Академія медичних наук України

Інститут фармакології та токсикології

Сидорова ІРИна ВОЛОДИМИрівна

УДК 615.272.4.014.425:544.792+547.856

Пошук церебропротекторів у ряду

4-гідразинохіназоліна та його

конденсованих аналогів

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

КИЇВ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Запорізькому державному медичному університеті МОЗ України на кафедрі фармакології та медичної рецептури

Науковий керівник: доктор біологічних наук Бєленічев Ігор Федорович,

Запорізький державний медичний університет МОЗ України,

завідувач кафедри фармакології та медичної рецептури

(м. Запоріжжя)

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор,

Заслужений діяч науки і техніки України

Громов Леонід Олександрович,

Інститут фармакології та токсикології

АМН України, завідувач відділом

нейрофармакології (м. Київ)

доктор медичних наук, професор

Степанюк Георгій Іванович

Вінницький національний медичний

університет ім. М. І. Пирогова МОЗ України,

завідувач кафедри фармакології (м. Вінниця)

Провідна установа: Харківський державний медичний університет

МОЗ України, кафедра фармакології та

медичної рецептури (м. Харків)

Захист відбудеться “ 17 ” травня 2006 року о 1300 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 в Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Пот'є, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Пот'є, 14.

Автореферат розісланий “ 13 ” квітня 2006 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01,

кандидат біологічних наук І. В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Згідно міжнародних епідеміологічних досліджень (World Development Report), у світі від інсульту щорічно помирає 4,7 млн. чоловік. В більшості країн інсульт займає 2-3 місце в структурі загальної смертності населення, в нашій країні - друге, поступаючись лише кардіоваскулярній патології. Інсульт займає перше місце, як причина стійкої втрати працездатності. Серед усіх видів інсультів переважають ішемічні ураження мозку (Е. И. Гусев и др., 2003; R. Davenport et al., 2000; A. Rabinstein et al., 2000).

При ішемічному ураженні мозку в результаті зниження мозкового кровотоку відбувається порушення функції дихального ланцюга мітохондрій і енергетичного обміну, глутаматна "ексайтотоксичність", порушення іонного гомеостазу клітини з підвищенням внутріклітинного вмісту іонів кальцію, лактат-ацидозом, активацією внутріклітинних ферментів, підвищенням синтезу NO, розвитком оксидативного стресу, експресією генів, аноксичною деполяризацією мембран і смертю клітини (К. Т. Турпаев и др., 2002; А. А. Болдырев и др., 2000; В. А. Малахов и др., 2001).

Клінічні дослідження найбільш активних в експерименті засобів первинної церебропротекції - антагоністів глутаматних рецепторів, виявили багато побічних ефектів, таких як галюцинації, запаморочення, ністагм, нудота, блювання, артеріальна гіпотонія (Е. И. Гусев и др., 2003). ГАМК-ергічні препарати, зокрема пірацетам, в гострий період ішемії не мають захисної дії та посилюють метаболічний ацидоз (В. И. Скворцова, 2003). Як засоби вторинної церебропротекції застосовуються антиоксидантні препарати (З. А. Суслина и др., 2000). Проходять клінічні випробування такі антиоксиданти, як PBN, троллокс, раксофлат. Добре відомі емоксипін та мексідол.

Незважаючи на очевидну перспективність антиоксидантної терапії при ішемічних станах і багаточисельні позитивні результати, отримані в модельних експериментах (В. В. Дунаєв и др., 1999; Е. И Гусев и др., 2003; І. Ф. Бєленічев та ін., 2005), сучасні антиоксиданти-церебропротектори мають ряд побічних ефектів при тривалому застосуванні (нудота, помірне підвищення артеріального тиску, шкірний висип). Тому необхідний подальший пошук нових церебропротекторів з антиоксидантним механізмом дії для корекції каскадних деструктивних постішемічних процесів.

Перспективними в цьому напрямі є похідні хіназоліну, що мають широкий спектр біологічної активності, зокрема антиоксидантну, ноотропну та протиішемічну (І. Ф Бєленічев, 2002; Н. В. Бухтіярова, 2003; С. І. Коваленко, 2003).

Дослідженнями співробітників Запорізького державного медичного університету виявлена антиоксидантна та протиішемічна активність серед похідних 4-аміно-хиназоліну (Р. С. Синяк и др., 1990; В. В. Дунаєв та ін., 1996; І. А. Мазур та ін., 1995), N-(4-хіназоліл)аміноалкіл(арил)карбонових і 2-R2-6-R3-8-R4-(3H)-хіназолон-4-іл-3-()-алкілкарбонових кислот та їх водорозчинних солей (Н. В Бухтиярова, 2003; І. Ф. Бєленічев та ін., 1995-2005). Однак їх лікувальна та профілактична ефективність при ішемічних станах головного мозку не досліджена. На сьогодні антиоксидантна та протиішемічна активність у ряду 4-гідразинохіназоліна та його конденсованих аналогів не вивчена, що свідчить про доцільність проведення досліджень і цьому напрямку.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлена дисертаційна робота виконана як фрагмент планової науково-дослідної роботи кафедр фармацевтичної хімії та фармакології Запорізького державного медичного університету "Цілеспрямований пошук біологічно активних речовин у ряду п'яти- і шестичленних азагетероциклів та створення на їх основі лікарських препаратів" (№ державної реєстрації 0102 U 002863, шифр ІН 15.00.02.01).

Мета і завдання дослідження. На основі скринінгових досліджень виявити найбільш активні сполуки з церебропротективними властивостями у ряду похідних 4-гідразинохіназоліна та його конденсованих аналогів.

Згідно з метою дослідження виконувались наступні завдання:

1.

2.

3.

4.

Об'єкт дослідження. Білі щури з ішемією головного мозку, тканини головного мозку, кров.

Предмет дослідження. Антиоксидантні та церебропротективні властивості у ряду похідних 4-гідразинохіназоліна та його конденсованих аналогів.

Методи дослідження. Фармакологічні, біохімічні, токсикологічні, морфологічні та статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше отримані дані про антиоксидантну активність 47 сполук похідних 4-гідразинохіназоліна та його конденсованих аналогів. В дослідах in vitro встановлено, що 4 речовини на моделях ферментативного та неферментативного ініціювання вільнорадикального окислення (ВРО), інгібування супероксидрадикалу, монооксиду азоту та гальмування окисної модифікації білку (ОМБ) перевищують референс-препарати (дибунол, ?-токоферол, метіонін, унітіол, сечовину, N-АЦЦ і емоксипін).

В дослідах in vivo на моделі гострого порушення мозкового кровообігу (ГПМК) по типу ішемічного інсульту найбільший церебропротективний ефект демонструвала сполука НН-103 - N-(фенілаліліден)-N?-хіназолін-4-іл-гідразин. Вона перевищувала досліджувані сполуки за такими показниками, як зниження активності ВВ-КФК в сироватці крові, зниження утворення МДА, ДК, ТК, нітрит-іону, продуктів окисної модифікації білка в тканинах головного мозку, подовження латентного часу заходу в тесті умовної реакції пасивного уникання (УРПУ). Вперше показано, що церебропротективний механізм дії цієї сполуки, ймовірно, пов'язаний із здатністю інгібувати процеси ВРО, зокрема пригнічувати активні форми кисню, а також гальмувати окисну модифікацію білка тканин головного мозку.

Практичне значення отриманих результатів. В результаті проведених досліджень виявлена сполука N-(фенілаліліден)-N?-хіназолін-4-іл-гідразин (НН-103), яка проявляє виражену антиоксидантну і церебропротективну активність, що перевищує по силі дії відомі референс-препарати (пірацетам, емоксипін, тіотриазолін). Нами отримано деклараційний патент на дану сполуку.

Результати дисертаційної роботи використовуються в наукових дослідженнях і учбовому процесі кафедр фармакології Дніпропетровської державної медичної академії, Запорізького державного медичного університету, Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, Кримського державного медичного університету ім. С. І. Георгіївського.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз наукової літератури за даною темою, визначені мета і завдання дослідження, освоєні і відтворені моделі гострого порушення мозкового кровообігу на тваринах. Самостійно проведено пошук речовин з антиоксидантною активністю серед 47 сполук похідних 4-гідразинохіназолина та його конденсованих аналогів in vitro на п'яти моделях ініціації вільнорадикального окислення. Автором модифікована методика визначення неврологічного дефіциту у тварин після моделювання ГПМК.

Виконано статистичну обробку отриманих результатів, проведено аналіз результатів, сформульовані висновки роботи, опубліковані основні положення дисертації. Оформлення дисертаційної роботи та автореферату виконано дисертантом самостійно.

Апробація роботи. Основні фрагменти результатів дисертаційної роботи були оприлюднені на: Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю створення фармацевтичного факультету Запорізького державного медичного університету "Історія і перспективи розвитку фармацевтичної науки і освіти" (м. Запоріжжя, 10-11 березня 2004 р.); Науково-практичній конференції з міжнародною участю "Створення, виготовлення, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів і біологічно активних добавок" (м. Тернопіль, 14-15 вересня 2004 р.); II з'їзді Токсикологів України (м. Київ, 12-14 жовтня 2004 р.); IV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю по клінічній фармакології (м. Вінниця, 7-8 жовтня 2004 р.); VI Національному з'їзді фармацевтів України "Досягнення і перспективи розвитку фармацевтичної галузі України" (м. Харків, 28-30 вересня 2005 р.); VI міжнародній науково-практичній конференції "Актуальні проблеми токсикології. Безпека життєдіяльності людини", присвяченій 100-річчю з дня народження Л. І. Медведя (м. Київ, 1-3 жовтня 2005 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових робіт, які повною мірою відображають ії зміст, з них 10 журнальних статей (1 - самостійно), в тому числі 7 статей у наукових фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 1 деклараційний патент, 4 тез у матеріалах з'їздів, конгресів, науково-практичних конференцій різних рівнів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 196 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, двох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків та списку літератури, який містить 249 літературних джерела, з них вітчизняних – 147, зарубіжних – 102. Робота проілюстрована 42 таблицями, 11 рисунками, 1 додатком.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. Наукова стратегія пошуку біологічно активних сполук, у тому числі і церебропротекторів, на сьогодні базується на ряді пріоритетних напрямків, серед яких комп'ютерні технології конструювання, генна інженерія, медична і комбінаторна хімія, молекулярне моделювання, високоефективний тотальний скринінг та інші (В. В. Поройков, 1999; О. А. Раевский, 1999; С. Ю. Суйков та ін., 2001). Враховуючи це, нами спільно з групою синтетиків (керівник - професор С. І. Коваленко) на першому етапі була сформована віртуальна бібліотека, систематизована за допомогою пакету ISIS 2.4. На другому етапі проводився відбір структур-кандидатів і вибір напрямків досліджень. Для обробки бібліотеки і відбору структур-лідерів використовувалася комп'ютерна програма PASS C&T (Prediction Activity for Substanses: Complex and Training). Прогноз біологічної активності з використанням комп'ютерної програми PASS C&T проведений в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України (к. хім. н. С. М. Ярмолюк).

На третьому етапі проведені дослідження на антиоксидантну (АОА) і антирадикальну (АРА) активність. В основі різноманітних методів in vitro закладений механізм ініціації ВРО.

На четвертому етапі відібрані сполуки-кандидати оцінюються в умовах моделювання ГПМК по типу ішемічного інсульту за такими показниками як виживаність тварин, зниження неврологічного дефіциту, здатність до навчання і запам'ятовування, вплив на інтенсивність ВРО, АО-системи, енергетичний метаболізм тканин головного мозку.

П'ятий етап - найактивніша речовина (сполука-лідер) досліджується на різних моделях ГПМК (двосторонній фотоіндукований тромбоз судин лобової частки кори головного мозку, ішемії-реперфузії головного мозку, двостороння перев’язка загальних сонних артерій), де враховується його вплив на неврологічний і когнітивний дефіцит, динаміку відновлення неврологічного статусу, зниження процесів ВРО, активацію АО-системи, нормалізацію показників вуглеводно-енергетичного обміну, нормалізацію морфологічної картини в порівнянні з тіотриазоліном, емоксипіном, пірацетамом.

Оцінку антиоксидантної активності нових синтезованих сполук проводили в дослідах in vitro - методами ферментативного та неферментативного ініціювання ВРО, методом оцінки по інгібуванню активних форм кисню – супероксидрадикалу та монооксиду азоту, методом оцінки по гальмуванню окисної модифікації білка.

Ферментативне ініціювання проводили шляхом додавання надлишку НАДФ.Н2 до гомогенних тканин мозку білих щурів. АОА оцінювали по рівню зниження кінцевого продукту ВРО – МДА в гомогенатах (Ю. І. Губський та ін., 2001). Неферментативне ініціювання моделювали шляхом додавання солей двовалентного заліза до суспензії ліпопротеїдів курячого яйця (Г. И. Клебанов Г.И. и др., 1999; Ю. І. Губський та ін., 2001). Антиоксидантну активність сполук по інгібуванню супероксидрадикалу виявили в реакції аутоокислення адреналіну в адренохром у лужному середовищі (Ю. І. Губський та ін., 2001). Індукцію монооксиду азоту здійснювали опроміненням водних розчинів нітропрусиду натрію (10мМ) і аскорбінової кислоти (40мМ) світлом від джерела потужністью 300 Вт з довжиною хвилі 425 нм. Антиоксидантну активність сполук по інгібуванню монооксиду азоту тестували за ступенем гальмування окислення аскорбінової кислоти, вимірюючи оптичну густину при 265 нм та виражали у відсотках інгібування окислення аскорбату (Ю. І. Губський та ін., 2001).

Метод оцінки окисної модифікації білків (ОМБ) заснований на реакції взаємодії окислених амінокислотних залишків з 2,4-динітрофенілгідразином (2,4-ДНФГ) з утворенням 2,4-динітрофенілгідразонів – альдегідних та карбоксильних груп, та по накопиченню продуктів дефрагментації білка (B. Halliwell, 1999).

Досліди виконано на 890 білих щурах лінії Вістар масою 220-260 г. Всі тварини утримувалися на стандартному раціоні харчування віварію, при природній зміні дня і ночі. Щури отримані з розплідника ІФТ АМН України. Всі експериментальні процедури і оперативні втручання здійснювали відповідно до "Положення про використання тварин в біомедичних дослідженнях".

Оскільки нашою метою стала оцінка церебропротективної активності сполук, то нам були необхідні моделі експериментальної патології головного мозку, адекватні клінічним ситуаціям, таким як ішемічний інсульт (Ю. В. Буров и др., 1987; Б. Ю. Ирипханов и др., 1989; М. Б. Плотников и др., 1994). Вказаним вимогам відповідає двостороння перев'язка загальних сонних артерій у зв'язку з видовими анатомо-фізіологічними особливостями кровопостачання головного мозку білих щурів (И. В. Ганнушкина и др., 1977; В. Д. Трошин и др., 2000; W. M. Clark et al., 2002). При цьому спостерігається відповідний неврологічний дефіцит, когнітивні порушення, гістологічні і біохімічні зміни тканини головного мозку.

Двосторонню перев'язку загальних сонних артерій виконували під етамінал-натрієвим наркозом (40 мг/кг), з використанням хірургічного доступу шляхом виділення сонних артерій і накладення на них шовкової лігатури (С. А. Шалимов и др., 1989).

Двосторонній фокальний ішемічний осередок в лобовій частці кори головного мозку щурів створювали методом фотохімічної ішемії (B. D. Watson et al., 1985). Ця методика заснована на принципі фотохімічної стимуляції утворення тромбів в судинах мозку щурів при взаємодії світлового променя із попередньо введеним в кровоносне русло флюоресцентним фарбником - бенгальським рожевим.

Модель гострої ішемії-реперфузії головного мозку відтворювали шляхом двосторонньої оклюзії загальних сонних артерій протягом 30 хвилин на фоні артеріальної гіпотензії (пентамін 20 мг/кг), за рахунок накладення і зняття лігатури під етамінал-натрієвим наркозом (40 мг/кг) (С. А. Шалимов и др., 1989; М. В. Биленко, 1989).

Тварини виводились з експерименту в ранковий час під етамінал-натрієвим наркозом (40 мг/кг). Після досягнення глибокого наркозу розтиналась передня стінка живота і черевна порожнина, і після введення голки в район біфуркації аорти проводився забір крові. У тварин з експериментальною ішемію головного мозку швидко розкривалась черепна коробка, після чого видаляли ішемізовану півкулю і заморожували в рідкому азоті.

Для біохімічних досліджень тканини гомогенізувалися в сольовому ізотонічному розчині (0,15 М KCl) при охолодженні (до +4С) за допомогою скляного гомогенізатора в співвідношенні 1:40. Після виділення ядер i незруйнованих клітин (1000g), методом диференційного центрифугування (15000g) виділялася цитозольна фракція (М. И. Прохорова, 1982).

Екстракцію ліпідів проводили за методом Р. Кейтс (1974). Безбілковий екстракт одержували додаванням точної наважки гомогенату тканини в хлорну кислоту (0,6 М), з наступною нейтралізацією 5,0 М К2СО3 (М. И. Прохорова, 1982).

Для оцінки інтенсивності вільнорадикального окислення в плазмі крові та тканинах головного мозку визначали початкові та кінцеві продукти ВРО – дієнові кон’югати (ДК), триєнкетони (ТК), малоновий діальдегід (МДА) відповідно до загальноприйнятих методів (М. В. Биленко, 1989; Л. И. Андреева и др., 1988; Р. Кейтс 1974; В. С. Коган и др., 1986), продукти ОМБ (B. Halliwell, 1999), вміст стабільних метаболітів оксиду азоту по Грісу (Н. В. Горбунов, 1995). Стан антиоксидантної системи оцінювали по активності супероксиддисмутази (СОД), каталази, глутатіонпероксидази (ГПР) та рівню ?-токоферолу в тканинах головного мозку (А. Р. Гаврилова, 1986; М. А. Королюк и др., 1988; С. Чевари, 1988; І. М. Rapola, 1998). Стан вуглеводно-енергетичного обміну визначали по рівню найбільш важливих інтермедіатів – АТФ, АДФ, АМФ, лактату, пірувату, малату (В. В. Зінчук, 1999; В. В. Меншиков и др., 1987; М. И. Прохорова, 1982). Для оцінки ішемічного пошкодження тканин головного мозку визначали рівень гіперферментемії церебрального ізоензиму креатинфосфокінази (ВВ-КФК) (Г. А. Яровая и др., 1982).

Досліджувались такі препарати: пірацетам (ЗАТ "Фармацевтична фірма "Дарниця", Україна) в дозі 250 мг/кг, емоксипін (АТ Таллінський фармацевтичний завод, Естонська Республіка) - 100 мг/кг, тіотриазолін (АТ "Галичфарм", Україна) - 50 мг/кг, досліджувані сполуки (НН-103; 90; 91; 87) – 25 мг/кг, 47 нових сполук – похідні 4-гідразинохіназоліну різних хімічних структур, синтезованих на кафедрі фармацевтичної хімії Запорізького державного медичного університету (професор С. І. Коваленко). Препарати вводили щурам per os щоденно протягом 14 діб експерименту. Синтезовані сполуки в дослідах in vitro вводили в систему в кількості, кратній їх молекулярним масам.

Неврологічний дефіцит у тварин визначали по шкалі stroke-index (С. P. McGrow, 1977). Дослідження неврологічних рефлексів проводили по шкалі Я. Буреша, дослідження орієнтовно-дослідницької поведінки проводили в тесті "відкрите поле" (Я. Буреш и др., 1991). Здатність тварин до навчання і запам'ятовування аверсивного стимулу оцінювали в тесті умовної реакції пасивного уникання (УРПУ) (Ю. В. Буров и др., 1987; М. Я. Головенко, 2002).

Морфологічні дослідження проводилися на кафедрі патофізіології Запорізького державного медичного університету при консультативній допомозі професора А. В. Абрамова. Тканини головного мозку експериментальних тварин поміщали на 1 добу у фіксатор Карнуа і після стандартної гістологічної проводки тканину парафінували (Э. Пирс, 1962). Для вивчення морфології нейронів на ротаційному мікротомі виготовляли 4-мікронні зрізи нейронів кори лобової частки та гіпокампа, які депарафінували і зафарблювали для визначення змісту нуклеїнових кислот галлоціанін-хромовим галуном по Ейнарсону (Э. Пирс, 1962). Морфометричні дослідження проводили на мікроскопі Axioskop (Zeiss, Німеччина). Зображення нейронів в області зони CA1 гіпокампа та пірамідного шару в лобовій корі, одержувані на мікроскопі, за допомогою високочутливої відеокамери COHU-4922 (COHU Inc., США) вводили в комп'ютерну програмно-апаратну систему цифрового аналізу зображення DIAS (Y. M. Kolesnik et al., 2002). Аналіз зображень проводили в напівавтоматичному режимі.

Отримані результати піддавали статистичній обробці згідно з методом варіаційної статистики із використанням t-критерію Ст’юдента.

Результати досліджень та їх обговорення. Пошук антиоксидантної та антирадикальної активності проводили серед 47 сполук, які мають наступну хімічну структуру: N-(R-ариліден)-N?-(3H-хіназолін-4-іліден)-гідразини (1.1, 1.2, 1.3), N-[2-R-3-(R1-феніл)-аліліден]-N?-(3Н-хіназолін-4-іліден)гідразини (1.4), N-[1-алкіл-(1-R-феніл-, 1-R-нафтіл)-етиліден]-N-(3Н-хіназолін-4-іліден)гідразини (1.7, 1.8, 1.9), [(3H-хіназолін-4-іліден)-гідразоно]карбонові кислоти (1.5), (3H-хіназолін-4-іліден)гідразиди алкіл(алкарил-, арил-)карбонових кислот (1.6), 3-алкіл(алкарил-, арил-)[1,2,4]триазоло[1,5-c]хіназоліни (1.10, рис. 1).

Рис. 1. Структурні формули сполук похідних 4-гідразинохіназоліна та його конденсованих аналогів

Фармакологічним скринінгом антиоксидантної і антирадикальної активності в дослідах in vitro серед 47 похідних 4-гідразинохіназоліна та його конденсованих аналогів найбільшу АОА та АРА виявили 4 сполуки: N-(R-ариліден)-N?-(3H-хіназолін-4-іліден)-гідразини (НН-87; НН-90; НН-91) та N-[2-R-3-(R1-феніл)-аліліден]-N?-(3Н-хіназолін-4-іліден)гідразини (НН-103)., перевищуючі (р?0,05) по силі антиоксидантної і антирадикальної дії інші сполуки та референс-препарати.

Аналіз взаємозв'язку "структура-дія" серед 47 досліджуваних речовин показав, що антиоксидантна і антирадикальна активність суттєво залежить від природи замісника, введеного до хіназолінового або 1,2,4-триазоло[5,1-с]хіназолінового циклу, і, крім того, від ліпофільності синтезованих сполук.

При вивченні гострої токсичності було встановлено, що сполуки НН-103; НН-90; НН-91; НН-87 відносяться до класу малотоксичних при їх пероральному введенні щурам (ЛД50 501-5000 мг/кг).

Дослідження показали, що найбільш ефективною дозою для досліджуваних сполук при пероральному введенні щурам з двосторонньою перев'язкою загальних сонних артерій є доза 25 мг/кг.

Курсове призначення досліджуваних сполук, а також препаратів порівняння в гострий період ішемічного інсульту тваринам з двосторонньою перев'язкою загальних сонних артерій приводило до нормалізації багатьох показників вуглеводно-енергетичного обміну, активності ферменту ВВ-КФК.

Встановлено інгібуючий вплив всіх досліджуваних сполук на процеси ВРО в тканинах головного мозку. При їх призначенні в тканинах головного мозку підвищувалася активність СОД, каталази, ГПР і рівень ?-токоферолу. Паралельно реєструвалося зниження стабільних продуктів ВРО - МДА, ДК і ТК.

Важливим моментом в антиоксидантній активності похідних 4-гідразино-хіназоліну є гальмування окисної модифікації білка, що виражається в зниженні утворення альдегідних та карбоксильних груп і ступеня його дефрагментації в гомогенаті мозку щурів. Введення досліджуваних сполук знижувало утворення стабільного метаболіту оксиду азоту - нітрит-іону в тканинах головного мозку експериментальних тварин з ГПМК.

В групі тварин з ішемічним інсультом (контрольна група) виживаність складає 30% на 4 добу експерименту. При введенні досліджуваних сполук, а також емоксипіну і тіотриазоліну виживаність щурів складала 60-80% (р?0,05).

Дослідження тварин, що вижили, по шкалі stroke - index С. P. McGrow показало, що у 100% тварин присутні важкі неврологічні симптоми: парези і паралічі 1-4 кінцівок, положення тіла на боку, неутримування тварин на стрижні, що обертається. Досліджувані сполуки помітно послаблювали у тварин неврологічний дефіцит.

Дослідження процесів навчання і пам'яті на моделі УРПУ на 14 добу дослідження показало наявність у тварин контрольної групи вираженого когнітивного дефіциту, що виражається в зниженні в 5,7 раз латентного часу заходу в камеру і повною відсутністю навчених тварин. Введення похідних 4-гідразинохіназоліну збільшувало тривалість латентного періоду заходу в темну камеру і збільшувало кількість тварин із збереженням пам'ятного сліду.

Досліджувані сполуки при курсовому призначенні експериментальним тваринам надавали виражену церебропротективну дію, що має одну спрямованість, оскільки всі сполуки мають схожу структуру, але відрізняються по силі ефекту.

Таким чином, в дослідах in vivo на моделі ГПМК по типу ішемічного інсульту на моделі двосторонньої перев'язки загальних сонних артерій найбільший церебропротективний ефект надавала сполука НН-103 - N-(фенілаліліден)-N?-хіназолін-4-іл-гідразин. Вона перевищувала досліджувані сполуки за такими показниками, як зниження активності ВВ-КФК в сироватці крові, зниження утворення МДА, ДК, ТК, нітрит-іону, продуктів ОМБ в тканинах головного мозку, подовження латентного часу заходу в тесті умовної реакції пасивного уникання.

Курсове призначення НН-103 протягом 4 діб тваринам з двосторонньою перев'язкою загальних сонних артерій приводило до гальмування реакцій ВРО, реактивації антиоксидантної системи захисту, нормалізації систем біоенергетики в тканинах мозку і зниженню гіперферментемії ВВ-КФК. Так, при введенні НН-103 тваринам з двосторонньою перев'язкою загальних сонних артерій у тканинах головного мозку рівень АТФ підвищувався на 100% відносно контролю (табл.). Введення сполуки НН-103 приводило до інтенсифікації аеробних процесів синтезу АТФ (зниження лактату, збільшення малату).

Важливим моментом у механізмі церебропротективної дії НН-103 є його антиоксидантний ефект. Так, у головному мозку тварин з двосторонньою перев'язкою загальних сонних артерій, що отримували НН-103 на протязі 4-х діб, спостерігалося зниження продуктів ВРО в головному мозку: ДК на 33,5%, ТК – 54,8% і МДА – 49,2%, підвищувалась активність СОД у 3,6 рази, каталази у 3,87 рази, ГПР у 1,65 рази та вміст ?-токоферолу на 30,8% відносно контролю (р?0,05), що перевищує показники препаратів порівняння.

При введенні НН-103 відбувається гальмування ОМБ, що виражається в зниженні утворення альдегідних (АФГ) (48,5%) і карбоксильних (КФГ) (64,0%) груп - основних маркерів ОМБ і зниженні ступеня його дефрагментації при довжині хвилі 254 нм (20,2%); при ?=272 нм (46,4%); при ?=280 нм (45,5%) порівняно з контролем (р?0,05), що дорівнює з емоксипіну та перевершує показники пірацетаму та тіотриазоліну (табл.).

Введення НН-103 знижувало утворення стабільного метаболіту оксиду азоту - нітрит-іону в тканинах головного мозку на 36,8% відносно контролю (р?0,05), що перевищує показники препаратів порівняння.

Таблиця

Вплив НН-103 на біохімічно-функціональні показники тканин головного

мозку щурів на 4 добу після ГПМК (двостороння перев’язка загальних сонних артерій)

Група тварин | АТФ мкмоль/г ткан. | СОД, у.о./мг білка/хв. | МДА мкмоль/г ткан. | ВВ-КФК ммоль/л/год. | АФГ

?=274 нм | КФГ

?=363 нм

Інтактні | 2,15±0,03 | 328,6±14,5 | 0,52±0,05 | 0,05±0,002 | 5,66±0,02 | 8,78±0,13

ГПМК (контроль) | 0,90±0,02 | 72,1±1,63 | 1,26±0,08 | 0,197±0,004 | 13,6±0,26 | 29,7±0,31

ГПМК+ НН-103 | 1,80±0,01* | 262,1±27,4*° | 0,64±0,03*° | 0,09±0,002*° | 7,00±0,21*° | 10,7±0,17*°

ГПМК +емоксипін | 1,70±0,08* | 125,1±11,3* | 0,76±0,06* | 0,12±0,002 | 7,00±0,14*° | 12,6±0,14*

ГПМК+тіотриазолін | 1,82±0,03* | 180,7±25,6* | 0,80±0,05 | 0,11±0,004 | 7,50±0,15* | 16,6±0,14

ГПМК+пірацетам | 1,47±0,15* | 112,4±14,1 | 1,00±0,04 | 0,166±0,003 | 11,0±0,13 | 24,6±0,11

Примітки:

1. * – р?0,05 по відношенню до контролю;

2. о – р?0,05 по відношенню до пірацетаму.

Рис. 2. Вплив НН-103 на неврологічний дефіцит щурів з ГПМК (двостороння перев'язка загальних

сонних артерій) по шкалі C. P. McGrow.

Рис. 3. Вплив НН-103 на відтворення УРПУ у щурів на різних моделях ішемії головного мозку на 14 добу експерименту

Про зменшення пошкодження нейронів і протиішемічну дію НН-103 судили по зниженню показників гіперферментемії ВВ-КФК на 54,3% відносно контролю (р?0,05), що перевищує показники референс-препаратів (див. табл.).

По показникам відновлення неврологічного дефіциту при двосторонній перев’язці загальних сонних артерій по шкалі C. P. McGrow захисний ефект НН-103 відповідає емоксипіну та перевищує показники пірацетаму і тіотриазоліну (див. рис.2).

Крім того, сполука НН-103 досліджувалась на різних моделях порушення мозкового кровообігу, таких як двосторонній фотоіндукований тромбоз судин лобової частки кори головного мозку та ішемія-реперфузія головного мозку.

При моделюванні фототромбозу у тварин спостерігалася неврологічна симптоматика по шкалі C. P. McGrow середнього ступеня тяжкості, але був виражений когнітивний дефіцит (зниження в 3,75 рази часу заходу в темну камеру в УРПУ). Введення сполуки НН-103 збільшувало латентний період заходу в УРПУ, перевищуючи референс-препарати, тобто більш виражено впливало на функції навчання та пам'яті. Ступінь неврологічного дефіциту на 4 добу при введенні НН-103 відповідав легкій неврологічній симптоматиці, що відповідає емоксипіну та перевищує показники пірацетаму та тіотриазоліну, при введенні яких відзначається середній ступінь тяжкості

Лікувальний ефект НН-103 з ішемією-реперфузією головного мозку у щурів виявлявся в підвищенні виживання тварин, в прискоренні відновлення поведінкових і когнітивних показників вищої нервової діяльності. НН-103 по ряду показників, характеризуючих антиоксидантну, протиішемічну активність, відновлення неврологічного і когнітивного дефіциту перевищував тіотриазолін і пірацетам, а емоксипін - по збереженню пам'ятного сліду в УРПУ.

Вищевикладене підтвердилося при морфологічних дослідженнях тканин головного мозку після експериментального ГПМК на моделі двосторонньої перев’язці загальних сонних артерій. У тварин контрольної групи на 4 добу спостерігалося чотирикратне переважання кількості тих нейронів, які дегенерували, над тими, що вижили у корі лобової частки і практично двократне – в СА1 зоні гіпокампа. Ішемічна загибель нейронів в корі лобової частки з рівною імовірністю відбувається шляхом каріопікнозу або цитолізу, тоді як в гіпокампі - переважно шляхом цитолізу. Курсове введення сполуки НН-103, тіотриазоліну та емоксипіну викликало практично рівне двократне зменшення процесів нейрональної загибелі в корі лобової частки; тоді як для пірамідних нейронів СА1 зони гіпокампа (структурі, що відповідає за функції пам’яті) найбільшою нейропротективною дією володіла сполука НН-103, що усилювала виживаність нейронів більш ніж у 2,5 рази. При введенні пірацетаму в пірамідному шарі візуалізувалися лише одиничні нейрони,які вижили; більша частина клітин була представлена пікнотичними клітинами; у всіх щурів гіпокамп був повністю зруйнований – на його місті спостерігалася кіста. Таким чином, пірацетам в гострий період мозкового інсульту володіє негативною дією.

Так при введенні НН-103 знижувалася загибель нейронів кори лобової частки (в 1,65 рази) і СА1 зони гіпокампа (в 2,57 рази) щодо контролю. Сполука НН-103 володіє значною нейропротективною дією в період гострого мозкового інсульту і найбільш ефективно по відношенню до гальмування нейрональної загибелі у гіпокампі. При цьому емоксипін і тіотриазолін найбільш ефективні відносно гальмування нейрональної загибелі в корі лобової частки.

Ймовірно, в зв’язку з вищевказаними особливостями, виявленими при морфологічних дослідженнях, вивчена нами сполука НН-103 перевищувала референс-препарати при різних моделях ішемії мозку в тесті УРПУ, що досліджує процеси навчання і пам’яті.

Таким чином, проведені дослідження дозволили виявити серед 47 сполук похідних 4-гідразинохіназоліна та його конденсованих аналогів одну найактивнішу - НН-103 (N-(фенілаліліден)-N?-хіназолін-4-іл-гідразин) з високими церебропротективними властивостями, що, ймовірно, пов'язано із здатністю інгібувати процеси ВРО, а також гальмувати окисну модифікацію білка тканин головного мозку.

Висновки

Вперше в результаті досліджень in vitro та in vivo у ряду похідних 4-гідразинохіназоліну та його конденсованих аналогів виявлена сполука N-(фенілаліліден)-N?-хіназолін-4-іл-гідразин, яка проявляє виражені церебропротективні властивості на різних моделях ішемії головного мозку.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Перелік робіт опублікованих за темою дисертації

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

Анотації

Сидорова І. В. Пошук церебропротекторів у ряду 4-гідразинохіназоліна та його конденсованих аналогів. – Рукопис.

Дисертація