НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ
ПЕТРУШКО МАРИНА ПАВЛІВНА
УДК: 612.646:615.014.41:57.017
МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ, ЦИТОЛОГІЧНІ І МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАТИВНИХ І КРІОКОНСЕРВОВАНИХ ЕМБРІОНІВ ЛЮДИНИ
03.00.19 - кріобіологія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Харків-2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Науковий консультант:
Офіційні опоненти:
Провідна установа: |
академік НАН України,
доктор медичних наук, професор
Грищенко Валентин Іванович,
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, директор ІПКіК НАН України, м.Харків
доктор біологічних наук професор, Лівшиць Людмила Аврамівна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу геноміки людини, м.Київ
доктор біологічних наук, професор, академік УААН Осташко Федір Іванович,
Інститут тваринництва УААН, провідний науковий співробітник відділу біотехнології репродукції сільськогосподарських тварин, м.Харків
доктор біологічних наук, професор Гордієнко Євген Олександрович, Інститут проблем кріобіології
і кріомедицини НАН України, завідувач відділу низькотемпературного консервування, м.Харків
Національний медичний університет
ім. О.О.Богомольця МОЗ України, Науково-дослідний лабораторний центр, м.Київ
Захист відбудеться “17” листопада 2006 року о 13. 30 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, Харків-15, вул.Переяславська, 23
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, за адресою: 61015, Харків-15, вул.Переяславська, 23
Автореферат розісланий “15” вересня 2006 р.
Учений секретар
спеціалізованої Вченої ради,
доктор медичних наук, професор,
член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. В Україні за останнє десятиріччя спостерігається стійка тенденція до депопуляції, основною причиною якої є зниження народжуваності. Крім того, безплідні шлюби складають 10-35% від загальної кількості пар репродуктивного віку. Тому для покращення демографічної ситуації важливо вирішення проблеми безплідного шлюбу (Грищенко В.І., 2003).
За визначенням Всесвітньої організації охорони здоров'я лікування безплідності методами допоміжних репродуктивних технологій успішне, якщо в результаті отримана одноплідна вагітність без патологій розвитку (ESHRE Capri Workshop, 2000). Багатоплідна вагітність розглядається як ускладнення, оскільки зростає ризик передчасних пологів, народження дітей з низькою вагою та виникнення інших медичних, соціальних і економічних проблем (Калініна О.О., 2004).
У зв'язку з цим виникає питання вибору ембріонів для трансплантації в порожнину матки пацієнтки, що, у свою чергу, передбачає визначення чітких морфологічних критеріїв, які відображають високий імплантаційний потенціал і генетичну повноцінність ембріонів. Не менш актуальними вважаються питання кріоконсервування ембріонів, які залишилися невикористаними після ембріоперенесення та їх селекції після заморожування-відігрівання (Gerris J., 2002). Запропонована альтернатива – культивування та трансфер бластоцисти - не є оптимальною, оскільки цієї стадії в умовах in vitro досягає не більш 50% ембріонів (Henman M., 2005). Відзначається, що для настання вагітності переніс у порожнину матки пацієнтки 4-клітинних ембріонів найбільш сприятливий (Jaroudi K., 2004).
Науково-технічний прогрес у біології та медицині, у першу чергу розвиток репродуктивних технологій та методів генетичної діагностики, дозволяє на практиці здійснити профілактику уроджених аномалій розвитку і спадкоємної патології (Бариляк І.Р., 2003; Гречаніна О.Я., 2003; Запорожан В.М., 2003; Лівшиць Л.А., 2003). Незважаючи на широке використання методів кріоконсервування репродуктивних клітин і ембріонів людини, ще не отримано переконливих доказів щодо негативного впливу таких процедур на генетичний апарат. Виникнення різного роду ушкоджень може бути перешкодою для широкого використання кріоконсервованих ембріонів у методах допоміжних репродуктивних технологій.
Наведені факти підтверджують актуальність і необхідність дослідження впливу факторів кріоконсервування на морфофункціональні, цитологічні та молекулярно-генетичні характеристики преімплантаційних ембріонів людини з метою перенесення в порожнину матки пацієнток тільки генетично повноцінних ембріонів.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася з 2000 по 2005 р. у рамках наукових тем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України відповідно до напрямку роботи відділу кріобіології систем репродукції (№ 2.2.6.66 "Вивчення механізму підвищення фертильності гамет і стійкості фетальних клітин людини і тварин при дії низьких температур у сполученні з іншими фізичними і хімічними факторами", № державної реєстрації 0100U000408 і № 2.2.6.96 "Вивчення особливостей дії низьких температур і гіпотермії на гамети, ембріони, ембріональні клітини в залежності від етапу гамето- і ембріогенезу, розробка середовищ збереження, кріоконсервування і репарації нелетальних кріоушкоджень цих біооб’єктів", № державної реєстрації 0101U003480). Автор був відповідальним виконавцем вказаних тем.
Мета і задачі дослідження. На підставі детального аналізу морфофункціональних, цитологічних і молекулярно-генетичних характеристик визначити вплив факторів кріоконсервування на генетичний апарат преімплантаційних ембріонів людини; розробити науково обґрунтовані принципи комплексної оцінки ембріонів за морфологічними характеристиками, здатністю до поновлення мітозу, швидкістю морфогенетичних процесів і результатами преімплантаційної генетичної діагностики для їх використання у допоміжних репродуктивних технологіях при лікуванні безпліддя.
Для досягнення даної мети необхідно вирішити наступні задачі.
1. Розробити принципи оцінки стану ембріонів до і після кріоконсервування та використати їх як біомаркери кріостійкості;
2. Визначити ефективність кріоконсервування ембріонів людини, що знаходяться на різних стадіях преімплантаційного розвитку;
3. Провести порівняльний аналіз життєздатності кріоконсервованих зигот, що знаходяться у різних фазах клітинного циклу;
4. Порівняти швидкість морфогенетичного розвитку нативних і кріоконсервованих преімплантаційних ембріонів людини;
5. З’ясувати стан мітозів в бластомерах ембріонів людини до і після впливу факторів кріоконсервування;
6. Провести цито- та молекулярно-генетичний аналіз нативних і кріоконсервованих ембріонів людини з метою виявлення впливу факторів кріоконсервування на їх генетичний апарат;
7. Провести цитогенетичний аналіз ооцитів та сперміїв для визначення внеску батьківського і материнського геномів у загальну частоту хромосомної нестабільності ембріонів;
8. Підвищити життєздатність преімплантаційних ембріонів людини за допомогою систем сокультивування з преовуляторною сироваткою крові пацієнтки, фолікулярною рідиною преовуляторних фолікулів, клітинами кумулюсу і гранульози.
Об'єкт дослідження. Процеси ушкодження генетичного апарату преімплантаційних ембріонів людини після кріоконсервування та взаємозв'язок цих процесів з морфологічною і функціональною цілістю ембріонів людини, що культивувалися in vitro.
Предмет дослідження. Морфофункціональні, цитологічні і молекулярно-генетичні характеристики ембріонів людини, що знаходилися на різних стадіях преімплантаційного розвитку.
Методи дослідження. Для одержання преімплантаційних ембріонів людини застосовували екстракорпоральне запліднення ооцитів, отриманих у пацієнток, що проходили лікування безплідності методами допоміжних репродуктивних технологій. У роботі використовували морфологічний метод оцінки ембріонів при прижиттєвій світловій мікроскопії. Стан хроматину оцінювали за методом фарбування клітин флюоресцентними барвниками. Стан генетичного апарату визначали за допомогою цитогенетичного методу шляхом каріотипування і флюоресцентної гібридизації in situ. Для кріоконсервування ембріонів використовували режими повільного охолодження. Здатність до поновлення мітозу і темпи дроблення вивчали в умовах тривалого культивування ембріонів людини in vitro. Для реабілітації кріоконсервованих ембріонів після відігрівання використовували методи сокультивування на монослої клітин кумулюсу і гранульози, а також біологічно активні рідини.
Статистичну обробку експериментальних даних здійснювали за методом Стьюдента. За критерій вірогідності розходження приймали рівень 95 % (р<0,05).
Наукова новизна отриманих результатів. Уперше досліджено морфофункціональні характеристики ембріонів людини, що знаходились на різних стадіях морфогенезу, визначено оптимальний термін розвитку і морфологічні параметри ембріонів для кріоконсервування. Уперше вивчена швидкість морфогенетического розвитку ембріонів людини після кріоконсервування. При цьому виявлено, що оцінка життєздатності, яка заснована тільки на морфологічних параметрах і темпах дроблення in vitro недостатня, оскільки вона не враховує вплив факторів кріоконсервування на генетичний апарат ембріонів. Тому важливим є вивчення генетичної повноцінності кріоконсервованих ембріонів із залученням цитогенетичних і молекулярно-генетичних досліджень. Уперше показано, що фактори кріоконсервування знижують мітотичний індекс наступного поділу ембріонів після кріоконсервування, збільшують кількість патологічних станів мітозів і індукують виникнення пікнотичних ядер. У преімплантаційних ембріонах людини після кріоконсервування зростає частота анеуплоїдії хромосом групи G, збільшується частота мозаїцизму і поліплоїдії. Переконливо продемонстровано, що грубі хромосомні аберації в нативних і деконсервованих ембріонах виявляються у виді порушення каріо- і цитокинезу: утворення полімультинуклеарних бластомерів, фрагментів бластомерів, що містять нерівномірні маси хроматину. Доведена необхідність вивчення внеску батьківського і материнського геномів у частоту хромосомної нестабільності преімплантаційних ембріонів. Уперше показана ефективність сокультивування з біологічно активними рідинами, клітинами кумулюсу і гранульози для підвищення життєздатності кріоконсервованих ембріонів людини.
Практичне значення одержаних результатів. Морфологічна та генетична оцінка кріоконсервованих ембріонів, встановлення швидкості морфогенетичного розвитку – гарантія перенесення повноцінних ембріонів у порожнину матки пацієнтки. Тому запропоновані методики можуть бути рекомендовані для лікувальних установ, що застосовують методи допоміжних репродуктивних технологій, а також у наукових інститутах, які досліджують преімплантаційний розвиток ембріонів.
Матеріали дисертаційного дослідження використовуються у навчальному процесі кафедри медичної біології, генетики і паразитології Харківського медичного університету, кафедри генетики Львівського Державного Університету ім. І. Франка, кафедри хімії і біохімії Харківської Державної зооветеринарної Академії, у Центрі репродукції людини “Імплант”, м.Харків, клініках з лікування безпліддя “Надія” м.Київ, “Інтерсоно”, м.Львів.
Особистий внесок здобувача. Винесені на захист положення і результати отримані дисертантом особисто. Роботи, що відносяться до теми дисертаційної роботи, опубліковані у співавторстві з науковим консультантом теми академіком НАН України В.І.Грищенко та іншими співробітниками відділу кріобіології системи репродукції, відбивають результати загального планування і проведення експериментів, аналіз отриманих результатів і підготовки матеріалів до друку. Сформульовані основні положення і зроблені остаточні висновки дисертації. В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:
- у роботах [1, 7, 17, 32] у приготуванні препаратів та цитогенетичному аналізі ооцитів, обробці результатів та формулюванні висновків;
- у роботах [3, 4, 5, 9, 10, 13, 14, 27, 29, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 41] у самостійному проведенні культивування нативних та кріоконсервованих ембріонів та їх морфофункціональному аналізі, участі при обговоренні результатів та винесенні остаточних висновків;
- у роботах [16, 21, 22, 25, 46, 51] у проведенні кріоконсервування ембріонів людини, аналізі результатів та формулюванні висновків;
- у роботах [2, 6, 11, 12, 28] у проведенні ембріологічного етапу програми екстракорпорального запліднення ооцитів і культивування ембріонів;
- у роботах [18, 26, 31, 38, 42, 43, 44, 52, 53] у виконанні цитогенетичних та молекулярно-генетичних досліджень, інтерпретації, статистичній обробці і узагальненні отриманих даних;
- у роботах [48, 50] у вивченні швидкості морфогенетичного розвитку ембріонів, статистичній обробці результатів досліджень.
Апробація результатів дисертації. Про результати досліджень було проінформовано на наукових форумах: 33-му (Іспанія, 1996 р.), 38-му (Шотландія, 2001 р.), 40-му (Португалія, 2003 р.), 41-му (Китай, 2004 р.) щорічних Міжнародних з'їздах товариства кріобіології; на симпозіумі з міжнародною участю "Безплідність. Допоміжні репродуктивні технології" (Київ, 1995, 1997, 1999, 2000 рр.), з'їзді українського Наукового товариства кріобіологів (Харків, 1995, 1998, 2001, 2003 рр.), Міжнародному симпозіумі "Біоетика на порозі третього тисячоріччя" (2000 р.); ІІІ Парнасівській конференції (Львів, 2000 р.); конференції молодих вчених "Медицина третього тисячоріччя" (Харків, 2001, 2002 рр.); конференції товариства молекулярної біології і генетики (Київ, 2001 р.); науково-практичній конференції Асоціації репродуктивної медицини України з міжнародною участю (Київ, 2002, 2003, 2006 рр.), V (Адлер, 1995 р.), VІ (Санкт-Петербург, 1996 р.), VII (Сочі, 1997 р.), ХІ (Самара, 2002 р.), ХII (Санкт-Петербург, 2003 р.), ХІV (Саратов, 2004 р.) і ХV (Чебоксари, 2005 р.); Міжнародних конференціях Російської асоціації репродукції людини "Репродуктивні технології сьогодні і завтра", а також на Міжнародній конференції "Збереження генетичних ресурсів" (Санкт-Петербург, 2004 р.).
Публікації. Основні положення дисертації викладено в 53-х наукових працях: в наукових фахових виданнях - 17, статтях закордонного друку - 4, статтях збірників наукових праць - 7 (з них 3 у збірниках, затверджених ВАК України), тезах доповідей на наукових форумах – 23 ( 21 з них - на міжнародних). Отримано 2 патенти України на винахід.
Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 350 сторінках друкованого тексту і складається з вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали і методи дослідження”, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення отриманих результатів, висновків, переліку використаних джерел літератури, що включає 568 першоджерел (62 сторінки) та додатків (6 сторінок). Дисертацію ілюстровано 31 таблицями та 42 рисунками, з яких 7 таблиць та 8 рисунків на окремих сторінках.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Загальна методика і основні методи дослідження. Дослідження проведено на преімплантаційних ембріонах людини. Ембріони одержували після запліднення in vitro ооцитів пацієнток, що проходили лікування безплідності методом екстракорпорального запліднення. Після перенесення 4-х ембріонів у порожнину матки пацієнтки (Наказ МОЗ, № 24, 1999 р.) одержували письмову, інформовану, вільну згоду подружньої пари на проведення подальших наукових експериментів на репродуктивних клітинах та ембріонах.
Ембріони оцінювали під інвертованим мікроскопом Olympus BX 100 (зб. х600) через кожні 24 год культивування протягом 5 діб. Використовували систему аналізу зображень Scion Image for Windows, 2000. Враховували кількість та діаметр бластомерів, щільність міжклітинного контакту, ступінь фрагментації, прозорість і гомогенність цитоплазми, наявність цитоплазматичних вакуолей і стан zona pellucida.
Кріоконсервування ембріонів проводили за повільною програмою з 1,2-пропандіолом (1,2-ПД). Відігрівання ембріонів проводили протягом 30 сек інкубації у водяній бані (37С) (Lassale B, 1995).
Виживання ембріонів оцінювали за морфологічними критеріями, здатністю до поновлення мітозу та частотою дроблення до стадії бластоцисти.
Цитогенетичні препарати хромосом преімплантаційних ембріонів готували за методом Тарковського (Tarkowsky A., 1966), молекулярно-генетичний аналіз флюоресцентною гібридизацією in situ проводили за (Coonen E., 2002). Визначені зонди (Multi Vysion PB) використовували для хромосом 13, 21, 22 і центромерних ділянок хромосом 16 і 18. Препарати вивчали під мікроскопом Olympus BX 100 із флюоресцентною насадкою і системою аналізу зображень FISH Vysis PB. Цитологічний аналіз фіксованих ембріонів проводили за класифікацією патологій мітозу (Алов І., 1982).
Стан хроматину ядер бластомерів вивчали після фарбування флюоресцентним барвником Hoechst 33342 і морфологічної оцінки на інвертованому мікроскопі з флюоресцентною насадкою USIO USH 102D, використовуючи NU-фільтр в області спектру 334-465 нм (Fabian D., 2005).
Кількісне визначення вільних амінокислот у сироватці крові проводили за методом PICO-TAG на амінокислотному аналізаторі “Waters”.
Сокультивування ембріонів людини проводили на клітинах кумулюсу і гранульози, а також з додаванням фолікулярної рідини і материнської преовуляторної сироватки крові в середовище культивування (Lindley E., 2001).
Результати досліджень та їх обговорення
Морфофункціональні характеристики нативних і кріоконсервованих ембріонів людини. Метою першої серії експериментів було визначення життєздатності преімплантаційних ембріонів людини після еквілібрації з розчинами кріопротекторів. Слід зосередити увагу на такому феномені: на етапі переносу ембріонів із культурального середовища з температурою 37С в розчини кріопротекторів з температурою 22С відбуваються осмотичні ушкодження (стиск бластомерів, зміна міжклітинної адгезії). Тому надалі ембріони охолоджували в середовищі культивування з 37 до 22С із швидкістю 0,7С/хв, потім переносили в розчини кріопротекторів. У даній серії експериментів обрали розчин 1,2-ПД у концентраціях 1, 1,5 і 2М, який готували на фосфатно-буферному середовищі. Ембріони, що експонували в стандартному культуральному середовищі при 0, 22 і 37С протягом 5 і 10 хв без розчину кріопротектора, були обрані як контроль. Досліджувані ембріони поділяли на три групи. I групу складали 4-клітинні ембріони, етап насичення в яких проводили з розчином 1М, II – 1,5 М і III - 2 М 1,2-ПД.
Після 10-хвилинної експозиції ембріонів контрольної групи при фізіологічних умовах (37С) їх виживання складало 97,6 2,3%, при температурі 22С мало тенденцію до зниження (94,43,5%) і вірогідно (р<0,01) знижувалося при температурі 0С (684,9%). Введення в середовище еквілібрації ембріонів розчинів кріопротекторів при 37С призводило до достовірного зниження їх виживання (р<0,01). Десятихвилинна експозиція 4-клітинних ембріонів при 22С не вплинула на їх виживання і складала для контролю, I, II і III груп відповідно 94,43,5; 92,93,4; 95,92,7 і 94,33,7% (р>0,05).
Встановлена залежність між виживанням і температурою експозиції ембріонів людини. Зменшення часу експозиції до 5 хв істотно не вплинуло на життєздатність ранніх ембріонів. Однак, враховуючи той факт, що зменшення часу експозиції ембріонів у розчині кріопротектора з метою зниження його цитотоксичного впливу не дає можливості для повного насичення, було прийняте рішення застосувати 10-хвилинну експозицію на етапі насичення ембріона розчином кріопротектора.
Ембріони були кріоконсервовані після інкубації в кріоконсервуючому розчині при температурі 22С (I група). Даний розчин містив 1,5 М 1,2-ПД і 0,1 М сахарози. Охолодження здійснювали з 22 до 7С зі швидкістю 2С/хв, ініціацію кристалізації при -7С, охолодження зі швидкістю 0,3 С / хв до –30 С з наступним зануренням зразків у рідкий азот (Lassal B., 1985). Визначали температуру кристалізації кріоконсервуючого розчину -5С. Виходячи з цього, було зроблено припущення, що при зниженні температури “сидінгу” до -7С можлива спонтанна кристалізація розчину. Тому II групу склали ембріони, які кріоконсервували за наступною програмою: 10-хвилинна експозиція в 1,5 М розчині 1,2-ПД; охолодження від кімнатної температури до -5С зі швидкістю 0,7С /хв; ручний “сидінг” при -5С;
повільне охолодження зі швидкістю 0,3С/хв до -32С; занурення зразків у рідкий азот. ІІІ групу ембріонів кріоконсервували таким чином: 10-хвилинна експозиція в 1,5М розчині 1,2-ПД; охолодження від 22С до -5С зі швидкістю 0,7С /хв; 10-хвилинна стабілізація для вирівнювання температури всього зразка, ручний “сидінг” при -5С; повільне охолодження зі швидкістю 0,3С /хв до -32С; занурення зразків у рідкий азот. Відігрівання проводили швидко на водяній бані при температурі 30С.
Порівняльний аналіз морфології нативних і кріоконсервованих ембріонів при використанні комплексної оцінки якості після 48 год культивування дозволив встановити, що ембріони всіх досліджуваних груп до кріоконсервування знаходилися на одній стадії розвитку, мали інтактну блискучу оболонку, правильні, щільно прилягаючі один до одного бластомери і світлу, дрібнозернисту цитоплазму без вакуолярних і цитоплазматичних включень (табл.1). Кількість ушкоджених бластомерів зростала зі зниженням температури “сидінгу”. Більшість ембріонів I і II груп характеризувалися руйнуванням одного бластомера або повним їх лізисом.
Виявилося, що в нативних ембріонах середня кількість бластомерів на ембріон склала 3,970,01, 3,990,02 і 3,920,01 для І, ІІ і ІІІ груп відповідно (p>0,05). В поодиноких ембріонах усіх досліджуваних груп відзначали залучення цілого бластомера до процесів фрагментації. Після кріоконсервування середня кількість бластомерів у ембріоні склала 2,640,09, 3,570,06 та 3,750,04 для І, ІІ і ІІІ груп відповідно.
У роботі вивчали морфометричні характеристики ембріонів до і після кріоконсервування. Незалежно від протоколу кріоконсервування 62,82,8; 65,20,8 і 67,82,1% ембріонів I, II і III груп відповідно мали однаковий розмір бластомерів. Однак в усіх групах спостерігалися макробластомери, що виникли, імовірно, за рахунок злиття двох сусідніх клітин.
Цитоплазма бластомерів нативних ембріонів характеризувалася прозорістю і гомогенністю. Після кріоконсервування в ембріонах І і ІІ груп виникали дегенеративні зміни в цитоплазмі у вигляді агрегації гладкого ендоплазматичного ретикулуму, одного чи декількох вакуолеподібних утворень в центрі бластомера. В ембріонах І групи відзначали утворення великих “проломів” і розриви zona pellucida.
Для з'ясування залежності виживання від морфологічних характеристик ембріони поділяли на дві групи: нативні (n=52) і кріоконсервовані (n=53). Ембріони кожної групи були віднесені до одного з чотирьох типів категорії якості (тип фрагментації) за процентним вмістом цитоплазматичних фрагментів: перша – ембріони з бластомерами сферичної форми, які щільно прилягають один до одного, мають світлу дрібнозернисту цитоплазму, інтактну zona pellucida без цитоплазматичних фрагментів; друга – ембріони з нерівними бластомерами з фрагментацією, що не перебільшує 10%; третя – ембріони з фрагментацією цитоплазми небільш 50% та інтактною zona pellucida; четверта фрагментація цитоплазми ембріонів більш 50%.
Таблиця 1
Морфологічні характеристики ембріонів людини до і після кріоконсервування
Характеристика ембріонівЕмбріони, %
І група
n =163 | ІІ група
n =166 | ІІІ група
n =157 | До заморожування | Після відігріванняДо заморожування | Після відігріванняДо заморожування | Після відігріванняБластомери інтактні | 96,70,7 | 52,15,1 | 97,10,9 | 60,50,5 | 96,30,3 | 85,40,6** | Однаковий розмір бластомерів | 85,90,1 | 62,82,8 | 88,60,7 | 65,20,8 | 89,71,7 | 67,82,1* | Наявність не більш 25% цитоплазматичних фрагментів83,13,2 | 43,81,0 | 85,40,6 | 68,81,0 | 82,20,2 | 78,90,9* | Прозорість і гомогенність цитоплазми | 96,20,2 | 69,71,7 | 67,82,1 | 59,50,8 | 98,10,1 | 96,51,5** | Наявність цитоплазматичних вакуолей | - | 12,20,2 | - | 4,70,7*** | - | -
Разрив zоna pellucida | - | 8,10,1 | - | 1,21,2 | - | - | Щільний міжклітинний контакт | 97,60,4 | 96,91,1 | 95,70,3 | 84,90,6 | 96,91,1 | 95,70,3 | Примітки:
1. * у порівнянні з ембріонами після кріоконсервування І і ІІ груп, p<0,05;
2. ** у порівнянні з ембріонами після кріоконсервування І і ІІ груп, p<0,01;
3. *** у порівнянні з І групою, p<0,001;
4. ознака відсутня.
Ембріони досліджуваних груп кріоконсервували. Після деконсервації проводили морфологічну оцінку збереження ембріонів методом світлової мікроскопії.
Ембріони без фрагментації цитоплазми мали високий рівень виживання після кріоконсервування. Картина фрагментації ембріонів першого типу статистично не відрізнялася до і після кріоконсервування. Після кріоконсервування вірогідно зростала кількість ембріонів із третім і четвертим типами фрагментації за рахунок лізису бластомерів, які були оточені фрагментованими ділянками.
Середня кількість бластомерів в ембріонах першого типу складала 3,70,3. Після кріоконсервування загальна кількість бластомерів знизилася за рахунок їх руйнування або за рахунок додаткової фрагментації ділянок цитоплазми (табл. 2). У зв'язку з цим вірогідно зросла загальна кількість ембріонів з третім і четвертим типами фрагментації.
Слід звернути увагу на факт зниження загальної кількості бластомерів при підвищенні ступеня фрагментації. Так, середня кількість бластомерів для першого-четвертого типів склала 3,20,7, 2,90,9, 2,20,8 і 0,80,6 відповідно. Через 48 год культивування загальна кількість бластомерів у нативних і кріоконсервованих ембріонів першого і другого типів статистично зрівнялася, тоді як для ембріонів третього і четвертого типів була характерна інша картина розвитку.
Таблиця 2
Загальна кількість бластомерів в ембріонах людини з різним типом фрагментації цитоплазматичних ділянок
Тип фраг-ментації | Час культивування, год | Контроль | Кріоконсервовані ембріони, Mm | 24 | 48 | 24 | 24 | 48 | До кріоконсервування |
Після відігрівання
Перший | 3,70,3 | 6,70,6 | 3,70,3 | 3,20,7 | 6,11,5 | Другий | 3,60,3 | 6,20,9 | 3,60,4 | 2,90,9 | 5,41,9 | Третій | 3,40,4 | 5,50,7 | 3,20,4 | 2,20,8* | 3,91,7*
Четвертий | 2,00,6 | 2,60,9 | 2,60,6 | 0,80,6* | 1,00,8**
Примітки:
1. * достовірні відмінності від контролю й ембріонів досліджуваної групи до кріоконсервування, р <0,05;
2. ** достовірні відмінності від контролю й ембріонів досліджуваної групи до кріоконсервування, р <0,001.
Оскільки фрагментація цитоплазматичних ділянок 4-клітинних ембріонів впливає на їх виживання, а також, з огляду на той факт, що перші ділення дроблення преімплантаційних ембріонів людини мають асинхронний характер, який може впливати на їх виживання після кріоконсервування, об'єктом дослідження були обрані зиготи.
Облік морфології ядерець має істотне значення в морфофункціональній оцінці стану клітини, оскільки з ядерцями пов'язані процеси транскрипції і трансформації рибосомальної РНК (Braude P., 2002). З огляду на цей факт зиготи були розділені на чотири типи:
перший зигота з рівною кількістю нуклеолей, які знаходяться у зоні контакту пронуклеусів;
другий зигота з рівною кількістю нуклеолей, які розсіяні у площині пронуклеусів;
третій зигота з різною кількістю нуклеолей в пронуклеусах;
четвертий – зигота з нерівними пронуклеусами.
У даному дослідженні контрольну групу склали 149 зигот, І і ІІ по 113, ІІІ 80. Через 24 год у контрольній групі нормальний розвиток продемонстрували більш 87,85,1% клітин з першим типом морфології пронуклеусів. Аналогічні дані були характерні для ІІ групи, у той час як зиготи, кріоконсервовані через 18 год після інсемінації (І група), розвилися в нормальні ембріони тільки в 251,5% випадків. Інші були або заблоковані на стадії зиготи, або характеризувалися високим ступенем фрагментації цитоплазми. Подібна картина спостерігалася при подальшому розвитку зигот, кріоконсервованих через 26 год після инсемінації. Аналогічні результати були характерні для другого типу організації пронуклеусів (табл. 3).
Таким чином, на підставі отриманих даних можна зробити висновок про перспективність кріоконсервування зигот через 22 год після інсемінації, коли чітко візуалізуються два пронуклеуси. У цей час зигота знаходиться в G2 фазі клітинного циклу (Balakier H., 1993). Ранні зиготи і зиготи на стадії, яка передує мітозу, найбільш чутливі до дії ушкоджуючих факторів кріоконсервування.
Об'єктивним критерієм морфофункціональної цілісті кріоконсервованих ембріонів є їх здатність до поновлення мітозу і дроблення in vitro до стадії бластоцисти (Landgley M., 2001).
Вивчали швидкість морфогенетичного розвитку і порівнювали кількість бластомерів в еквівалентних стадіях формування бластоцисти нативними і деконсервованими ембріонами.
Ембріони були розділені на дві групи: І - ембріони культивували 120 год, ІІ – ембріони кріоконсервували на стадії 4-х бластомерів, після відтаювання культивували in vitro.
Таблиця 3
Морфологічні характеристики ембріонів після 24 год культивування
нативних і кріоконсервованих зигот людини
з різним типом морфології пронуклеусів та різним терміном запліднення
Тип
зигот | Нативні ембріони (контроль), % | Кріоконсервовані ембріони , %
1 і 2 категорії якості | 3 і 4 категорії якості/блок | І група (18 год після інсемінації) | ІІ група 22 год після інсемінації) | ІІІ група (26 год після інсемінації) | 1 і 2 категорії якості | 3 і 4 категорії якості/блок | 1 і 2 категорії якості | 3 і 4 категорії якості/блок | 1 і 2 категорії якості | 3 і 4 категорії якості/блок | Перший | 87,85,1 | 12,20,9 | 25,01,5* | 75,16,8 | 80,05,5 | 200,9 | 14,30,9* | 85,78,1 | Другий | 81,67,7 | 18,40,3 | 14,30,9* | 85,75,5 | 68,24,9 | 31,82,9 | 17,41,1* | 82,67,8 | Третій | 58,84,2 | 41,23,8 | 0,30,01* | 99,78,8 | 43,53,3 | 56,55,2 | 4,30,3* | 95,68,8 | Четвертий | 52,05,0 | 48,04,0 | 0** | 100 | 12,50,8** | 87,56,6 | 0** | 100 |
Примітки:
1 * достовірні відмінності від контролю й ембріонів третьої групи, р <0,05;
2. ** достовірні відмінності від контролю, р <0,001.
Показник формування бластоцист розраховували як відношення ембріонів, що сформували бластоцисти, до загальної кількості ембріонів. Усього було аспіровано 334 і 342 ооцитів, що складало 11,50,8 і 12,70,8 ооцитів на пацієнтку (р>0,05). Запліднилося 81,21,7 і 83,32,4% ооцитів відповідно (p<0,05). З 156 невикористаних для перенесення ембріонів контрольної групи 501,2% досягли стадії бластоцисти.
Після кріоконсервування 163 ембріонів ІІ групи, які були не використані для ембріоперенесення, 9,80,23% цілком зруйнувалися, у 11,01,4% виживання склало менш 50%, в інших ембріонах (78,91,6%) більш 50% бластомерів були інтактними. Після культивування стадії бластоцисти досягли 14,60,6% ембріонів, що вірогідно нижче, ніж у І групі (p<0,001). При 100%-му збереженні бластомерів вихід бластоцист був найбільшим - 54,21,4%, порівнянно з кількістю бластоцист, сформованих нативними ембріонами.
Частота досягнення стадії “вилуплення” бластоцисти для нативних ембріонів вірогідно вища, ніж для кріоконсервованих. У той же час еквівалентні стадії розвитку характеризуються різною кількістю бластомерів.
Кріоконсервовані ембріони демонструють прискорені темпи дроблення в порівнянні з нативними. Так, якщо рання бластоциста нативних ембріонів характеризується наявністю 54,02,5 бластомерів, то після кріоконсервування кількість бластомерів зростала до 63,12,1 (p<0,05).
Для кавітованої бластоцисти середня кількість бластомерів складала 65,42,1, для кріоконсервованих ембріонів цей показник збільшився до 82,23,6 (p<0,01). Для бластоцист в стадії “вилуплення” вірогідно зростає розходження в середній кількості клітин на бластоцисту для нативних і кріоконсервованих ембріонів відповідно 872,6 і 1254,5 (р<0,001) (рис.1).
Таким чином, кріоконсервування впливає на швидкість морфогенетичного розвитку, який виражається в збільшенні кількості бластомерів у бластоцисті. Однак фактори кріоконсервування зменшують здатність ембріонів до вивільнення з zona pellucida, що вимагає проведення процедури допоміжного “вилуплення”.
Цитогенетичний і молекулярно-генетичний аналіз нативних і кріоконсервованих ембріонів людини. Проаналізовано 268 фіксованих препаратів нативних ембріонів (контроль) і 284 кріоконсервованих. Виявлено наявність інтерфазних і каріокінетичних ядер у ембріонів контрольної групи, що пояснюється асинхронністю протікання клітинних циклів. Кількість патологічних мітозів у преімплантаційних ембріонах експериментальної групи (13,0%) була вища, ніж у контрольної (4,8%), однак спектр патологічних мітозів був іншим. У нативних ембріонах патологія мітозів була пов'язана з ушкодженням хромосом. Серед патологічних мітозів, що спостерігаються у кріоконсервованих ембріонах, виявлялися ушкодження хромосом (хроматидні мости; сповільнення руху хромосом у метакінезі; утворення мікроядер) і ушкодження мітотичного апарату (трехполюсний і моноцентричний мітози; зім’ята і грудкувата метафази). Слід зазначити, що найбільш частими патологіями мітозу були набрякання і злипання хромосом.
Після цитологічного дослідження з’ясовано, що більшість бластомерів контрольних ембріонів знаходилася в стадії інтерфази мітозу, мала виражені базофільні ядра, у яких чітко проглядалися ядерця. Так, 89,30,5% бластомерів знаходилися в інтерфазі, 5,00,5% на ранній профазі мітозу 4,10,5% бластомерів перебували в стадії метафази мітозу. У контрольних препаратах кількість пікнотично змінених ядер склала 1,60,3%. Слід звернути увагу на зміну цитологічної картини у ембріонів після кріоконсервування у бік зменшення кількості бластомерів в інтерфазі (71,20,7%) і збільшення клітин на ранній профазі мітозу 18,10,8%. На стадії метафази мітозу знаходилося 3,10,05% клітин. Після кріоконсервування кількість пікнотичних ядер збільшилася до 7,60,4%, що може свідчити про загибель внутрішньоклітинних структур і некротичні процеси, які відбуваються в клітині після кріоконсервування.
Для цитогенетичного аналізу методом каріотипування виявилися придатними 57,51,6% нативних і 60,31,5% кріоконсервованих ембріонів. В інших випадках спостерігали дегенеративні зміни (конденсація чи деспіралізація хроматину, злипання хромосом); у 68,1% випадків нативні ембріони мали нормальний диплоїдний набір хромосом (рис.2); у 26,9% - були анеуплоїдними. Мозаїчними вважали 2,5% ембріонів (табл. 4). При аналізі ембріонів людини після кріоконсервування встановлено, що нормальні метафазні пластинки візуалізувалися у 42,1% випадків, частота поліплоїдії збільшилася до 7%, анеуплоідії - до 27,2%, мозаїцизму - до 23,7% .
Таблиця 4
Результати цитогенетичного аналізу ембріонів людини до і після кріоконсервування
Каріотип | Кількість ембріонів,n,%
Контроль | Кріоконсервовані | Диплоїдія | 46,ХХ;
46,ХУ
45-48 <2n>,ХХ
44-47<2n>,ХХ | 34
44
2
1 | 19
28
1
0 | Всього | 81 (68,1) | 48 (42,1) | Поліплоїдія | 69, ХХХ
92, ХХХУ
68-71, <3n>XXX
65-70, <3n>ХХ?
90-94, <4n>ХХХУ? | 2
1
0
0
0 | 3
2
1
1
1 | Всього | 3 (2,5) | 8 (7,0) | Анеуплоїдія | Гіперплоїдія | 47, XY, +C
47, ХХ, +Е
47, ХХ, +F
47,ХХ,+G
48,XX, +E,+E
48,XY,+C,+E
49,ХХ,+Е,+F,+G
51, XX,+B,+D,+E,+F,+G | 3
3
3
1
1
1
1
0 | 2
4
0
1
1
0
0
1
Всього | 13 (10,9) | 9 (7,9)
Гіпоплоїдія | 45,XX,-D
45,XX,-G
44,ХХ,-А,-В
43,ХУ, - А,-В,-С
40,ХУ?,-А,-В,-С,-E,-F,-G
43, XX, -F,-F,-G
43,XX,-E,-E,-F
43,XY,-E,-E,-F
43,XY?,-D,-E,-G
43,XX,--E,-E,-G,-G
42,XX,-F,-F,-G,-G
40,XY?,-A,-B,-D,-E,-F,-G
47,ХХ,+А,+В,+С | 1
2
4
1
2
2
0
0
2
1
1
1
0 | 0
0
1
1
2
4
3
4
3
1
0
0
2 | Всього | 17 (14,3) | 21 (18,4) | Комбіновані випадки | 45,ХХ,?+С,+D,-D,-F,-G
44XX, +D,-F,-G,-G | 0
2 | 1
0
Всього: | 32 (26,9) | 31 (27,2)
Мозаїцизм | Диплоїдні мозаїки:
1) хаотичні мозаїки
2) 2n/pol
3)мітотичні анеуплоїди:
а)мітотичне нерозходження хромосом
б)мітотичний анафазний міст
в)ендоредуплікація |
2
1
0
0
0 |
9
8
1
2
2 | Поліплоїдні мозаїки | 0 | 5 | Гаплоїдні мозаїки | 0 | 0 | Всього | 3 (2,5) | 27 (23,7) | Всього: | 119 (100) | 114 (100) |
Серез 7 груп хромосом найбільш часто анеуплоідія виникала за рахунок нерозходження хромосом груп Е, F і G, що було характерним як до, так і після кріоконсервування ембріонів. Частота аномального розходження хромосом груп А, С+Х и D була вірогідно нижча теоретично очікуваної, а груп E, F і G - вища (р<0,05) (табл. 5).
Таблиця 5
Частота аномальної розбіжності серед 7 груп хромосом нативних і кріоконсервованих ембріонів людини
Досліджувані групи ембріонів | Групи хромосом
A | B | C+X | D | E | F | G | Всього
Нативні, % | 10,4 | 10,4 | 9,1 | 7,8 | 18,2 | 19,5 | 24,7 | 100
Кріоконсервовані, % | 6,8 | 8,0 | 9,1 | 6,8 | 31,8 | 21,6 | 15,9 | 100
Очікувана частота, % | 13,0 | 8,7 | 34,9 | 13,0 | 13,0 | 8,7 | 8,7 | 100
Примітка:
* - теоретично очікувана частота розраховувалася з урахуванням того, що хромосоми різних груп мають однакову імовірність аномальної розбіжності.
Встановлено збільшення нерозходження хромосом груп E і F в ембріонах людини після кріоконсервування.
Враховуючи труднощі щодо одержання повноцінних препаратів метафазних хромосом і той факт, що патології мітозу можуть носити зворотній характер, було здійснено молекулярно-генетичний аналіз інтерфазних хромосом методом флюоресцентної гібридизації in situ.
Проведено FISH-аналіз 10 ембріонів людини після 48 год культивування in vitro: 3 ембріони першої категорії якості перебували в стадії 4-х бластомерів, 7 ембріонів (першої і другої категорій якості) - на стадії 8-ми бластомерів. Всі ембріони були зафіксовані і пройшли успішну гібридизацію. FISH-аналіз був можливий у 32 бластомерах (табл. 6).
Кріоконсервували 20 ембріонів першої категорії якості (чіткі, рівні бластомери однакової величини, відсутність фрагментації). На стадії 2-х бластомерів знаходилися 5 ембріонів (25%), на стадії 4-х бластомерів - 10 (50%) і на стадії 8-ми бластомерів - 5 (25%).
Після кріоконсервування 16 ембріонів зберегли 50% інтактних бластомерів, у 4-х ембріонах спостерігали повний лізис бластомерів. Таким чином, частота виживання ембріонів склала 80%.
За результатами аналізу інтерфазних ядер 80% нативних і 63,7% кріоконсервованих ембріонів мали нормальний каріотип. Поліплоїдні мозаїки (тетра- і гексаплоїдні клітинні лінії) були виявлені у 18,2% ембріонів після кріоконсервування. Частота анеуплоїдії по 13, 18, 21 і 22-й хромосомах у нативних і кріоконсервованих ембріонах статистично не відрізнялась (р>0,05).
Таблиця 6
Цитогенетичний аналіз ембріонів людини до кріоконсервування методом FISH-аналізу
Номер ембріона | Кількість клітин | Кількість FISH-сигналів у хромосомах | Діагностика ембріона | 13 | 18 | 21 | 16 | 22 | 1 | 4 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | Норма | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | Норма | 3 | 1 | 3 | 2 | 2 | 0 | 2 | Комплексний мозаїк | 1 | 2 | 3 | 2 | 2 | 4 | 1 | 2 | 2 | 1 | 2 | 3 | 1 | 1 | 2 | 3 | 0 | 1 | 4 | 6 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | Норма | 5 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | Норма | 6 | 1 | 3 | 3 | 1 | 3 | 3 | Комплексний мозаїк | 2 | 2 | 2 | 0 | 2 | 2 | 1 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 7 | 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | Норма | 8 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | Норма | 9 | 2 | 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | Норма | 10 | 5 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | Норма |
Успішна гібридизація була здійснена у 11 ембріонах (68,8%), FISH-аналіз був можливий у 37 бластомерах (табл. 7).
Таблиця 7
Цитогенетичний аналіз ембріонів людини після кріоконсервування методом FISH-аналізу
Номер ембріона | Кількість клітин | Кількість FISH-сигналів у хромосомах | Діагностика ембріона | 13 | 18 | 21 | 16 | 22 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | Норма | 2 | 1 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | Тетраплоїд 4N | 3 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | Комплексний мозаїк | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 2 | 1 | 0 | 4 | 7 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | Норма | 5 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | Норма | 6 | 3 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | Комплексний мозаїк | 2 | 2 | 2 | 2 | 0 | 2 | 1 | 0 | 2 | 0 | 0 | 2 | 1 | 1 | 2 | 1 | 3 | 2 | 1 | 2 | 4 | 4 | 2 | 2 | 7 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | Норма | 1 | 2 | 2 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 3 | 2 | 8 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2
