МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ПОПОВА НАТАЛЯ ГЕННАДІЇВНА

УДК 616.98:578.825:612.648

РОЛЬ ГЕРПЕСВІРУСІВ ПРИ МАТЕРИНСЬКО-

ПЛОДОВІЙ ІНФЕКЦІЇ І СИСТЕМА

ПРОГНОЗУВАННЯ СТУПЕНЯ РИЗИКУ

ПЕРЕДАЧІ ГЕРПЕСВІРУСНОЇ ІНФЕКЦІЇ

НОВОНАРОДЖЕНОМУ

03.00.06 – вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті мікробіології та імунології імені І.І. Мечникова АМН України.

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор

Панченко Людмила Олександрівна,

Інститут мікробіології та імунології
імені І.І. Мечникова АМН України,

завідувач лабораторії вірусних інфекцій.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дзюблик Ірина Володимирівна,

Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України,

завідувач кафедри вірусології;

доктор медичних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України

Щербінська Алла Михайлівна, Інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л.В. Громашевського АМН України, головний науковий співробітник

лабораторії загальної вірусології.

Провідна установа

Дніпропетровська державна медична академія, кафедра мікробіології,

вірусології та імунології, МОЗ України, м. Дніпропетровськ.

Захист відбудеться “20” квітня 2006 р. о 15.30 годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.01 при Національному

медичному університеті імені О.О. Богомольця за адресою: 03057,

м. Київ, проспект Перемоги, 34, санітарно-гігієнічний корпус, аудиторія №2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету

імені О.О. Богомольця за адресою: 03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1.

Автореферат розісланий “17 ” березня 2006 р.

Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Войцеховський В.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Кінець XX-го та початок XXI-го століть характе-ризуються зростанням вірусних захворювань, що в 90-х роках вже були від-не-сені до переліку хвороб, які в наступні нові епохи визначатимуть “обличчя” інфекційних хвороб людства [Collier L., 1996; Захаров Ю.А., 2000]. Серед найбільш розповсюджених вірусних захворювань сучасного періоду є герпесвірусні інфекції (ГВІ). Вони викликаються збудниками родини Herpesсеред яких значна частка належить вірусу простого герпесу (ВПГ).

За даними глобального огляду досліджень герпесвірусної патології, майже 90-100% дорослого і дитячого населення після п’яти років життя в усіх країнах світу інфіковані вірусом простого герпесу [Malkin J.E., 2004; Weiss H., 2004]. В країнах СНД на хронічні герпесвірусні інфекції хворіють не менше 22-х мільйонів людей [Исаков В.А. и др., 1999; Кускова Т.К., Белова Е.Г., 2004].

Захворювання, які спричинені герпесвірусами, посідають друге місце (15,8%) після грипу (35,8%) серед причин смертності від вірусних інфекцій [Гранитов В.М., 2001]. Особливо високий рівень смертності (до 80%) спостерігається серед новонароджених дітей, які хворіють на герпесвірусні менінгіти і енцефаліти, а також дисемінованими формами захворювання, якщо вони своєчасно не розпізнаються і не здійснюється специфічне лікування антигерпетичними препаратами [Кудашов Н.И. и др., 1997; Kimberlin D.W., 2004; Whitley R., 2004; Xavier A.F. et al., 2005].

Значному зростанню хворих на ГВІ в світі, в т.ч. в Україні, сприяють різноманітні фактори: різке погіршення навколишнього середовища в останні роки, широке безконтрольне застосування препаратів з імуносупресивною дією та ін. Цьому сприяє і властивість вірусу, здатного до персистенції в організмі на протязі всього життя і реактивації його під впли-вом різноманітних екзо- та ендогенних факторів [Whitley R.J., Sandstrom E., 1995]. В умовах кризової демографічної ситуації в Україні, коли рівень смертності перевищує народжуваність, що є загрозою існування генофонду держави, особлива увага повинна бути направлена на охорону материнства і дитинства [Лукьянова Е.М., 2001].

Численними дослідженнями вітчизняних і зарубіжних дослідників встановлена значна роль герпесвірусів (ВПГ, ЦМВ) в розвитку материнсько-плодової інфекції (МПІ) [Ismail M.A., 1992; Арестова И.М., 1993; Чуприна В.А., 1994; Толкач С.Н. і співавт., 2001; Brown Z., 2004; Kimberlin D.W.,2004]. Відомо, що здоров’я новонародженої дитини формується під час її внутрішньоутробного розвитку і в значній мірі залежить від характеру взаємовідносин між матір’ю і дитиною. Наявність клінічно-маніфестної або прихованої ГВІ під час вагітності та пологів у матері є фактором ризику для нормального розвитку плоду та стану здоров’я дитини після народження [Malkin J.E., Beumont M.G., 1999; Ясиновская М., 2000; Eskild A. et al., 2000]. Тому, для запобігання розвитку внутрішньоутробної та неонатальної герпесвірусної інфекції важливе значення має своєчасне виявлення хворих та вірусоносіїв серед вагітних жінок і породіль. Незважаючи на велику кількість наукових робіт, присвячених вивченню МПІ, дотепер існує широке коло ще невирішених і мало досліджених питань. Серед них найбільшої уваги заслуговує встановлення лабораторно-діагностичних критеріїв ГВІ у вагітних жінок та розробка алгоритму комплексного дослідження жінок з високим ризиком розвитку і передачі ВПГ-інфекції плоду і новонародженому, а також недостатньо даних відносно частоти ГВІ у вагітних жінок та ін.

Не повністю вивчено патогенез ГВІ, особливо на клітинному і тканинному рівнях, відсутні комплексні вірусно-морфологічні дослідження органів антенатально загиблих плодів та плаценти інфікованих герпесвірусом жінок-породіль.

Важливою задачею є також розробка системи прогнозування ступеня ризику розвитку внутрішньоутробної інфекції у новонароджених. В системі прогнозування, яка розроблена і використовується в Росії [Офенгейм М.Л. з співавт., 2001], враховуються тільки морфологічні ураження плаценти жінок-породіль. Розробка та використання вітчизняної більш досконалої системи комплексного вірусно-морфологічного прогнозування ступеня ризику передачі ГВІ новонародженому пов’язана з необхідністю зниження частоти випадків невиношування вагітності, вад розвитку плодів і мертвонародженості у інфікованих герпесвірусами вагітних жінок, інвалідизації та ранньої дитячої смертності новонароджених дітей.

Таким чином, вищенаведеними даними вітчизняних та закордонних дослідників обґрунтовується актуальність і пріоритетність вивчення герпес-вірусної патології та розробки ефективних засобів профілактики МПІ. Вирі-шення поставлених в роботі задач відповідає потребам наукової і практичної медицини і буде сприяти подальшому розвитку охорони здоров’я матері і дитини у рамках національних програм “Планування сім’ї” та “Діти України”.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у рамках науково-дослідних робіт за темами: “Вірусологічний моніторинг за герпесвірусами (HSV-1, HSV-2 і CMV) і вивчення їх ролі в розвитку материнсько-плодової інфекції, захворюваності дітей молодшого віку та юнаків для підвищення якості лікувально-діагнос-тичного процесу” (шифр ЦФ 4.33.99, № держреєстрації 0199U003172, термін виконання 01.1999–12.2001 рр.); “Система комплексного вірусно-морфоло-гіч-ного прогнозування ризику розвитку внутрішньоутробної герпесвірусної (HSV, CMV) інфекції у новонароджених дітей” (шифр АМН 48/2002, № держреєстрації 0102U001571, термін виконання 01.2002–12.2004 рр.). НДР виконувались в лабораторії вірусних інфекцій Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України і фінансувались із бюджету МОЗ та АМН України. Дисертант був виконавцем окремих фрагментів вищезазначених тем. Мета і завдання дослідження. Мета роботи: з’ясувати роль герпесвірусів в розвитку материнсько-плодової інфекції і розробити систему прогнозування ступеня ризику передачі герпесвірусної інфекції від інфікованої матері новонародженому.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні задачі:

1. Визначити та запропонувати найбільш значущі лабораторно-діагностичні критерії ВПГ-інфекції у жінок репродуктивного віку та в період вагітності.

2. Встановити частоту ВПГ-інфекції у вагітних жінок м. Харкова та Харківської області, виявити групи ризику щодо розвитку материнсько-плодової інфекції.

3. Розробити схему комплексного обстеження жінок репродук-тив-ного віку та алгоритм обстеження вагітних з групи ризику на герпесвірусну (ВПГ 1/2 , ЦМВ) інфекцію.

4. В експерименті in vitro на перещеплюваній культурі клітин вивчити морфологічні зміни під впливом вірусу простого герпесу I-го типу.

5. Провести вірусологічні дослідження на герпесвіруси (ВПГ1/2) в тканинах антенатально загиблих плодів та проаналізувати морфологічні зміни в плаценті інфікованих вірусом простого герпесу жінок-породіль.

6. Розробити систему прогнозування ступеня ризику передачі вірусу простого герпесу від інфікованих матерів новонародженим дітям.

Об’єкт дослідження: частота виділення герпесвірусів при материнсько-плодовій інфекції та встановлення критеріїв прогнозування ступеня ризику інфікування герпесвірусами новонароджених.

Предмет дослідження: вірус простого герпесу І-го типу (ВПГ-1), штам “УС”, цитомегаловірус (ЦМВ), клінічний матеріал від вагітних жінок, тканини антенатально загиблих плодів, морфологічні зміни в посліді жінок-породіль з ВПГ-інфекцією.

Методи дослідження: вірусологічні, цитологічні, молекулярно-генетичні, морфологічні, ультразвукові, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на основі розроблених клініко-лабораторних критеріїв з урахуванням анамнестичних, клінічних, ультразвукових та лабораторних даних показана висока частота ВПГ-інфекції у жінок репродуктивного віку та вагітних, які мешкають м. Харкові та Харківської області. Вагітні жінки з обтяженим акушерським анамнезом, у яких в крові був виявлений ВПГ-антиген, низькоавідні Ig G або ДНК ВПГ, віднесені до групи високого ризику передачі ГВІ новонародженим.

Порівняння даних вірусологічного обстеження з найбільш характер-ними ультразвуковими ознаками МПІ дозволило доповнити і вперше віднести до найбільш характерних маркерних особливостей ВПГ-інфекції “незрілу плаценту” та дистрофічні зміни в провізорних органах плодів.

Розроблено і науково обґрунтовано схему комплексного клініко-лабораторного обстеження на ГВІ (ВПГ1/2, ЦМВ) жінок репродуктивного віку. Представлений також алгоритм обстеження вагітних жінок з високим ризиком передачі ВПГ-інфекції плоду і новонародженому, який є необхідним для пренатальної ідентифікації діагнозу і вибору правильної тактики нагляду за вагітними.

Отримані нові дані про характер деструктивних уражень ВПГ на клітинному та тканинному рівнях. В інфікованих культурах клітин через 36 годин після інфікування ВПГ відмічалось різке пригнічення мітотичної актив-ності та формування патологічних мітозів, що в подальшому призво-дило до появи цитопатичної дії (ЦПД) та повного руйнування моношару клітин.

На підставі виявлення вірусу в різних органах (легенях, печінці, нирках та головному мозку) підтверджена роль ВПГ в порушенні тканин органів плодів, які антенатально загинули. Знаходження ВПГ в плаценті вагітних жінок та одночасно в пуповинній крові загиблих плодів є підтвердженням трансплацентарної передачі вірусу від матері плоду.

Вперше розроблена система комплексного вірусно-морфологічного прогнозування ступеня ризику передачі ГВІ від інфікованої матері новонародженим дітям на підставі вірусологічного обстеження вагітних жінок та морфологічного дослідження плаценти і пуповини, а також досліджень материнської та пуповинної крові. Пріоритетність отриманих результатів досліджень підтверджена деклараційним патентом України №67413 A, “Спосіб прогнозування ступеня ризику передачі внутрішньо-утробної герпесвірусної інфекції новонародженому” / №2003098530; Опублік. 15.06.2004, Бюл. №6, 2004 р.

Практичне значення отриманих результатів. Сформульовані і реко-мендовані для практичного використання найбільш значущі лабораторно-діагностичні критерії герпесвірусної МПІ з урахуванням анамнестичних, клінічних, ультразвукових і лабораторних даних обстеження. Доведено необ-хідність проведення комплексного обстеження на ВПГ-інфекцію вагітних жінок, особливо з обтяженим акушерським анамнезом (ОАА), а також жінок репродуктивного віку з метою зниження ступеня ризику передачі захворювання плоду і новонародженому. Запропоновано схему комплексного обстеження на ГВІ (ВПГ 1/2 та ЦМВ) жінок репродуктивного віку, а також алгоритм обстеження жінок з високим ризиком передачі інфекції плоду і новонародженому в період вагітності на ВПГ-інфекцію. Рекомендовано для уточнення етіологічного діагнозу проведення вірусологічного дослідження органів антенатально загиблих плодів та плаценти інфікованих ВПГ жінок. Запропоновано нову систему прогнозування ступеня ризику передачі герпесвірусної інфекції від інфікованої матері новонародженим дітям.

Результати досліджень впроваджені у роботу кафедри неонатології Харківської медичної академії післядипломної освіти, а також у роботу пологового будинку №4 м. Харкова. Результати досліджень відображено у формі галузевих (медико-біологічних) нововведень:

1. Алгоритм комплексного обстеження подружніх пар на наявність герпесвірусної інфекції / Панченко Л.О., Торяник І.І., Бруснік С.В., Радченко О.О., Попова Н.Г. // Інформаційний бюлетень (додаток до Журналу Акаде-мії медичних наук України).-АМН України. -Київ, 2002.-Вип. 15.-С.29.

2. Система комплексного вірусно-морфологічного прогнозування ступеня ризику передачі внутрішньоутробної герпесвірусної інфекції новонародженому / Панченко Л.О., Торяник І.І., Бруснік С.В., Попова Л.О., Попова Н.Г., Радченко О.О., Короваєва І.В. //Інформаційний бюлетень (додаток до Журналу Академії медичних наук України).-АМН України.-Київ, 2005.-Вип. 21.-С. 55.

Для практичного використання надруковані та впроваджені в практику вірусологічної лабораторії ОблСЕС, епідеміологічного відділу СЕС на Південній залізниці та кафедри неонатології ХМАПО методичні рекомендації “Епідеміологія, клініка, лабораторна діагностика, лікування і профілактика цитомегаловірусної інфекції у дітей”,-МОЗ України.-Харків, 1999. - 35 с.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно проведено інформаційно-патентний пошук та аналіз наукової літератури за темою дисертації. Дослідження в рамках двох планових НДР, в межах наукової тематики яких виконана дисертаційна робота, проводились за особистою участю пошукача. Власноруч проведено імуноферментний скринінг ВПГ-антигену та специфічних низькоавідних антитіл Ig G у вагітних та жінок репродуктивного віку, а також виявлення ВПГ-антигену в органах антенатально загиблих плодів. Особисто проведені дослідження по визначенню мітотичної активності культури клітин під впливом штаму “УС” ВПГ-1. Здобувач брав участь у розробці схеми та алгоритмів клініко-лабораторного обстеження жінок дітородного віку та вагітних з високим ризиком передачі ГВІ плоду і новонародженому та написанні і оформленні патенту на спосіб прогнозування ступеня ризику передачі внутрішньоутробної ВПГ-інфекції новонародженому. Автором самостійно написано дві роботи, які опубліковані у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України. Здобувачем самостійно проведено систематизацію і узагальнення отриманих даних, їх статистичну обробку та сформульовано висновки.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на 1-му Конгресі неонатологів України (Харків, 1998 р.), міжнародному 11th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Disease (Стамбул, 2001 р.), конференції молодих вчених ХДМУ “Медицина III-го тисячоліття” (Харків, 2002 р.), науково-практичній конференції “Актуальні питання клінічної медицини” (Полтава, 2002 р.), IV Міждисциплінарній науково-практичній конференції “Епідеміологія, імунопатогенез, діагностика, лікування хламідіозу та TORCH-інфекцій” (Київ, 2002 р.), 1st FEMS Congress of European Microbiologists (Словенія,
2003 р.), X з’їзді товариства мікробіологів України (Одеса, 2004 р.), науково-практичній конференції з міжнародною участю, присвяченій 200-річчю з дня заснування Харківського державного медичного університету “Від фундаментальних досліджень до прогресу в медицині” (Харків, 2005 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи повністю відображені у 16 наукових працях, в тому числі 5 статтях у фахових журналах, що входять до переліку, затвердженого ВАК України, 11 тезах вітчизняних та міжнародних конференцій, методичних рекомендаціях, двох галузевих медико-біологічних нововведеннях та деклараційному патенті України на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, аналітичного огляду літератури, основної частини, яка включає опис матеріалів і методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків та списку використаної літератури. Бібліографічний покажчик складається з 224 джерел. Робота викладена на 125 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 14 таблицями, 20 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність проблеми, визначені мета, задачі, об’єкт і предмет дослідження, сформульовано наукову новизну, розкрито теоретичне та практичне значення роботи, визначено особистий внесок автора, наведені дані про апробацію отриманих результатів.

В огляді літератури представлені новітні погляди на герпесвіруси, їх власти-вості, патогенез та роль ВПГ при МПІ. Наведені сучасні концепції лабораторної діагностики ГВІ. Критичний огляд літератури висвітлив відсутність науково обґрунтованої інформації щодо сучасних лабораторно-діагностичних критеріїв ВПГ-інфекції серед вагітних жінок, вірусологічних досліджень на герпесвіруси в органах плодів при викиднях та абортах по медичним показникам, а також системи прогнозування ступеня ризику передачі внутрішньоутробної ГВІ інфекції новонародженим дітям. Ці ще невирішені питання зумовили необхідність проведення наукових досліджень з даної проблеми.

Матеріали та методи досліджень. Під час виконання роботи використано клінічний матеріал (кров, слина і сеча) від 397 жінок дітородного віку (з них 256 – вагітних жінок) віком від 18 до 38 років з різним терміном вагітності, в т.ч. вагітних з обтяженим акушерським анамнезом (ОАА), 44 зразків органів (головний мозок, легені, печінка, нирки) та кров із пуповини від 12 антенатально загиблих плодів, а також плацента жінок-породіль.

На специфічні герпесвірусні низькоавідні імуноглобуліни класу G обстежені вагітні жінки з ОАА (117 осіб) та без ОАА (47 осіб), в крові яких був виявлений ВПГ 1/2-антиген. 52 вагітні жінки (32 з ОАА та 20 без ОАА) з асимптоматичною МПІ обстежені на ДНК-ВПГ за допомогою ПЛР. Ультразвукова діагностика здійснювалася співробітниками Харківського спеціалізованого Медико-генетичного центру. Результати УЗД сумісно аналізувалися нами після проведення вірусологічних досліджень.

Поряд з виявленням маркерів ВПГ-інфекції проведено виявлення цитомегаловірусних клітин (ЦМК) в слині і сечі 108 вагітних жінок з МПІ і 37 вагітних жінок без МПІ (контрольна група) на ЦМВ-інфекцію.

Для виявлення герпесвірусних маркерів (ВПГ 1/2-антигену та низькоавідних Igдо нього) у обстежених вагітних та жінок репродуктивного віку, а також в 10% емульсії тканин органів (головного мозку, легень, печінки, нирок) плодів, які антенатально загинули, та плаценті жінок-породіль використовували імуноферментний метод (ІФА) з комерційними тест-системами “Герпес Скрин” російських біотехнологічних компаній “ЗАТ НИАРМЕДИК”, ЗАТ БТК “БИОСЕРВИС” (детекція антигену ВПГ 1 та 2 типів) та “Герпес-Диагност”, ЗАТ БТК “БИОСЕРВИС” (виявлен-ня вірусспецифічних низькоавідних антитіл класу Ig G), Москва (Росія). Тестування здійснювали на імуноферментному аналізаторі АІФ-Ц-01С. Визначали рівень оптичної щільності (ОЩ) в порівнянні з оптичною щільністю критичною (ОЩ крит. = 2хОЩк-) та обчислювали індекс авідності (ІА) антитіл. Наявність антитіл з ІА ? 35% свідчила про гостру первинну ВПГ-інфекцію, ІА 36-40% – про стадію реконвалесценції, ІА > 41% – про хронічну ВПГ-інфекцію.

Для підтвердження атипових і субклінічних форм ВПГ-інфекції сироватку крові вагітних жінок досліджували на наявність ДНК ВПГ за допомогою якісного методу ПЛР з використанням тест-системи “АмпліСенс-200 HSV-430” виробництва (“АмпліСенс”, Росія). Дослідження були проведені на базі клініко-діагностичної лабораторії міського пологового будинку з неонатологічним стаціонаром м. Харкова.

Для специфічного визначення цитомегаловірусних клітин в осадах слини і сечі використовували цитоскопічний метод.

Для пошуку та ідентифікації морфологічних маркерів у тканинах посліду жінок-породіль із ВПГ-інфекцією були використані морфологічні методи дослідження. З цією метою за допомогою мікроскопії (гістологічні методи) вивчали структурні зміни у тканинах зародкової та материнської частин плаценти, плацентарних оболонках, ендотеліальному шарі пуповинної вени.

Метод електронної трансмісійної мікроскопії був використаний для виявлення ультраструктурних змін у тканинах посліду жінок-породіль. Ультратонкі зрізи контрастували ураніл-ацетоном, цитратом свинцю, аналізували у електронному трансмісійному мікроскопі (ЕМБ-100 БР).

Для вивчення патогенезу ВПГ-інфекції на клітинному рівні визначали особливості морфологічних змін у інфікованій герпесвірусом перещеплюваній культурі клітин. У роботі було використано штам “УС” вірус простого герпесу 1-го типу (ВПГ-1) (IA–105 ТЦД50/мл). Вірус виділено у 1975 р. від хворого з ГВІ і зберігався в колекції вірусів Інституту вірусології ім. Д.І. Івановського РАМН (Москва, Росія). Для дослідження вірус був люб’язно наданий к.б.н. Кривохатською Л.Д. (Інститут отоларингології ім. О.С. Коломійченко АМН України). В лабораторії вірус був адаптований до перещеплюваної культури клітин коронарних судин теляти (КСТ), на якій титр його складав 4,0 lg ТЦД50/мл.

Для визначення морфологічних змін в культурі клітин КСТ під впливом штаму “УС” ВПГ-1 досліджували мітотичну активність (МА) в різні строки репродукції вірусу – через 18, 24, 36 і 48 годин. В інфікованих клітинах після їх фіксації та фарбування гематоксиліном Карачі визначали МА в проміллє (0/00). Одночасно виявляли кількість патологічних мітозів, їх окремі форми стосовно загальної кількості, що приймали за 100%.

При статистичній обробці отриманих результатів використовували загальнові-домі методи рядової і альтернативної варіаційної статистики. Застосовували параметричний метод оцінки відмінностей середніх двох вибірок за критерієм Ст’юдента (t), використовуючи програмно-математичний комплекс для ПК МS Ехсеl 98 та пакет прикладних програм “Statgraphics”. Розраховували середнє арифметичне (або середньо-логарифмічне) (М), стандартну похибку (m) та вірогідність відмінностей між окремими показниками у групах (р).

Результати досліджень та їх обговорення. В роботі представлені дослідження, проведені по чотирьом напрямкам, які відобразили вивчення ролі ГВІ при МПІ в залежності від чотирьох ключо-вих моментів: розробці лабораторно-діагностичних критеріїв для встановлення діагнозу герпесвірусної МПІ, визначення здатності ВПГ викликати морфологічні зміни в інфікованих клітинах, вірусологічному ушкодженню тканин різних органів при внутрішньоутробному інфікуванні плодів і розробці системи комплексного вірусно-морфологічного прогнозування ступеня ризику передачі ГВІ від інфікованої матері новонародженому.

Визначення лабораторно-діагностичних критеріїв герпесвірусної МПІ. За допомогою імуноферментного методу (виявлення ВПГ1/2-антигену) при обстеженні 256 вагітних жінок та виявлено високий рівень їх інфіку-вання ВПГ (64,0±3,0%), особливо у вагітних з ОАА (79,6±3,3%), P<0,01. У 1/3 із 141 обстеженої жінки репродуктивного віку також детектований ВПГ 1/2-антиген з більш високим показником виявлення у жінок з ОАА (39,7±5,9%), P<0,05. Ці дані підтвердили необхідність виділення жінок з виявленим ВПГ-антигеном в крові у групи підвищеного ризику розвитку несприятливого перебігу вагітності, пологів і можливості передачі ГВІ плоду, а також новонародженому. При цьому звертає на себе увагу, що тільки у 1/3 вагітних жінок і у 1/4 жінок репродуктивного віку із анамнезу вдалося з’ясувати наявність рецидивуючої ВПГ-інфекції різної локалізації та з різною частотою рецидивування. На момент проведення лабораторного обстеження більшість жінок почували себе здоровими, скарг не пред’являли, незважаючи на лабораторно встановлений факт виявлення в крові ВПГ.

Для уточнення первинної або рецидивуючої форми перебігу ВПГ-інфекції було проведено дослідження з виявлення низькоавідних Igу вагітних жінок з наявністю та без ОАА, у яких в крові був виявлений ВПГ-антиген. Специфічні Ig G виявлено у більш значної кількості вагітних жінок з ОАА в порівнянні з жінками без ОАА (85,5±3,2% і 68,0±4,7% відповідно, р<0,05). У більшості вагітних (у 108 із 164 обстежених жінок, 65,9±3,7%) в сироватці крові були виявлені високоавідні Igщо є підтвердженням перенесеної ними ВПГ-інфекції в минулому.

Приведені факти свідчать про високий рівень перебігу ВПГ-інфекції у латентній або субклінічній формі та придатність для вірусологічного скринінгу і моніторингу методу ІФА. Однак, при порівнянні двох методів (ІФА і ПЛР), які були використані для діагностики ВПГ-інфекції, більш результативною була ПЛР, за допомогою якої вдалося виявити на 9-10% більше інфікованих ВПГ серед вагітних.

При проведенні досліджень нами було враховано значення при МПІ другого важливого герпесвірусу з групи TORCH-комплексу– цитомегаловірусу (ЦМВ). За допомогою цитоскопічного методу були обстежені 108 вагітних з підозрою на МПІ та, як контроль, група вагітних (37 жінок), які при ультразвуковому обстеженні не мали ознак МПІ. Встановлено, що у вагітних жінок з МПІ в 5 разів частіше були знайдені ЦМК в осадах слини, ніж в сечі. У вагітних жінок без ознак МПІ в осадах слини і сечі ЦМК були знайдені у невеликої кількості осіб. Наявність ультразвукових ознак МПІ та виявлення ЦМК в слині або сечі вагітних, навіть при відсутності клінічних проявів інфекції, нами було розцінено як латентна форма ЦМВ-інфекції.

Вагітні жінки з виявленою ЦМВ-інфекцією також, як і при ВПГ-інфекції, були віднесені до групи осіб з підвищеним ризиком передачі захворювання плоду і підлягали підвищеній увазі лікарів.

Важливим питанням наших досліджень було окреслення найбільш інформативних ультразвукових показників при вірусному ураженні плоду. Аналіз ультразвукових ознак МПІ у 45 вагітних з лабораторно підтвердженим ВПГ-захворюванням показав, що, поряд з іншими ознаками найбільш часто у інфікованих плодів зустрічались гепатомегалія, вентрикуломегалія, гіпоплазія грудної клітки. Перелічені ознаки МПІ, які викликані ВПГ, були доповнені такою ознакою як “незріла плацента”, а при дослідженні провізорних органів плодів – маловоддям, що зустрічалося у 28,9±6,8%.

На основі проведених досліджень встановлені основні критерії герпесвірусної МПІ, які включають: анамнестичні, клінічні, ультразвукові та лабораторні ознаки.

Для підвищення ефективності виявлення ВПГ і ЦМВ інфікованих розроблено схему комплексного обстеження жінок репродуктивного віку на ГВІ, яке має важливе значення для підготовки до запланованої вагітності з метою запобігання герпесвірусних захворювань (рис. 1). Крім того, розроблений алгоритм обстеження на ВПГ-інфекцію вагітних жінок з різним сероімунологічним статусом (рис. 2) та алгоритм прогнозування наслідків внутрішньоутробної ВПГ-інфекції плоду і новонароджених.

1. 2. 3. 4.

Рис. 1. Схема комплексного клініко-лабораторного обстеження жінок репродуктивного віку на

герпесвірусну (ВПГ, ЦМВ) інфекцію.

Рис. 2. Алгоритм обстеження вагітних жінок на ВПГ- інфекцію.

Використання запропонованих алгоритмів дозволяє своєчасно виявляти вагітних з високим інфекційним ризиком, запобігати ускладненням у матері і плоду, здійснювати цілеспрямовані лікувальні і профілактичні заходи для реального зниження рівня захворюваності у матерів та новонароджених.

Вірусно-морфологічні зміни в культурах клітин і тканинах орга-нів антенатально загиблих плодів та посліді жінок-породіль під впливом вірусу простого герпесу. В експерименті in vitro для підтвердження ролі ВПГ на клітинному рівні були вивчені морфологічні зміни в інфікованій перещеплюваній культурі клітин коронарних судин теляти (КСТ). Був використаний штам “УС” ВПГ-1, з інфекційним титром 4,0 lg ТЦД50/мл. Мітотичну активність (МА) інфікованих культур КСТ досліджували через 18, 24, 36 і 48 годин.

Спостереження за інфікованою штамом “УС” ВПГ-1 культурою клітин КСТ показали, що через 18 годин після інфікування утворювалися характерні “бляшки”. Вони представляли собою конгломерати клітин, нагромаджених найчастіше одна на іншу (кількістю від 4 до 25) з вакуолізованою цитоплазмою. Через 24 години після інфікування кількість “бляшок” збільшувалося: на 1000 врахованих клітин приходилося від 19 до 25 конгломератів на відміну від контрольної культури.

У багатьох клітинах спостерігалася вакуолізація цитоплазми і ядер, з’являлися внутрішньоядерні включення (у 1-3% від кількості врахованих клітин), а також відходження хроматину до периферії ядра (до 70% від кількості врахованих клітин). У цей період часу зареєстровано збільшення числа патологічних мітозів, серед яких домінуючою формою були колхіциноподібні метафази.

Через 36 годин після інокуляції інфікованими виявлялися практично усі клітини, що позначалося на їхній загальній деструкції, очевидно, внаслідок ушкодження мембран, що приводить до втрати клітинами первинної форми.

Через 48 годин після інфікування спостерігався загальний цитопатичний ефект, що виявлявся в деструкції практично всіх клітин (до 90%) і відторгнення їх від поверхні скла.

Результати кількісних показників МА в інфікованій герпесвірусом та контрольній культурі КСТ наведені в табл. 1.

Підвищення МА в клітинах через 18-24 годин після інокуляції герпесвірусу деякою мірою можна пояснити стимуляцією синтезу клітинної ДНК на самих ранніх термінах інфекції. Надалі, починаючи з 36 години після інфікування, відбувався синтез ДНК ВПГ, що викликав пригнічення процесу ділення клітин і появу патологічних мітозів.

Через 48 годин спостереження відзначалася повна дегенерація клітин, поява патологічних мітозів (переважно К-мітозів), деструкція клітинного шару в той час, як неінфіковані клітини продовжували ділитися (МА 17,8±1,040/00).

Таблиця 1

Показники мітотичної активності інфікованої ВПГ-1
та контрольної культури клітин КСТ

Строк

дослід-ження,

години | Мітотична активність, 0/00 | Кількість патологічних

мітозів, %

Інфіковані культури

(М ± m) | Контрольні культури

(М ± m) | Р | Інфіковані культури | Контрольні культури | Р

18 | 16,8 ± 0,75 | 17,9 ± 0,92 | > 0,05 | 8 | 6 | <0,05

24 | 24,4 ± 0,87 | 19,6 ± 1,28 | < 0,01 | 14 | 10 | <0,01

36 | 15,2 ± 0,64 | 18,0 ± 1,2 | < 0,01 | 12 | 8 | <0,01

48 | Повна дегенерація культури клітин | 17,8 ± 1,04 | Повна дегенерація

культури клітин | 10

Графічне зображення змін МА інфікованих герпесвірусом і контрольних культур клітин КСТ в динаміці показано на рис. 3.

Таким чином, для штаму “УС” характерна виражена здатність до цитоагломерації і слабка здатність до симпластутворення. Встановлено короткочасну стимуляцію МА клітин КСТ через 24 години після інфікування штамом “УС” ВПГ-1, що через 36 годин змінилася пригніченням МА і появою цитопатичного ефекту.

Рис. 3. Мітотична активність культури клітин КСТ, інфікованої ВПГ-1.

Для з’ясування ролі ВПГ на тканинному рівні проведені дослідження з виявлення ВПГ у тканинах різних органів антенатально загиблих плодів. Патологічний матеріал (головний мозок, легені, печінка, нирки, плацента) був отриманий від жінок, у яких в строк від 28 тижнів вагітності відбулась загибель плоду. Дані щодо виявлення ВПГ 1/2-антигену в органах антенатально загиблих плодів представлені в табл. 2.

Таблиця 2

Результати імуноферментного виявлення ВПГ 1/2-антигену
в тканинах органів антенатально загиблих плодів

NN антена-

тально загиблих плодів породіль | Показники ОЩ при виявленні антигену із різного матеріалу

головний мозок | легені | печінка | нирки | ОЩ критична | Всього

інфікова-них органів

1 | 1,110* | 0,223 | 1,293* | 0,905* | 0,340 | 3

2 | 1,008* | 1,007* | 0,956* | 0,350 | 0,390 | 3

3 | - | 0,329 | 0,778* | 0,269 | 0,320 | 1

4 | 0,232 | 0,053 | 0,255 | 0,542* | 0,320 | 1

5 | 1,171* | 0,404 | 0,980* | 1,197* | 0,390 | 3

6 | 0,214 | 0,482* | 0,603* | 0,213 | 0,380 | 2

7 | 0,345 | 0,819* | 0,402 | 0,943* | 0,400 | 2

8 | 0,390 | 0,223 | 0,355 | 0,290 | 0,400 | 0

9 | 0,235 | 0,329 | 0,193 | 0,255 | 0,400 | 0

10 | 0,793* | 0,814* | 0,291 | 0,380 | 0,320 | 2

11 | - | - | 0,770* | - | 0,320 | 1

12 | 0,228 | 0,522* | 0,703* | 0,701* | 0,320 | 3

Всього позитивних результатів | 4 | 5 | 7 | 5 | 21

Примітка.

* – р<0,05 відносно “ОЩ критичної”.

Ступінь інфікованості досліджених плодів суттєво різниться і пов’язаний із втягненням у процес одного чи декількох органів. Так, у трьох плодів ВПГ був знайдений тільки в одному органі (№3 і №11 – в печінці і №4 – в нирках), у трьох плодів були інфікованими два органа (№6 – легені і печінка, №7 – легені і нирки, №10 – головний мозок і легені).

Високий ступінь герпесвірусного ураження знайдено у 4-х плодів
(№№ 1, 2, 5 і 12), у яких інфікованими були по три досліджених органи. Поєднання інфікованих органів у плодів було різним: головний мозок + печінка + нирки; головний мозок + легені + печінка; легені +печінка + нирки. Одночасно, в трьох випадках з втягненням в інфекційний процес трьох органів (№№ 2, 5 і 12) ВПГ 1/2-антиген також був знайдений в крові із пуповини плодів. ВПГ-інфікування декількох органів у досліджених плодів є свідоцтвом дисемінованої герпесвірусної інфекції, яка призвела до антенатальної загибелі плодів.

При проведенні ІФА (виявлення ВПГ-антигену) було встановлено, що кров матерів антенатально загиблих плодів мала високі показники ОЩ, котрі, як і в органах плодів, у декілька разів (іноді в три і більше) перевищували показники ОЩ крит.

У разі гістологічного дослідження посліду жінок-породіль із герпесвірусною інфекцією були встановлені пошкодження, що зосереджувались у базальній мембрані, ворсинчастому хоріоні, судинному руслі плаценти, її оболонках, ендотеліальному шарі пуповинної вени. За своїм характером зміни, що були викликані ВПГ, відповідали інфекційному запаленню, що супроводжувалось явищами лімфо-плазмоцитарної інфільтрації. Морфологічні порушення призводили до ушкодження кровообігу (в тому числі і на мікросудинному рівні) та поступового розвитку процесів як компенсаторного, так і декомпенсаторного типу. Таким чином, ВПГ відіграє важливу роль в патогенезі ГВІ на клітинному і тканинному рівнях що веде до дисемінації вірусу при МПІ.

Система прогнозування ступеня ризику передачі герпесвірусної інфекції новонародженому. Враховуючи тяжкість ВПГ-інфекції та наслідків у новонароджених нами було розроблено комплексну вірусно-морфологічну систему прогнозування ступеня ризику (низький, середній, високий) передачі ВПГ-інфекції від матері новонародженому на основі об’єктивних показників вірусологічного та морфологічного досліджень.

В розробленій системі ступінь ризику передачі ГВІ від інфікованої матері новонародженому нами оцінювався як низький, середній, високий (від 5-10%, 20-40% до 60-100% відповідно) в залежності від виявлення герпесвірусного антигену в материнській і пуповинній крові в сукупності з наявністю чи відсутністю морфологічних змін в плаценті та пуповині жінок-породіль. Критерії ступеня ризику передачі ВПГ-інфекції від інфікованої матері новонародженому наведені в таблиці 3.

Таблиця 3

Комплексна система прогнозування
ступеня ризику передачі ВПГ-інфекції
від інфікованих матерів новонародженим

Ступінь ризику

передачі | Вірусно-морфологічні маркери ВПГ-інфекції | Показ-ник

ступеня ризику передачі в%

Наявність ВПГ в крові | Морфологічні зміни в

материн-ській | пуповин-ній | плаценті | пуповині

Високий ступінь ризику передачі | виявлений

антиген ВПГ |

виявлений антиген ВПГ |

гіганто-клітинний метаморфоз, зміни у ядерно-цитоплазма-тичному співвідношенні, крововиливи у тканини плаценти, розриви тіла плаценти, “ішемічні інфаркти” | дефекти шарів пуповинної вени та наявність стазу, тромбозу | 100

виявлений

антиген ВПГ |

виявлений антиген ВПГ |

гіганто-клітинний метаморфоз, зміни у ядерно-цитоплазма-тичному співвідношенні, наявність крововиливів у тканині плаценти | дефекти шарів пуповинної вени та наявність стазу, тромбозу | 80

виявлений

антиген ВПГ |

виявлений

антиген ВПГ | порушення плацентації, попереднє відслоєння плаценти, наявність крововиливів у тканині плаценти |

дефекти шарів пуповинної вени | 60

Продовження табл. 3

Ступінь ризику

передачі | Вірусно-морфологічні маркери ВПГ-інфекції | Показ-ник

ступеня ризику передачі в%

Наявність ВПГ в крові | Морфологічні зміни в

материн-ській | пуповин-ній | плаценті | пуповині

Середній ступінь ризику передачі | виявлений

антиген ВПГ | відсутній антиген ВПГ | фальшиве прирощення

плаценти, порушення плацентації, наявність вогнищ кальцинозу | морфологічні зміни відсутні | 40

в анамнезі інфікованих жінок періодичні рецидиви ВПГ-інфекції | відсутній антиген ВПГ | порушення плацентації,

наявність вогнищ кальцинозу | морфологічні зміни відсутні | 20

Низький ступінь ризику передачі | латентна ВПГ-інфекція без рецидивів | відсутній антиген ВПГ |

фальшиве

прирощення

плаценти | морфологічні зміни відсутні | 5-10

Використання системи прогнозування ризику передачі ВПГ-інфекції від інфікованої матері новонародженому дозволяє своєчасно розробити тактику антивірусного лікування як інфікованої матері, так і хворого но-вонародженого, і тому з більшою ефективністю впливати на рівень захворюваності та смертності, що сприятиме народженню здорових дітей. Проведення спе-цифічної діагностики дає можливість знизити затрати на необґрунтоване лікування у тих випадках, коли захворювання були викликані іншими збудниками.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі щодо ролі вірусу простого герпесу в розвитку материнсько-плодової інфекції на підставі визначених лабораторно-діагностичних критеріїв та встановлено можливість прогнозування ступеня ризику передачі захворювання від інфікованої матері новонародженому. Обґрунтовано необхідність проведення комплексного обстеження на вірус простого герпесу вагітних та жінок репродуктивного віку, особливо з обтяженим акушерським анамнезом, з метою зниження ступеня ризику передачі захворювання плоду і новонародженому.

1. Визначені та запропоновані найбільш значущі лабораторно-діагностичні критерії материнсько-плодової інфекції, які основані на комплексі анамнестичних, клінічних, ультразвукових і лабораторних методів дослідження. Для підтвердження герпесвірусної інфекції рекомендовано визначення антигену вірусу простого герпесу, низькоавідних Ig G, виявлення ДНК, цитомегаловірусних клітин при цитоскопічному дослідженні слини та сечі. Вперше при інфікуванні вірусом простого герпесу, поряд з відомими ознаками, встановлено нову ультразвукову ознаку материнсько-плодової інфекції – “незріла плацента“, що рекомендується враховувати в якості допоміжного критерію для діагностики.

2. Встановлено високу частоту інфікування вірусом простого герпесу (64,0±3,0%) вагітних жінок м. Харкова та Харківської області, особливо з обтяженим акушерським анамнезом (79,6±3,3%), P<0,01. У не вагітних жінок антиген вірусу простого герпесу був знайдений в 28,4±3,8% випадків, показник інфікованості був вищим у жінок з обтяженим акушерським анамнезом (39,7±5,9%), P<0,05. Всі жінки з виявленим в крові антигеном, а також Ig G з індексом авідності ?35% віднесені до груп високого ризику несприятливого перебігу вагітності, пологів та передачі інфекції, викликаної вірусом простого герпесу, плоду і новонародженому.

3. В експерименті на перещеплюваній культурі клітин, інфікованої вірусом простого герпесу 1-го типу, виявлено характер цитопатичної дії вірусу. Морфологічні зміни виявлялись у вигляді вакуолізації цитоплазми, маргинації хроматину, формуванні внутрішньоядерних включень, короткочасної стимуляції мітотичної активності.

4. Встановлено особливості патогенної дії вірусу простого герпесу на тканини органів антенатально загиблих плодів. Показано накопичення вірусу в різних органах (в головному мозку, легенях, печінці, нирках), в пуповинній крові та плаценті, що є підтвердженням трансплацентарної передачі вірусу від інфікованої матері плоду.

5. Виявлено запальний характер змін у кожному із структурних компонентів посліду жінок-породіль (плацента, екстраплацентарні оболонки, пуповинна вена), що супроводжувався явищами лімфо-плазмоцитарної інфільтрації. Морфологічні порушення призводили до ушкодження кровообігу на мікросудинному рівні та поступового розвитку процесів як компенсаторного, так і декомпенсаторного типу.

6. На підставі запропонованих лабораторно-діагностичних критеріїв розроблено схему комплексного обстеження жінок репродуктивного віку, а також алгоритм обстеження вагітних жінок з різним сероімунологічним статусом на герпесвірусну інфекцію. Використання запропонованих алгоритмів дозволяє своєчасно виявляти вагітних з високим інфекційним ризиком, запобігати ускладненням у матері і плоду, здійснювати цілеспрямовані лікувальні та профілактичні заходи для реального зниження рівня захворюваності у матерів та новонароджених.

7. Розроблено систему прогнозування ступеня ризику передачі захворювання, викликаного вірусом простого герпесу, від інфікованої матері новонародженому. Ступінь ризику визначено, як низький (5-10%), середній (20-40%) та високий (60-100%) при виявленні антигену вірусу простого герпесу в материнській і пуповинній крові в сукупності з наявністю або відсутністю морфологічних змін в плаценті та пуповині жінок-породіль.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Періодичні фахові видання, що затверджені ВАК України:

1. Панченко Л.О., Павленко Н.В., Попова Н.Г., Радченко О.О. Герпесвірусні інфекції (Сучасний погляд на проблему) // Експериментальна і клінічна медицина. - 2002. - №3. - С. 65-68. (Здобувачем зібрана та проаналізована вітчизняна та іноземна література за проблемою дослідження, виконаний переклад першоджерел, проведено структуризація статті та підготовлено роботу до публікації).

2. Торяник И.И., Гречанина Ю.Б., Попова Н.Г., Радченко Е.А., Панченко Л.А., Брусник С.В., Казмирчук В.В., Попова Л.А. Патологоморфологические особенности плаценты при герпесвирусной инфекции // Ультразвукова перинатальна діагностика. - 2002. - 15.- С. 71-75. (Здобувачем проведено забір матеріалу, підбір реактивів для морфологічного