Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Сиволоб Андрій Володимирович

УДК 577.323.2 : 576.315.42

Молекулярні механізми структурної динаміки хроматину

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі загальної та молекулярної генетики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Рибальченко Володимир Корнійович,

НДІ фізіології імені академіка Петра Богача Київського національного університету імені Тараса Шевченка, завідувач відділу цитофізіології

доктор біологічних наук, професор

Корнелюк Олександр Іванович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу білкової інженерії

доктор фізико-математичних наук

Волков Сергій Наумович,

Інститут теоретичної фізики імені М.М.Боголюбова НАН України, провідний науковий співробітник

Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О.Богомольця, м. Київ.

Захист відбудеться “ 24 ” травня 2006 р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 215

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “ 4 ” квітня 2006 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради О.В. Цимбалюк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. ДНК в еукаріотичних клітинах існує тільки у вигляді складного комплексу з білками, який називають хроматином, і який, власне, є фізичним субстратом апарату спадковості. Головним білковим компонентом хроматину є позитивно заряджені білки – гістони. Завдяки електростатичним взаємодіям так званих корових гістонів з ДНК утворюється елементарна структурна одиниця хроматину – нуклеосома. Взаємодія нуклеосом із лінкерними гістонами призводить до компактизації структури та формування фібрили хроматину товщиною 30 нм. Суттєвим моментом організації хроматину є та обставина, що хроматинова фібрила формує петлі, кінці яких є жорстко закріпленими на скелетних структурах клітинного ядра. Тобто ДНК петлі є топологічно еквівалентною до циркулярної ДНК.

На сьогодні досягнуто значного прогресу щодо розуміння детальної молекулярної структури нуклеосоми на підставі, в першу чергу, кристалографічних досліджень (Luger et al., 1997; Richmond and Davey, 2003). Але це стосується статичної структури нуклеосоми. Численні дослідження особливостей функціонування хроматину in vivo призвели до фундаментального уявлення, що хроматин у цілому і нуклеосома зокрема, є динамічними утвореннями, здатними до певних конформаційних перебудов. Характер та молекулярні механізми таких перебудов здебільшого залишаються недостатньо вивченими. Структурні перетворення нуклеосоми, що залежать від зміни зовнішніх умов, є добре відомими завдяки дослідженням in vitro, але у відповідь на досить екстремальні впливи, які є далекими від фізіологічних. До цілком фізіологічних факторів слід віднести зміни топологічного стану циркулярної ДНК (або ДНК у складі ядерних петель), вплив яких на структуру нуклеосоми є практично не дослідженим.

Проблема молекулярних механізмів конформаційної динаміки нуклеосоми та хроматину в цілому є тісно пов'язаною із загальним розумінням молекулярних механізмів нуклеопротеїнових взаємодій у складі хроматину, серед яких можна відокремити два ключові моменти: неспецифічні електростатичні взаємодії, що стабілізують хроматин; вплив специфічної послідовності пар основ ДНК, який призводить до феномена переважного позиціювання нуклеосом відносно послідовності, що має велике значення для функціонування геному. Існуючі якісні уявлення щодо вказаних механізмів нуклеопротеїнових взаємодій не дозволяють кількісно описати відповідні процеси.

Дисертація присвячена розв’язанню наукових проблем, що пов’язані з молекулярними механізмами електростатичних нуклеопротеїнових взаємодій у складі хроматину, позиціювання нуклеосом відносно послідовності пар основ ДНК, конформаційної динаміки нуклеосом у складі циркулярної ДНК за фізіологічних умов. Указані проблеми мають велике значення для розуміння загальних принципів нуклеопротеїнових взаємодій та молекулярної організації й функціонування апарату спадковості, фізичним субстратом якого є хроматин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у тісному зв'язку з науково-дослідними темами “Особливості структурної організації хроматину еукаріот, які визначають ефективність дії на ДНК фізичних та хімічних факторів” (№ держреєстрації 0197U003138, 1997-2000 рр.) та “Вплив біологічно-активних речовин та еластичних напружень ДНК на будову хроматину в ядрах клітин” (№ держреєстрації 0101U002169, 2001-2005 рр.), які входили до Комплексної наукової програми “Здоров’я людини”, і в рамках яких автор дисертаційної роботи був одним з відповідальних виконавців.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягає у тому, щоб встановити молекулярні механізми структурної динаміки хроматину та нуклеопротеїнових взаємодій у його складі. Об'єктом дослідження є хроматин, предмет дослідження – його структурна динаміка та нуклеопротеїнові взаємодії у його складі. Відповідно до мети вирішуються наступні завдання:

1. Розробка кількісної теорії електростатичних взаємодій позитивно заряджених лігандів з ДНК та аналіз взаємодії гістонових комплексів з ДНК на її підставі.

2. Розробка кількісної теорії електростатичного внеску у вигин молекули ДНК та її застосування до структури нуклеосоми.

3. Розробка теорії переважного позиціювання нуклеосом відносно послідовності пар основ ДНК.

4. Вивчення конформаційної рухливості ДНК у складі нативних клітинних ядер.

5. Вивчення та теоретичний аналіз конформаційної динаміки нуклеосоми, субнуклеосомної частинки тетрасоми – комплексу ДНК із тетрамером гістонів (Н3-Н4)2, наднуклеосомної частинки, утвореної за участю лінкерного гістона, у складі циркулярної ДНК.

6. Вивчення та аналіз впливу послідовності пар основ ДНК та ацетилування гістонів на конформаційну динаміку нуклеосоми та інших нуклеогістонових комплексів.

Для вирішення поставлених завдань застосовано наступні експериментальні та теоретичні методи дослідження: тирозинова флуоресценція білків, флуоресценція бромистого етидію, релаксація комплексів у присутності ДНК-топоізомерази І, футпринтинг ДНК за допомогою ДНКази І та вільних радикалів, електрофорез, комп’ютерне моделювання, теоретичний аналіз експериментальних результатів за допомогою розроблених теоретичних моделей.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено теорію взаємодії позитивно заряджених лігандів з ДНК на підставі рівняння Пуассона-Больцмана для зарядженого циліндра. На відміну від розроблених раніше теоретичних підходів, теорія дозволяє більш точно кількісно оцінювати термодинамічні параметри взаємодії позитивно заряджених білків з ДНК.

Вперше розроблено теоретичну модель, яка вказує, що молекулярним механізмом компактизації ДНК у присутності позитивно заряджених лігандів є утворення лігандом полікатіонних містків між віддаленими по ланцюгу ділянками ДНК.

Розроблено теорію електростатичного внеску у вигин молекули ДНК на підставі рівняння Пуассона-Больцмана для зарядженого циліндра. Теорія вперше дозволяє кількісно оцінити ефект асиметричної нейтралізації зарядів, яка значно полегшує вигин ДНК у складі нуклеопротеїнових комплексів.

Аналіз конформаційної динаміки нуклеосом у залежності від іонної сили удосконалює уявлення про основний механізм такої динаміки, яка зумовлена можливістю руйнування електростатичних контактів гістонів з ДНК та контактів димера гістонів Н2А-Н2В з тетрамером (Н3-Н4)2.

Розроблена теорія позиціювання нуклеосом відносно послідовності пар основ ДНК є оригінальним ефективним засобом передбачати переважні нуклеосомні позиції з точністю до 10 п.о.

Вперше показано існування структурної динаміки нуклеосоми та інших нуклеогістонових комплексів у складі циркулярної ДНК за фізіологічних умов. Вперше охарактеризовані певні конформаційні стани нуклеосоми та інших нуклеогістонових комплексів, які залежать від топологічного стану ДНК. Вперше продемонстровано вплив послідовності пар основ ДНК та ацетилування гістонів на структурну динаміку нуклеосоми.

Вперше запропоновано динамічну модель організації хроматину, згідно з якою головним загальним наслідком утворення нуклеопротеїнових комплексів хроматину є значне підвищення конформаційної рухливості ДНК, що є необхідною умовою функціонування геному.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані в дисертації результати мають значення для розуміння молекулярної організації хроматину та функціонування апарату спадковості, а також загальних принципів нуклеопротеїнових взаємодій. Розроблена теорія взаємодії позитивно заряджених лігандів з ДНК може бути застосована для аналізу термодинаміки взаємодії білків з ДНК, теорія електростатичного внеску у вигин ДНК – для вивчення широкого класу нуклеопротеїнових комплексів, в яких ДНК є вигнутою. Теорія позиціювання нуклеосом застосовується на практиці для передбачення переважних позицій нуклеосом на певних фрагментах ДНК. Ця теорія може бути також використана для аналізу потенційних особливостей структури хроматину геномних послідовностей ДНК. Підходи, що розроблені для досліджень структурної динаміки нуклеосом у складі циркулярної ДНК, можуть бути використані для дослідження особливостей структури та конформаційних перетворень інших нуклеопротеїнових комплексів.

Особистий внесок здобувача. Усі результати, як експериментальні, так і теоретичні, що наведені в дисертації, були отримані здобувачем особисто. Те саме стосується розроблених методів аналізу даних та узагальнюючих теоретичних концепцій. В обговоренні результатів приймали участь С.М.Храпунов та А.Прюнель (Інститут Жака Моно, Франція). Експериментальний підхід щодо релаксації циркулярної ДНК у присутності ДНК-топоізомерази І розроблено сумісно з А.Прюнелем. Клітинні ядра були надані для дослідження Н.В.Бондар та С.Ф.Безруковим; плазміди, що містять певні фрагменти ДНК, та гістонові комплекси – співробітниками Інституту Жака Моно (Франція) А.Прюнелем, Ф. Де Лючія, М. Алілятом та К.Лавелем; гістон Н5 та його фрагменти – В.Рамакрішнаном (Кембриджська Лабораторія молекулярної біології, Велика Британія). Усім вказаним особам автор висловлює щиру подяку.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи оприлюднені на IX симпозіумі "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1987), VI конференції по спектроскопії біополімерів (Харків, 1988), X симпозіумі "Структура и функции клеточного ядра" (Гродно, 1990), 9 конференції "Ферменты микроорганизмов – нуклеазы" (Казань, 1991), VIІ конференції по спектроскопії біополімерів (Харків, 1991), XІ симпозіумі "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 1993), Міжнародному біофізичному конгресі (Амстердам, 1996), нараді Європейської молекулярно-біологічної лабораторії з транскрипції (Гейдельберг, 1996), конференції "Structures nuclйaires et chromatine" (Париж, 2000), XII Конференції з біомолекулярної стереодинаміки (Олбані, США, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 30 друкованих праць, з них 22 статті та тези 8 доповідей на наукових конференціях та з’їздах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, шести розділів, висновків, списку використаних джерел. Перший розділ присвячено огляду літератури, другий – опису матеріалів та методів дослідження, в інших розділах викладено результати власних досліджень та їх обговорення. Дисертація ілюстрована 77 рисунками та 11 таблицями. Перелік використаних джерел охоплює 351 найменування. Дисертаційну роботу викладено на 305 сторінках машинописного тексту.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження. В роботі використано клітинні ядра печінки щурів та гістонові комплекси (октамер гістонів (Н2А-Н2В-Н3-Н4)2, димер Н2А-Н2В, тетрамер (Н3-Н4)2, лінкерний гістон Н5 та його глобулярна частина GH5), які виділяли з ядер еритроцитів курчат та очищували за стандартними методиками. Використано також ацетильовані гістонові комплекси з культури клітин мишачої лімфоїдної лейкемії та гістони Н3 і Н4 з усуненими кінцевими невпорядкованими ділянками (хвостами), які було отримано з оброблених трипсином нуклеосомних кор-частинок еритроцитів. Для досліджень релаксації у присутності ДНК-топоізомерази І використано дві серії фрагментів ДНК розміром від 349 до 366 п.о. (з кроком 1–2 п.о). Перша серія, позначена як Taq, веде походження від певного фрагменту плазміди pBR322, друга (Bam) – від ділянки гена 5S рРНК морського їжака Lytechinus variegatus. Фрагменти довжиною 256 та 359 п.о. серії Bam використовували для досліджень флуоресценції бромистого етидію (БЕ). Ділянка фрагмента 256 п.о. довжиною 199 п.о. (із радіоактивною міткою на 5'-кінці одного чи іншого ланцюгу) використовувалася для футпринтинга ДНК за допомогою ОН* радикалів.

Приготування топоізомерів. Лінійні фрагменти ДНК циркуляризували за допомогою ДНК-лігази у присутності бромистого етидію (для отримання негативних топоізомерів) чи нетропсину (для отримання позитивних топоізомерів). Окремі топоізомери розділяли шляхом препаративного електрофорезу в поліакриламідному гелі, із смуг якого екстрагували ДНК. Для досліджень релаксації з топоізомеразою І фрагменти перед циркуляризацією було дефосфорильовано та помічено на 5'-кінцях радіоактивним фосфором 32Р.

Реконструкція нуклеогістонових комплексів проводилась за стандартними методами ступінчастого діалізу суміші певного комплексу з ДНК у 2 М NaCl проти буфера ТЕ (10 мМ трис-HCl, 1 мМ EDTA, pH 7,5) або сольового стрибка від 2 до 0,5 М NaCl та наступного діалізу проти буферу ТЕ.

Футпринтинг ДНК. Нуклеогістонові комплекси, реконструйовані на лінійному 199 п.о. фрагменті ДНК, оброблялися ОН* радикалами за методом Dixon et al. (1991), після чого зразок наносили на поліакриламідний гель для електрофорезу в нативних умовах. Відповідні смуги вирізалися з цього гелю, із них отримували розщеплену ДНК, яку наносили на поліакриламідний сіквенуючий гель для електрофорезу в денатуруючих умовах. Нуклеосоми, реконструйовані на певних топоізомерах, обробляли мікрококовою нуклеазою. Отримані таким чином кор-частинки нуклеосом обробляли ДНКазою І. Після електрофорезу в нативних умовах ДНК екстрагували з відповідних смуг, мітили радіоактивним фосфором 32P та наносили на сіквенуючий гель.

Релаксація у присутності ДНК-топоізомерази І. Реконструйовані комплекси інкубували з еукаріотичною ДНК-топоізомеразою І у буфері релаксації (приблизно фізіологічна іонна сила) при 37°С та наносили на поліакриламідний гель для електрофорезу в нативних умовах. ДНК із відповідних смуг релаксованих комплексів екстрагували та наносили на поліакриламідний гель для електрофорезу в присутності хлорокіну з метою кількісного аналізу складу топоізомерів.

Електрофорез у нативних умовах проводили у 4% поліакриламідному гелі у буфері ТЕ. Електрофорез із метою розділення топоізомерів проводили у 4% поліакриламідному гелі у присутності хлорокіну. Електрофорез у денатуруючих умовах проводили на апараті та за стандартним протоколом фірми "BioRad". Усі гелі було візуалізовано на фосфоріміджері Storm ("Molecular Dynamics"). Кількісний аналіз гелів проводився за допомогою програмного забезпечення ImageQuant ("Molecular Dynamics").

Флуоресценція вимірювалася у кварцових кюветах при 25°С на спектрофлуориметрах "Элюмин-2М" або "Hitachi F-2000". Власну флуоресценцію гістонів збуджували світлом із довжиною хвилі 280 нм, реєстрували при 304 нм. Флуоресценцію БЕ збуджували світлом при 330 нм, реєстрували при 600 нм. Ступінь зростання флуоресценції БЕ використовували для визначення щільності адсорбції БЕ на ДНК х (число адсорбованиих молекул на пару основ) та концентрації вільного барвника L.

Теоретичні методи. Для моделювання конформації ДНК у складі реконструйованих комплексів було застосовано теорію рівноважних конфігурацій еластичного стержня (Tobias et al., 1994), яка дає змогу, для певних граничних умов, знайти для кожного значення ?Lk (різниця між Lk та найбільш вигідним твістом) циркулярної ДНК малого розміру (мініциклу) певну рівноважну конфігурацію петлі, її еластичну енергію, райзинг мініциклу Wr та рівень торсійних напружень у складі петлі ?Tw. Підгонка теоретичних моделей під експериментальні результати здійснювалась за методом Жордана-Гаусса за допомогою спеціально розробленої комп’ютерної програми. Якість підгонки оцінювалась за критерієм ч2. Процес адсорбції БЕ аналізувався у межах моделі з перекриттям потенційних сайтів зв’язування (McGhee and von Hippel, 1974) та оригінальної моделі двох структурних станів нуклеопротеїнової частинки. Результати релаксації нуклеогістонових комплексів аналізувалися на підставі оригінальних моделей двох чи трьох структурних станів.

Механізми електростатичних нуклеопротеїнових взаємодій у складі хроматину. У межах широко відомої теорії конденсації протиіонів Меннінга (Manning, 1978) навкруг такого високо зарядженого поліелектроліту, яким є ДНК, утворюється шар конденсованих протиіонів високої локальної концентрації, яка не залежить від зовнішньої іонної сили розчину. Тоді заряд на фосфатних залишках ДНК є екранованим завдяки шару протиіонів, і головний внесок у електростатичну енергію системи дає ентропія змішування конденсованих протиіонів. На підставі уявлень Менінга Рекордом та співавт. (Anderson and Record, 1982) розроблено теорію взаємодії позитивно заряджених лігандів із нуклеїновими кислотами, яка часто використовується для оцінки числа електростатичних контактів у комплексі такого ліганду з нуклеїновою кислотою.

Проте, опис найближчого іонного оточення ДНК за Менінгом є досить грубим спрощенням. Як свідчать різноманітні теоретичні та експериментальні дослідження, в області іонної сили до 1 М одноосновної солі розподіл іонів навкруг ДНК досить точно описується рівнянням Пуассона-Больцмана (ПБ-рівняння) для рівномірно зарядженого циліндра.

Теорія електростатичних взаємодій позитивно заряджених лігандів із ДНК. З метою побудувати теорію взаємодії, яка була б зручною для аналізу конкретних випадків взаємодії позитивних лігандів з ДНК, ми використовуємо спрощене ПБ-рівняння (Fuoss et al., 1951; Le Bret and Zimm, 1984), яке нехтує присутністю коіонів у найближчому оточенні ДНК, але має аналітичне рішення.

На підставі спрощеного ПБ-рівняння у роботі отримані аналітичні вирази для електростатичної енергії поліелектроліту та показано, що значення енергії практично не відрізняються від результатів чисельних розрахунків за строгим ПБ-рівнянням. На основі отриманого аналітичного виразу електростатичної енергії було одержано рівняння, що пов’язує константу зв’язування позитивно зарядженого ліганду з ДНК із зарядом ліганду (числом нейтралізованих фосфатних залишків у сайті взаємодії) N, його розміром (загальним числом фосфатних залишків у сайті взаємодії) Z, неелектростатичними внесками в енергію взаємодії та іонною силою розчину С. Залежність логарифма константи від логарифма концентрації солі може бути апроксимована, особливо у вузькому інтервалі іонної сили, прямою лінією, як це й спостерігається у багатьох експериментах. У граничному випадку С > 0 нахил логарифмічної залежності константи від концентрації солі дорівнює –0,88N, що співпадає з результатом Рекорда і співавт., теорія яких, таким чином, є граничним випадком запропонованої теорії.

Більшість білків, які взаємодіють з ДНК за електростатичним механізмом, не повністю нейтралізують сайт зв'язування на ДНК (Z > N). Такий випадок, що він є більш загальним, має свої особливості у порівнянні з повною нейтралізацією (Z = N). Зростання Z практично не впливає на характер залежності константи від іонної сили, але призводить до значного зростання її абсолютної величини. При С=0,1 М та N=5 зростання Z від 5 до 10 підвищує константу майже на три порядки, при Z?3N значення константи виходить на плато. Отже, при однаковому числі електростатичних контактів, зв'язування з ДНК ліганду більшого розміру є більш вигідним енергетично. Фізичний механізм такого підвищення спорідненості при неповній нейтралізації сайту взаємодії на ДНК полягає у підвищенні числа протиіонів, які визволяються у зовнішній розчин після зв'язування ліганду.

Запропонований підхід на підставі спрощеного ПБ-рівняння повністю підтверджує головний висновок розроблених раніш теорій поліелектролітів: визволення протиіонів у зовнішній розчин є головним фізичним механізмом зв'язування з ДНК позитивно заряджених лігандів. Але наш підхід дозволяє більш точно кількісно описати процес взаємодії позитивних лігандів із ДНК та отримати більш адекватні способи аналізу експериментальних даних із метою оцінки числа електростатичних контактів та внесків від неелектростатичних взаємодій. Крім того, запропонована теорія виявляє невідомий раніш ефект зростання спорідненості ліганду до ДНК при збільшенні його розміру.

Компактизація ДНК у присутності полікатіонів. Білки, що компактизують ДНК у клітинному ядрі, мають деякі типові ознаки. Вони є, повністю або у частині молекули, невпорядкованими поліпептидами, що містять позитивно заряджені амінокислоти, які, як правило, згруповані у кластери. Очевидне припущення полягає в тому, що такі кластери можуть незалежно один від одного взаємодіяти з віддаленими по ланцюгу ділянками ДНК. Розглянуто теоретичну модель, компонентами якої є безмежно довга молекула ДНК у розведеному водному розчині, одноосновна сіль та ліганд, що складається з двох кластерів позитивних залишків. Кластери з'єднані гнучкою ділянкою поліпептидного ланцюга, тобто ліганд може утворювати полікатіонний місток, коли два кластери взаємодіють із віддаленими по ланцюгу сайтами ДНК.

Одержано рівняння, що оцінює хімічний потенціал ланки ДНК м як функцію енергії електростатичного розштовхування між ланками та енергії утворення полікатіонного містка. Обидва внески залежать від щільності клубка ДНК та іонної сили розчину: перший знижується, другий зростає при підвищенні концентрації солі. Мінімізація м дає оцінку рівноважної об’ємної щільності ланок та умову переходу клубка у компактний стан (глобулу), звідки знайдена “фазова діаграма” для переходу клубок-глобула у координатах з (відношення загальної концентрації ліганду до загальної концентрації сайтів зв’язування на полімері) та концентрації солі С.

Як показує “фазова діаграма”, при низьких значеннях іонної сили ліганд не може компактизувати ДНК при будь-яких значеннях з: незважаючи на високу ефективність електростатичних взаємодій ліганду з ДНК, високе електростатичне розштовхування не дозволяє перевести полімер у компактний стан. Підвищення іонної сили призводить до зниження розштовхування між ланками полімеру і, відповідно, до полегшення утворення компактної форми. Причому оптимум має місце приблизно при фізіологічних значеннях концентрації солі. Дисоціація ліганду при подальшому підвищені іонної сили знов робить компактизацію неможливою. Отже, компактизація ДНК у присутності полікатіонів та характер залежності цього процесу від іонної сили добре пояснюються, якщо прийняти утворення полікатіонних містків як єдиний молекулярний механізм компактизації. Суттєвим моментом при цьому є та обставина, що "запуск" процесу утворення містків є можливим лише після досягнення певного рівня нейтралізації зарядів ДНК сумісною дією полікатіона та низькомолекулярних катіонів. Викладена теорія, яка носить якісний характер, добре пояснює відомі властивості компактизації хроматину: в умовах низької іонної сили in vitro хроматинова фібрила є декомпактизованою низкою нуклеосом, яка формує компактну фібрилу товщиною 30 нм за фізіологічних іонних умов. Зрозуміло, що викладена теорія описує лише загальний механізм процесу компактизації внаслідок утворення полікатіонних містків невпорядкованими ділянками корових гістонів та лінкерного гістона Н1.

Електростатичний внесок у вигин ДНК. З метою проаналізувати зміни електростатики при вигині, молекула ДНК знов була апроксимована як рівномірно заряджений циліндр. При вигині такого циліндра поверхнева щільність заряду перетворюється у неоднорідну – збільшується з того боку, куди здійснюється вигин, та зменшується – з протилежного. Відповідно, якщо для прямого циліндра потенціал залежить лише від відстані від осі, у ПБ-рівнянні вигнутого циліндра з'являється кутова залежність потенціалу. Ці зміни позначені далі як зміни електростатичних взаємодій на короткій відстані. Іншим наслідком вигину є зменшення відстані між будь-якими двома точками вздовж осі полііона (зміни на довгій відстані). У роботі запропонована форма ПБ-рівняння для вигнутого циліндра, яка бере до уваги лише ефекти першого типу. ПБ-рівняння для вигнутого циліндра у повній формі було раніше вирішено Фіксманом (Fixman, 1982) із метою описати залежність від іонної сили персистентної довжини ДНК. Оскільки рівномірний вигин є неможливим у розчині, де напрям кривизни у будь-якій точці є випадковим, модель Фіксмана дає верхню оцінку електростатичного внеску в персистентну довжину.

Запропоноване “редуковане” ПБ-рівняння було вирішено чисельно. Залежність електростатичної енергії від радіуса кривизни ДНК дає оцінку електростатичного внеску в персистентну довжину. Оскільки враховуються тільки електростатичні взаємодії на короткій відстані, наш підхід дозволяє оцінити нижню границю такого внеску. Реальні експериментальні значення персистентної довжини (Hagerman, 1981; Kam et al., 1981; Cairney and Harrington, 1982) знаходяться між двома теоретичними оцінками в області низької іонної сили та узгоджуються з ними при концентрації солі вище 10 мМ, коли дві теоретичні моделі практично співпадають, і персистентна довжина перестає залежати від іонної сили. Оскільки наш підхід є більш простим, ніж підхід Фіксмана, він може бути легко застосованим для оцінки електростатичного внеску в рівномірний вигин ДНК у складі нуклеопротеїнових комплексів при іонній силі вище 10 мМ.

Була розглянута модель, в якій ДНК вигинається на поверхні білка при нейтралізації фосфатних залишків у зоні контакту (асиметрична нейтралізація). Відповідні граничні умови дають нове рішення ПБ-рівняння та оцінку електростатичної енергії для цього випадку. Важлива роль асиметричної нейтралізаціїї зарядів ДНК у стабілізації вигнутого стану ДНК у нуклеосомі була запропонована раніше (Mirzabekov and Rich, 1979). Отримані співвідношення та їх чисельне вирішення дозволяють оцінити цей ефект кількісно та з’ясувати його фізичний механізм.

Головним внеском в електростатичну енергію є внесок від ентропії змішування іонної атмосфери навкруг ДНК. Відповідно, електростатична енергія вигину залежить, головним чином, від ентропійних витрат на перерозподіл іонів у межах іонної атмосфери. Слабка залежність персистентної довжини від іонної сили вказує, що цей перерозподіл практично не залежить від концентрації іонів у зовнішньому розчині. Тобто, підвищення локальної концентрації протиіонів там, де поверхнева щільність заряду підвищується внаслідок вигину, приблизно компенсується зниженням локальної концентрації протиіонів на протилежному боці циліндра. При цьому середня локальна концентрація, як і для прямого циліндра, майже не змінюється.

Але, при асиметричній нейтралізації заряду на поверхні циліндра у складі нуклеопротеїнового комплексу, пониження щільності заряду на протилежному відносно білка боці молекули ДНК супроводжується визволенням деякої частини протиіонів у зовнішній розчин. Таке визволення є тепер некомпенсованим (протилежний бік є нейтралізованим), тобто призводить до підвищення ентропії системи: електростатичний внесок у енергію вигину ДНК у цьому випадку є негативним (вигідним) і таким, що залежить від іонної сили. Застосування отриманих рівнянь до вигину ДНК у нуклеосомі показує, що в області С між 0,01 та 0,1 М приблизно 30–50% неелектростатичних витрат на вигин є компенсованими завдяки електростатичного внеску, тобто асиметрична нейтралізація суттєво стабілізує структуру нуклеосоми.

Конформаційні перетворення нуклеосоми, що залежать від іонної сили розчину, були досліджені за допомогою методів власної тирозинової флуоресценції гістонів на нуклеосомах, реконструйованих на полімерній ДНК. Результати проаналізовані на підставі розглянутих вище теоретичних підходів.

Зниження іонної сили від 2,5 до 1 мМ NaCl призводить до суттєвого зниження анізотропії флуоресценції. Аналіз літературних даних указує, що це свідчить про руйнування контактів між димером Н2А-Н2В та тетрамером (Н3-Н4)2 у складі нуклеосоми, при цьому відбувається розгортання кінцевих ділянок нуклеосомної ДНК довжиною ~20 п.о. Побудована теоретична модель, що описує ймовірність компактного нерозгорнутого стану ділянки. Вільна енергія компактного стану має три внески: енергія вигину ділянки; енергія гістон-гістонових взаємодій між димером і тетрамером; енергія електростатичного розштовхування між кінцевою ділянкою та центральним витком нуклеосомної ДНК. Перший та останній внески є несприятливими (позитивними), другий – сприятливим для компактного стану. Енергія вигину була оцінена на підставі викладеного вище теоретичного підходу. Енергія гістон-гістонових взаємодій – на підставі значень константи зв'язування димера з тетрамером у 2 М NaCl (Benedict et al., 1984). Порівняння з експериментальними результатами свідчить, що зростання електростатичного розштовхування є основною силою, що сприяє розгортанню кінцевих ділянок при пониженні іонної сили.

Екстраполяція енергії розштовхування до фізіологічної іонної сили вказує, що ця енергія прямує до 0 в області С ~ 100 мМ. Крім того, знижується спорідненість гістонів до ДНК (згідно до теорії електростатичних взаємодій). В результаті змінюється енергетичний баланс: якщо при С = 1 мМ руйнування контактів димера з тетрамером є значно більш легким, ніж руйнування контактів димера з ДНК, у фізіологічних умовах більш легким стає руйнування електростатичних ДНК-гістонових контактів. Кількісні оцінки вказують на можливість спонтанного розгортання кінцевих ділянок нуклеосомної ДНК за фізіологічних умов. Цей висновок підтверджується результатами Anderson et al. (2002) та описаними нижче результатами щодо конформаційної динаміки нуклеосоми.

Добре відомо, що при зростанні іонної сили відбувається дисоціація нуклеосоми: в області концентрації NaCl ~0,6–1,2 М дисоціює димер гістонів Н2А-Н2В, при ~1,2–2,0 М – тетрамер (Н3-Н4)2. Цей процес також було досліджено методами тирозинової флуоресценції. Одночасний вимір інтенсивності та анізотропії флуоресценції дозволив окремо реєструвати ступінь дисоціації димера Н2А-Н2В та тетрамера (Н3-Н4)2 від ДНК: анізотропія фіксує руйнування контактів димера з тетрамером, інтенсивність – контактів обох комплексів із ДНК. Окремо досліджена також дисоціація комплексу димера з ДНК у відсутності тетрамера. Термодинамічний аналіз отриманих кривих дисоціації дозволив розрахувати залежність від іонної сили відповідних констант зв’язування. Ці залежності, в свою чергу, були проаналізовані на підставі теорії електростатичних взаємодій позитивно заряджених лігандів із ДНК. Отримані параметри (табл. 1) дозволяють зробити наступні висновки.

Нуклеосомна ДНК стабілізована 26 електростатичними контактами (приблизно в середньому 1,9 контакти на виток подвійної спіралі) з глобулярною поверхнею октамера гістонів, що добре узгоджується з кристалографічними даними Luger et al. (1997). Це демонструє можливості застосованої теорії.

При взаємодії димера з нуклеосомою (на відміну від його взаємодії з вільною ДНК) з'являється досить великий негативний неелектростатичний внесок у загальну енергію взаємодії, який зумовлює зростання спорідненості димера до нуклеосоми. Очевидно, що цей внесок складається з двох компонент: негативна енергія взаємодії димера з тетрамером (яка превалює) та позитивна енергія вигину ДНК.

Таблиця 1

Параметри взаємодії гістонових комплексів з ДНК

Тип комплексу | Число електроста-тичних контактів N* | Неелектростатичний внесок у енергію взаємодії ДGT (kBT)**

Димер Н2А-Н2В, взаємодія з ДНК | 6 | 0

Димер Н2А-Н2В, взаємодія з нуклеосомою | 6– | 7,3

Тетрамер (Н3-Н4)214 | +6,4

* із глобулярною частиною комплексів – невпорядковані хвости вже не взаємодіють з ДНК в зоні дисоціації.

**kB – константа Больцмана, T – абсолютна температура.

Оцінка обох компонент на підставі відомих величини вигину в нуклеосомі та параметрів взаємодії між димером та тетрамером дає добре узгодження з величиною, наведеною в табл.1. Позитивний внесок в енергію взаємодії тетрамера з ДНК зумовлений вигином ДНК у комплексі з тетрамером (тетрасомі), але його величина (табл. 1) відповідає радіусу кривизни 8,5 нм – приблизно у два рази більше, ніж у нуклеосомі. Тобто, в зоні дисоціації тетрасома характеризується значним латеральним відкриттям відносно її структури у нуклеосомі. Як показано нижче, потенційна можливість латерального відкриття тетрасоми реалізується у фізіологічних умовах під дією надспіралізації у циркулярній ДНК.

Вигин ДНК та позиціювання нуклеосом відносно послідовності нуклеотидів. У складі хроматину нуклеосоми утворюються на великій кількості різних послідовностей ДНК, і, практично, завдяки величезній ефективності електростатичних взаємодій, ДНК будь-якої природної послідовності здатна бути інкорпорованою в нуклеосому. Проте велика кількість експериментальних даних свідчить про феномен переважного позиціювання нуклеосом на певних послідовностях ДНК, і таке позиціювання є дуже важливим для регуляції генетичної активності.

З метою з’ясувати механізм позиціювання було запропоновано модель нуклеосомної ДНК як гетерогенного ізотропного стержня, еластичні властивості якого залежать від послідовності пар основ уздовж подвійної спіралі. Застосовано два набори констант жорсткості щодо вигину для 10 типів динуклеотидних контактів у ДНК. Перший набір базується на вимірах персистентної довжини для синтетичних полімерів (Hogan and Austin, 1987), другий – на даних щодо температури плавлення динуклеотидів у складі ДНК (Gotoh and Tagashira, 1981). Обидва набори дають подібні результати щодо енергії вигину нуклеосомної ДНК певної послідовності. Згідно запропонованого алгоритму, в межах певної послідовності розраховується величина енергії вигину для всіх можливих позицій нуклеосомного "вікна" довжиною 125 п.о. У випадку досить короткої молекули ДНК, яка може містити лише одну нуклеосому, точка мінімуму енергії є точкою переважного позиціювання. Для довгих послідовностей ДНК, які містять кілька нуклеосом, нуклеосоми розташовуються на випадкових сайтах, що не перекриваються і характеризуються певними значеннями енергії вигину. Далі застосовується стандартна процедура Монте-Карло, яка дозволяє мінімізувати енергію вигину цієї системи.

Запропонована модель очевидно має декілька обмежень: застосовані параметри потребують уточнення, еластичні властивості динуклеотидів залежать від контексту послідовності, суперспіраль ДНК у нуклеосомі не є ідеальною (у її складі присутні області більш та менш різкого вигину) тощо. Незважаючи на це, модель виявляється достатньою, щоб, у багатьох випадках, задовільно описати відомі з літератури експериментальні результати щодо позиціювання нуклеосом in vitro з точністю до одного витка подвійної спіралі.

Аналіз позиціювання нуклеосом на довгих фрагментах ДНК дозволяє констатувати, що велике значення має також ефект границі, яка визначає рамку розташування нуклеосом. Роль такої границі може відігравати нуклеосома у певній найбільш імовірній позиції або регуляторний білок, зв'язаний з ДНК у певному специфічному сайті.

Проведений аналіз указує також на інший важливий фактор позиціювання – конформаційну рухливість нуклеосоми. Коли певна ділянка ДНК характеризується дуже високою енергією, що її потрібно витратити на вигин усієї ДНК у нуклеосомі, експериментальні результати свідчать про змінену форму нуклеосоми з частковим розгортанням нуклеосомної ДНК. У такому випадку розрахунки ймовірності позиціювання нуклеосоми призводять до узгодження з експериментом, якщо довжина нуклеосомної ДНК є зниженою приблизно до одного витка суперспіралі.

Структурна динаміка нуклеосоми у взаємозв'язку з топологією циркулярної ДНК. Флуоресценція бромистого етидію. Представлений вище аналіз деяких важливих аспектів нуклеопротеїнових взаємодій у складі хроматину вказує на потенційну здатність нуклеосоми до структурних перетворень. Важливим фактором, який може впливати на ці перетворення за фізіологічних умов, є надспіралізація циркулярної ДНК. Далі викладені результати, які були отримані при дослідженні хроматинових комплексів із циркулярною ДНК методом флуоресценції БЕ. Барвник, інтеркалюючи між сусідніми парами основ ДНК, розкручує їх на певний кут і, відповідно, викликає зміну топологічного стану циркулярної ДНК. Завдяки вимірам флуоресценції БЕ, можна дослідити процес його адсорбції на ДНК, який сам залежить від рівня надспіралізації та еластичних властивостей ДНК. Якщо циркулярна ДНК утворює нуклеопротеїновий комплекс, його конформаційні зміни, що залежать від топології ДНК, будуть впливати на процес інтеркаляції.

Топологічні та еластичні властивості ДНК у складі клітинних ядер. ДНК хроматинової петлі в клітинному ядрі є топологічно еквівалентною до циркулярної ДНК, і для неї виконуються всі специфічні закономірності, пов'язані з надспіралізацією. За рахунок того, що інтеркаляція БЕ викликає у складі циркулярної ДНК (хроматинової петлі) надспіралізацію позитивного знаку, спорідненість БЕ до інтактної або релаксованої шляхом внесення одноланцюгових розривів петлі є різною. Після внесення розривів у ДНК петлі (за рахунок опромінення лазерним світлом у присутності слідової кількості БЕ або шляхом м’якої обробки ДНКазою І) спостерігається зростання флуоресценції доданого БЕ, тобто спорідненості барвника до ДНК. Шляхом флуоресцентного титрування було отримано ізотерми адсорбції БЕ на ДНК клітинних ядер до та після внесення одноланцюгових розривів. Аналіз ізотерм дозволяє визначити константу зв’язування, частку доступної для барвника ДНК, щільність надспіралізації у (яка була у відсутності БЕ) та силову константу надспіралізації Ksc. Два останні параметри входять до відомого виразу для вільної енергії надспіралізації Gsc, який для вільної циркулярної ДНК має вигляд (тут і далі енергія в одиницях kBT):

Gsc = (Ksc/N)(?Lk)2, (1)

де N – загальна кількість пар основ, ?Lk = Lk – Lk0, Lk0 – найбільш вигідний твіст лінійної ДНК у певних умовах. Оскільки у = ?Lk/Lk0, Gsc можна виразити через у. Знаючи кут розкручування сусідніх пар основ за рахунок інтеркаляції, неважко також врахувати рівень надспіралізації, що залежить від присутності БЕ: треба замінити ?Lk у рівн.1 на ДLktot = ДLk + ДLkЕ, де ДLkЕ – рівень надспіралізації, що вноситься барвником.

Ізотерми адсорбції були отримані також у присутності гепаріну, який ефективно знімає білки з ДНК. Усі параметри, що оцінені в результаті аналізу ізотерм (частка доступної ДНК, щільність надспіралізації у ядрах до та після видалення білків, середній розмір хроматинової петлі), є очікуваними на підставі даних літератури. Але єдиний параметр – значення Ksc для нативних (у відсутності гепаріну) ядер – виявився несподівано низьким.

Силова константа надспіралізації показує, наскільки швидко зростає енергія еластичних напружень при зростанні надспіралізації (рівн. 1). Згідно класичного рівняння Уайта-Фуллера ?Lk = ?Tw + Wr, еластичні напруження певним чином розділюються між змінами твісту ?Tw (торсійні напруження) та вигином ДНК, який призводить до ненульового райзингу Wr. Для мініциклів ДНК (див. нижче) вигин є дуже невигідним енергетично, усі напруження реалізуються як торсійні, і Ksc має значення ~4000. Для більш довгих циркулярних плазмід існують значні флуктуації Wr, що знижує Ksc до ~1000. Значення Ksc для ядер у присутності гепаріну (1800300) є дещо більшим, ніж для циркулярних плазмід, що можна пояснити утрудненням конформаційної рухливості ДНК у межах малого об'єму ядра. ДНК у складі хроматину нативних ядер має певну просторову організацію, що вона залежить від міцних нуклеопротеїнових взаємодій. Отже можна було б очікувати, що райзинг хроматинової петлі не може змінюватись, ДНК хроматину є завдяки цьому дуже жорсткою (еластичні напруження реалізуються тільки у вигляді змін твісту), і значення Ksc наближається до своєї верхньої оцінки. Але експеримент указує, що величина Ksc для нативних ядер є навіть майже в два рази меншою, ніж після усунення гістонів (1100300). Отже, ДНК хроматину нативних клітинних ядер зберігає високу конформаційну рухливість. Цей на перший погляд парадоксальний висновок знаходить своє пояснення у механізмах конформаційної рухливості нуклеосоми та інших нуклеогістонових комплексів, результати вивчення яких представлено нижче.

Топологічні та еластичні властивості вільних мініциклів ДНК. Ізотерми адсорбції БЕ були отримані для двох лінійних фрагментів ДНК довжиною 256 та 359 п.о., а також для окремих циркулярних топоізомерів цих фрагментів. Дві ізотерми, “лінійну” та “циркулярну”, можна об’єднати в одну, зобразивши залежність ln(Llin/L) від щільності зв’язування х БЕ на ДНК (L – концентрація вільного БЕ для топоізомера, Llin – концентрація вільного БЕ, що є необхідною для досягнення того самого значення х на лінійній ДНК). Ордината такої залежності порівнює спорідненості БЕ до циркулярної та лінійної ДНК: якщо ордината є позитивною, то спорідненість до циркулярної ДНК є більш високою; якщо ордината є негативною, – навпаки. Приклад такої ізотерми для топоізомера з ДLk = –1,15 (256 п.о.) представлено на рис. 1. Для циркулярних плазмід більшого розміру ізотерма є прямою лінією, нахил якої є пропорційним до силової константи надспіралізації Ksc. Для мініциклу (рис.1) замість однієї можна виділити