КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Снігур ГАЛИНА Олександрівна

УДК 578.85/86

ЕПІДЕМІОЛОГІЯ ВІРУСІВ

ЗЕРНОВИХ КУЛЬТУР В АГРОЦЕНОЗАХ України

03.00.06 – вірусологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ-2006

Дисертація є рукописом.

Робота виконана на кафедрі вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Поліщук Валерій Петрович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Коваленко Олексій Григорович, Інститут мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу фітопатогенних вірусів

кандидат біологічних наук, доцент Шевченко Жанна Петрівна, Уманський державний аграрний університет, доцент кафедри захисту рослин

Провідна організація: Одеський національний університет імені І.І. Мечникова, Міністерство освіти і науки України

Захист дисертації відбудеться „____”________________ 2006 р. о ______ год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12, ауд. 433.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська 64.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська 58.

Автореферат розісланий „_____” _______________ 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Молчанець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Протягом останнього часу в усьому світі величезна увага приділяється вірусним хворобам, які значно знижують урожай зернових культур, порушуючи процес утворення зерна та погіршуючи його якість.

Визначення ареалу розповсюдженості вірусів, механізмів передачі, кола рослин-хазяїв та резервантів, реакції на зміни оточуючого середовища дає можливість не тільки більш повно охарактеризувати збудника вірусної природи, але і прогнозувати появу та розвиток вірусних хвороб (Поліщук, 2001).

В основу відомих на сьогодні засобів боротьби з фітовірусними інфекціями покладені рання діагностика та прогнозування розповсюдження вірусів рослин, які передаються за допомогою векторів, а саме членистоногих та нематод (Можаева, 2003; Олейник, 1968; Юхименко, 2000). Відомо, що віруси рослин, при потраплянні з рослинними рештками у грунт, здатні тривалий час зберігати свою інфекційність. В подальшому ці віруси можуть інфікувати сприйнятливі рослини, як за допомогою різних переносників так і без їх участі (Шпаар, 1995). Постає нагальна потреба у своєчасному виявлені резервуарів вірусних інфекцій в агроценозах, а також у дослідженнях можливих шляхів розповсюдження фітовірусів через грунт (Будзанівська, 1998; Walsh, 1998).

Поява в останні десятиріччя нових діагностичних методів для визначення наявності фітовірусів, таких як імуноферментний аналіз, полімеразна ланцюгова реакція та інші, дали змогу на новому рівні вивчати передачу вірусів, особливо за допомогою насіння. Відомо, що збереження вірусу в інфікованому насінні є надійним способом його виживання, оскільки насіння слугує лінкером між посівними сезонами. Це особливо важливо для вірусів, які мають вузьке коло рослин-хазяїв, а також для вірусів, які не передаються векторами, наприклад, для вірусу штрихуватої мозаїки ячменю (Mink, 1993). Тому для боротьби і обмеження розповсюдження ВШМЯ дуже важливо проводити тестування посівного, а особливо селекційного матеріалу.

Таким чином, маючи досить грунтовну теоретичну базу, перспективним напрямком є створення правильної стратегії і тактики боротьби з вірусними хворобами та вірусами зокрема – тестування посівного, а особливо селекційного матеріалу, своєчасна діагностика хвороби, цілеспрямована боротьба з резервантами та комахами-переносниками, дотримання агротехнічних норм та запровадження стійких сортів (Міщенко, 2004).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у межах науково-дослідної роботи кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка за темою (реєстраційний номер №01БФ036-01) “Моніторинг збудників вірусних інфекцій з метою розробки наукових основ екологічно чистих технологій вирощування сільськогосподарських культур” та в рамках наукового співробітництва між кафедрою вірусології та Інститутом дослідження стійкості та діагностики патогенів Федерального центру селекції культивованих рослин (Ашерслебен, Німеччина) за темою: „Віруси зернових культур, що передаються грибами”.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було вивчення поширеності вірусних хвороб на зернових культурах в Україні та оцінка сприйнятливості злакових культур до потенційно небезпечних вірусів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

обстежити агроценози різних областей України на наявність вірусів злакових;

виявити та охарактеризувати найбільш розповсюджені віруси;

отримати діагностичні системи до деяких вірусів зернових культур;

провести аналіз сортів та селекційних ліній злакових на наявність насіннєвої вірусної інфекції;

провести скринінг селекційного матеріалу на чутливість до грунтових вірусів злакових.

Об‘єкт дослідження - віруси зернових культур та зернові злаки.

Предмет дослідження – поширеність вірусів зернових в агроценозах України, оцінка сприйнятливості сортів та селекційних ліній злакових.

Методи дослідження. Візуальне обстеження посівів, біологічне тестування, різні модифікації імуноферментного аналізу, імуноблотинг відбитку тканин (tissue print-immunoblotting), трансмісивна електронна мікроскопія, електрофорез білків в ПААГ, імуноелектроблотинг, розробку діагностичної системи для ідентифікації ВШМЯ в насінні злакових проводили на основі ПЛР.

Наукова новизна одержаних результатів. Показано, що з 11 досліджуваних вірусних патогенів найчастіше вірусна інфекція виявлялась на рослинах, відібраних в агроценозах Харківської, Одеської, Київської, Чернігівської та Вінницької областей. З`ясовано, що найбільш розповсюдженими вірусами зернових культур є вірус жовтої карликовості ячменю, вірус мозаїки бромусу та вірус смугастої мозаїки пшениці. Вперше в агроценозах України були виявлені грунтові віруси злакових: вірус веретеновидної смугастої мозаїки пшениці, вірус м‘якої мозаїки ячменю (Bymovirus), грунтовий вірус мозаїки пшениці та грунтовий вірус мозаїки злакових (Furovirus).

Виділено та ідентифіковано ізолят вірусу мозаїки бромусу (ВМБ).

Проведено тестування насіннєвого матеріалу 85 різних сортів та ліній злакових за допомогою імуноферментного аналізу на контамінацію вірусом штрихуватої мозаїки ячменю (ВШМЯ). Показано, що насіння 11,8 % досліджених сортів та ліній містить антигени ВШМЯ.

Проведено скринінг 107 сортів, ліній та диких видів злаків на чутливість до грунтового вірусу мозаїки злакових (ГВМЗ), виявлено 6 сортів пшениці, що є несприйнятливі до ГВМЗ.

Практичне значення роботи. Визначено найбільш розповсюджені віруси зернових культур та ідентифіковано нові, які раніше не діагностувались в агроценозах нашої країни.

Для тестування промислових посівів зернових культур з метою прогнозування появи і розвитку вірусної інфекції та створення стратегії для обмеження розповсюдження вірусу мозаїки бромусу виділено та очищено ізолят ВМБ та отримано діагностичну тест-систему на основі ІФА.

Для діагностики ВШМЯ в насінні посівного та селекційного матеріалу зернових культур розроблена діагностична система на основі ПЛР.

Виявлено 6 сортів пшениці, що є несприйнятливими до ГВМЗ, які можуть бути рекомендовані як перспективні для створення стійких сортів пшениці до даного вірусу.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Інформаційних пошук, опрацювання літературних джерел, розробка схем експерименту, отримання експериментальних даних, їх узагальнення та інтерпретацію автором дисертації здійснено особисто. Підготовку публікацій за отриманими результатами та представлення результатів на наукових конференціях здійснено за участю наукового керівника.

Лабораторні дослідження з тестування насіннєвого та селекційного матеріалу на чутливість до грунтового вірусу мозаїки злакових проведено автором на базі Інституту дослідження стійкості та діагностки патогенів (Ашерслебен, Німеччина).

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на Днях науки у Національному Університеті Києво-Могилянська Академія (Київ, Україна, січень 2003 р.); 1-му Міжнародному конгресі європейських мікробіологів (Любляна, Словенія, червень 2003 р.); 11-му Міжнародному конгресі з вивчення молекулярних взаємовідносин рослина - мікроорганізм (Санкт-Петербург, Росія, липень 2003 р.); 4-й Всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів (Київ, Україна, квітень 2004 р.); 10-му з‘їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, Україна, вересень 2004р.); 4-й Міжнародній конференції “Біоресурси і віруси” (Київ, Україна, вересень 2004 р.); Конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників Інституту мікробіології і вірусології НАНУ ім. Д.К. Заболотного (Київ, Україна, лютий 2005 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт, з них 3 статті в наукових виданнях, 5 - матеріали конференцій. Права співавторів не порушено.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів та їх обговорення, підсумків, висновків та переліку використаних джерел. Повний обсяг роботи складає 135 сторінок друкованого тексту, що включає 40 рисунків, 3 таблиці та перелік використаних джерел (176, з них 119 - іноземні).

Подяка. Автор щиро вдячний всім, з ким співпрацював під час виконання роботи. Особлива подяка висловлюється д.б.н. У. Кастірр і проф., д.б.н. Т. Кюне (Інститут дослідження стійкості та діагностки патогенів, Німеччина) та к.б.н. Рябчуну В.К. (Інститут рослинництва ім. В.Я. Юр‘єва).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Розділ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з трьох підрозділів, в яких наведені сучасні відомості про віруси та вірусні хвороби зернових культур, висвітлені питання діагностики уражених вірусами рослин, наведено сучасні підходи до захисту рослин від вірусного ураження та обмеження розповсюдження вірусів у агроценозах України.

Розділ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для виявлення вірусів застосовували візуальне обстеження посівів зернових культур в агроценозах основних зерносіючих областей України та відбирали зразки рослин в трьох повторностях з трьох сталих географічних точок, та вносили в стерильні пакети. Досліджували агроценози в Вінницькій, Дніпропетровській, Донецькій, Запорізькій, Київській, Львівській, Одеській, Полтавській, Сумській, Харківській, Херсонській, Хмельницькій, Черкаській та Чернігівській областях. Дослідження біологічних властивостей вірусів зернових культур проводили на рослинах-індикаторах Chenopodium amaranticolor, Phaseolus vulgaris, Nicotiana tabacum cv. Samsun, N. benthamiana. Ідентифікацію вірусів проводили за допомогою імуноферментного аналізу з комерційними тест-системами до вірусу мозаїки бромусу (BMБ), вірусу смугастої мозаїки бромусу (BСМБ), вірусу жовтої карликовості ячменю (ВЖКЯ), вірусу карликовості пшениці (ВКП), вірусу штрихуватої мозаїки ячменю (BШМЯ), вірусу смугастої мозаїки пшениці (ВСМП), вірусу веретеновидної смугастої мозаїки пшениці (ВВСМП), вірусу м‘якої мозаїки ячменю (ВMМЯ), вірусу жовтої мозаїки ячменю (ВЖMЯ), грунтового вірусу мозаїки пшениці (ГВМП), грунтового вірусу мозаїки злакових (ГВМЗ) та трансмісивної електронної мікроскопії. Виділення та очищення вірусу мозаїки бромусу проводили за різними методиками, що дало змогу порівняти ефективність очистки та концентрації вірусу; найбільш оптимальною для виділення ВМБ виявилась методика Wechmar (1968) з нашими модифікаціями. Для отримання антисироватки до ВМБ імунізацію кролів породи шиншила проводили за схемою Гнутової (1993); як імуноген використовували очищений препарат ВМБ. Структурний білок виділеного вірусу досліджували за допомогою електрофорезу за Лемлі з використанням 14% розділяючого та 5% концентруючого поліакриламідних гелів (ПААГ). Специфічність отриманої антисироватки до ВМБ перевіряли методом імуноелектроблотингу. Розробку діагностичної системи для ідентифікації вірусу штрихуватої мозаїки ячменю в насінні злакових проводили на основі полімеразної ланцюгової реакції. Ідентифікацію грунтового вірусу мозаїки злакових (ГВМЗ) в рослинах, відібраних в агроценозах України, проводили за допомогою виявлення спор спокою вектора Polymyxa graminis та імуноблотингу відбитку тканин (tissue print-immunoblotting). Скринінг селекційного матеріалу на чутливість до ГВМЗ проводили при вирощуванні рослин в контамінованому вірусом грунті протягом 3 – 4 місяців в умовах, оптимальних для розвитку вірусної інфекції (150C); тестування рослин проводили методом імуноферментного аналізу з використанням комерційної тест-системи до ГВМЗ. Насіння зернових культур для тестування було люб‘язно надане співробітниками Центру генетичних ресурсів рослин України Інституту рослинництва ім. В.Я. Юр‘єва (м. Харків) та селекціонерами різних науково-дослідних інститутів.

Розділ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

3.1. Візуальне обстеження посівів та відбір первинного матеріалу за зовнішніми симптомами

За період з 2002 по 2005 роки нами було проведено обстеження посівів злакових в агроценозах різних областей України на наявність вірусних інфекцій зернових культур. У всіх досліджених господарствах та промислових посівах дослідних інститутів рослини мали симптоми вірусного ураження, які були подібними між собою, але відрізнялись за ступенем прояву. Найчастіше спостерігались симптоми пожовтіння та почервоніння верхівок листкових пластинок та різноманітна мозаїка. Симптоми мозаїки на листках являли собою чергування світло- та темно-зелених ділянок, які утворювали мозаїчний візерунок. Найчастіше така мозаїчність спостерігалась на молодих листках рослин, наприклад, на полях Вінницької та Черкаської областей. В агроценозах досліджуваних областей найчастіше спостерігались симптоми пожовтіння та почервоніння верхівок листкових пластинок. Крім вище перерахованих симптомів на зернових ми спостерігали затримку росту та карликовість, наприклад на рослинах пшениці в агроценозах Харківської області.

Таку картину, на наш погляд, можна пояснити тим, що на досліджених полях злакові вирощуються впродовж тривалого періоду, за рахунок чого відбувається постійна циркуляція вірусів в даних агроценозах. На рослинах з вищеназваними симптомами в багатьох випадках були зареєстровані шкідники, зокрема цикадки, попелиці та кліщі, які є переносниками вірусів злакових. Також на зернових культурах спостерігались хвороби грибної та бактеріальної етіології.

В результаті проведення візуального обстеження виявлено, що найгірший фітосанітарний стан мали посіви в агроценозах Харківської, Одеської, Київської та Вінницької областей.

3.2. Виявлення уражених рослин злакових методом імуноферментного аналізу

Для ідентифікації вірусів у відібраних зразках злакових рослин за допомогою імуноферментного аналізу використовували стандартні тест-системи до вірусу мозаїки бромусу (BMБ), вірусу смугастої мозаїки бромусу (BСМБ), вірусу жовтої карликовості ячменю (ВЖКЯ), вірусу карликовості пшениці (ВКП), вірусу штрихуватої мозаїки ячменю (BШМЯ), вірусу смугастої мозаїки пшениці (ВСМП), вірусу веретеновидної смугастої мозаїки пшениці (ВВСМП), вірусу м‘якої мозаїки ячменю (ВMMЯ), вірусу жовтої мозаїки ячменю (ВЖMЯ), грунтового вірусу мозаїки пшениці (ГBMП) та грунтового вірусу мозаїки злакових (ГBMЗ).

У ході експерименту було здійснено постановку ІФА з рослинним матеріалом злакових окремо по кожній з обстежених областей. Результати наших досліджень дають змогу стверджувати, що найвищий відсоток уражених вірусами рослин виявився в Харківській, Одеській, Київській, Чернігівській та Вінницькій областях (рис. 1).

Рис. 1. Порівняння ступеню ураженості злакових рослин вірусами в агроценозах різних областей України

Результати дослідження зразків, відібраних з основних найбільш уражених областей, на вірусні інфекції зернових культур представлені на рисунку 2.

При тестуванні злакових в агроценозах Харківської області (рис. 2.а)) показано, що найчастіше на рослинах ідентифікувались вірус жовтої карликовості ячменю (BЖКЯ) та вірус карликовості пшениці (ВКП), іноді вірус мозаїки бромусу (BMБ). Враховуючи, що при візуальному обстеженні досить часто спостерігалась затримка росту та карликовість, можна зробити висновок про ураження зернових культур в Харківській області саме вірусом жовтої карликовості ячменю та вірусом карликивості пшениці.

Дослідження зернових культур в агроценозах Одеської області (рис. 2.б)) показало, що на рослинах ідентифікували лише вірус жовтої карликовості ячменю (BЖКЯ) та вірус мозаїки бромусу (BMБ), але відсоток уражених рослин вірусною інфекцією за результатами імуноферментного аналізу був дуже високий. Це підтверджувало і візуальне обстеження посівів, при якому найчастіше спостерігались симптоми пожовтіння та почервоніння верхівок листкових пластинок.

Тестування зернових відібраних в агроценозах Київської області (рис. 2.в)) показало, що найчастіше на рослинах ідентифікувалися вірус жовтої карликовості ячменю та вірус мозаїки бромусу. Важливим є те, що в Київській області, а саме на промислових посівах Миронівського інституту пшениці, як і на рослинах в Харківській області, виявлено вірус карликовості пшениці, який є високопатогенним і найчастіше призводить до неможливості формування колосу. Крім того, в різних районах Київської області в рослинних зразках виявлялися антигени вірусів, що передаються через грунт, зокрема антигени грунтового вірусу мозаїки злакових, грунтового вірусу мозаїки пшениці, вірусу веретеновидної смугастої мозаїки пшениці та вірусу м’якої мозаїки ячменю.

а) б)

в) г)

Рис. 2. Ураженість злакових культур вірусними хворобами в різних областях України за результатами імуноферментного аналізу: а) Харківська область; б) Одеська область; в) Київська область; г) Чернігівська область.

При дослідженні злакових в агроценозах Чернігівської області (рис. 2.г)) показано, що рослини були суттєво контаміновані двома вірусами: вірусом жовтої карликовості ячменю (ВЖКЯ) та вірусом мозаїки бромусу (ВМБ), крім того нами був виявлений вірус смугастої мозаїки пшениці (ВСМП).

Обстеження методом ІФА зернових культур в агроценозах Вінницької області показало, що рослини найчастіше були інфіковані вірусом мозаїки бромусу (BMБ), вірусом жовтої карликовості ячменю (BЖКЯ) та вірусом смугастої мозаїки пшениці (ВСМП) з явною перевагою в ураженні першим вірусом. Цікаво те, що на дикоростучих злаках, що зростали поблизу посівів, була відмічена змішана інфекція BMБ, BЖКЯ та грунтового вірусу мозаїки злакових.

Рис. 3. Узагальнення результатів тестування зернових культур на наявність вірусної інфекції в полях досліджених областей України методом ІФА

Узагальнення результатів, отриманих методом ІФА, показало нерівномірне розповсюдження досліджуваних вірусів у всіх обстежених регіонах. Як видно з рисунку 3, на обстежених посівах найчастіше ідентифікувалися вірус жовтої карликовості ячменю (ВЖКЯ), вірус мозаїки бромусу (BMБ) та вірус смугастої мозаїки пшениці (ВСМП). Ці результати співпадають з літературними даними стосовно обстеження посівів, що проводилися починаючи з 70-х років минулого століття, які реєстрували дані збудники в полях різних областей України. Отримані результати свідчать про те, що вищезгадані патогени вірусної природи циркулюють в агроценозах України багато років.

Також нами вперше в агроценозах України методом ІФА були виявлені антигени грунтових вірусів (рис. 3): вірусу веретеновидної смугастої мозаїки пшениці (ВВСМП), вірусу м‘якої мозаїки ячменю (ВMMЯ), грунтового вірусу мозаїки пшениці (ГВМП) та грунтового вірусу мозаїки злакових (ГВМЗ), що передаються за допомогою гриба Polymyxa graminis і можуть зберігатись у грунті в спорах спокою вектора більше 20 років. В Україні раніше не проводилась діагностика вищезгаданих вірусів, але, як показують наші результати, вони присутні в агроценозах нашої країни і, можливо, на їх долю припадає значний відсоток ураження цінних злакових культур.

Таким чином, наведені результати узгоджуються з даними оцінки фітосанітарного стану посівів при візуальному обстеженні полів в 14 зерносіючих областях України і доводять, що найбільш ураженими вірусною інфекцією є зернові культури в Харківській, Одеській, Київській та Вінницькій областях. Крім того, симптоми, що найчастіше спостерігались на зернових, зокрема пожовтіння та почервоніння верхівок листкових пластинок та різноманітна мозаїка, є типовими саме для вірусу жовтої карликовості ячменю (ВЖКЯ), вірусу мозаїки бромусу (ВМБ) і вірусу смугастої мозаїки пшениці (ВСМП), відповідно, що підтверджується результатами імуноферментного аналізу. Вперше в агроценозах України за допомогою ІФА були виявлені антигени грунтових вірусів, що передаються спорами спокою гриба Polymyxa graminis.

3.3. Електронномікроскопічне дослідження деяких вірусів зернових культур

Для виявлення, ідентифікації та визначення морфологічних особливостей вірусів злакових було застосовано трансмісивну електронну мікроскопію вірусвмісних препаратів виготовлених методом негативного контрастування.

Для проведення аналізу брали сік уражених рослин з різноманітними симптомами, відібраних в досліджуваних областях України, що обстежувалися в ІФА. Електронномікроскопічні дослідження показали, що матеріал злакових містив вірусні частки різної морфології. Було виявлено сферичні вірусні частки діаметром 27±0,5 нм (рис. 4), які за літературними даними характерні для двох вірусів злакових, зокрема вірусу жовтої карликовості ячменю (BЖКЯ) та вірусу мозаїки бромусу (BMБ). Дослідження цих рослин методом ІФА з тест-системами до згаданих вірусів показали позитивну реакцію з антисироваткою до вірусу мозаїки бромусу. Порівняння результатів ІФА та електронномікроскопічних даних дають підставу стверджувати, що рослини були інфіковані вірусом мозаїки бромусу.

Рис. 4. Електронномікроскопічне зображення вірусу мозаїки бромусу, інструментальне збільшення х 40 . | Рис. 5. Електронномікроскопічне зображення грунтового вірусу мозаїки злакових, інструментальне збільшення х30 .

При електронномікроскопічних дослідженнях зразків жита (Secale cereale), відібраних в агроценозах Чернігівської області, було виявлено паличкоподібні вірусні частки довжиною 130-160 нм і 20 нм в діаметрі, які є характерними для грунтового вірусу мозаїки злакових (рис. 5). При тестуванні даних зразків методом ІФА з тест-системою до цього вірусу відмічена позитивна реакція. Отже, результати ІФА та електронномікроскопічних даних дають підставу стверджувати, що рослини були інфіковані саме грунтовим вірусом мозаїки злакових, який раніше не ідентифікувався в агроценозах України.

Таким чином, результати електронномікроскопічних досліджень збігаються з даними імуноферментного аналізу щодо ураження зернових культур вірусом мозаїки бромусу та грунтовим вірусом мозаїки злакових. В соці уражених рослин злакових виявлено сферичні вірусні частки вірусу мозаїки бромусу діаметром 27±0,5 нм та паличкоподібні віріони грунтового вірусу мозаїки злакових з лінійними розмірами 130-160 х 20 нм.

3.4. Біологічне тестування вірусів злакових культур

Для біологічного тестування в роботі було використано декілька видів рослин, а саме: Chenopodium amaranticlor, Nicotiana tabacum cv. Samsun, N. benthamiana, Phaseolus vulgaris, які інокулювали механічно та ін‘єкцією в жилку листка. Для інокуляції рослин використовували вірусвмісний препарат (виділений з рослин Hordeum vulgare) в концентрації 50 мкг/мл та сік рослин Secale cereale, Triticum aestivum та Hordeum vulgare з симптомами вірусного ураження (в розведенні 1:50).

В результаті проведених досліджень на рослинах-індикаторах, інокульованих вірусами, були виявлені наступні симптоми: на листку Phaseolus vulgaris, яку було інфіковано соком рослин з симптомами мозаїки та смугастості методом уколу в жилку при основі листка через два тижні спостерігались дрібні некрози по периферії листкової пластинки, на лободі (Chenopodium amaranticolor), яку інокулювали соком рослин з симптомами мозаїки, на 10 день з’явилися локальні ураження, що характерні для вірусу мозаїки бромусу. На молодих листках тютюну (N. tabacum cv. Samsun), який було інфіковано соком рослин з симптомами мозаїки на молодих листках ми спостерігали прижилкову некротизацію тканини. За симптомами на злакових і реакцією тютюну на грунтовий вірус мозаїки злакових, а також враховуючи літературні дані, можна зробити висновок про можливість використання тютюну як рослини індикатора для ГВМЗ. На листках N. benthamiana, який було інфіковано соком рослин з симптомами штрихуватості, через два тижні розвивались симптоми мозаїки та деформації листкових пластинок, на тютюні (Nicotiana tabacum cv. Samsun) через два тижні після інокуляції соком з вище згаданих рослин розвивались локальні ураження невеликого розміру, що характерно для вірусу штрихуватої мозаїки ячменю.

Таким чином, поєднання результатів біологічного тестування з представленими вище даними ІФА дає можливість стверджувати про ураження зернових культур в агроценозах України такими вірусами, як: ВМБ, ВШМЯ та ГВМЗ.

3.5. Препаративне виділення вірусу мозаїки бромусу

В результаті виділення вірусу мозаїки бромусу за різними методиками та їх порівняння, було визначено найбільш ефективну методику Wechmar, використання якої дозволило отримати гомогенні препарати віріонів. Отримані препарати не містили рослинних домішок та структурних компонентів зруйнованих віріонів. Тому в подальшій роботі для виділення ВМБ ми використовували методику за Wechmar з деякими модифікаціями, як описано нижче.

Вірус мозаїки бромусу накопичували на рослинах ячменю (Hordeum vulgare). Листя гомогенізували в 0,5 М ацетатному буфері рН 4,0 та центрифугували при 5000 об/хв протягом 25 хв. Після високошвидкісного центрифугування (100000g 3 год) осад ресуспендували в 0,05 М ацетатному буфері рН 5,5 і знову центрифугували при 5000 об/хв протягом 20 хв. Після декількох циклів диференціального центрифугування чистоту та концентрацію очищеного препарату визначали спектрофотометрично. Співвідношення Е260/280 вірусного препарату становило 1,55, що збігається з літературними даними для очищеного препарату вірусу мозаїки бромусу. Оптичну густину препарату вимірювали при різному його розведенні і визначали концентрацію ВМБ, яка становила 4±0,1 мг/мл.

3.6. Дослідження капсидного білка вірусу мозаїки бромусу

Для визначення молекулярної маси капсидного білка ВМБ було проведено аналітичний електрофорез у поліакриламідному гелі за Лемлі з використанням додецил сульфату натрію як детергента.

В результаті фарбування електрофореграм кумасі блакитним R-250 у треках кожного з дослідних зразків спостерігався один основний компонент (рис. 6). За результатами електрофоретичного дослідження було визначено молекулярну масу білкової фракції для 2-х зразків: 1 - 20400 Да та 2 – 20320 Да. В результаті статистичної обробки визначено молекулярну масу структурного білка оболонки ВМБ - 20360 60 Да. Це співпадає з літературними даними щодо молекулярної маси білка вірусу мозаїки бромусу: 20300 Да (Гнутова, 1993).

3.7. Розробка діагностичної тест-системи до вірусу мозаїки бромусу

Для отримання антисироватки до вірусу мозаїки бромусу імунізацію кролів проводили вірусвмісним очищеним препаратом за схемою Гнутової (1993). З крові імунізованих кролів була отримана поліклональна сироватка до ВМБ. За допомогою непрямого імуноферментного аналізу було встановлене робоче розведення сироватки при титруванні її в діапазоні від 1:500 до 1:128000. Титр сироватки склав 1:64000, робоче розведення - 1:16000. Як контроль при постановці реакції використовували сік здорової рослини Hordeum vulgare в розведенні 1:50.

Оскільки найчастіше вірусні антигени діагностують у соці досліджуваних рослин, то потрібно, щоб діагностична антисироватка була специфічна тільки до вірусних антигенів і не реагувала з компонентами соку. Для доведення специфічності отриманої антисироватки до ВМБ проводили імуноелектроблотинг за Towbin (1979) з очищеним вірусним матеріалом та соком здорової рослини. В результаті проведення імуноелектроблотингу було встановлено, що одержана поліклональна антисироватка на нітроцелюлозній мембрані реагує з білком, маса якого відповідає капсидному білку ВМБ (молекулярна маса 20360 60 Да), але не реагує з іншими білками – компонентами соку здорової рослини (рис. 7). Таким чином, представлені результати свідчать про високу специфічність сироватки до вірусу ВМБ.

Рис. 6. Електрофореграма білка ВМБ.

1 - маркерні білки; 2 - очищений препарат ВМБ з рослин пшениці (3 мг/мл); 3 - очищений препарат ВМБ з рослин ячменю (4 мг/мл) | Рис. 7. Імуноблотограма вірусного білка.

1 - сік здорових рослин пшениці;

2 - очищений препарат ВМБ;

3 - сік здорових рослин ячменю

Для створення тест-системи на основі отриманої антисироватки до вірусу мозаїки бромусу нами була екстрагована фракція імуноглобулінів класу G та отриманий кон‘югат Ig G з ферментом лужною фосфатазою.

Перевірка якості отриманої тест-системи та підбір оптимального розведення Ig G і кон‘югату при тестуванні в ІФА були проведені за стандартною методикою.

Таким чином, нами була отримана власна діагностична тест-система до ВМБ, яка в подальшому може використовуватись для дослідження промислових посівів зернових культур в агроценозах України на наявність вірусу мозаїки бромусу з метою прогнозування появи і розвитку вірусної інфекції та розробки заходів, направлених на обмеження розповсюдження вірусу.

3.8. Виявлення сортів та ліній зернових культур,

уражених вірусом штрихуватої мозаїки ячменю

При діагностиці вірусу штрихуватої мозаїки ячменю ми тестували методом ІФА проростки та молоді рослини з насіння сортів та ліній злакових культур, а також диких злаків. Показано, що 11,8% досліджених сортів містили антигени ВШМЯ (10 з 85 сортів).

З‘ясовано, що найбільш ураженими із досліджених є сорти пшениці: „Саратовська 68”, „Рання 93” та „Прохоровка”, відсоток інфікованого насіння яких лежить в межах від 45 до 65 %. Менш ураженими є сорт пшениці „Воронежська 6” та селекційні лінії „D-253” та „D-257” – інфікованість насіння у межах 10 %. Слід відмітити, що і такий відсоток є досить небезпечним, особливо, якщо врахувати, що ураженим є саме селекційний матеріал. Це може призвести як до ускладнень при виведенні нових сортів (наприклад, зменшується конкурентноздатність пилку), так і до розповсюдження вірусної інфекції та розвитку вірусних епідемій.

Потрібно врахувати важливість тестування ВШМЯ не тільки в проростках та рослинах, але і безпосередньо в насінні, де концентрація вірусу дуже низька. Проаналізувавши сучасні методи ідентифікації вірусів, врахувавши достовірність отриманих результатів, чутливість методів (наприклад, чутливість полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) значно перевищує чутливість ІФА) та швидкість отримання результату, ми вважали за доцільне розробку тест-системи до ВШМЯ на основі ПЛР. Тим більше, що за допомогою ПЛР ми матимемо змогу виявляти також нуклеїнову кислоту, яка, власне, і є носієм інфекційності вірусу, що уможливить отримання об‘єктивних даних.

3.9. Створення діагностичної системи на основі ПЛР для

вірусу штрихуватої мозаїки ячменю

Враховуючи складність візуальної діагностики вірусної інфекції та важливість виявлення ВШМЯ не лише в проростках та рослинах, але й в насінні, ми створили діагностичну систему для ВШМЯ на основі ПЛР. Нами були розроблені праймери, специфічні до послідовності капсидного білка ВШМЯ та підібрані оптимальні умови постановки реакції.

Для розробки праймерів ми застосували програму Designer PCR 1,03 (Research Genetics) та використали з банку даних EMBL - EBI (European Bioinformaties Institute) відомі послідовності капсидного білка вірусу штрихуватої мозаїки ячменю. Праймери специфічні до послідовності капсидного білка ВШМЯ:

left - 5’GTGAGGAGGTGATGGGTAAT;

right - 5’TTCCAGTCTTTCAGAATCTCTC

продукт ампліфікації 417 тпо

Для відпрацювання постановки ПЛР нами було підібрано оптимальні умови постановки реакції. Зокрема, ми варіювали температурами відпалювання, підбираючи оптимальні, та проводили реакцію з використанням різних Таg-полімераз. Найбільш оптимальним для ампліфікації був наступний режим:

940 С – 3 хв; 30 циклів: 940 С – 30 сек, 580 С – 30 сек, 720 С – 30 сек; 720 С - 10 хв.

Результати проведення ПЛР з підібраними праймерами до ВШМЯ щодо підбору оптимальних умов постановки реакції показано на рисунку (рис. 8).

Як видно з рисунку, з Таg-полімеразою фірми Sigma працює лише один позитивний контроль, з Тag-полімеразою фірми Gibco два позитивні контролі дають позитивну реакцію, а сік здорових рослин різних видів зернових культур не реагує в реакції у жодній системі (рис. 8). Отже, ми показали, що результат постановки ПЛР залежить не тільки від температури відпалювання, а і від Тag-полімерази. В нашому випадку оптимальною виявилась Тag-полімераза фірми Gibco.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Рис. 8. Виявлення ВШМЯ за допомогою ПЛР: 1 - 2 позитивні контролі; 3 - 9 зразки здорових рослин з Таg-полімеразою (Sigma); 10 - маркери; 11 - 12 позитивні контролі; 13 - 19 зразки здорових рослин з Тag-полімеразою (Gibco).

Таким чином, для тестування вірусу штрихуватої мозаїки ячменю безпосередньо в насінні за допомогою ПЛР ми розробили праймери, специфічні до ділянки капсидного білка ВШМЯ, та підібрали оптимальні умови постановки реакції.

3.10. Ідентифікація грунтового вірусу мозаїки злакових

та його вектора в кореневій системі рослин

Крім вірусів, які досить давно виявляються в агроценозах України, нашу увагу привернули грунтові віруси злакових, які за результатами імуноферментного аналізу також мають місце на посівах в Україні.

За літературними даними відомо, що грунтові віруси переносяться спорами спокою та зооспорами гриба Polymyxa graminis, еукаріотичного облігатного паразиту коренів рослин, непатогенного для хазяїна. Спори спокою можуть виживати в грунті кілька десятиріч і в сприятливих умовах кожна з них звільняє одну первинну зооспору. Найбільша небезпека грунтових вірусів полягає в тому, що у переноснику вони можуть зберігати інфекційність більше 20 років.

Молоді спори спокою P.graminis тісно упаковані і мають прямокутну форму, але вони округляються і розвивають багатошарову клітинну стінку при дозріванні. Зрілі спори спокою зазвичай формують кластери характерної морфології. Цю властивість використовують для ідентифікації вектора грунтових вірусів.

Для виявлення спор спокою переносника методом світлової мікроскопії ми досліджували кореневу систему рослин, які давали позитивні результати в ІФА з антисироватками до грунтових вірусів. Дослідження показали наявність спор спокою гриба в кореневих волосках обстежених рослин.

Враховуючи спосіб передачі грунтового вірусу мозаїки злакових, що найчастіше ідентифікувався з грунтових вірусів в агроценозах України за результатами ІФА, крім виявлення антигенів вірусу в листках, за допомогою імуноблотингу відбитку тканин (tissue print-immunoblotting) ми виявляли вірус також в кореневій системі рослин. Цей метод дозволяє виявити не тільки наявність вірусу, але й проникнення та локалізацію в корінні рослин. При проявленні нітроцелюлозної мембрани за допомогою антисироватки до ГВМЗ нами було показано наявність грунтового вірусу мозаїки злакових в корінні рослин жита сорту „Арфа” (рис. 9).

Отже, результати імуноблотингу відбитку тканин вказують на наявність вірусу в кореневій системі та підтверджують дані імуноферментного аналізу про ураження рослин грунтовим вірусом мозаїки злакових.

Рис. 9. Виявлення антигенів грунтового вірусу мозаїки злакових в кореневій системі рослин жита сорту „Арфа”.

Таким чином, спори спокою переносника грунтових вірусів здатні виживати в грунті кілька десятиріч і можуть викликати значні втрати при вирощуванні на таких грунтах чутливих до нього сортів злакових. Хімічна боротьба з захворюваннями, спричинюваними грунтовими вірусами, є неефективною та неприйнятною з економічної та екологічної точок зору. Крім того, з літератури відомо, що при вирощуванні злакових в грунтах, контамінованих вірофорними ізолятами P. graminis, зооспори переносника, звільнені з коріння вірусорезистентних рослин, не містили і не переносили вірус. Перераховані вище факти стимулювали пошук та виведення резистентних сортів зернових культур до грунтових вірусів.

3.11. Скринінг селекційного матеріалу на чутливість до грунтового вірусу мозаїки злакових

Враховуючи, що єдиний ефективний спосіб боротьби з грунтовими вірусами – отримання стійких сортів, ми провели скринінг селекційного матеріалу на чутливість до грунтового вірусу мозаїки злакових. Для аналізу використовували 16 зразків кожного сорту, лінії чи дикого виду злаків, які вирощували у кліматичних камерах протягом 3 – 4 місяців в умовах, оптимальних для розвитку вірусної інфекції (150C) у грунті, контамінованому грунтовим вірусом мозаїки злакових. Кожну рослину тестували методом ІФА з використанням комерційної тест-системи до ГВМЗ.

При тестуванні зернових культур, а також диких злаків на чутливість до грунтового вірусу мозаїки злакових за допомогою імуноферментного аналізу було показано, що з 107 досліджених сортів, ліній чи диких видів злаків лише 6 сортів пшениці (5,6%) виявилися несприйнятливими до ГВМЗ (рис. 10).

Рис. 10. Результати тестування різних злаків на сприйнятливість до грунтового вірусу мозаїки злакових: 1 – озима пшениця „Альбатрос одеський”; 2 – озима пшениця „Василина”; 3 – яра пшениця „Харківська 26”; 4 – яра пшениця „Харківська 30”; 5 – озима пшениця „Оренбургська”; 6 – озима пшениця „Сєвєрская 157”; k+ 1 – жито „Ticino”; k+ 2 – озима пшениця „Hadm 10439-1”; k– ELISA – здоровий сік; k + ELISA – позитивний контроль.

На рисунку 10 представлено сорти пшениці, в яких не виявлено антигени грунтового вірусу мозаїки злакових. Можливо, в рослинах цих сортів вірус не здатний активно розмножуватись. Отже, ми можемо говорити про несприйнятливість даних сортів до ураження ГВМЗ. Ці сорти можуть бути рекомендовані як перспективні для виведення нових, резистентних до ГВМЗ, сортів пшениці.

ВИСНОВКИ

В результаті дослідження агроценозів 14 зерносіючих областей України протягом 2002-2005 рр. на наявність вірусних інфекцій злакових методами візуального обстеження, імуноферментним аналізом та електронною мікроскопією показано, що найбільший відсоток уражених рослин виявився в агроценозах Харківської, Одеської, Київської, Чернігівської та Вінницької областей (64%, 62%, 33%, 32% та 27 % відповідно).

Показано, що найбільш розповсюдженими вірусами зернових культур в агроценозах України є вірус жовтої карликовості ячменю (Luteovirus), вірус смугастої мозаїки пшениці (Тritimovirus) та вірус мозаїки бромусу (Bromovirus).

Вперше в агроценозах України виявлено 4 грунтові віруси злакових: вірус веретеновидної смугастої мозаїки пшениці, вірус м‘якої мозаїки ячменю (Bymovirus), грунтовий вірус мозаїки пшениці і грунтовий вірус мозаїки злакових (Furovirus), та спори спокою їх переносника - гриба Polymyxa graminis в кореневих волосках рослин.

Виділено та очищено ізолят вірусу мозаїки бромусу, отримано поліклональну специфічну антисироватку та розроблено діагностичну тест-систему до цього вірусу.

При тестуванні сортів та ліній зернових, які вирощуються в Україні, показано, що насіння більшості з них не містить антигени вірусу штрихуватої мозаїки ячменю (ВШМЯ), лише 10 (11,8 %) сортів, контаміновано цим вірусом.

Вперше в Україні на основі полімеразної ланцюгової реакції шляхом підбору праймерів та умов постановки ПЛР розроблено діагностичну систему для вірусу штрихуватої мозаїки ячменю (Hordeivirus).

Скринінг 107 сортів, ліній та диких видів злаків на чутливість до грунтового вірусу мозаїки злакових виявив 6 несприйнятливих сортів (5,6 %), які можуть бути рекомендовані як перспективні для створення нових стійких сортів до цього вірусу.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Снігур Г.О., Будзанівська І.Г., Поліщук В.П. Моніторинг вірусів злакових в агроценозах України.// Мікробіологічний журнал. – 2005. – Т. 67., № 5. – С.: 88-95. (Пошукачем визначено ідею роботи, проведено збір матеріалу та виконано експерементальну частину, крім того пошукачем підготовлено статтю до друку. Висновки зроблено колективно).

Юхименко А.І., Будзанівська І.Г., Снігур Г.О., Гірко В.С., Бойко А.Л., Поліщук В.П. Деякі особливості ураження озимої пшениці вірусом жовтої карликовості ячменю.// Захист рослин. – 2003. - №5. – С.: 5-6. (Пошукачем проведені обробка одержаних результатів, виготовлення ілюстрацій. Відбір зразків здійснено колективно. Висновки зроблено при участі всіх авторів).

Снігур Г.О., Будзанівська І.Г., Олійник С.В., Поліщук В.П. Моніторинг деяких вірусів злакових в агроценозах України.// Наукові записки. Національний університет Києво-Могилянська академія. – 2003. – Том 22. – С.: 385-388. (Пошукачем визначено ідею роботи та виконано експерементальну частину, крім того пошукачем підготовлено статтю до друку. Висновки зроблено колективно).

Снігур Г.О., Будзанівська І.Г., Кастір У., Олійник С.В., Поліщук В.П. Ідентифікація грунтових вірусів на території України. – Зб. тез Х з‘їзду Товариства мікробіологів України. – 2004. - Одеса, Україна. - С.: 371.

Снігур Г.О., Олійник С.В., Кастір У. Моніторинг грунтових вірусів злакових в Україні. - Зб. тез ІV Міжнародної конференції “Біоресурси і віруси”. – 2004. – Київ, Україна. – С.: 95.

Снігур Г.О. Діагностика вірусів злакових на Україні. IV Всеукраїнська наукова конференція студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні”. –