ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ПОЛЯКОВА Олена Валеріївна

УДК 616.155.194:[618.33+616.37]

Патологічна анатомія підшлункової залози плодів та новонароджених від матерів із анемією

14.03.02 – патологічна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Харківському національному університеті ім. В.Н.Каразіна МОН України

НАУКОВИЙ КЕРІВНИК – кандидат медичних наук, доцент Проценко Олена Сергіївна, Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна МОН України.

ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ – доктор медичних наук, професор Сорокіна Ірина Вікторівна, Харківський державний медичний університет МОЗ України, професор кафедри патологічної анатомії;

доктор медичних наук, професор Терещенко Валентина Павлівна, Інститут сорбції та проблем ендоекології НАН України, м. Київ, завідувач лабораторії ендоекології та техногенноіндукованої патології.

Провідна установа: Інститут педіатрії, акушерства і гінекології АМН України, м. Київ.

Захист відбудеться “23” листопада 2006 р. о 13.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.600.01 при Харківському державному медичному університеті за адресою: 61022, м. Харків, проспект Леніна, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського державного медичного університету (61022, м.Харків, проспект Леніна, 4).

Автореферат розісланий “16” жовтня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

д.мед.н., професор Лазуренко В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Внутрішньоутробний період формування людського організму є найбільш важливим етапом розвитку індивідуума, і, саме, на цьому етапі відбувається закладка всіх систем і органів людини. Став прописною істиною факт, що чим в сприятливіших умовах протікає вагітність, тим більше підстав чекати народження здорової дитини. Згідно з даними ВООЗ, майбутній стан здоров'я індивідуума на 16-18% визначається генетичними чинниками і на 67-74% - чинниками зовнішнього середовища (А.Ф. Яковцова з співавт., 1992), а для плоду, що розвивається, саме організм матері є зовнішнім середовищем, яке може виступати як сприятливим так і несприятливим чинником (J.J. Hoet, 1999). Ускладнення вагітності, екстрагенітальна патологія матері, вплив шкідливих чинників зовнішнього середовища на материнський організм (іонізуюче випромінювання, забруднення атмосфери різними хімічними речовинами), а також спосіб життя вагітної (нераціональне живлення, гіподинамія, шкідливі звички) надають украй несприятливу дію на організм плоду, що формується (А.Ф. Яковцова і співавт., 1999). У зв'язку з цим, особливо перспективними в плані профілактики різних захворювань дітей і дорослих є дослідження, які торкаються внутрішньоутробного періоду розвитку індивідуума.

Останніми роками в структурі екстрагенітальних порушень вагітних одне з центральних місць займає залізодефіцитна анемія (ЗДА), що розвивається, як правило, в другій половині вагітності (Е.Н. Коноводова, 2003; B. Nynke, 2003).За даними ВООЗ частота ЗДА, що зустрічається у вагітних в різних регіонах світу коливається в межах 21-80%. Близькі до даних показників результати вітчизняних і зарубіжних досліджень - від 15 до 83,1% (В.Г. Деміхов, 2004; B. Nynke, 2003). Останніми роками в Російській федерації наголошується збільшення захворюваності ЗДА серед вагітних в 12,9 разу (Я.А. Лещенко, І.В. Мильникова, 2001). У нашій країні за даними Інституту педіатрії, акушерства і гінекології АМН України захворюваність ЗДА серед вагітних в останні 10 років збільшилася майже в 8 разів (з 6,5 до 51,2%) (Т.З. Марченко, 2003).

Доказано, що при впливі різноманітних шкідливих факторів як з боку організму матері, так і з боку навколишнього середовища, в інкреторних органах плода виникає ряд морфологічних змін. Ендокринна система, що виконує разом з нервовою та імунною системами тонку регуляцію, “настроювання” біологічних функцій організму, яке спрямовано на збереження гомеостазу, відіграє особливу роль в реалізації адаптаційно-пристосувальних реакцій. Саме цьому питання профілактики виникнення різноманітної патології з боку ендокринних залоз привертають увагу багатьох сучасних дослідників. Дослідження морфологічних особливостей найважливіших систем плоду і немовляти при різних патологічних станах матері дозволяє з великою імовірністю прогнозувати наявність і характер ураження цих систем у постнатальному онтогенезі.

Таким чином, вибрана тема актуальна і нова, бо в сучасній перинатології ця проблема не вивчена і залишається відкритою.

Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є фрагментом комплексної науково-дослідницької роботи факультету фундаментальної медицини Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна „Нові технології в комплексному лікуванні цукрового діабету” (номер державної реєстрації 0103U004282), що входить в координаційний план пріоритетних напрямків наукових досліджень, затверджений Міністерством освіти і науки України. Автором забезпечений збір матеріалу, проведені морфометричні, імуногістохімічне дослідження, а також був проведений аналіз морфофункціональних особливостей тканини підшлункової залози в умовах анемії матері в залежності від ступеню тяжкості.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи є вивчення морфофункціонального стану екзо- й ендокринного апарату ПЗ у плодів і новонароджених, що народилися від матерів, вагітність яких була ускладнена ЗДА.

Завдання дослідження:

1. Провести аналіз клінічних даних досліджуваних плодів і новонароджених, їх соматометричних показників залежно від ступеня тяжкості ЗДА.

2. Здійснити гістологічне і гістохімічне дослідження морфо-функціональних особливостей екзокринного апарату ПЗ плодів і новонароджених від матерів, вагітність яких була ускладнена ЗДА порівняно з екзокринним апаратом ПЗ від матерів, вагітність яких протікала фізіологічно.

3. Оцінити морфологічні параметри ендокринного відділу ПЗ: загальну середню кількість острівців на обмеженому полі зору, загальні розміри острівців, загальну середню кількість клітин в острівцях, середню кількість б- та в-клітин в острівцях.

4. Дослідити морфо-функціональні особливості б- та в-клітин острівців, використовуючи морфологічні і імуногістохімічне методи дослідження.

5. Проаналізувати динаміку співвідношення б:в залежно від ступеня тяжкості ЗДА та ступінь прояву апоптозу б- та в-клітин острівців, використовуючи морфологічні і імуногістохімічні методи дослідження.

6. Дослідити стромально-судинний компонент ПЗ в єдиній системі стромально-паренхіматозних взаємостосунків за допомогою морфологічних, імуногістохімічних і морфометричних методів дослідження.

Об'єкт дослідження – анемія вагітних.

Предмет дослідження – морфо-функціональний стан підшлункової залози плодів та новонароджених в залежності від строку гестації та ступеню анемії матері на підставі визначення стану ендокринних та екзокринних клітин паренхіми залози морфометрично, цито - плазматичного індексу, стану ядра; а також продукуючої функції цих клітин; змін зі сторони стромального компоненту в залежності від ступеню анемії матері з виділенням питомої ваги судин; та визначення змін індексу апоптозу з прогресуванням анемії матері.

Методи дослідження – для досягнення поставленої мети та вирішення завдань використано макроскопічний, органометричний, гістологічний, гістохімічний, морфометричний, імуногістохімічний та статистичний методи.

Наукова новизна одержаних результатів. На матеріалі перинатальних аутопсій загиблих плодів і новонароджених в результаті комплексного дослідження із застосуванням морфологічного, гістохімічного, морфометричного, імуногістохімічного і статистичного методів вперше виявлені зміни внутрішньоутробного розвитку ПЗ, обумовлені наявністю у матері під час вагітності анемії. Визначені характер і спрямованість змін морфо-функціональної активності ПЗ плодів і новонароджених залежно від ступеня тяжкості материнської анемії і внутрішньоутробного віку плоду.

Вперше було встановлено, що анемія матері під час вагітності реалізується прискоренням темпів внутрішньоутробного розвитку ПЗ плоду, підвищенням рівня морфо-функціональної активності б- і в-клітин аж до "робочого" виснаження і масової клітинної загибелі переважно шляхом апоптозу. При цьому, ступінь пошкодження плодової ПЗ прямо пропорційна ступеню тяжкості материнської анемія і зворотно пропорційна ступеню зрілості плоду.

Вперше встановлено, що материнська анемія легкого ступеню приводить до внутрішньоутробної гіпертрофії і гіперплазії б- і в-клітин ПЗ з посиленням їх морфо-функціональної активності. Зміни, що виявляються в описуваних структурах при дії анемії середнього ступеня тяжкості, є граничними і характеризуються наближенням до вичерпаності морфо-функційних можливостей для компенсаторного збільшення функції. При важкому ступеню анемії виявлені ознаки пригноблення і виснаження функцій екзо- і ендокриноцитів. Отже, анемія матері під час вагітності обумовлює внутрішньоутробне порушення дозрівання і диференціювання б- і в-клітин ПЗ плоду, що, можливо, веде до порушення функціонування органу в подальшому. Виявлений взаємозв'язок між змінами соматометричних показників плодів і новонароджених і тяжкістю материнської анемії.

Практичне значення одержаних результатів. Проведене комплексне дослідження морфології ПЗ плодів дозволило з'ясувати особливості впливу такого ускладнення вагітності, як анемія, на формування і становлення функцій ПЗ плоду. Виявлені зміни і закономірності відкривають нові аспекти механізмів розвитку порушення екзо- і ендокринного відділів ПЗ як у плодів і новонароджених, так і у дітей більш старшого віку, а також у дорослих індивідуумів. Виявлені внутрішньоутробні зміни, пов'язані з патологічною дією анемії, приводять до зменшення здатності організму плоду до адаптації, до зменшення об'єму компенсаторно-адаптовних реакцій на будь-якому етапі подальшого онтогенезу.

Враховуючи, що продукти секреції екзо- і ендокринного апарату ПЗ грають важливу роль на різних етапах проміжного обміну, забезпечуючи фізіологічний баланс метаболічних процесів, можна з упевненістю стверджувати, що її антенатальна ураження маніфестуватиме у вигляді тієї або іншої ендокринної патології в постнатальному онтогенезі. На підставі цього неонатологам рекомендовано враховувати функціональний стан екзо- і ендокринного апарату ПЗ у таких новонароджених, а педіатрам і ендокринологам виділяти групи ризику відносно розвитку у них ендокринопатій надалі. Пренатальна профілактика поразок плоду при материнській анемії дозволить уникнути розвитку і маніфестації різної патології з боку ПЗ у подальшому постнатальному розвитку.

Результати роботи впроваджені у роботу патологоанатомічних відділень Харківської обласної клінічної лікарні, Дніпропетровської дитячої обласної клінічної лікарні, Сумської обласної клінічної лікарні, відділення дитячої патологічної анатомії УДСЛ ОХМАТДИТ, відділу патологічної анатомії Київської міської клінічної лікарні №10, а також в учбовий процес кафедри загальної та клінічної патології факультету фундаментальної медицини Харківського національного університету імені В.Н.Каразіна, кафедри патологічної анатомії медичного факультету Сумського державного університету, кафедри патологічної анатомії Дніпропетровської державної медичної академії, кафедри морфології людини Інституту екології та медицини.

Особистий внесок дисертанта. Автором самостійно зібрано матеріал, проаналізовані клінічні, соматометричні, органометричні дані. Був проведений аналіз стану екзокриноцитів: діаметр ядра, об’єм ядра, об’єм цитоплазми, діаметр клітини, об’єм клітини, ядерно-цитоплазматичний індекс. З метою виявлення та оцінки різних популяцій ендокриноцитів було проведене дослідження на препаратах, які були оброблені за методикою Малорі з подальшим Морфометричним дослідженням цих клітин, а саме: щільність розташування острівців Лангерганса, їх площа, загальна кількість клітин в них, а також кількість - клітин та - клітин та їх співвідношення. Також була проведена морфометрія клітин кожної популяції ендокринної частини. Для оцінки стану ядерного матріксу було проведене дослідження на препаратах, які були оброблені за Фьольгеном-Росенбеком та МКАт CD95. Також був оцінений функціональний стан екзо- та ендокринних частин. Дисертантом був зроблений аналіз стану стромального компоненту з виділенням питомої ваги судин, та з подальшою оцінкою стану ендотелію. Також автором проведено статистичну обробку матеріалу, аналіз та узагальнення отриманих результатів, що дозволило сформулювати наукові положення і зробити висновки даної роботи.

Апробація роботи. Основні положення дисертації викладені, обговорені та схвалені на науково-практичній конференції молодих вчених, присвяченої 350-річчю міста Харкова (Харків, 2004), на Всеукраїнській науково-практичній конференції „Актуальні проблеми морфологічної діагностики хвороб плода і дитини” (Чернівці, 2004), на Українській конференції молодих вчених „Досягнення молодих вчених – майбутнє медицини” (Харків, 2005), на науково-практичної конференції з міжнародною участю, присвяченої 22-річчю з дня заснування Харківського державного медичного університету (Харків, 2005р.), на Всеукраїнській науково-практичній конференції „Сучасні проблеми морфології” (Полтава, 2006).

Апробацію роботи проведено на спільному засіданні кафедри патологічної анатомії Харківського державного медичного університету, кафедри патологічної анатомії Харківської медичної академії післядипломної освіти, кафедри загальної та клінічної патології Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна, відділень патологічної анатомії Інституту загальної та невідкладної хірургії АМН України, Обласної клінічної лікарні (2006р.)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 наукових робіт, у спеціалізованих виданнях, затверджених ВАК України – 4; у збірниках наукових конференцій – 3.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 150 сторінках машинопису. Складається із вступу, огляду літератури, чотирьох розділів власних досліджень, їх обговорення, висновків, додатків та списку літератури, який містить 220 джерел: вітчизняних - 115, іноземних - 105 (обсягом 23 сторінки). Робота ілюстрована 45 таблицями та 71 малюнками, в тому числі 46 мікрофотографіями (обсягом 21 сторінка).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Для досягнення мети та вирішення завдань даної роботи було вивчено 65 випадки загибелі плодів, що загинули антенатально у терміні 30 – 40 тижнів та новонароджених, що загинули протягом перших п’яти діб життя. Залежно від ступеню важкості анемії матері досліджувану групу було розподілено на три підгрупи: О1, куди увійшли плоди та новонароджені (27 випадків) від матерів з легкім ступенем важкості анемії; група О2 - випадки загибелі плодів та новонароджених (21 випадок) від матерів зі середнім ступенем важкості анемії; група О3 - випадки загибелі плодів та новонароджених (17 випадків) від матерів із важким ступенем важкості анемії. Контрольну групу склали плоди та новонароджені (23 випадки) від матерів з фізіологічним перебігом вагітності.

Розтин померлих новонароджених і плодів та забір матеріалу проводився у прозектурах Харківського центру перенатальної патології та Харківської дитячої обласної лікарні протягом 2002-2005 років. Під час розтину плоди та новонароджені зважувались, вимірювалась їх довжина, оцінювались відповідність морфологічних показників терміну гестації та макроскопічні показники досліджуваних залоз.

Матеріал фіксували у забуференому 10% розчині нейтрального формаліну. Гістологічні блоки виготовлялись шляхом стандартної парафінової проводки. Морфологічну будову залоз вивчали за допомогою рутинних гістологічних методик: фарбування гематоксиліном та еозином, пікрофуксином за Ван Гізоном, за Малорі. Рибонуклеїнова кислота (РНК) визначалась реакцією Браше з контролем розчином кристалічної рибонуклеази при температурі 370С протягом 2-х годин. Дезоксирибонуклеінова кислота (ДНК) визначалась реакцією Фьольгена-Росенбека. Контролем були зрізи, що не зазнали гідролізу.

Дослідження мікропрепаратів здійснювалось на мікроскопі Olympus BX-41 з наступною каріометрією, плоїдометрією та відеомікроскопічною цитофотомет-рією (К. Ташке, 1980) за допомогою програми Olympus DP-Soft (Version 3:1). При плоїдометрії за еталон диплоїдності взято лімфоцит, хромосомний набір позначено як 2С ( Г.Г. Автандилов, 2002).

Імуногістохімічне дослідження проводили на парафінових зрізах, товщиною 5-6 мкм непрямим методом Кунса по методиці Brosman (1979). Клітки-продуценти інсуліну і глюкагону диференціювали за допомогою моноклональних антитіл (МКАт) до інсуліну і глюкагону фірми Serotec, UK. Апоптоз визначали з МКАт CD95, а ендотелін-1 продукуючі клітини виявлялися МКАт до ендотеліну-1 (Novocastra Laboratories Ltd. UK). Як люмінесцентною міткою використовували F (ab)-2 - фрагменти кролячих антитіл проти імуноглобулінів миші, що мітяться ФІТЦ. Препарати вивчали в люмінесцентному мікроскопі МЛ-2 з використанням світлофільтрів: ФС-1-2, СЗС-24, БС-8-2, УФС-6-3. Інтенсивність свічення визначали на мікрофлюорометрі з ФЭУ-35 і виражали в умовних одиницях, рівних струму, що протікає через вимірювальний прилад, виражених в мка.

Числові дані оброблені за методом варіаційної статистики з обчисленням середньої арифметичної (М), середньоквадратичного відхилення (д), середньої помилки різниці (m), імовірності різниці (р). Остання між двома середніми при малих вибірках визначалась за таблицею Стьюдента з дотриманням умови (n1+n2-2). При визначення ступеня вірогідності припускалась точність р<0,05. Також було проведено кореляційний та альтернативний аналіз отриманих цифрових даних (Г.Ф.Лакин, 1990).

Результати дослідження та їх обговорення. Аналізуючи приведені клінічні дані про досліджувані плоди, новонароджених і їх матерів слід зазначити той факт, що ЗДА частіше ускладнює I-II вагітність, I-II роди. Вік вагітних з ЗДА, як правило, не перевищує 27 років. Гестаційний вік досліджуваних плодів із ступенем тяжкості материнської анемії не корелює.

При аналізі антропометричних показників нащадків звертає на себе увагу тенденція збільшення середньої маси тіла плодів (у терміні гестації до 35 тижнів) групах О1 та О2 і зменшення в групі О3 (табл.1). У більш зрілих плодів і новонароджених середня маса збільшена тільки в групі О1, а в групі О2 та О3 маса тіла має тенденцію до зменшення (таб.1). Таким чином, ми констатуємо збільшення маси тіла при незначній дії шкідливого чинника і зменшення її при значному, що є поширеною адаптаційною реакцією при ускладненій вагітності. Показники маси і довжини тіла досліджуваних плодів і новонароджених між собою мають сильний позитивний зв'язок.

Таблиця 1

Фізичні параметри досліджуваних плодів та новонароджених

Досліджувана група | Внутрішньоутробний вік (в тижнях)

30 – 34 | 35 – 40

Середня маса тіла, 10-3кг

К | 1800,0±130,0 | 3180,0±250,0

О1 | 1900,0±318,2* | 3271,4±221,5*

О2 | 2150,0±394,0* | 2150,0±394,0*

О3 | 1880,0±318,2* | 3050,4±221,5*

Середня довжина тіла, 10-2м

К | 42,8±1,8 | 51,2±1,6

О1 | 44,8±2,9* | 50,9±2,6*

О2 | 43,7±2,6* | 50,7±5,4*

О3 | 44,0±2,9* | 50,9±2,6*

Примітка. * - p<0,05 порівняно з контрольною групою

На підставі нашого дослідження можна зробити висновок, що важка ЗДА матері є додатковим чинником ризику народження дітей із ЗВУР або гіпотрофією. Встановлено, що у даної групи матерів частіше, ніж у 2 рази народжуються доношені новонароджені з ознаками гіпотрофії. Зменшення маси плоду при важких формах материнської ЗДА пояснюється тим, що при анемії формується фетоплацентарна недостатність, яка в свою чергу обумовлює хронічну внутрішньоутробну гіпоксію плоду.

Аналіз зміни довжини тіла не виявив ніяких закономірностей зміни його у незрілих (терміном гестації до 35 тижнів) плодів, проте, у більш зрілих плодів та у новонароджених виявлена тенденція до зменшення довжини тіла по мірі зростання ступеню тяжкості материнської анемії. При дослідженні органометричних параметрів залоз встановлено достовірне збільшення як маси ПЗ в цілому, так і окремих її частин (головки, тіла, хвоста). Причому, якщо при неважких анеміях маса залоз змінюється трохи і недостовірно, то при важких формах материнської анемії різниця в масі залоз істотна (табл.2). Збільшення маси ПЗ викликане новоутворенням сполучної тканини і заміщенням паренхіми залози сполучнотканинним компонентом. Останнє, у свою чергу, можливо обумовлене гіпоксією. Зміни розмірів ПЗ в цілому і її окремих частин у нащадків матерів, вагітність яких була ускладнена ЗДА, не виявлено.

Таблиця 2

Розміри окремих частин ПЗ плодів і новонароджених виношених

в умовах материнської ЗДА різного ступеню тяжкості, кг х 10-3 |

К | О1 | О2 | О3

голівка | 11,2±0,4 | 11,7±0,3 | 12,4±0,4* | 12,9±0,3*

тіло | 12,4±0,4 | 12,9±0,4 | 13,7±0,5* | 14,5±0,5*

хвіст | 21,1±0,7 | 22,2±0,6 | 23,6±0,6* | 24,7±0,5*

Примітка. * - (К – О) p<0,05

При вивченні морфофункціонального стану екзокринного апарату ПЗ плодів і новонароджених від матерів із ЗДА були виявлені наступні особливості: збільшення середніх розмірів ацинусів по мірі зростання тяжкості материнської ЗДА за рахунок збільшення розмірів екзокринних клітин (табл. 3). Розміри екзокріноцитов збільшуються за рахунок збільшення розмірів ядер і за рахунок збільшення об'єму цитоплазми. Проте, об'єм цитоплазми збільшується значніше, що обумовлює зменшення ядерно-цитоплазматичного індексу по мірі обважніння ЗДА матері.

Таблиця 3

Морфометричні параметри ациноцитів екзокринної частини ПЗ плодів і новонароджених, виношених в умовах ЗДА матері різного ступеню тяжкості

Параметр | К | О1 | О2 | О3

Яd, м х10-6 | 6,03±0,23 | 6,11±0,27* | 6,70±0,30* | 6,93±0,33*

Яv, м3 х10-18 | 114,75±4,11 | 119,38±4,52* | 157,41±5,71* | 174,19±6,12*

Цv, м3 х10-18 | 145,25±6,33 | 183,14±7,08* | 356,60±11,47* | 396,05±12,14*

Кd, м х10-6 | 7,92±0,34 | 8,33±0,36* | 9,94±0,39* | 10,29±4,07*

Кv, м3 х10-18 | 260,0±10,71 | 302,52±12,15* | 514,01±17,84* | 570,24±23,11*

ЯЦІ | 0,790±0,029 | 0,652±0,030* | 0,441±0,187* | 0,440±0,195*

Примітка. * - (К – О) p<0,05

Показники розмірів ацинусов, розмірів ациноцитів і діаметру їх ядер позитивно корелюють із ступенем тяжкості материнської ЗДА, виразність зв'язків - середня.

Описане збільшення морфометричних параметрів екзокриноцитов свідчить про збільшення рівня їх морфо-функціональної активності під дією материнської ЗДА. Дані цитофотометричного дослідження з вимірюванням оптичної щільності ДНК в ядрах ациноцитів і РНК в їх цитоплазмі це підтверджують (табл. 4).

Так, по мірі зростання ступеню тяжкості ЗДА матері в ациноцитах хроматин стає більш еухромним деконденсованим і, відповідно, зменшується оптична щільність ДНК (табл. 4). При цьому, необхідно відзначити, що між тяжкістю материнської ЗДА і показником оптичної щільності ДНК в ядрах екзокріноцитов виявляються середньої сили позитивні кореляційні зв'язки. Оптична щільність РНК в цитоплазмі екзокринних клітин, навпаки, збільшується, що свідчить про посилення білково-синтетичної активності клітин. При важких формах ЗДА, особливо у незрілих плодів, в частині ациноцитів з'являються ознаки вичерпаності функцій у вигляді так званого феномена маргінації хроматину. Хроматин в ядрах таких клітин конденсується під нуклеолеммой і розташовується під нею у вигляді темно-фіолетової стрічки, тоді як центральна частина ядра виглядає оптично прозорою. Феномен маргінації хроматину розглядають як морфологічний еквівалент однієї з передстадій апоптозу (В.А.Туманський, 2005). Одиничні екзокринні клітки з феноменом маргінації хроматину виявляються вже в групі О2. У групі О3 такі клітини численніші, а у плодів терміном гестації до 35 тижнів зустрічаються в кожному полі зору. Таким чином, можна говорити про появу ознак інтенсифікації процесів масової клітинної загибелі шляхом апоптозу в екзокринній частині ПЗ плодів і новонароджених при дії важких форм материнської ЗДА, яка ушкоджує.

Таблиця 4

Оптична щільність ДНК в ядрах і РНК в цитоплазмі ациноцитів екзокринної частини ПЗ плодів і новонароджених, виношених в умовах ЗДА матері різного ступеню тяжкості

Оптична щільність | К | О1 | О2 | О3

ДНК | 2,017±0,07 | 2,002±0,07 | 1,994±0,06* | 1,856±0,05*

РНК | 1,637±0,04 | 1,629±0,03* | 1,630±0,03 | 1,639±0,04*

Примітка. * - (К – О) p<0,05

При вивченні ендокринної частини ПЗ плодів і новонароджених виявлено, що в цілому переважають острівці дефінітивного типу, проте у плодів, загиблих в терміні гестації 30-35 тижнів зустрічаються острівці, що мають вид "плащових", - центральний комплекс в-клітин оточений масою дрібніших б- клітин. При оцінці розмірів і щільності розташування острівців в хвостовій частині ПЗ виявлено: щільність розташування острівців Лангерганса збільшується по мірі зростання ступеню тяжкості ЗДА матері (табл. 5). Коефіцієнт кореляції між показником щільності розташування острівців в досліджуваних залозах і тяжкістю материнської анемії - 0,93, тобто є сильний позитивний зв'язок. Можливо, частково, подібний перерозподіл щільності розташування острівців пов'язаний із зміною стромально-паренхіматозних взаємостосунків в досліджуваних залозах.

Одночасно із збільшенням щільності розташування змінюються розміри острівців (табл. 5). В групі О1 острівці мають найбільшу площу і достовірно перевершують за своїми морфометричними показниками острівці плодів і новонароджених групи К. По мірі зростання тяжкості ЗДА матері розміри ендокринних острівців потомства зменшуються і вже в досліджуваній групі О2 мають достовірно меншу площу, ніж в групі К. Описана зміна розмірів острівців, з одного боку, обумовлена зміною загальної кількості клітин в них, з іншою, зміною загальних розмірів самих клітин, що становлять острівці. Між показниками діаметру острівців і кількості клітин в них в досліджуваних групах О2 і О3 виявляються середньої сили кореляційні зв'язки негативної спрямованості. Кореляційний аналіз показав наявність середньої сили зв'язків між діаметром острівців і діаметром -ендокриноцитів у всіх досліджуваних групах, спрямованість зв'язків частіше негативна. Зв'язок між розміром острівців Лангерганса і діаметром в-клітин виявлений тільки в групі К і групи О3. Необхідно відзначити, що показники розміру острівців і кількості клітин в них мають негативні середньої сили кореляційні зв'язки з тяжкістю материнської анемії.

Таблиця 5

Морфометричні показники ендокринного апарату хвостової частини ПЗ плодів і новонароджених в залежності від ЗДА матері різного ступеня тяжкості

Параметр | К | О1 | О2 | О3

Щільність розташування острівців Лангерганса, на полі зору 1,6х10-6м2 | 6,67

±0,23 | 7,53

± 0,27* | 8,57

± 0,32* | 9,67

± 0,38*

Площа острівців Лангерганса, м2х10-9 | 10,66

±0,43 | 13,37

±0,57* | 8,54

±0,33* | 7,70

±0,29*

Загальна кількість клітин в острівцях Лангерганса | 269,17 ±12,46 | 273,85

± 11,70 | 336,31

± 14,82 | 195,07

± 8,75

Кількість б-клітин в острівцях Лангерганса | 98,25

±3,91 | 96,94

±3,85 | 134,71

±5,74 | 86,13

±3,31

Кількість в-клітин в острівцях Лангерганса | 160,45

±7,02 | 170,08

±7,50 | 197,18

±8,86 | 106,64

±4,33

б : в | 1:1,63 | 1:1,75 | 1:1,46 | 1:1,24

Примітка. * - (К – О) p<0,05

Змінюється не тільки загальна кількість ендокриноцитів в острівцях, але і їх якісний склад. У групі О1, загальне число клітин (273,85±11,70), а також співвідношення б-клітини : в-клітини (1:1,75) фактично не відрізняються від показників групи К (табл. 5). Острівці групи О2 найбільш "клітинні", загальне середнє число клітин в них досягає 336,31±14,82, тобто в даній групі можна говорити про гіперплазію острівкових ендокриноцитів. Причому гіперплазії піддаються як б- так і в-клітини, проте, в б-ендокриноцитах гіперпластичні процеси виражені інтенсивніше, що обумовлює зміну співвідношення б-клітини: в-клітини, яке в цій групі складає 1:1,46 (табл. 5). Встановлено, що клітини острівців Лангерганса володіють великою здатністю до проліферації і значно меншої - до гіпертрофії. У групі О3 виявляється гіпоплазія клітин, яка найбільш виражена у в-ендокриноцитах і, яка, у свою чергу, приводить до ще більшого переважання б-клітин в острівцях і зміні б: в (табл.5).

Важливу роль в порушеннях ендокринної функції ПЗ і її компенсаторно-адаптовних реакціях грають зміни нормальних кількісних співвідношень між числом різних клітин острівців, зокрема, б-та в-клітин. Тому був оцінений рівень морфо-функціональної активності ендокриноцитів різного типа островкового апарату ПЗ плодів і новонароджених, виношених в умовах ЗДА різного ступеня тяжкості за допомогою морфометричних і цитофотометричних методів дослідження. При морфометрії б- ендокриноцитів ПЗ виявлено збільшення діаметру ядер в групах О1 та О2, що свідчить про збільшення їх морфо-функціональної активності даних клітинних популяцій (табл. 6). В групі О3 активність клітин даного типу знижується, що веде до зменшення морфометричних параметрів їх ядер. Цитоплазма б-клітин збільшена тільки в групі О1, але зі зростанням материнської ЗДА клітини "втрачають" свою цитоплазму. В результаті - ЯЦІ в групах О1 і О2 значно більше одиниці.

Таблиця 6

Морфометричні параметри б- ендокриноцитів острівців ПЗ плодів і новонароджених, виношених в умовах ЗДА матері різного ступеня тяжкості

Параметр | К | О1 | О2 | О3

Яd, м х10-6 | 4,35±0,19 | 4,59±0,21 | 4,62±0,18 | 4,54±0,17

Яv, м3 х10-18 | 43,08±1,96 | 50,61±2,03* | 51,61±2,07* | 48,98±1,77*

Цv, м3 х10-18 | 54,87±2,35 | 84,03±3,85* | 32,18±1,32*^ | 26,32±1,07*?

Кd, м х10-6 | 5,72±0,26 | 6,36±0,29* | 5,43±0,21^ | 5,24±0,24*

Кv, м3 х10-18 | 97,95±3,73 | 134,64±5,33* | 83,79±3,07^ | 75,30±2,97*?

ЯЦІ | 0,785±0,026 | 0,602±0,023 | 1,603±0,036*^ | 1,861±0,054*

Примітка. * - (К – О) p<0,05

^ - (О1 – О2) p<0,05

?- (О2 – О3) p<0,05

Таким чином, можна говорити про збільшення рівня морфо-функціональної активності б- ендокриноцитів потомства при дії неважких форм ЗДА матері, і, навпаки, про пригноблення клітинної активності при впливі важкої материнської ЗДА.

Це підтверджується даними імуногістохімічного дослідження з МКАт до глюкагону (табл. 7) і даними цитофотометричного дослідження оптичної щільності ДНК в ядрах і РНК в цитоплазмі клітин даного типа.

Аналогічні тенденції зміни морфометричних і цитофотометричних параметрів виявлені і при дослідженні в- ендокриноцитів. Діаметр ядер збільшується в групі О1 і прогресивно зменшується по мірі зростання тяжкості ЗДА (табл.8). Аналогічна і динаміка зміни об'єму цитоплазми в- ендокриноцитів. Цитофотометричне і імуногістохімічне дослідження (табл. 7) підтверджують збільшення морфо-функціональної активності в-клітин в групі, і про зниження клітинних функцій по мірі зростання материнської ЗДА. Причому ступінь пригноблення рівня морфо-функціональної активності в- ендокриноцитів прямо пропорційний ступеню тяжкості ЗДА матері і обернено пропорційна - ступені зрілості плоду або новонародженого. Середня інтенсивність свічення зрізів, оброблених МКАт до інсуліну в імунофлюоресцентному світлі, підтверджує ці результати.

Таблиця 7

Середній показник інтенсивності свічення ендокриноцитів та ендотеліоцитів, а також динаміка змінення апоптозного індексу ПЗ плодів і новонароджених, досліджуваних груп після обробки препаратів МКАт

Групи | Інтенсивність свічення глюкагону, Ах10-6 | Інтенсивність світіння інсуліну, Ах10-6 | Апоптозний індекс, % | Інтенсивність свічення ендотеліоцитів, Ах10-6

К | 24,45 ± 1,76 | 24,45 ± 1,76 | 5,3±0,4 | 9,21±0,67

О1 | 28,56 ± 2,87* | 28,56 ± 2,87* | 5,8±0,52 | 9,34±0,88

О2 | 20,18 ± 1,94** | 20,18 ± 1,94** | 6,85±0,63* | 10,12±1,0*

О3 | 18,31 ± 1,01** | 18,31± 1,01** | 12,23±1,89* | 18,32±1,7*

Примітка. *(К – О) p<0,05

**(О1 – О) p<0,05

При вивченні ендокриноцитів ПЗ плодів і новонароджених від матерів з анемією різного ступеня тяжкості нами були виявлені ознаки посилення масової клітинної загибелі шляхом апоптозу. При мікроскопії апоптотичних клітин спостерігається конденсація хроматину під нуклеолеммой, пікноз ядра з гофрованими контурами, зморщення клітини та її фрагментація на апоптозні. У групі О2 такі клітини одиничні, в групі О3 їх кількість збільшується. Про посилення процесів клітинної загибелі свідчать дані плоїдометрії (табл. 9).

Таблиця 8

Морфометричні параметри в- ендокриноцитів острівців ПЗ плодів і новонароджених, виношених в умовах ЗДА матері різного ступеня тяжкості

Параметр | К | О1 | О2 | О3

Яd, м х10-6 | 5,73±0,20 | 6,73±0,31* | 6,57±0,29* | 5,35±0,18^?

Яv, м3 х10-18 | 98,46±3,37 | 159,54±5,28* | 148,43±5,17* | 80,15±3,23*

Кd, м х10-6 | 7,40±0,33 | 8,52±0,37* | 8,14±0,25* | 6,98±0,29^?

Кv, м3 х10-18 | 212,08±7,54 | 323,69±12,66* | 282,28±9,98* | 177,98±7,41*

Цv, м3 х10-18 | 113,62±4,32 | 164,15±7,33* | 133,85±6,54* | 97,83±3,96*

ЯЦІ | 0,867±0,033 | 0,972±0,027* | 1,109±0,057* | 0,819±0,031*

Примітка. * - (К – О) p<0,05

^ - (О1 – О3) p<0,05

?- (О2 – О3) p<0,05

По мірі зростання материнської анемії в острівковім апараті ПЗ нащадків збільшується кількість клітин з меншим, ніж в нормі, вмістом хроматину. Присутність в клітинній популяції клітин з анеуплоїдними ядрами свідчить про наявність процесів клітинної загибелі в них. При кореляційному аналізі цифрових даних, одержаних в результаті проведеного плоїдометричного дослідження, як в популяції б-ендокриноцитів, так і у в-клітинній популяції виявляються сильні позитивні зв'язки між тяжкістю материнської анемії і числом клітин, що гинуть. Інтенсифікація процесів масової клітинної загибелі підтверджується також даними імуногістохімічного дослідження. При проведенні непрямої реакції Кунса з використанням МКАт до CD95, з подальшим вимірюванням середньої інтенсивності свічення гістологічних зрізів в імунофлюоресцентному світлі виявлено достовірне збільшення рівня експресії CD95 і збільшення апоптозного індексу, підрахованого для ендокриноцитів острівців ПЖ (табл.7). Показник апоптозного індексу позитивно і сильно корелює з кількістю клітин, що гинуть (за даними плоїдометрії), а також має сильний позитивний кореляційний зв'язок із ступенем тяжкості анемії матері.

Паралельно із збільшенням кількості клітин, у яких ядра з неповним набором генетичного матеріалу, збільшується число клітин із поліплоїдними ядрами, а число клітин з нормальним вмістом хроматину, відповідно, зменшується (табл.9).

Таблиця 9

Питома вага б- і в-клітин з різним вмістом генетичного матеріалу в ядрах, %

Досліджувана група | Вміст хроматину в ядрах ендокриноцитів

>2С

(поліплоїдні клітини) | 2С

(нормальні клітини) | <2С

(клітини, що гинуть)

б-клітини

К | 2,14±0,43 | 95,63±12,75 | 2,11±0,39

О1 | 2,21±0,40 | 96,01±11,33 | 2,09±0,27

О2 | 4,83±1,11* | 92,37±9,73 | 2,87±0,33

О3 | 5,01±1,15* | 89,77±7,47* | 5,33±1,03*

в-клітини

К | 2,73±0,58 | 95,03±9,32 | 2,65±0,46

О1 | 2,69±0,55 | 95,31±10,12 | 2,51±0,37

О2 | 4,11±0,98* | 89,23±12,77 | 6,74±1,32*

О3 | 5,24±1,21* | 86,34±11,04* | 8,32±1,70*

Примітка. * - (К – О) p<0,05

Збільшення кількості поліплоїдних ядер свідчить про підвищення морфо-функціонального навантаження на ендокринні структури плоду при обваженні анемії матері. Поліплоїдизація ядер клітин, яку ми спостерігали в острівковому апараті плодів і новонароджених при дії ЗДА, має свій біологічний сенс. Передбачається, що поліплоїдні клітини грають корисну роль при стресових ситуаціях, тому що вони стійкіші і для них характерна підвищена біосинтетична активність. Крім того, необхідно відзначити, що поліплоїдію розглядають як один з механізмів фізіологічної регенерації.

Паренхіматозний і стромально-судинний компоненти органу або тканини є єдиною саморегульованою системою, що забезпечує мікроциркуляцію, проникність, живлення клітин і функціонування органу в цілому. У стромально-паренхіматозних взаємовідносини сполучна тканина бере участь як інтегральне ціле. В організмі, що розвивається, морфогенетичні можливості сполучної тканини зводяться до регулюючого впливу на процеси проліферації і диференціювання епітеліальних клітин, на формування структур органів в постнатальному періоді. При дослідженні паренхіматозно-стромальних взаємостосунків в ПЗ встановлено, що по мірі зростання тяжкості анемії матері в ПЗ плодів збільшується питомий об'єм стромального компоненту (табл. 10) за рахунок новоутворення міжчасточкової та внутрішньочасточкової сполучної тканини і цей показник має сильний позитивний кореляційний зв'язок із ступенем тяжкості ЗДА.

Таблиця 10

Питома вага строми, паренхіми та судинного компоненту в стромі ПЗ плодів і новонароджених від матерів з анемією різного ступеня тяжкості, % |

Строма | Паренхіма | Судини | Строма: судини

К | 18,32±3,58 | 81,70±13,32 | 7,07±1,33 | 2,59

I | 18,64±3,73* | 81,33±16,26* | 10,25±2,05* | 1,82

II | 25,11±5,02* | 74,92±14,98* | 9,72±1,94* | 2,58

III | 32,61±6,52* | 67,35±13,47* | 7,03±1,41* | 4,6

Примітка. * - (К – О) p<0,05

Як відомо, судинна система володіє високою пластичністю — здатністю перебудовуватися, піддаватися гіперплазії або, навпаки, редукції відповідно до змінних умов функціонування органів. Проведене нами визначення питомої ваги судинного компоненту в досліджуваних ПЗ виявило наявність ангіоматозу у плодів і новонароджених від матерів з анемією легкого ступеня тяжкості з подальшою редукцією судин і, як наслідок, наростанням гіпоксії і кисневого голодування паренхіматозних структурних компонентів по мірі зростання тяжкості материнської анемії (табл. 10).

Одночасно із сторони ендотеліального вистилання судин виявлено достовірне підвищення інтенсивності свічення в препаратах, оброблених МКАт до ендотеліну-1 по мірі зростання ступеню тяжкості материнської анемії (табл. 7) - коефіцієнт кореляції між цими показниками - 0,72. Відомо, що при багатьох патологічних станах відмічається збільшення вмісту ендотеліна-1 в ендотелії судин мікроциркуляторного русла і подібна картина, трактується як ознака дисфункції ендотелію.

Підводячи підсумок сказаному, слід сказати, що серед хвороб, що ускладнюють перебіг вагітності, найчастіше зустрічається анемія. Тому патологічні зміни, що виникають при анемії, зв'язані, перш за все, з хронічною гіпоксією, що несприятливо впливає на плід. Оскільки формування ендокринних структур ПЗ і часткове становлення їх функції відбувається у внутрішньоутробному періоді, на підставі наших спостережень можна зробити висновок, що мав місце негативний вплив анемії матері на формування морфологічних особливостей ПЗ і внутрішньоутробне "програмування" екзо- і ендокринної функції ПЗ. Як відомо особливості формування ПЗ в антенатальному періоді можуть лягти в основу патогенезу її захворювань, як в дитячому віці, так і в дорослому житті людини. Зміни умов внутрішньоутробного розвитку викликають порушення структури і функції острівців, які роблять довічний вплив і призводять до розвитку порушення толерантності до глюкози і цукрового діабету в дорослому житті. Одержані дані допоможуть здійснювати правильний підхід до первинної профілактики діабету і хронічних дегенеративних хвороб ПЗ.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі представлене теоретичне узагальнення та нове рішення наукової задачі, що дозволило виявити внутрішньоутробні порушення становлення структури та функції підшлункової залози, обумовлені впливом анемії.

1. 1. Під впливом материнської ЗДА в плодів і новонароджених змінюються такі соматометричні показники, як маса і довжина тіла. При ЗДА матері легкого чи середнього ступеня тяжкості маса тіла нащадків має тенденцію до підвищення, а при тяжкій ЗДА, навпаки, ? до зниження. Довжина тіла плодів і новонароджених зменшується прямо пропорційно ступеню тяжкості материнської анемії.

2. ЗДА матері приводить до збільшення морфо-функціональної активності екзокринного апарату ПЗ плодів і новонароджених. Ступінь посилення морфо-функціональної активності екзокринних клітин прямо пропорційний ступеню тяжкості материнської анемії. При тяжких формах материнської ЗДА в екзокриноцитах з'являються морфологічні ознаки вичерпаності функцій і посилення апоптозу. Тяжкість цих ушкоджень прямо пропорційна ступеню тяжкості анемії матері і зворотно – ступеню зрілості плоду чи новонародженого.

3. При патологічному впливі материнської ЗДА в плодових ПЗ змінюються розмір і щільність розташування острівців Лангерганса, що збільшується прямо пропорційно ступеню тяжкості анемії матері. При легкій ЗДА острівці збільшені, при тяжких формах анемії – зменшуються із наростанням ступеня тяжкості ЗДА.

4. Анемія матері легкого чи середнього ступеня тяжкості в ПЗ плоду реалізується підвищенням морфо-функціональної активності як б-, так і в - ендокриноцитів, їхньою гіперплазією. Тяжка ЗДА призводить до вираженого виснаження функцій ендокриноцитів ПЗ нащадків, їхньої гіпоплазії, інтенсифікації процесів масової клітинної загибелі шляхом апоптозу.

5. Посилення процесів апоптозу в ендокриноцитах плоду із наростанням ступеня тяжкості ЗДА матері більш інтенсивно виражено в в-клітинах, що приводить до зміни співвідношення між ендокриноцитами з перевагою глюкагонсинтезуючих б - ендокриноцитів над інсулінпродукуючими в-клітинами.

6. Зі збільшенням ступеня тяжкості материнської ЗДА в ПЗ потомства наростає гіпоксія, що , в свою чергу, викликає надлишкове розростання внутрі- та міжчасточкової сполучної тканини. Ступінь склерозу досліджених залоз плодів і новонароджених прямо пропорційний ступеню тяжкості материнської анемії. При цьому вплив материнської анемії легкого ступеня тяжкості викликає розвиток ангіоматозу строми. Втім, надалі наростання гіпоксії приводить до зриву адаптації і редукції судинного русла.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Лікарям-патологам слід врахувати виявлені зміни в підшлунковій залозі плодів та новонароджених від матерів з анеміями і розцінювати їх як прояви специфічних адаптаційних станів органа, зумовлених патологічним