Львівська національна академія ветеринарної медицини
Львівська національна академія
ветеринарної медицини
імені С.З.Ґжицького
ПОЛТАВЧЕНКО
ТЕТЯНА ВІКТОРІВНА
УДК 614.9.-07.637.128
Удосконалення ветеринарно-санітарного контролю
загальної кількості бактерій в молоці
відповідно до сучасних вимог
16.00.09 – ветеринарно-санітарна експертиза
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата ветеринарних наук
Львів – 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Білоцерківському державному аграрному університеті Міністерства аграрної політики України, Тернопільській дослідній станції Інституту ветеринарної медицини УААН, Інституті епізоотології УААН, м. Рівне, Рівненській обласній державній лабораторії ветеринарної медицини
Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, професор
Касянчук Вікторія Вікторівна Сумський національний
аграрний університет, завідувач кафедри технології
молока і молочних продуктів
Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, заслужений діяч
науки і техніки України Демчук Михайло Васильович
Львівська національна академія ветеринарної медицини
імені С.З.Ґжицького, професор кафедри гігієни тварин
доктор ветеринарних наук, професор
Волинець Леонід Кузьмич Інститут ветеринарної
медицини УААН (м. Київ), завідувач лабораторії
ветеринарно-санітарної експертизи
Провідна установа: Вінницький державний аграрний університет,
кафедра мікробіології, технології переробки
продуктів тваринництва та санітарної експертизи
Міністерства аграрної політики України
Захист дисертації відбудеться “16--” січня 2007 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.826.03 у Львівській національній академії ветеринарної медицини імені С.З.Ґжицького за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 50, аудиторія №1.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З.Ґжицького за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 50.
Автореферат розісланий “12” грудня 2006 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
кандидат ветеринарних наук, доцент Салата В.З.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Молоко є продуктом особливих властивостей. Це один із найкращих продуктів, що створений природою.
Проте молоко може бути і небезпечним для організму людини. Найбільшу небезпеку в молоці можуть спричинити патогенні та умовно патогенні мікроорганізми. Шляхи потрапляння мікроорганізмів у молоко дуже різноманітні, найбільш вагомими є неналежні умови отримання молока та захворювання корів на мастит.
Згідно з переліком харчових продуктів, розробленим ВООЗ, за рівнем забруднення мікроорганізмами і частотою випадків харчових отруєнь молоко і молочні продукти зараховані до першої категорії ризику.
Останніми роками в Україні спостерігається тенденція до зниження якості закупівельного молока, що обумовлено економічними і соціальними причинами, в тому числі збільшенням кількості виробництва товарного молока в особистих підсобних господарствах населення. На молокопереробні підприємства надходить більше 50% молока з цих господарств, яке в більшості випадків має значне бактеріальне забруднення тому є малопридатним для виробництва більшості молокопродуктів (О.М.Якубчак, 2005; Г.О.Єресько, 2006; Л.О.Карпенко, 2006; І.В.Гончаренко, 2006; В.І.Слободкін, 2006).
Висока бактеріальна забрудненість молока, що надходить на вітчизняні молокопереробні підприємства, - одна з найбільш вагомих перешкод на шляху підвищення якості молокопродуктів. Тому актуальним є питання аналізу стану ветеринарно-санітарних умов виробництва молока за сучасних умов та удосконалення методів контролю його мікробіологічних показників. Особливо це питання набрало актуальності з перспективою вступу України до СОТ та гострою необхідністю виробляти конкурентоспроможну молокопродукцію.
Розв’язанню проблем якості та безпеки молока повинно сприяти впровадження систем управління на всіх технологічних етапах виробництва сирого молока. Обов’язковими складовими сучасних технологічних етапів є моніторинговий контроль якості молока та ефективності технологічних операцій його одержання. (В.І.Хоменко, 1990; Я.Й.Крижанівський, В.А.Тутельян, 1998; В.Л.Козак, 2003; М.В.Демчук, 2003; Р.Й.Кравців, В.В.Касянчук, 2005).
При прийманні молока на молокопереробних підприємствах та на пунктах закупівлі молока застосовуються редуктазні проби, оскільки вони нескладні у виконанні та дають можливість швидко визначати бактеріальну забрудненість молока, що в умовах виробництва є дуже важливим. В той же час редуктазні проби мають ряд недоліків, що пов’язано з високою чутливістю цих проб до впливу різних чинників довкілля. Крім того, ефективність цих проб на даний час вивчена недостатньо, особливо за умов впровадження нових нормативів умісту загальної кількості мікроорганізмів у молоці за вимогами ДСТУ 3662-97.
Отже, виникла потреба наукового обґрунтування оцінки ефективності методів досліджень молока на загальну кількість мікроорганізмів та проведення аналізу даних щодо впливу сучасних умов отримання молока на рівень мікроорганізмів у ньому.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексної теми лабораторії ветеринарно-санітарної експертизи Тернопільської дослідної станції Інституту ветеринарної медицини УААН “Розробити систему санітарно-гігієнічних та протимаститних заходів, які забезпечать одержання молока високої санітарної якості” (номер державної реєстрації 0101 U 002305).
Мета та завдання досліджень. Мета дисертаційної роботи полягала в удосконаленні ветеринарно-санітарного контролю сирого збірного молока коров’ячого за мікробіологічними показниками та вдосконалення методів визначення його загального бактеріального забруднення.
Для досягнення поставленої мети необхідно було:–
вивчити та проаналізувати умови виробництва молока в сировинній зоні Рівненської та Тернопільської областей і дати ветеринарно-санітарну його оцінку за показниками якості та безпеки;–
провести дослідження для встановлення рівня інформативності класичного мікробіологічного методу дослідження на загальну кількість мікроорганізмів у молоці при різних температурах інкубації посівів; –
визначити ефективність редуктазних проб з резазурином та метиленовим синім і встановити чинники, що негативно впливають на результати досліджень;–
порівняти результати досліджень на загальну кількість бактерій у молоці редуктазними пробами з резазурином та метиленовим синім з результатами методу прямого посіву в чашки Петрі;–
удосконалити редуктазну пробу щодо можливості ефективного використання її для дослідження охолодженого молока; –
на підставі комплексного науково обґрунтованого аналізу редуктазної проби з резазурином розробити вдосконалену схему її застосування;–
розробити методичні рекомендації для визначення загальної кількості мікроорганізмів у молоці редуктазною пробою з резазурином, що узгоджуються з вимогами нормативів ДСТУ 3662-97.
Об’єкт досліджень: молоко коров’яче сире, санітарні умови його одержання.
Предмет досліджень: методи визначення вмісту бактерій у молоці коров’ячому сирому та їх відповідність вимогам ДСТУ 3662-97.
Методи досліджень: поставлені в роботі завдання виконувались експериментально з використанням ветеринарно-санітарних, мікробіологічних, органолептичних, а також біометричних методів досліджень.
Наукова новизна одержаних результатів полягає у проведенні ветеринарно-санітарної оцінки сирого молока, що надходить з особистих підсобних господарств населення Тернопільської та Рівненської областей через мережу пунктів закупівлі молока, оцінюванні факторів, що впливають на показники його якості та безпеки. Науково обґрунтовані середньосезонні значення кількості мікроорганізмів у молоці залежно від температури його охолодження, рівня санітарної культури, домішки маститного молока.
Теоретично та експериментально обґрунтовано ступінь інформативності редуктазних проб з резазурином та метиленовим синім порівняно з методом прямого посіву в чашки Петрі при визначенні загальної кількості мікроорганізмів у сирому молоці.
Уперше резазуринову пробу піддано системному вивченню залежно від часу та температури охолодження молока, підтверджена невисока чутливість проби до вмісту в молоці психротрофної мікрофлори.
Виявлено, що молоко з умістом ? 1 млн/см3 мікроорганізмів непридатне для зберігання в охолодженому стані, тому що активне розмноження психротрофної мікрофлори спричиняє різке погіршення його технологічних властивостей.
Експериментально підтверджено, що у сирому молоці кількість мікробів, які здатні утворювати колонії на поживному середовищі для визначення загальної кількості мікроорганізмів при температурі +30єС протягом 72 год., утричі більше, ніж тих, що утворюють колонії при +37єС протягом 48 год.
Розроблено варіант оцінки редуктазної проби з резазурином для визначення загальної кількості мікроорганізмів у молоці.
Практичне значення одержаних результатів. Для ефективного визначення загальної кількості мікроорганізмів у сирому молоці рекомендовано використовувати розроблену схему оцінки редуктазної проби з резазурином, яка має більш об’єктивні показники порівняно з використанням редуктазної проби з метиленовим синім.
Запропоновано триетапну схему оцінки резазуринової проби та умови її застосування, що дає можливість визначати загальну кількість мікроорганізмів у сирому молоці за нормативами ДСТУ 3662-97.
Результати досліджень, що викладені в дисертаційній роботі, увійшли до:“
Ветеринарні та санітарні вимоги до особистих підсобних господарств населення-виробників сирого товарного молока” (затверджені наказом Держдепартаменту ветеринарної медицини України №17 від 21.03.2002 р.);“
Ветеринарні та санітарні вимоги до пунктів закупівлі молока від тварин, які утримуються в особистих підсобних господарствах населення” (затверджені наказом Держдепартаменту ветеринарної медицини України №18 від 21.03.2002 р.); “
Методичні рекомендації щодо ветсанекспертизи молока і молочних продуктів” (для слухачів Інституту післядипломного навчання керівників і спеціалістів ветеринарної медицини – ІПНКСВМ), затверджених радою ФВМ Білоцерківського ДАУ, протокол №7 від 25 лютого 2002 р.
Особистий внесок здобувача. Дисертантка самостійно провела пошук літературних джерел, упорядкувала огляд літератури за темою дисертації, розробила схеми та порядок виконання експериментальних робіт, освоїла та використала усі описані в роботі методики. Самостійно провела експериментальні дослідження та теоретичну інтерпретацію їх результатів. За участю наукового керівника визначила напрям наукових досліджень, зробила узагальнення отриманих результатів, оформила наукові статті.
Апробація результатів дисертації. Основні результати експериментальної роботи доповідались на: Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 150-річчю з дня заснування Харківського зооветеринарного інституту, “Проблеми зооветеринарії та ветеринарної медицини” (Харків, 2001); Міжнародній науковій конференції “Сучасна аграрна наука і напрямки, проблеми і шляхи їх вирішення”, (Львів 2001); Науковій конференції докторантів і аспірантів “Тиждень науково-дослідної роботи молодих учених та студентської молоді” (Б.Церква, 2002); Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 25-річчю створення Інституту ветеринарної медицини УААН “Біотехнологія у ветеринарній медицині” (Київ, 2002); Міжнародній науково-практичній конференції “Досягнення та перспективи розвитку ветеринарної науки”, (Полтава, 2000); Міжнародній науково-практичній конференції: “Екотрофологія. Сучасні проблеми” (Б.Церква, 2005).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових праць, серед яких 6 – у наукових виданнях, що входять до переліку, затвердженого ВАК України.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 141 сторінці комп’ютерного тексту та складається з наступних розділів: вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел літератури, додатків. Робота ілюстрована 25 таблицями та 16 рисунками. Список використаних джерел літератури включає 216 найменувань, у тому числі українською та російською мовами – 175, іншими мовами – 41.
Загальна методика ТА основні МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Робота виконана в Білоцерківському ДАУ, Тернопільській дослідній станції Інституту ветеринарної медицини УААН, Інституті епізоотології УААН, м. Рівне, Рівненській обласній державній лабораторії ветеринарної медицини та на молочних заводах і пунктах закупівлі молока Рівненської та Тернопільської областей в період 2000-2005 рр.
Робота складалася з основних шести блоків досліджень. Перший блок охоплював комплекс моніторингових досліджень сирого молока, що надходило від пунктів закупівлі молока від особистих підсобних господарств населення та колективних господарств. Результати виконання програми першого блоку дали можливість визначити фактичний рівень якості молока, ефективності його первинної обробки, заготівлі та передачі на переробні підприємства. Виявлено також ті фактори, які необхідно враховувати при розробці нової схеми оцінки редуктазної проби з резазурином.
Другий і третій блоки присвячені вивченню ідентичності та ефективності стандартних методів визначення вмісту бактерій у молоці посівом у чашки Петрі з інкубацією при +37°С і +30°С, а також редуктазних проб з метиленовим синім та резазурином.
Четвертий блок – визначення можливості використання резазуринової проби для контролю молока за мікробіологічними нормативами стандарту – ДСТУ 3662-97.
П’ятий та шостий блоки присвячені розробці нової схеми використання резазуринової проби, за допомогою якої можна було б визначати якість молока за мікробіологічними нормативами ДСТУ 3662-97, а також апробації цієї схеми у виробничих умовах.
Відбір зразків молока, змивів з молочного посуду і доїльних апаратів, з об’єктів довкілля ферми, доставку їх у лабораторію проводили відповідно до “Санитарных правил по уходу за доильными установками, аппаратами и молочной посудой, контролю их санитарного состояния и санитарного качества молока” (1987), мікробіологічний аналіз виконали згідно з вимогами ГОСТ 9225-84, та ДСТУ 3662-97.
Наявність у молоці збірному домішки молока корів, хворих на мастит, виявляли за допомогою препарату мастоприм згідно з ГОСТ 23453-90 та методичними рекомендаціями “Мастит сільськогосподарських тварин”, Київ, 1997. Вміст психротрофної мікрофлори в молоці визначали посівом його децимальних розведень у чашки Петрі з середовищем для визначення загальної кількості мікроорганізмів при температурі інкубації +6С протягом 10-12 діб. Уміст води в молоці визначали за допомогою приладу “Лактан”. Температуру молока визначали за ГОСТ 26754-85 “Молоко. Методы измерения температуры”. Наявність інгібіторів у молоці виявляли згідно з ГОСТ 23454-79 “Молоко. Методы определения ингибирующих веществ”. Визначення густини молока проводили згідно з ГОСТом 3625-84 “Молоко и молочне продукты. Методы определения плотности”.
При визначенні якості молока, яке надходило на переробку, досліджено 444 проби, з них на вміст води – 276 проб.
Для виявлення основних джерел надходжень у молоко мікроорганізмів другої температурної групи досліджено 40 проб змивів зі шкіри дійок вимені корів, з доїльних апаратів і молочного посуду – 166 змивів. Досліджено 24 зразки грубих кормів, 10 проб фекалій корів, 16 проб повітря. Для порівняльних досліджень редуктазних проб і методу посіву на чашки Петрі досліджено 337 проб сирого молока. При розробці нового варіанта оцінки редуктазної проби з резазурином використано 249 зразків молока.
Результати досліджень підлягали біометричній обробці за П.Ф.Рокітським (1973), з використанням комп’ютерної програми Excel. Різницю з контролем вважали вірогідною при p<0,05, p<0,01, p<0,001.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ та їх аналіз
Ветеринарно-санітарна оцінка умов отримання молока сирого
та визначення показників його якості та безпеки
Визначено, що в Рівненській та Тернопільській областях від 81,2% до 92,4% корів зосереджено в особистих підсобних господарствах, за рахунок яких переробні підприємства одержують 87-92 % молока. Збір молока здійснюється через мережу закупівельних пунктів, розташованих у пристосованих приміщеннях. Охолоджувачами забезпечені 5,5-2,4 % закупівельних пунктів.
Влітку молоко вищого ґатунку на переробні підприємства не надходило, неґатункове (мікробне число від 4 до 50 млн.) становило від 82,8% до 86,4%. Взимку кількість неґатункового молока знижувалась до 41,3%, основна його маса оцінювалася другим ґатунком з середнім умістом бактерій від 1-2,5 млн/см3. Вірогідної різниці щодо вмісту мікроорганізмів у молоці, що надходило з колективних господарств і від пунктів закупівлі молока від тварин, які утримуються в особистих підсобних господарств населення, – не виявлено.
Молоко густиною ? 1028 кг/м3 не містило домішки води, за густини 1027,9-1027,0 кг/м3 в 38,0% проб молока була встановлена наявність більше 0,5% води, за густини 1026,9-1026,0 кг/м3 таких проб налічувалося 95,2%, за густини ? 1025,9 кг/м3 і менше всі проби молока містили більше 1,0% доданої води. Додавання до молока води невідомого походження підвищує рівень його небезпеки. Отже, густину молока необхідно вважати показником його безпеки.
Визначено, що система заготівлі молока через мережу пунктів закупівлі потребує докорінної реорганізації. Ветеринарно-санітарні вимоги до їх комплектації обладнанням, система оцінки якості молока, його первинної обробки викладені в нормативно-методичному документі “Ветеринарні та санітарні вимоги до пунктів закупівлі молока від тварин, які утримуються в особистих підсобних господарствах населення” (2002).
Експериментально підтверджено, що до 80,0% мікрофлори свіжонадоєного збірного молока формується за рахунок мікрофлори доїльного обладнання та молочного посуду, санітарна обробка якого виконується незадовільно.
Порівняльна характеристика методів визначення вмісту бактерій у молоці
Для характеристики редуктазних проб з метиленовим синім та резазурином, а також методу прямого посіву у чашки Петрі досліджено 337 проб молока збірного свіжонадоєного через 2-3 години після доїння корів. Дослід проведено за ГОСТ 9225-84 в його першій редакції з тим, щоб дотриматися нормативів, за якими розроблялися редуктазні проби в їх першій редакції. Результати досліджень подані в таблиці 1.
Дані таблиці 1 свідчать, що результати редуктазних проб мали більшу вірогідність при дослідженні молока першого класу і збігалися з результатами досліджень, отриманих шляхом прямого підрахунку колоній в 91,9-96,4 % випадків.
Встановлено також, що із збільшенням загальної кількості мікроорганізмів у досліджуваному молоці редуктазні проби більш чутливі порівняно з методом посіву у чашки. Так, з 91 проби молока, оцінених пробою з резазурином другим класом, прямим посівом 71 проба (78,0%) зарахована до першого класу, і тільки 20 проб – до другого. У принципі такі ж результати одержані за проби з метиленовим синім.
Виявлено також, що проба з резазурином має значно більшу чутливість, ніж проба з метиленовим синім.
Таблиця 1
Порівняння результатів редуктазних проб з резазурином
та метиленовим синім (n=337, М±m)
Редук-тазна проба |
Клас мо-лока | Кількість проб молока |
% | Уміст бактерій, визначений посівом у чашки тис./см3 | ? 500 | 501-4000 | 4000-20000 | > 20000 | Кіль-кість
проб |
% | Кіль-кість
проб |
% | Кіль-кість
проб |
% | Кіль-кість
проб |
% | З реза-зури-ном | 1
2
3
4 | 168
91
78
- | 49,8
27,1
23,1
- | 162
71
12
- | 96,4
78,0
15,4
- | 6
20
44
- | 3,6
22,0
56,4
- | -
-
18
- | -
-
23,1
- | -
-
4
- | -
-
5,1
- | з ме-тиле-новим синім | 1
2
3
4 | 223
73
40
1 | 66,3
21,8
11,9
- | 205
40
-
- | 91,9
54,8
-
- | 18
30
17
- | 8,1
41,1
42,5
- | -
3
19
- | -
4,1
47,5
- | -
-
4
1 | -
-
10,0
0,3 |
Встановлено, що при додаванні до збірного молока (n=71) першого класу за редуктазними пробами 5,0% молока з чверток, уражених субклінічним маститом, пробою з резазурином переводиться в другий клас 57,1% проб молока. Проба з метиленовим синім малочутлива до домішки молока з хворих чверток, при наявності у молоці 50,0% молока з чверток, уражених субклінічним маститом, вона реагує зниженням класу всього в 21,3% випадків.
При наявності у молоці соматичних клітин у межах 800 тис/см3 резазуринова проба виявляє чутливість в 41,2%, а редуктазна проба з метиленовим синім – лише у 5,9%. Отже, за умови роздільного доїння хворих на мастит та здорових корів проблема зниження якості молока та рівня його безпеки при застосуванні резазуринової проби буде розв’язана.
З метою оцінки інтенсивності зміни кольору суміші молока і розчину резазурину в процесі постановки редуктазної проби нами було введено позначення цифрами основних кольорів та їх відтінків, які реєструються під час визначення загальної кількості мікроорганізмів в молоці: синій колір – 1, фіолетовий – 2, фіолетово-рожевий – 3, рожево-фіолетовий – 4, рожевий – 5, слабо-рожевий – 6, білий – 7. Це дало можливість при дослідженні проб молока визначати середнє цифрове значення кожного кольорового показника в гамі кольорів редуктазної проби з резазурином через встановлені проміжки часу обліку. Середні цифрові дані були перенесені на графік. На рисунку 1 показано результати дослідження молока відразу після доїння корів і того ж молока через 2 години.
Рис. 1. Результати резазуринової проби при дослідженні молока після видоювання корів і через 2 години (n=12)
Примітка. ¦-----------¦ зміна кольору при дослідженні молока відразу після видоювання корів.
¦____________¦ зміна кольору при дослідженні цього ж молока через 2 години.
Встановлено, що при визначенні класу молока через 2 години після доїння результат зменшується в середньому на 0,6 цифрового показника кольору суміші молока і розчину резазурину.
Отже, протягом 2 годин властивості молока щодо відновлення резазурину стабілізуються, що дає можливість одержувати більш об’єктивні результати. Виявлено, що додавання до молока 5,0% води на одну цифрову позначку гальмує відновлення кольору резазурину.
Проведеними дослідженнями виявлено, що варіант резазуринової проби при температурі інкубації +37С є оптимальним. Незначне прискорення процесу відновлення резазурину при +43С до (0,3 цифрового значення) не є суттєвим порівняно з цією ж реакцією при +37С. Відновлення резазурину при +30С уповільнюється на 0,2-0,3 цифрового значення його кольору.
Результат визначення співвідношення загальної кількості мікроорганізмів у молоці, що визначалися методом прямого посіву за температури інкубації посівів при +37°С та +30°С наведені в таблиці 2.
Таблиця 2
Результати дослідження молока методом прямого посіву за інкубації
при +37°С та +30°С (n=444)
Ґатунок молока за ДСТУ
3662-97 | Кількість проб молока | Загальна кількість бактерій, тис./см3 | Співвідношення результатів досліджень при температурі
+37С до +30С | температура | +37С | +30С | Літо | Вищий | 162 | 50,4±2,8 | 119,3±6,3** | 1:2,4
Перший | 46 | 163,2±9,4 | 429,2±17,7** | 1:2,6
Другий | 63 | 420,9±19,9 | 1800,0±28,7*** | 1:4,3 | Середнє 1:3,1 | Зима | Вищий67 | 40,5±3,1 | 141,6±4,8*** | 1:3,5
Перший | 31 | 125,5±3,6 | 432,4±5,0*** | 1:3,4
Другий | 63 | 415,9±7,7 | 1890,0±85,3*** | 1:4,5 | Неґатункове | 12 | 2355,0±21,3 | 8450,0±36,9*** | 1:3,6 | Середнє 1:3,8 | Примітка. Рівень вірогідності p<0,01**, p<0,001***
Як видно з таблиці 2, результати визначення вмісту бактерій у молоці методом прямого посіву за температури інкубації +37°С протягом 48 годин (перша температурна група мікрофлори молока) відрізняються від результатів, отриманих методом з інкубацією посівів при +30°С протягом 72 годин (друга температурна група мікрофлори молока). Кількість мікробів другої групи в 2,4-3,6 раза більша від мікробів першої групи
Вивчення властивостей резазуринової проби із застосуванням передінкубації
Враховуючи необхідність охолодження молока і тимчасового його зберігання на фермах чи на закупівельних пунктах в охолодженому стані, ми провели визначення динаміки мікробіологічного процесу в молоці, охолодженому до різних температур. Досліджували проби, відібрані від охолодженого до +6°С молока, що було отримане влітку та взимку. Проби (n=113) відбирали від партій молока, що зберігалось при вищезазначеній температурі 6, 24, 48, 72 год.
Визначення загальної кількості мікроорганізмів проводили методом прямого посіву при температурі інкубації +37±1°С; +30±1°С; +6±1°С. Мікроорганізми, що росли при зазначених вище температурах, умовно поділяли на першу, другу, третю температурні групи.
Встановлено, що молоко, витримане охолодженим протягом 48 год. взимку і влітку, відрізнялось за складом мікроорганізмів зазначених вище груп. Молоко взимку містило більше мікроорганізмів другої та третьої температурних груп. У літньому молоці відзначали значне зменшення мікроорганізмів третьої групи.
Результати досліджень підтверджують об’єктивність визначення загальної кількості мікроорганізмів у молоці при +30°С протягом 72 год.
Тенденція до більш активного розмноження мікрофлори літнього молока спостерігається за рахунок двох груп мікроорганізмів, і тільки через 48-72 години починається прискорене розмноження бактерій третьої групи. У молоці зимовому збільшення вмісту бактерій відбувається за рахунок другої і особливо третьої групи (рис. 2).
Як видно з рис. 2, швидкість розмноження мікроорганізмів в охолодженому молоці, що отримане взимку, значно уповільнена порівняно до швидкості розмноження мікроорганізмів в молоці, що отримане літом.
Для більш об’єктивної оцінки охолодженого молока, яке зберігалось в охолодженому стані при температурі +6±1єС рекомендована редуктазна проба з передінкубацією, тобто, з попередньою витримкою молока протягом певного часу до проведення досліджень. Автори (Денис Р., 1972; Даниленко І.П., 1975) повідомляють різні варіанти методів щодо температури попередньої витримки так і що до її часу.
Результати даних досліджень показали, що при дослідженні охолодженого до +6±1єС молока із загальною кількістю мікроорганізмів в ньому більше 3 млн/см3 воно оцінювалось редуктазною пробою, як гатункове. Встановлено, що за умови незначного початкового мікробного обсіменіння охолодженого молока за період передінкубації відбувалося незначне збільшення кількості мікроорганізмів, яке не впливало на результат редуктазної проби. У молоці із значним початковим умістом бактерій до охолодження (в межах 4-5млн/см3) при дослідженні його через 24-48 год. резазуриновою пробою в результаті її недостатньої чутливості при дослідженні охолодженого молока не одержують об’єктивних результатів. Молоко в цьому випадку оцінюють як гатункове. Отже, відрізнити охолоджене молоко з незначним умістом бактерій від молока із значним їх вмістом неможливо. При аналізі результатів резазуринової проби отриманих із застосуванням передінкубації проб охолодженого молока нами, було встановлено, що найбільш оптимальними параметрами перендінкубації охолодженого молока слід вважати температуру (+14±1єС) та термін протягом 7 годин. У цьому випадку молоко оцінювалось резазуриновою пробою вищим ґатунком за умови, коли початковий вміст бактерій у ньому знаходився в межах 30 тис./смі.
Отже, резазуринову пробу з передінкубацією можна застосувати при дослідженні молока для виготовлення продуктів дитячого харчування.
Рис. 2. Розмноження мікрофлори молока при зберіганні його при температурі +6С
Примітка. ¦ ¦ друга температурна група +30С (зима)
^ ^ третя температурна група +6С (зима)
¦ ¦ друга температурна група +30С (літо)
х х третя температурна група +6С (літо)
Розробка варіантів резазуринової проби.
Розробка варіанта для вибракування неґатункового за ДСТУ 3662-97 молока
Результат резазуринової проби визначається за певним кольором – від синього, фіолетового до рожевого та білого. Метою даної серії досліджень було визначення взаємозв’язку між загальною кількістю бактерій у молоці з появою відповідного кольору в ході резазуринової проби.
Облік результатів резазуринової проби проводили через 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 90 хвилин. Проби молока паралельно досліджували на вміст бактерій методом прямого посіву.
Виявлено, що результати, обліковані через 10 та 15 хвилин, неінформативні. Варіант двадцятихвилинний виявився прийнятним для виявлення негатункового молока (табл. 3). Була виявлена кольорова гама, що встановлюється протягом 20 хв. При цьому поділ молока на ґатункове та неґатункове пролягає між фіолетовим і фіолетово-рожевим кольорами. Крім того, визначено, що результати резазуринової проби, які отримують через 20 хвилин, мають похибку в межах 12,5-28,4 %.
Отже, з відносно невеликою похибкою протягом 20 хв. резазуриновою пробою можливо визначити молоко, що належить до гатункового та неґатункового
Таблиця 3
Результати оцінки зміни гами кольорів двадцятихвилинної
резазуринової проби для виявлення
молока неґатункового (n=191)
Колір суміші молока і розчину резазурину | Кількість проб молока | Загальна кількість мікроорганізмів в 1 см3 молока | ґатункове | неґатункове | ? 300 | 301-500 | 501-3000 | 3001-5000 | > 5000
Синій | 108 | 20 | 14 | 50 | 4 | 20 | Фіолетовий | 40 | 10 4 8
106=71,6 % | 4 14
42=28,4 % | всього
по групі | 148 | Фіолетово-рожевий | 16 | - | - | 2=12,5 % | 2 | 12 | Рожево-фіолетовий | 12 | - | - | - | 2 | 10 | Рожевий | 15 | - | - | - | - | 15 |
При оцінюванні результатів резазуринової проби через 60 хвилин отримали дані, що висвітлені в таблиці 4
Як видно з таблиці 4, для одногодинної резазуринової проби інформативними є колір фіолетово-рожевий, яким можна розмежувати молоко ґатункове і неґатункове. Величина похибки 6,2-18,6 %.
Таблиця 4
Оцінка одногодинної резазуринової проби для визначення ґатункового молока за гамою кольорів (n=408)
Колір суміші молока і розчину резазурину | Кількість проб молока | Загальна кількість мікроорганізмів в 1 см3 молока | ґатункове | неґатункове
? 300 | 301-500 | 501-3000 | 3001-5000 | > 5000
Синій | 124 | 71 | 16 | 26 | 4 | 7
Фіолетовий | 72 | 18 | 6 | 33 | 1 | 14 | Фіолетово-рожевий | 35 | 4 | 4 | 10 | 5 | 12 | Всього
по групі | 231 | 93 26 69
188=81,4 % | 10 33
43=18,6 % | Рожево-фіолетовий | 49 | 3 | 1 | 1 | 7 | 37 | Рожевий | 48 | 1 | 2 | 2 | 7 | 36 | Блідо-рожевий
і білий | 80 | - | - | 1 | 18 | 61 | Всього по групі | 177 | 4 | 3 | 4 | - | -
11= 6,2 % |
В таблиці 5 подано результати півторагодинної резазуринової проби для визначення молока вищого ґатунку.
Дані таблиці 5 свідчать, що при дослідженні резазуриновою пробою молока, яке містить до 300 тис./см3 мікроорганізмів після півторагодинної експозиції характерним є фіолетово-рожевий колір.
Оскільки різниця між мікробним числом 300 тис. та 500 тис. для резазуринової проби практично непомітна, слід констатувати, що верхня межа чутливості редуктазної проби є кількість мікроорганізмів ? 500 тис. в 1 см3 молока. Півторагодинна резазуринова проба виявляє 57,9% молока із зазначеним вище вмістом мікроорганізмів. Для дослідження молока півторагодинною резазуриновою пробою необхідно проводити додаткові дослідження на наявність інгібіторів та домішок води.
Таблиця 5
Оцінка півторагодинної резазуринової проби для визначення молока вищого ґатунку за гамою кольорів (n=240)
Колір
суміші молока і розчину резазурину | Кількість проб молока | Загальна кількість мікроорганізмів тис./см3 | ґатункове | неґатункове
? 300 | 301-500 | 501-3000 | 3001-5000 | > 5000
Синій | 5 | 4 | 1 | - | - | -
Фіолетовий | 36 | 12 | 6 | 18 | - | - | Фіолетово-рожевий | 73 | 28 | 15 | 14 | 3 | 13 | Всього по групі | 114 | 44 22 32=28,1 %
66=57,9 % | 3 13
16 =14,0 % | Рожево-фіолетовий | 31 | 3 | 6 | 12 | - | 10 | Рожевий | 65 | 12 | 2 | 3 | 12 | 36 | Блідо-рожевий
і білий | 30 | - | 2 | 10 | 3 | 15 | Всього по групі | 126 | 15 | 10 | 25 | 15 | 61 | 25 = 19,8 % |
На підставі проведених досліджень була розроблена схема оцінки резазуринової проби, за допомогою якої можна поділити молоко на ґатункове і неґатункове, а також визначити молоко вищого редуктазного класу за умови обов’язкового паралельного дослідження його на можливий уміст інгібіторів та домішки води.
Запропонована схема оцінки резазуринової проби полягає в такому. Перші результати обліковують через 20 хв. і визначають ті проби, які належать до неґатункових. Через 60 хв. проводять повторний облік результатів і додатково визначають зразки неґатункового молока, при цьому визначають також ґатункове молоко (перший та другий ґатунок). Через 90 хв. проводять остаточний облік результатів, виділяють ті зразки, які можна зарахувати до вищого класу.
Паралельно досліджують всі зразки ґатункового молока на наявність домішки води, а також на вміст інгібіторів та соматичних клітин. Одержані результати, а також результати інших досліджень (температура молока при доставці на переробку, чистота, кислотність, густина), що визначені ДСТУ 3662-97, узагальнюють і остаточно визначають ґатунок молока.
Проведення поділу молока за вмістом мікроорганізмів у ньому на перший та другий класи можливо здійснити лише методом прямого посіву.
ВИСНОВКИ
1. На основі зібраних і проаналізованих в двох областях матеріалів дано науково обгрунтовану ветеринарно-санітарну характеристику поширеній в Україні системі заготівлі молока через мережу пунктів його закупівлі. Встановлено, що серед основних чинників, що впливають на ступінь мікробного забруднення молока виділяється недостатній рівень гігієни утримання корів і санітарної обробки вимені і доїльного обладнання, первинної обробки і зберігання молока.
Теоретично та експериментально обґрунтовано ступінь інформативності редуктазних проб при визначенні загальної кількості мікроорганізмів у сирому молоці.
2. На молокопереробні підприємства Рівненської та Тернопільської областей надходить 87-92 % товарного молока від особистих підсобних господарств населення і лише 8-13% з ферм виробничих аграрних об’єднань. Якість молока в обох випадках незадовільна, кількість неґатункового молока влітку досягає 70,9-74,5 %, взимку – 65,1-66,4 %.
3. Експериментально підтверджено невідповідність результатів дослідження молока на вміст мікроорганізмів методом прямого посіву у чашки Петрі за інкубації +37С протягом 48 годин та при +30С протягом 72 год. У другому випадку виявляється бактерій влітку в 3,1 раза, взимку – в 3,8 раза більше, ніж при використанні першого варіанта.
4. При одночасному дослідженні молока редуктазними пробами (з метиленовим синім, резазурином) та методом посіву у чашки Петрі виявлено, що результати трьох методів дослідження молока першого класу збігаються у 91,9-96,4 % випадків. Із збільшенням загальної кількості мікроорганізмів у молоці редуктазні проби виявилися більш чутливими порівняно з методом посіву у чашки Петрі: проба з резазурином – на 50,9%, з метиленовим синім – на 33,0%. Проба з резазурином чутливіша за пробу з метиленовим синім на 11,2-16,5 %.
5. Проба з резазурином у 57,1% випадків реагує зниженням якості молока на один клас при наявності в ньому 5,0% молока з чверток вимені, уражених субклінічним маститом. Проба з метиленовим синім тільки в 21,7% випадків реагує на наявність у збірному молоці 50% такого молока.
6. Вивчено вплив окремих чинників на результати резазуринової проби: температури та часу інкубації, наявність домішок води чи інгібіторів у молоці. Визначено, що температура +37°С є оптимальною для постановки резазуринової проби, термін дослідження не більше ніж 1,5 години. Наявність у молоці 5,0% і більше води зменшує чутливість проби на 10,0-12,0 %.
7. Розроблено науково обґрунтований триетапний варіант резазуринової проби для визначення мікробіологічного класу молока згідно з нормативними вимогами ДСТУ 3662-97. Встановлено, що редуктазною пробою визначення молока першого та другого класів у діапазоні мікробного числа від 300 до 500 тис./см3 неможливе.
8. Розроблено варіант постановки резазуринової проби з передінкубацією протягом 7 годин за температури +13...+14°С для оцінки охолодженого молока, який дає можливість відбирати молоко з умістом до 30 тис./см3. Метод може бути застосований при одержанні молока для виробництва продуктів дитячого харчування.
9. Об’єктивні результати оцінки охолодженого молока на загальне мікробне обсіменіння резазуриновою пробою можна отримати тільки в перші 24 години після видоювання корів, тому, що темпи розмноження психротрофної групи мікрофлори молока, охолодженого до +6...+8°С, значно зростають через 30-48 годин його зберігання.
ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ
1. Розроблені нами науково обґрунтовані ветеринарно-санітарні та організаційні рекомендації щодо виробництва молока в селянських підсобних господарствах та закупівлі його через мережу пунктів збору, внесені до таких документів:
- “Ветеринарні та санітарні вимоги до особистих підсобних господарств населення – виробників сирого товарного молока” (затверджені наказом Держдепартаменту ветеринарної медицини України №17 від 21.03.2002 р.);
- “Ветеринарні та санітарні вимоги до пунктів закупівлі молока від тварин, які утримуються в особистих підсобних господарствах населення” (затверджені наказом Держдепартаменту ветеринарної медицини України №18 від 21.03.2002 р.).
Вказані документи зареєстровано в Міністерстві юстиції України 5.04.02 р. за № 336/6624 та № 337/6625.
2. При відборі молока, придатного для виробництва продуктів дитячого харчування, доцільно використовувати розроблену нами резазуринову пробу з передінкубацією, яка дає змогу визначати молоко з умістом бактерій до 30 тис./см3, придатного для виробництва продуктів дитячого харчування.
3. Результати окремих досліджень, що викладені в дисертаційній роботі, увійшли до “Методичних рекомендацій щодо ветсанекспертизи молока і молочних продуктів” (для слухачів Інституту післядипломного навчання керівників і спеціалістів ветеринарної медицини – ІПНКСВМ), затверджених радою ФВМ Білоцерківського ДАУ, протокол № 7 від 25 лютого 2002 р.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Полтавченко Т.В. Сучасні правові й нормативні аспекти ветеринарно-санітарної експертизи на ринках // Ветеринарна медицина України. – 1999. – №6. – С. 41.
2. Полтавченко Т.В. Порівняльна характеристика проб на редуктазу для оцінки якості молока // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини. –Харків, 2001. – Вип. 9 (33). Част. 2. – С.128–131.
3. Полтавченко Т.В. Придатність резазуринової проби за ГОСТ 9225–84 для визначення мікробіологічної якості молока згідно з вимогами ДСТУ 3662–97 “Молоко коров’яче збиране. Вимоги при закупівлі” // Науковий вісник Львівської державної ветеринарної академії імені С.З.Ґжицького. – Львів, 2001. – Т. 3. – № 3.– С.180–182.
4. Полтавченко Т.В. Прискорена резазуринова проба для визначення молока некондиційного за ДСТУ 3662–97 // Ветеринарна біотехнологія. Бюлетень. – Київ, 2002. – № 2. – С.191–193.
5. Полтавченко Т.В. Десятихвилинна резазуринова проба для відбраковки некондиційного молока // Вісник Полтавської державної аграрної академії – Полтава, 2002. – Т. 2 ( 21 ). – С. 239–240.
6. Крижанівський Я.Й., Полтавченко Т.В., Даниленко І.П., Остапів Н.М., Климик В.Т., Лисенко С.А. До проблеми визначення мікробіологічної якості молока за вимогами ДСТУ 3662–97 // Ветеринарна медицина України. – 2002. – №10. – С. 34–35. (Дисертантка провела і організувала лабораторні дослідження, обробила та узагальнила отримані результати, підготувала роботу до друку).
7. Касянчук В.В., Крижанівський Я.Й., Даниленко І.П., Кухтин М.Д., Полтавченко Т.В. Вдосконалення ветеринарно-санітарного контролю виробництва молока на фермі – основний важіль у забезпеченні населення високоякісною продукцією // Екотрофологія. Сучасні проблеми. – Б.Церква, 2005. – С. 105–108. (Дисертантка провела і організувала лабораторні дослідження, обробила та узагальнила отримані результати, підготувала роботу до друку).
8. Касянчук В., Крижанівський Я., Даниленко І., Полтавченко Т. Ретельний контроль виробництва молока на фермі – основний важіль у забезпеченні населення високоякісною продукцією // Тваринництво України. – 2006. - №4. – С. 20-22. (Дисертантка провела і організувала лабораторні дослідження, обробила та узагальнила отримані результати, підготувала роботу до друку).
Анотація
Полтавченко Т.В. Удосконалення ветеринарно-санітарного контролю загальної кількості бактерій в молоці відповідно до сучасних вимог. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.09 – ветеринарно-санітарна експертиза. – Львівська національна академія ветеринарної медицини імені С.З.Ґжицького. – Львів, 2006.
В дисертації висвітлені проблеми оцінки якості та безпеки сирого молока за мікробіологічними показниками згідно з нормативами ДСТУ 3662-97.
Вперше дано науково обґрунтовану ветеринарно-санітарну характеристику поширеної
