Б. та ін., 2001; Ванюшин П.Ф., 2001; Іnze D., Van Montagu M., 1995; Бра М. и др., 2005). При цьому універсальним початковим процесом, після якого клітина незворотно переходить до апоптозу, є зміна величини електрохімічного потенціалу мітохондріальної мембрани, зниження рівня відновленого глутатіону, НАДН, АТФ, АДФ, утворення активних форм кисню (АФК), інтенсифікація процесів пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ), порушення в системі про- та антиоксидантного стану (Лю Б.М., 2001; Матышевская О.П., 1998; Edreva A., 1992).

Особливий інтерес у цьому аспекті викликають дослідження радіопротекторних сполук, які є потужними антиоксидантами і значно підвищують резистентність організму до радіаційного впливу. За умов пошуку потенційно радіозахисних засобів пролонгованої дії перспективним є дослідження аскорбату і ніацину. Цим вітамінам відводиться важлива роль в здатності клітин і тканин протистояти розвитку вільнорадикальних пошкоджень. Антиоксидантна роль аскорбату ґрунтується на його реакції з високореактивними кисневими інтермедіатами. Хоча аскорбат наявний у водній фазі, він може захищати ліпіди і мембрани від окиснювального пошкодження шляхом ефективного зв’язування радикалів, які індукують пероксидне окиснення ліпідів (Кения М.В. и др., 1993; Потапович А.И. та ін., 2001). З’ясовано також, що ніацин захищає клітинні мембрани від окисного ушкодження в них білків і проявляє ефект антиоксиданту (Шаповал Г.С. та ін.; 2003, Великий М.М. та ін., 1996).

Даних про способи модифікації метаболічних порушень в мітохондріях опромінених організмів цими вітамінними сполуками ми не зустрічали. Це зумовлює актуальність і своєчасність проведення експериментальних досліджень та дає можливість розширити арсенал природних речовин, необхідних для корекції уражуючої дії іонізуючої радіації шляхом спрямованого впливу на енергетичний метаболізм мітохондрій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась з 1997 до 2004 року на кафедрі біохімії Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича і є частиною наукових тематик кафедри „Дослідження післядії радіаційного та хімічного забруднення на життєдіяльність живих організмів”, № держреєстрації 0194U028027, „Пошук, розробка та реалізація комплексних природних радіопротекторних та протипухлинних засобів для корекції захисних систем організмів вражених низькими дозами радіації та при канцерогенезі”, № держреєстрації 0100U005500, „Біохімічна адаптація організмів за умов дії стресорних факторів різної природи”, № держреєстрації 0103U004526.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було з’ясувати особливості мітохондріального метаболізму проростків кукурудзи за умов одноразового тотального рентгенівського опромінення дозами 0,129 і 1,29 Кл•кг-1 та довести можливості корекції його порушень за допомогою антиоксидантів – аскорбату та ніацину.

Відповідно до мети ставились наступні експериментальні завдання:

1. Дослідити функціонування дихального ланцюга мітохондрій проростків гібридів кукурудзи за дії іонізуючої радіації, аскорбату і ніацину.

2. Вивчити вплив аскорбату в поєднанні з ніацином на інтенсивність продукування Н+ мітохондріями, їх АТФ-азну та фосфорилуючу активність при опроміненні проростків дозами 0,129 і 1,29 Кл•кг-1.

3. Дослідити вміст молекулярних продуктів пероксидного окиснення ліпідів і білків в мітохондріях опромінених проростків гібридів кукурудзи за роздільної й спільної дії аскорбату і ніацину.

4. Встановити вплив аскорбату і ніацину на активність антиоксидантних ферментів та редокс-стан мітохондрій проростків гібридів кукурудзи уражених іонізуючою радіацією.

5. Визначити вміст аскорбату і продуктів його метаболізму в мітохондріях опромінених проростків гібридів кукурудзи за умов роздільної та спільної дії аскорбату та ніацину.

Об’єкт дослідження: радіаційне ураження метаболізму мітохондрій проростків гібридів кукурудзи і коригуючий ефект аскорбату та ніацину.

Предмет дослідження: показники окиснювального фосфорилування, пероксидного окиснення ліпідів і модифікації білків, активність ферментів антиоксидантної системи й редокс-стану мітохондрій проростків гібридів кукурудзи уражених іонізуючою радіацією за умов обробки насіння аскорбатом та ніацином.

Методи дослідження: біохімічні, полярографічні, ензиматичні, потенціометричні, спектрофотометричні, ультрацентрифугування та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведене порівняльне дослідження функціонального стану мітохондрій проростків гібридів кукурудзи за дії тотального рентгенівського опромінення в дозах 0,129 і 1,29 Кл•кг-1. Показано, що застосування аскорбату з ніацином призводить до підвищення ефективності радіопротекторної корекції метаболічних порушень клітинних органел, які уражені іонізуючою радіацією. Встановлено, що за умов дії іонізуючого випромінювання на фоні впливу аскорбату і ніацину відбувається посилення спряження окиснення і фосфорилування в мітохондріях опромінених проростків гібридів кукурудзи. Досліджені і кінетично охарактеризовані залежності сукцинатдегідрогеназної активності від концентрації субстрату в мітохондріях опромінених та неопромінених проростків. Виявлено збільшення вмісту продуктів пероксидного окиснення ліпідів, інтенсивності окиснювальної модифікації білків і зменшення активності ферментів антиоксидантного захисту та редокс-стану мітохондрій уражених іонізуючою радіацією. Продемонстровано корекцію вказаних показників мітохондрій даними вітамінними сполуками. Доведена ефективність застосування аскорбату спільно з ніацином в регуляції вмісту аскорбату і продуктів його метаболізму в мітохондріях опромінених проростків гібридів кукурудзи.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати доповнюють і поглиблюють існуючі уявлення про вплив іонізуючого опромінення на метаболічні процеси в клітинах проростків гібридів кукурудзи.

Встановлена ефективність використання аскорбату і ніацину для корекції окиснювальних процесів в мітохондріях рослин, які уражені іонізуючою радіацією.

Отримані дані можуть бути використані для пошуку нових радіопрофілактичних засобів.

Результати роботи застосовуються при проведенні практичних занять, читанні лекцій з біоенергетики, біофізики і радіобіології для студентів Чернівецького національного університету імені Ю. Федьковича, використані в навчальних посібниках: Свербивус Я.А., Онещук Н.В. Біофізика та радіобіологія. Навчальний посібник. – Чернівці: Рута, 1999. – 68 с.; Свербивус Я.А., Онещук Н.В. Наукова-дослідна робота студентів з біохімії. Навчальний посібник. – Чернівці: Рута, 2005. – 82 с.

Особистий внесок здобувача. Дисертанткою особисто здійснено розробку основних теоретичних і практичних положень роботи, проведено аналіз літературних джерел. Автором самостійно виконано біохімічні дослідження, кінетичний та статистичний аналіз фактичних результатів. Головна ідея та задачі досліджень були сформульовані науковим керівником – доктором біологічних наук, професором Марченком М.М. Аналіз експериментальних результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формування основних висновків роботи проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати досліджень були представлені на VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997); VIIІ Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); міжнародних конференціях: „Молодь у вирішенні регіональних та транскордонних проблем екологічної безпеки” (Чернівці, 2003); „Молодь і досягнення науки у вирішенні проблем сучасності” (Чернівці, 2003); „Екологія. Людина. Суспільство” (Київ, 2004); „Наука і освіта 2005” (Дніпропетровськ, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 5 статей у наукових фахових виданнях, 5 тез доповідей в матеріалах і збірниках конференцій та з’їздів та 2 навчальних посібники.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 139 сторінках комп’ютерного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, узагальнення, висновків, списку використаних джерел (всього 292 найменування). Робота містить 17 таблиць і 10 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В розділі описані особливості окиснювальної і фосфорилуючої активності мітохондрій рослин. Розглядається питання щодо регуляції дихання і набухання мітохондрій низькомолекулярними сполуками. Крім того, проаналізовано сучасні дані про вплив іонізуючої радіації на енергетичні системи та пероксидні процеси рослин, розглянуто антиоксидантну роль аскорбату за дії стресових факторів середовища.

Матеріали та методи дослідження. У дослідженнях були використані 4 – 5 добові етіольовані проростки кукурудзи (Zea mays L.) гібридів Піонер 3978 і БМ281, які вирощували в термостаті на вологому фільтрувальному папері при 260 С. У дослідних групах насіння попередньо обробляли розчинами аскорбату (1 мг/мл) й ніацину (0,5 мг/мл). Проростки опромінювали за допомогою рентгенівського апарату ДРОН-4 дозами 0,129 і 1,29 Кл·кг-1 за таких умов: напруга 180 кВ, сила струму 40 мА, фільтри 0,5 мм Сu та 1 мм Аl, фокусна відстань 40 см, опромінення тотальне. Вплив іонізуючої радіації досліджували через 4 години після одноразового опромінювання.

Мітохондрії отримували з тканин надземної частини методом диференційного центрифугування при температурі 0 – +40 С за описаною методикою (Войников В.К., Константинов Ю.М., 1991; Гавриленко В.Ф. и др., 1975). Дихання мітохондрій реєстрували за допомогою полярографа ПУ-1 з використанням закритого електроду Кларка. Аналіз метаболічного стану ізольованих мітохондрій проводили в комірці об’ємом 1,5 мл при температурі 250 С. Субстрати окиснення: сукцинат і 2-оксоглутарат. Дихання стимулювали додаванням у полярографічну комірку 200 мкмоль АДФ. На підставі полярограм розраховували швидкість поглинання кисню в основних метаболічних станах за Чансом (V3 та V4), показник дихального контролю (V3:V4) та ефективність фосфорилування (АДФ:О). Продукування Н+ мітохондріями реєстрували за допомогою рН-метричної установки, зібраної на базі водневого електроду, рН-метра рН-673М і самописця ПДА 1. (Малюк В.И., Коржов В.И., 1981). Зміни об’єму мітохондрій реєстрували за величиною оптичної густини суспензії, яка містила 1 мг мітохондріального білка при довжині хвилі 520 нм на спектрофотометрі СФ-46. Набухання оцінювали за зниженням, а скорочення за збільшенням оптичної густини. Результати спостережень виражали у відсотках від вихідної оптичної густини. ПОЛ тестували за кількістю проміжних (дієнові кон’югати) і кінцевих (малоновий альдегід) продуктів. Дієнові кон’югати, які утворюються в процесі пероксидного окиснення ліпідів за умов in vivo визначали методом УФ-спектроскопії в гептановій фракції. Вміст тіобарбітуратактивних продуктів ПОЛ (ТБК-активних продуктів) визначали за здатністю малонового альдегіду утворювати забарвлений комплекс при взаємодії з тіобарбітуровою кислотою (Стальная И.Д., 1977). Рівень окиснено модифікованих білків (ОМБ) визначали за їх здатністю взаємодіяти з 2,4-динітрофенілгідразином з утворенням 2,4-динітрофенілгідразонів, що мають характерний спектр поглинання (Мещишен І.Ф.; 1998, Дубинина Е.Е. и др., 1995). Активність сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.1) мітохондрій визначали за її здатністю відновлювати ферицианід калію (Прохорова М.И., 1982). Активність протонної АТФ-ази (КФ 3.6.1.3.) – за вмістом неорганічного фосфату, який звільняється в результаті гідролізу АТФ на мг білка за 1 хв. (Губський Ю.И., 1982). Активність каталази визначали за швидкістю розкладу пероксиду водню (Королюк М.А. и др., 1988). Активність аскорбатпероксидази (КФ 1.11.1.11.) визначали спектрофотометрично за зміною екстинкції при 290 нм (Nakano Y., Asada K., 1987). Активність аскорбатоксидази (КФ 1.10.3.3.) обчислювали за зміною поглинання при 265 нм внаслідок окиснення аскорбінової кислоти (Миттова В.О., Игамбердиев А.У., 2000). Активність пероксидази (КФ 1.11.1.7.) визначали за швидкістю реакції окиснення бензидину під дією ферменту (Плешков Б.П., 1976). Активність редокс-системи мітохондрій визначали за зменшенням концентрації ферицианіду калію в розчині (Щипарев С.М. и др., 1990). Уявну константу Міхаеліса Kм і Vmax розраховували з використанням графіків Лайнуівера-Берка. Концентрацію білка визначали методом Лоурі (Lowry O.H. et al., 1951). Для обчислення вмісту аскорбату, дегідроаскорбату та дикетогулонової кислоти використовували методи (Соколовский В.В. и др., 1974) у модифікації (Окунцов М.М., 1981). Концентрацію пероксиду водню визначали колориметрично (Wu G. et al., 1997). Вміст відновленого глутатіону визначали за допомогою реагенту Елмана (Гришко В.Н., Сыщиков Д.В., 2002). Визначали енергію проростання та схожість насіння (Казаков С.О., 2000).

Результати досліджень піддавали статистичному аналізу (Лакин Г.Ф., 1990). Достовірність отриманих даних визначали, використовуючи критерій Стюдента. Зміни вважали достовірними при р<0,05. Для розрахунків використовували комп’ютерну програму (Microsoft Excel, USA).

Результати досліджень та їх обговорення.

Вплив антиоксидантів на каталітичну активність дихального ланцюга мітохондрій опромінених проростків гібридів кукурудзи. Аналіз отриманих результатів засвідчив, що за умов рентгенівського опромінення в дозі 0,129 Кл·кг-1 зростає інтенсивність поглинання кисню мітохондріями в третьому (на 31%) та четвертому (на 66%) метаболічних станах органел (табл. 1). Підвищення інтенсивності дихання ізольованих мітохондрій супроводжувалось зниженням дихального контролю та величини відношення АДФ:О. Зростання швидкості дихання мітохондрій в стані 4 може означати послаблення в таких препаратах спряження окиснення з фосфорилуванням. За цим параметром дія радіації подібна до впливу на мітохондрії штучних роз’єднувачів типу 2,4-динітрофенолу (ДНФ), внесення яких в середовище інкубації різко знижує дихальний контроль, збільшує інтенсивність нефосфорилуючого дихання. При вивченні окиснювальної і фосфорилуючої активності мітохондрій проростків гібридів кукурудзи за умов опромінення рентгенівськими променями дозою 1,29 Кл·кг-1 встановлено, що дихання мітохондріальної суспензії зазнає певних змін. Зокрема, істотно змінювалось фосфорилуюче дихання (стан 3) та ступінь спряження окиснення і фосфорилування. Можливо, що зміна мітохондріальної активності обумовлена необхідністю забезпечення підвищеної потреби клітин в енергії для збереження їх життєдіяльності. Зсуви в активності процесу окиснювального фосфорилування, на нашу думку, є однією з первинних реакцій відповіді на дію несприятливого фактору, яка проявляється на субклітинному рівні. Встановлена тісна кореляція спряження окиснення і фофорилування з станом мітохондріальної організації. Так, лабілізація структури призводить до втрати фосфорилуючої активності (Скулачёв В.П., 1989). Характерно, що окиснення сукцинату особливо чутливе до змін структури мітохондрій, оскільки вся система перенесення електронів, включаючи дегідрогенази, зв,язана з мембранними структурами мітохондрій. Обробка насіння вітамінними сполуками стимулює дихання практично в усіх метаболічних станах, але найбільше в активному V3. Швидкість V3 зростає на 36 і 43% для аскорбату та ніацину, відповідно і 50% для їх сумісної дії. Дихання у контрольованому стані після фосфорилування АДФ (V4) стимулюється вітамінами меншою мірою і ці зміни не підтверджуються статистично. Отримані дані дають підставу вважати, що однією з причин збільшення швидкості поглинання кисню під дією аскорбату і ніацину може бути енергетичний зсув у співвідношенні АТФ:АДФ у мітохондріях у бік АДФ, яка є потужним стимулятором дихання. Підсилення дихання проходить за умов нормального функціонування механізму спряження окиснення і окиснювального фосфорилування. Аскорбат і ніацин підвищують ступінь спряження окиснення і фосфорилування, про що свідчить збільшення дихального контролю і коефіцієнта фосфорилування АДФ:О. Комплексне використання аскорбату і ніацину підсилює їх ефективність.

Порушення метаболізму мітохондрій за дії радіації супроводжується змінами активності ферментів, які беруть участь в транспорті електронів по дихальному ланцюгу. Одним з таких ключових ферментів мітохондрій, тісно пов’язаних з мембранними структурами, є сукцинатдегідрогеназа, яка безпосередньо зв’язана з дихальним ланцюгом, а перетворення сукцинату обмежується постачанням електронів в дихальний ланцюг. Результати досліджень (рис. 1) свідчать про зростання сукцинатдегідрогеназної активності мітохондрій опромінених проростків кукурудзи. Стимуляція сукцинатоксидазної гілки дихального ланцюга за рахунок активації сукцинатдегідрогенази, можливо, пов’язана з підвищенням субстратної активації ферментного комплексу, викликаного підсиленим надходженням сукцинату всередину мітохондрій. За дії рентгенівського опромінення та вітамінних сполук встановлено зниження сукцинатдегідрогеназної активності мітохондрій. Нами досліджено кінетичні параметри сукцинатдегідрогенази в мітохондріях проростків за умов дії іонізуючої радіації після передобробки насіння аскорбатом і ніацином.

Показано, що рентгенівське опромінення і вітаміни не впливали на Км, незважаючи на стимуляцію сукцинатдегідрогенази. Це дає підставу вважати, що одним з механізмів захисного впливу аскорбату за дії радіації є його участь у регулюванні активності ферментів і зміні функціонального стану мембран.

Функціональний стан мітохондрій проростків гібридів кукурудзи уражених іонізуючою радіацією та його корекція за допомогою антиоксидантів. Згідно з отриманими даними, тотальне рентгенівське опромінення проростків гібридів кукурудзи в дозах 0,129 і 1,29 Кл·кг-1 спричиняє закиснення середовища інкубації мітохондрій. Так, при дозі опромінення 0,129 Кл·кг-1 вміст протонів в позамітохондріальному середовищі збільшився на 32 %, а при дозі 1,29 Кл·кг-1 – на 85 %. Імовірно, в основі ефекту лежить здатність іонізуючого випромінювання змінювати протонну провідність мітохондріальної мембрани. Нами встановлено, що аскорбат і ніацин зменшують продукування Н+ ізольованими мітохондріями. Зокрема, найбільші зміни Н+ зафіксовано для опромінених мітохондрій дозою 1,29 Кл·кг-1 і менш виражені для неопромінених.

У переносі Н+ через мембрани і здійсненні процесу окиснювального фосфорилування бере участь протонна АТФ-аза (Опритов В.А., 2000). Нами проведено дослідження активності протонної АТФ-ази мітохондрій проростків кукурудзи за дії іонізуючої радіації, аскорбату і ніацину. В процесі експерименту відмічено підвищення активності Н+-АТФ-ази в мітохондріях уражених іонізуючою радіацією, максимум змін яких спостерігався при дозі опромінення 1,29 Клкг-1 (187 % відносно контролю). У разі застосування аскорбату і ніацину на фоні дії іонізуючої радіації Н+-АТФ-азна активність мітохондрій знижувалась. За спільної дії вітамінів активність ферменту знижувалася більше, ніж кожного з них окремо.

Для розуміння згаданих вище явищ особливе значення представляють дані про зміни об’єму мітохондрій опромінених проростків кукурудзи за умов дії аскорбату і ніацину. Середні амплітуди набухання не перевищували 12,6 % від величини вихідної оптичної густини. Як показали результати експериментів аскорбат і ніацин викликали зменшення набухання мітохондрій неопромінених проростків. За умов дії рентгенівського випромінювання дозами 0,129 і 1,29 Клкг-1 відбувалось зростання набухання мітохондрій, що виражається в значному зниженні оптичної густини суспензії (на 13 і 36 % відповідно). Абсолютна величина набухання неоднакова при опроміненні різними дозами рентгенівського випромінювання. Це свідчить про те, що із збільшенням дози опромінення зростає проникність мітохондріальної мембрани. Зменшення величини спонтанного набухання за дії аскорбату і ніацину найчіткіше виражено у мітохондріях, опромінених дозою 1,29 Кл•кг-1.

Для повної оцінки функціонального стану мітохондрій опромінених проростків кукурудзи і дії вітамінних сполук ми досліджували швидкість фосфорилування АДФ органелами. Аналіз виконаних досліджень засвідчив, що за умов опромінення дозами 0,129 і 1,29 Клкг-1 простежується зниження швидкості фосфорилування АДФ при використанні як сукцинату, так і 2-оксоглутарату. Під впливом аскорбату і ніацину зафіксоване достовірне підвищення швидкості фосфорилування, яке було пригнічене іонізуючою радіацією. Варто зазначити, що ефект від спільного застосування вітамінних сполук виявився дещо вищим, ніж від роздільного.

Дослідження вмісту молекулярних продуктів пероксидного окиснення ліпідів і білків в мітохондріях опромінених проростків гібридів кукурудзи за дії аскорбату і ніацину. Дані дослідів щодо визначення ПОЛ мітохондрій за утворенням дієнових кон’югатів свідчать про активність цього процесу в варіантах з опроміненням. В наших експериментах вміст дієнових кон’югатів у мітохондріях за дії іонізуючої радіації застосованих доз (0,129 Кл·кг-1 і 1,29 Кл·кг-1) збільшується на 25 і 84 %, відповідно. Обробка насіння вітамінними сполуками сприяла вірогідному зниженню кількості дієнових кон’югатів у кожній серії експериментів. В наших дослідженнях визначення ТБК-активних речовин показало, що вміст кінцевих продуктів ПОЛ в мітохондріях опромінених проростків дозами 0,129 і 1,29 Кл·кг-1 збільшувався на 34 і 85 %, відповідно (рис. 2). У проростках кукурудзи, вирощених з насіння, обробленого розчином аскорбату, встановлено достовірне зниження вмісту ТБК-активних продуктів в мітохондріях опромінених рослин дозою 1,29 Кл·кг-1 порівняно з контролем.

В дослідах з нікотиновою кислотою спостерігались аналогічні зміни. Досить ефективним виявилось завчасне застосування комплексу аскорбату і ніацину, яке викликало суттєве зниження вмісту ТБК-активних продуктів в мітохондріях опромінених проростків.

Нами з’ясовано, що аскорбат і ніацин зменшують вміст пероксиду водню в мітохондріях. Зокрема, найбільші зміни зафіксовано для опромінених мітохондрій і найменші для неопромінених. Максимальний вплив спостерігався за сумісного застосування аскорбату і ніацину.

За умов дії іонізуючої радіації може відбуватися окиснювальна деструкція макромолекул у тканинах, в тому числі, молекул білків. Нами встановлено, що із збільшенням дози опромінення зростає ступінь окиснювальної модифікації білків. Так, вміст альдегідо- і кетонопохідних нейтрального характеру (ОМБ370) в мітохондріях опромінених проростків дозами 0,129 і 1,29 Кл•кг-1 був на 22 і 85 % вищим порівняно з контролем. Водночас рівні альдегідо- і кетонопохідних основного характеру (ОМБ430) були на 17 і 49 % вищими, ніж у неопромінених органел. Отримані результати свідчать, що за дії іонізуючої радіації підвищується здатність білків піддаватись окиснювальній деструкції під впливом активних форм кисню та інших радикалів. Суттєвих змін зазнавали показники окиснювальної модифікації білків в уражених радіацією мітохондріях при застосуванні аскорбату і ніацину. Достовірне зниження вмісту альдегідо- і кетонопохідних нейтрального характеру відмічено при дозі 1,29 Кл•кг-1. Аналогічна закономірність спостерігалась і з боку альдегідо- і кетонопохідних основного характеру. Максимальне зниження ступеня окиснювальної модифікації білків після сумісного впливу аскорбату і ніацину зареєстровано в мітохондріях проростків опромінених дозою 1,29 Кл•кг-1.

Вплив аскорбату і ніацину на показники антиоксидантної системи мітохондрій проростків гібридів кукурудзи уражених іонізуючою радіацією. Аналізуючи одержані дані можна відзначити зростання активності каталази мітохондрій на 15 % при опроміненні дозою 0,129 Кл•кг-1 і зниження ферментативної активності на 47 % при опроміненні дозою 1,29 Кл•кг-1. Результати наших досліджень свідчать про те, що аскорбат, ніацин і їх суміш на фоні дії застосованих доз радіації істотно впливають на каталазну активність мітохондрій. Виражених змін зазнавали показники каталазної активності мітохондрій опромінених дозою 1,29 Кл•кг-1, тоді як при дозі 0,129 Кл•кг-1 цей вплив був незначний.

Як видно з наведених в табл. 2 даних, активність антиоксидантного ферменту аскорбатпероксидази у мітохондріях проростків кукурудзи суттєво зростала за дії рентгенівського опромінення дозою 0,129 Кл•кг- 1 порівняно з контролем (на 31 %), що імовірно, є наслідком збільшення вмісту пероксиду водню у мітохондріях рослин, який активно та постійно розкладається цим ферментом. Однак, при опроміненні проростків кукурудзи дозою рентгенівського випромінювання 1,29 Кл•кг-1 спостерігалось зниження ферментативної активності на 37 % порівняно з неопроміненими. Результати проведених нами досліджень показали, що аскорбат і ніацин викликають суттєве підвищення активності аскорбатпероксидази в неопромінених і опромінених високими дозами рентгенівських променів мітохондріях. Подібні закономірності встановлені для пероксидазної активності мітохондрій опромінених проростків кукурудзи.

Важливою захисною системою рослин є система глутатіону, яка забезпечує захист організму від згубної дії продуктів пероксидного окиснення речовин, регулює окисно-відновні процеси, знешкоджує ксенобіотики, виконує радіопротекторні функції, сприяючи, таким чином, встановленню оптимального рівня пероксидних сполук і збереженню антиоксидантного гомеостазу.

Встановлено, що застосування використаних нами вітамінних сполук призвело до зростання вмісту глутатіону в мітохондріях опромінених і неопромінених проростків кукурудзи.

Ми також досліджували вплив іонізуючої радіації на один з найінформативніших показників окисно-відновних процесів мітохондрій – їх редокс-стан. Зміна метаболічних станів мітохондрій супроводжується змінами редокс-станів піридиннуклеотидів і флавіннуклеотидів (Кондрашова М.Н., 1989). Ми показали, що швидкість відновлення ферицианіду зменшується при опроміненні дозами 0,129 і 1,29 Кл•кг-1 відповідно на 31 та 49 %. Антиоксиданти аскорбат і ніацин викликають підвищення швидкості відновлення ферицианіду, що вказує на стабілізацію редокс-стану мітохондрій. Таким чином, отримані результати дають підставу вважати, що аскорбат в поєднанні з ніацином відіграють важливу роль в корекції окисно-відновних процесів мітохондрій уражених іонізуючою радіацією.

Дія іонізуючої радіації на вміст продуктів метаболізму аскорбату в проростках гібридів кукурудзи. Аскорбат відіграє суттєву роль у захисті клітин від дії активних форм кисню, якщо вони генеруються у надлишку (Arrigoni O., 1994; Nemato S. et al., 1996). Виходячи з цього наступним етапом нашої роботи було вивчення впливу аскорбату і ніацину на вміст аскорбату та його похідних в мітохондріях проростків кукурудзи за дії різних доз рентгенівського опромінення. Як свідчать проведені дослідження, рентгенівське опромінення проростків кукурудзи дозами 0,129 і 1,29 Клкг-1 зумовлює суттєві зміни вмісту й співвідношення аскорбату, дегідроаскорбату та дикетогулонової кислоти в мітохондріях. Вміст аскорбату у мітохондріях опромінених проростків дозою 0,129 Клкг-1 збільшується на 26 %, а дозою 1,29 Клкг-1 зменшується на 44 %. Було показано, що під впливом іонізуючої радіації відбувається підвищення рівня дегідроаскорбату і дикетогулонової кислоти. Застосування вітамінних сполук мало позитивний вплив на вміст і співвідношення аскорбату, дегідроаскорбату і дикетогулонової кислоти в мітохондріях опромінених та неопромінених проростків кукурудзи. При одночасному застосуванні аскорбату і ніацину досліджувані показники нормалізувалися суттєвіше.

Співвідношення у клітині аскорбату і дегідроаскорбату важливий параметр її окисно-відновного статусу. У наших дослідженнях величина дегідроаскорбат/аскорбат істотно залежала від дози рентгенівського опромінення. Збільшення вмісту дегідроаскорбату свідчить про посилення окиснювальних процесів.

В мітохондріях проростків опромінених дозою 0,129 Клкг-1 це співвідношення збільшувалось на 42 %, а при дозі 1,29 Клкг-1 більше ніж у 2 рази порівняно з контролем (рис. 3). За описаних умов експерименту ми визначали активність аскорбатоксидази в мітохондріях проростків кукурудзи. Аскорбатоксидаза є одним із ферментів, які окиснюють аскорбат. Нами встановлено, що рентгенівське опромінення в дозі 0,129 Клкг-1 спричиняє вірогідне збільшення активності аскорбатоксидази в мітохондріях, водночас як опромінення проростків дозою 1,29 Клкг-1 викликає зниження аскорбатоксидазної активності. Отже, існує пряма залежність між вмістом аскорбату і активністю аскорбатоксидази в мітохондріях. Попередня обробка насіння кукурудзи аскорбатом і ніацином викликає нормалізацію активності ферменту в мітохондріях опромінених проростків.

Таким чином, використання вітамінів-антиоксидантів може мати важливе значення для регуляції вмісту аскорбату та його похідних в опроміненому організмі, захищаючи належним чином клітини рослин від ушкодження. З огляду на це, проведені дослідження дають можливість рекомендувати використання аскорбату в поєднанні з ніацином для подальшого дослідження з метою застосування їх для корекції метаболічних зрушень індукованих впливом іонізуючої радіації. Підсумовуючи отримані нами експериментальні результати, а також враховуючи дані літератури, можна запропонувати узагальнену схему ролі аскорбату і ніацину у регуляції функціонально-метаболічних порушень мітохондрій проростків гібридів кукурудзи уражених іонізуючою радіацією (рис. 4).

Відомо, що від фізико-хімічного складу фосфоліпідного оточення ензимних комплексів внутрішньої мембрани мітохондрій значною мірою залежить їх просторове розміщення, швидкість транспорту електронів, проникнення через мембрану субстратів окиснення. Тому, зрозуміло, що надходження в мітохондрії антиоксидантів разом із зменшенням окиснювальної модифікації білків, пригніченням процесів ліпопероксидації та активацією антиоксидантних ферментів призвело до ефективного посилення функціонального стану системи тканинного дихання і окиснювального фосфорилування.

Очевидно, що нормалізацією структурно-функціонального стану мітохондрій під впливом проведеної корекції можна пояснити отримані нами результати, які свідчать про достовірне підвищення інтенсивності окиснювального фосфорилування у мітохондріях опромінених клітин. Можна вважати, що вивчення сукупного функціонування досліджуваних шляхів біологічної дії аскорбату та ніацину дозволило представити загальну картину регуляції метаболічних перетворень, які мають місце в клітині в умовах in vivo, як при нормальних фізіологічних, так і при патологічних станах.

Таким чином, дослідження конкретних механізмів біологічної дії аскорбату і ніацину на тканинному та субклітинному рівнях організації за дії іонізуючої радіації показало їх важливу роль у регуляції біоенергетичних процесів, що дає змогу сконцентрувати подальші дослідження в одному з найперспективніших напрямків.

ВИСНОВКИ

У роботі вперше здійснено комплексне дослідження функціонального стану мітохондрій опромінених проростків гібридів кукурудзи і впливу ефективних антиоксидантів за корекції викликаних радіацією змін.

В результаті вирішення наукової проблеми зроблено наступні теоретичні та прикладні висновки:

1. Іонізуюча радіація в дозах 0,129 та 1,29 Кл•кг-1 індукує порушення активності дихального ланцюга мітохондрій опромінених проростків кукурудзи шляхом збільшення поглинання кисню в активному метаболічному стані 3 і контрольованому стані 4 й зниження дихального контролю та коефіцієнта фосфорилування (АДФ:О). В даних умовах досліду аскорбат і ніацин посилюють показники спряженості дихання та окиснювального фосфорилування.

2. Реакція енергетичного метаболізму мітохондрій на дію іонізуючої радіації досліджуваних доз відзначається зростанням сукцинатдегідрогеназної активності. Максимальна активація ензиму зареєстрована при дозі опромінення 1,29 Кл•кг-1. Аскорбат і ніацин викликають зниження активності сукцинатдегідрогенази, тоді як уявна константа Міхаеліса Км не зазнає суттєвих змін, що свідчить про незмінність спорідненості ферменту до субстрату в даних умовах експерименту.

3. Встановлено, що коригуюча дія аскорбату й ніацину на функціонально-метаболічні порушення мітохондрій уражених іонізуючою радіацією в дозах 0,129 і 1,29 Кл•кг-1 визначається зниженням вмісту іонів водню позамітохондріального середовища, нормалізацією активності протонної АТФ-ази, редокс-стану та амплітуди набухання мітохондрій.

4. Обробка насіння кукурудзи аскорбатом і ніацином та їх спільна дія викликають зменшення вмісту в мітохондріях проростків дієнових кон’югатів, ТБК-активних продуктів, пероксиду водню та зниження рівня окиснювальної модифікації білків індукованих рентгенівським опроміненням в дозах 0,129 і 1,29 Кл•кг-1.

5. Опромінення проростків кукурудзи дозою 0,129 Кл•кг-1 викликає підвищення активності каталази, аскорбатпероксидази і пероксидази в мітохондріях. При дозі опромінення 1,29 Кл•кг-1 активність вказаних антиоксидантних ферментів істотно знижується. За дії аскорбату і ніацину спостерігається активація активності каталази, аскорбатпероксидази та пероксидази в мітохондріях проростків, уражених іонізуючою радіацією.

6. Тотальне рентгенівське опромінення проростків кукурудзи дозою 0,129 Кл•кг-1 викликає зростання вмісту аскорбату та відновленого глутатіону в мітохондріях. Висока доза опромінення (1,29 Кл•кг-1) призводить до вірогідного зниження їх рівня в цих компартментах клітини. Доведено, що аскорбат і ніацин підвищують вміст аскорбату і відновленого глутатіону, знижують співвідношення дегідроаскорбат/аскорбат в мітохондріях опромінених проростків кукурудзи, що є доказом нормалізації в них окиснювальних процесів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Марченко М.М., Онещук Н.В., Свербивус Я.А. Регуляторна дія аскорбату та ніацину на активність дихального ланцюга мітохондрій проростків кукурудзи за радіаційного впливу // Физиология и биохимия культ. растений – 2004. – Т. 36, № 2 . – С. 161 – 166. (Здобувач визначила поглинання кисню мітохондріями, активність СДГ, провела статистичну обробку, підготувала статтю до друку).

2. Свербивус Я.А., Онещук Н.В. Зміни вмісту аскорбінової кислоти та її форм в паростках кукурудзи за умов рентгенівського опромінення і дії вітамінів С і РР // Науковий вісник Чернівецького університету: Збірник наукових праць. Вип. 126: Біологія. – Чернівці: Рута, 2001. – С. 149 – 155. (Здобувач визначила вміст аскорбінової кислоти в проростках кукурудзи, провела статистичну обробку, підготувала статтю до друку).

3. Онещук Н.В., Свербивус Я.А. Вплив аскорбату в поєднанні з ніацином на перекисне окислення ліпідів і антиоксидантну систему захисту мітохондрій паростків кукурудзи за умов рентгенівського опромінення // Науковий вісник Чернівецького університету: Збірник наукових праць. Вип. 169: Біологія. – Чернівці: Рута, 2003. – С.15 – 23. (Здобувач визначила вміст продуктів ПОЛ та активність основних ензимів антиоксидантної системи захисту, провела статистичну обробку, підготувала статтю до друку).

4. Онещук Н.В., Свербивус Я.А. Порушення функціонального стану мітохондрій уражених іонізуючою радіацією і корекція його за допомогою антиоксидантів // Науковий вісник Чернівецького університету: Збірник наукових праць. Вип. 193: Біологія. – Чернівці: Рута, 2004. – С. 29 – 38. (Здобувач визначила набухання мітохондрій, вміст Н+ в середовищі інкубації, активність Н+-АТФ-ази, статистично опрацювала результати, підготувала статтю до друку).

5. Онещук Н.В., Свербивус Я.А. Антиоксидантна дія аскорбату і ніацину на редокс-стан мітохондрій рослинних клітин, уражених іонізуючою радіацією // Науковий вісник Чернівецького університету: Збірник наукових праць. Вип. 223: Біологія. – Чернівці: Рута, 2004. – C. 89 – 95. (Здобувач визначила редокс-стан мітохондрій, вміст пероксиду водню, виконала статистичне опрацювання результатів, підготувала статтю до друку).

6. Свербивус Я.А., Онещук Н.В. Вплив вітамінів групи В на окисно-відновні системи опромінених паростків кукурудзи // Матеріали VII Українського біохімічного з’їзду. Ч. 2. – Київ, 1997. – С. 101 – 102. (Здобувач самостійно зробила експериментальну частину, провела статистичну обробку цих матеріалів, підготувала тези до друку).

7. Онещук Н.В., Свербивус Я.А. Регулюючий вплив аскорбату і ніацину на швидкість окислювального фосфорилювання і АТФ-азну активність мітохондрій за умов променевого ураження // Український біохімічний журнал. – Чернівці, 2002. – Т. 74, № 4б (додаток 2). – С. 232. (Здобувач провела експеримент та статистичну обробку результатів, підготувала тези до друку).

8. Марченко М.М., Онещук Н.В., Свербивус Я.А. Модифікація впливу інкорпорованого радіонукліду на вміст аскорбінової кислоти в паростках кукурудзи // Матеріали ІІ міжнародної наукової конференції: „Молодь у вирішенні регіональних та транскордонних проблем екологічної безпеки” – Чернівці: Золоті литаври, 2003. – С. 106 – 109. (Здобувач самостійно здійснила аналіз, провела статистичну обробку, зробила частину експериментальної роботи та підготувала матеріал до друку).

9. Онещук Н.В., Свербивус Я.А. Регуляція вмісту аскорбінової кислоти в мітохондріях опромінених проростків рослин за допомогою антиоксидантів // Матеріали VІІ Міжнародної науково-теоретичної конференції студентів, аспірантів та молодих вчених „Екологія. Людина. Суспільство”. – Київ, 2004. – С. 51. (Здобувач визначила вміст аскорбінової кислоти в мітохондріях, підготувала матеріал до друку, сформулювала основні положення та висновки).

10. Свербивус Я.А., Онещук Н.В. Вплив аскорбату і ніацину на ферментативну активність деяких оксидоредуктаз мітохондрій рослинних клітин уражених іонізуючою радіацією // Матеріали VIII Міжнародної науково-практичної конференції „Наука і освіта-2005”. – Дніпропетровськ: Наука і освіта, 2005. – Т. 10. Біологія. – С. 82. (Здобувач самостійно зробила експериментальну роботу по вивченню впливу аскорбату і ніацину на активність деяких оксидоредуктаз мітохондрій, підготувала тези до друку)

АНОТАЦІЯ

Онещук Н.В. Роль аскорбату та ніацину в регуляції функціонально-метаболічних порушень мітохондрій опромінених проростків гібридів кукурудзи. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія – Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, Чернівці, 2006.

Дисертація присвячена дослідженню механізмів регуляції функціонально-метаболічних порушень мітохондрій проростків гібридів кукурудзи уражених іонізуючою радіацією за допомогою аскорбату та ніацину. Встановлено, що при рентгенівському опроміненні проростків гібридів кукурудзи (Zea mays L.) дозами 0,129 і 1,29 Кл•кг-1 порушується дихання і фосфорилування, підвищується сукцинатдегідрогеназна активність мітохондрій. Аскорбат і ніацин в досліджуваних концентраціях активують ступінь спряження окиснення і фосфорилування про що свідчить достовірне збільшення дихального контролю і коефіцієнта фосфорилування АДФ. В даних умовах досліду відбувалось пригнічення закиснення середовища інкубації мітохондрій. Зниження продукування Н+ мітохондріями корелювало з їх скороченням, поглинанням кисню і зменшенням Н+-АТФ-азної активності. Виявлено також, що досліджувані вітамінні сполуки викликали зниження вмісту пероксиду водню, молекулярних продуктів окиснення білків та ліпідів і зростання редокс-активності мітохондрій. Отримані експериментальні дані свідчать про зміну рівня і перерозподілу продуктів метаболізму аскорбату в проростках кукурудзи залежно від дози опромінення. Ніацин в поєднанні з аскорбатом виявляє позитивний вплив на співвідношення аскорбату, дегідроаскорбату і дикетогулонової кислоти в мітохондріях опромінених проростків.

Ключові слова: рентгенівське опромінення, аскорбат, ніацин, мітохондрії, окиснювальне фосфорилування, Zea mays L.

АННОТАЦИЯ

Онещук Н.В. Роль аскорбата и ниацина в регуляции функционально-метаболических нарушений митохондрий облучённых проростков гибридов кукурузы. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия – Черновицкий национальный университет имени Юрия Федьковича, Черновцы, 2006.

В диссертации исследованы механизмы регуляции функционально-метаболических нарушений митохондрий проростков гибридов кукурузы (Zea mays L.) поражённых ионизирующей радиацией с помощью аскорбата и ниацина. Установлено, что при рентгеновском облучении проростков гибридов кукурузы дозами 0,129 і 1,29 Кл•кг-1 нарушается дыхание и фосфорилирование, повышается сукцинатдегидрогеназная активность митохондрий. Аскорбат и ниацин в исследуемых концентрациях активизируют степень сопряжения окисления и фосфорилирования о чём свидетельствует достоверное увеличение дыхательного контроля и коэффициента фосфорилирования АДФ. Комплексное использование аскорбата и ниацина усиливает эффективность отмеченных механизмов. В данных условиях эксперимента происходило угнетение закисления среды инкубации митохондрий. Снижение продукции Н+ митохондриями коррелировало с их сокращением, поглощением кислорода и уменьшением Н+-АТФ-азной активности. Установлено также повышение содержания диеновых конъюгатов, ТБК-активных продуктов и снижение активности каталазы и аскорбатпероксидазы в митохондриях облучённых проростков. Обработка семян кукурузы аскорбатом и ниацином вызывала снижение уровня пероксидного окисления липидов и повышение активности антиокислительных ферментов. Показано, что рост содержания пероксида водорода и окислительной модификации белков сопровождается снижением скорости восстановления феррицианида в митохондриях облучённых проростков. Отмечено, что аскорбат и ниацин в исследуемых концентрациях, вызывали уменьшение содержания пероксида водорода, молекулярных продуктов окисления белков и возрастания редокс-активности митохондрий облучённых проростков. Получены результаты, которые свидетельствуют об изменении уровня и перераспределения продуктов метаболизма аскорбату в проростках кукурузы в зависимости от дозы облучения. Ниацин в сочетании с аскорбатом положительно влияли на соотношение аскорбата, дегидроаскорбата и дикетогулоновой кислоты в митохондриях облучённых проростков.

Ключевые слова: рентгеновское облучение, аскорбат, ниацин, митохондрии, окислительное фосфорилирование, Zea mays L.

ANNOTATION

Oneshuk N.W. The role of ascorbate and niacin in the regulation of functional