Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

Шутов Леонід Павлович

УДК 612.822:611.813.14

Ефект хронічного прикладання німодипіну на кальцієвий гомеостаз у нейронах дорсального рогу спинного мозку щурів за умов розвитку діабетичної нейропатії

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в відділі загальної фізіології нервової системи в Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Наукові керівники :

Академік НАН Україні і РАН, доктор біологічних наук, професор,

Костюк Платон Григорович

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАНУ, директор

Доктор біологічних наук Войтенко Нана Володимирівна

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАНУ,

провідний науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, зав. лабораторії біофізики синаптичної передачі відділу фізіології нейрональних мереж Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України Федулова Світлана Анатоліївна.

Кандидат біологічних наук, молодший науковий співробітник Міжнародного Центру молекулярної фізіології Іванова Світлана Юріївна.

Провідна установа:

Київський Національний Університет ім. Т. Г. Шевченка,

кафедра біофізики

Захист відбудеться “_21” _березня__2006_ р. о _14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці інституту фізіології ім. О. О. Богомольця, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “ 21 ” лютого 2006 р. .

Вчений секретар спеціалізованої доктор біологічних наук

вченої ради З. О. Сорокіна-Маріна

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми.

Діабет за останні пів-століття перетворився в одну з найсерйозніших проблем охорони здоров'я в усьому світі. Дефекти периферичної нервової системи широко поширені в людей хворих на цукровий діабет, причому якщо таки порушення вже розвинулись, традиційна інсулінова терапія не в змозі ефективно запобігти їх подальшому розвитку. Хоча нейрологічні ускладнення є одним з найтяжчих й найнебезпечніших супутників цукрового діабету, що не перший рік звертає на себе увагу дослідників, остаточна ідентифікація причин їх виникнення і способів лікування, все ще є однією з найважливіших проблем.

Цілком логічним є припущення, що розвиток периферичних діабетичних нейропатій може бути пов'язаним із порушенням передачі ноцицептивних стимулів сенсорними нейронами та змінами в синаптичній передачі, що можуть бути наслідком розвитку порушень кальцієвого гомеостазу в даних нейронах. В багатьох дослідженнях показано численні зміни кальцієвої сигналізації в нейрональних тканинах за умов розвитку цукрового діабету, зокрема зміни кальційобмінних функції мітохондрій, параметрів деполяризаційного кальцієвого сигналу (Kruglikov et al. 2004) й швидкості проведення сигналів нервовими волокнами. Незважаючи на виявлену величезну кількість порушень у роботі кальційакумулюючих структур вторинних сенсорних нейронів (Kostyuk P. et al. 1995, 1999, 2000), дотепер невідомо, ушкодження яких з численних механізмів, залучених до регулювання Ca2+ у клітині, має вирішальне значення. Однією з найперших і найпомітніших змін є збільшення входу кальцію в клітину через дигідропіридинчутливі канали мембрани - подібні порушення достовірно ідентифіковані вже на третій тиждень розвитку стрептозотоцин-індукованого діабету в щурів (Voitenko et al. 2000). Показано, що хронічне введення блокаторів цього типу каналів, таких як ніфедипін, німодипін та ін., справляє нормалізуючий вплив на больові поведінкові реакції щурів при діабеті, на нефропатичні ускладнення діабету, сприяє значному уповільненню розвитку діабетичної мікроангіопатії та ретинопатії (Biesseles et al. 2005).

На сьогоднішній день механізми впливу дигідропіридинів на нейропатичні ускладнення діабету вивчені недостатньо. Дотепер нормалізуючий ефект дигідропіридинів на патогенез діабетичної нейропатії пов'язували, в основному, з їх можливою вазодилаторною дією (Biessels et al. 2005) і не проводили детальних досліджень їх впливу на кальційобмінні процеси в нейронах, що беруть участь у проведенні ноцицептивної інформації. Такий підхід зберігався і при дослідженні німодипіну - єдиного представника дигідропіридинів, що здатний проходити через гематоенцефалічний бар'єр й впливати безпосередньо на нейрони. З огляду на той факт, що нормалізуючий ефект дигідропіридинів, а особливо німодипіну, мав місце навіть на ранніх етапах розвитку діабетичної нейропатії, вивчення механізмів такого впливу набуває особливої важливості для виявлення тих нейрональных структур, ушкодження яких має першорядне значення для подальшого розвитку нейропатичних ускладнень діабету.

Враховуючи сказане, не викликає сумнівів велике теоретичне і практичне значення вивчення механізмів розвитку та корекції порушень кальцієвої сигналізації при діабетичних нейропатіях у нейронах дорсального рогу спинного мозку, як однієї з ланок у ланцюгу проведення больової інформації

Мета дослідження. Мета даної роботи полягала в оцінці впливу хронічного введення німодипіну на розвиток сенсорних полінейропатій у щурів зі стрептозотоцин - індукованим діабетом і виявити можливий вплив такої терапії на зміни кальцієвої сигналізації у вторинних сенсорних нейронах дорсального рогу спинного мозку, викликані діабетом.

Завдання дослідження.

1. Дослідити вплив хронічного введення німодипіну на зміни в больовій чутливості і поведінкових реакціях у щурів зі стрептозотоцин - індукованим (СТЗ) діабетом, використовуючи метод "формаліновий тест".

2. Дослідити можливий вплив хронічного прикладання німодипіну на зміни в термічній больовій і небольовій чутливості в щурів зі стрептозотоцин - індукованим діабетом, використовуючи метод "гаряча поверхня".

3. Порівняти характеристики [Ca2+]і транзієнту, викликаного гіперкалієвою деполяризацією в нейронах дорсального рогу (ДР) спинного мозку СТЗ-діабетичних щурів і діабетичних щурів, що отримували німодипін.

4. Дослідити вплив хронічного введення німодипіну на концентрацію [Ca2+]і в спокої в нейронах дорсального рогу спинного мозку діабетичних тварин.

5. Дослідити вплив хронічного введення німодипіну на зміни в роботі Ca2+-обмінних структур ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) в умовах розвитку СТЗ - індукованого діабету.

6. Відокремити можливий вазодилаторний ефект німодипіу від його прямої дії. Порівняти дію німодипіну з ефектом вазодилатору еналаприлу.

Наукова новизна одержаних результатів. Незважаючи на те, що вивченню впливу блокаторів дигідропіридин-чутливих кальцієвих каналів на виникнення та розвиток діабетичних нейропатій приділяється досить багато уваги, докладного вивчення кореляцій між їх впливом на больові поведінкові реакції діабетичних тварин та на нейрональний кальцієвий гомеостаз не проводилось.

На цей час не існує робіт, що зіставляли б зміни кальцієвої сигналізації в нейронах дорсального рогу спинного мозку зі змінами поведінкових реакцій діабетичних тварин під впливом блокаторів дигідропіридин-чутливих кальцієвих каналів. У такий спосіб, нами вперше проведені одночасні дослідження як функціонування Ca2+-регулюючих структур (в тому числі і роботи внутрішньоклітинних кальцієвих депо ЕР), так і поведінкових реакцій діабетичних тварин під дією хронічного введення німодипіну. Уперше здійснено спробу досідити вираженість прямого нейронального впливу німодипіну в порівнянні з ефектами, обумовленими його вазодилаторною дією.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Результати, одержані в ході експериментів на нейронах дорсального рогу в зрізax мозкової тканини, мають як теоретичне так і практичне значення. Краще розуміння механізму порушень метаболізму Ca2+ у нервових клітинах при викликаному діабеті може значно розширити розуміння патогенезу діабетичних нейропатій, а показаний ефект німодипіну може мати велике значення для виявлення тих нейрональних структур, ушкодження яких має першорядне значення для подальшого розвитку нейропатичних ускладнень діабету. Практичне значення мають дані про нормалізуючий вплив німодипіну на механізми внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу, що ушкоджуються в першу чергу при розвитку діабетичної нейропатії. Можливо, речовини, що блокують вхід кальцію через дигідропіридин-чутливі кальцієві канали нейронів, можна буде використовувати при компенсації порушень, викликаних розвитком діабетичних сенсорних нейропатій у людини.

Особистий внесок здобувача. Досліди по визначенню змін терморецепції та по визначенню змін больових реакцій при формаліновому тесті в щурів з експериментальним діабетом, що піддавалися хронічному впливу еналаприлу проводилися сумісно з інженером Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця В’ятченко-Карпінським В. Ю. Решта експериментів проводилася автором особисто. Обробка і статистичний аналіз усіх результатів проводився автором особисто.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідались на 3-му Форумі Федерації Європейських Товариств Нейронаук “FENS Forum 2002”, Париж, 2002; з'їзді Українського Біофізичного Товариства, Львів, 2002; міжнародному симпозіумі "Нейрональна диференціація та пластичність", Москва, 2003; школі нейронаук під егідою ІBRO "Рецептори. Канали. Мессенджери", Ялта, 2004; ІІІ з'їзді Українського Товариства Нейронаук, Донецьк, 2005; V міжнародному симпозіумі експериментальної і клінічний нейробиологии, Стара Лесна, Словаччина 2005, а також на семінарах сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця, Київ, Україна в 2000-2005 роках.

Публікації. За результатами роботи опубліковано пґять статей у наукових журналах та тези 3 доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел, який включає 232 найменування. Дисертаційна робота викладена на 132 сторінках та ілюстрована 23 рисунками.

Основний зміст роботи

У вступі обгрунтовано необхідність і актуальність дослідження впливу блокаторів дигідропіридинчутливих кальцієвих каналів на розвиток діабетичної сенсорної нейропатії, сформульовані мета і завдання дослідження, наведено відомості про наукову новизну, теоретичне та практичне значення роботи та апробацію отриманих результатів.

Розділ 1 „Огляд літературних даних” присвячений обговоренню порушень сенсорної чутливості, порушень у функціонуванні структур, що забезпечують проведення сенсорної інформації, змін у нейрональній кальцієвій сигналізації, що мають місце за умов розвитку цукрового діабету. Окрема увага приділена висвітленню змін, що стосуються дигідропіридин-чутливих кальцієвих каналів.

В розділі 2 „Матеріали та методи досліджень” описано методичні підходи, що було використано в процесі роботи, а саме:

· метод моделювання цукрового діабету у щурів (стрептозотоцинова модель діабету)

· методика виділення зрізів спинного мозку щурів;

· флуоресцентний метод вимірювання концентрації іонів Ca2+;

· методи оцінки змін больової чутливості „гаряча поверхня” та „формаліновий тест”;

· обробка отриманих результатів з використанням стандартних статистичних методів.

Метод “формаліновий тест”. Даний метод використовується для дослідження поведінкових реакцій тварин при гострому болю ). Ноцицептивний стимул викликали підшкірним введенням 20 мкл 5% розчину формаліну в задню лапу піддослідних тварин. Протягом наступних 90 хвилин поведінкові реакції кожної тварини (переміщення, споживання їжі та води, лизання та посмикування ушкодженої кінцівки) реєстрували з використанням комп'ютера.

Метод “гаряча поверхня”. Даний метод дозволяє вивчати больові реакції щурів на термічний стимул, а також визначати поріг больової температурної чутливості. Для створення ноцицептивного стимулу експериментальну тварину поміщали на поверхню, розігріту до температури, яка здатна викликати розвиток больової реакції. Після того, як експериментальні тварини були поміщені на поверхню з заданою температурою, починався відлік часу до появи характерної больової реакції – лизання задніх кінцівок. Проявом больової реакції вважали момент початку лизання однієї з кінцівок, що контактували з нагрітої поверхнею. У випадку, коли такої реакції не виникало протягом 10 хв., ми вважали температуру підпороговою. Після кожного експерименту проводився контроль відсутності опіків на кінцівках тварин. Температури, вищі за 49С, не використовувались з гуманних причин.

Індукція експериментального діабету проводилась шляхом внутрішньочеревної ін’єкції стрептозотоцину, розчиненого в ізотонічному фізіологічному розчині із розрахунку 80мг/кг ваги тварини. Використовувались щури линії Wistar у віці 21 день. Через 3 тижні після ін’єкції вимірювали рівень глюкози в плазмі крові, що було взято із хвостової вени. Вважалося, що в тварин розвився експериментальний діабет, якщо концентрація глюкози була не менша за 15 мМ. Такі тварини розподілялись на три групи. Перша група починала щоденно отримувати з їжею німодипін із розрахунку 20 мг/кг. Друга – в такому ж режимі отримувала еналаприл із розрахунку 5 мг/кг. Експерименти проводились на тваринах через 6 тижнів після ін’єкції стрептозотоцину. Всі тварини утримувались в ідентичних умовах.

Одержання зрізів спинного мозку Тонкі зрізи спинного мозку готували за методом Рандіч та співавторів (Randic M. et al. 1993). Експерименти проводили на щурах лінії Wistar загальним віком 9 тижнів. Під глибокою ефірною анестезією, проводили операцію розкриття оболонок спинного мозку, та видаляли люмбо-сакральну ділянку спинного мозку (сегменти L4 –S1). Безпосередньо після видалення, спинний мозок поміщали в охолоджений до 4 С інкубаційний розчин, який постійно оксигенували сумішшю 5% CO2 + 95% O2. Після очищення, спинний мозок прикріплювали до предметного столика вібротома (Campden Instruments LTD, Англія) де виготовляли його тонкі (300 мкМ) зрізи.

Фарбування клітин флуоресцентним барвником. Для кількісного визначення концентрації кальцію в нейронах дорсального рога спинного мозку використовували мембранно-проникну форму барвника фура-2 (фура- 2/АМ). Для введення кальцій-чутливого зонда в клітини, тонкі зрізи спинного мозку поміщали в базовий розчин, який містив естерифіковану незаряджену форму барвника в концентрації 5 мкмоль/л, розчинену в диметилсульфоксиді з додаванням детергенту Плуронік F-127 (0.02%). Зрізи фарбували протягом 50 хвилин при температурі 35о С та постійному оксигенуванні атмосфери, що оточує розчин зі зрізами, сумішшю 5% CO2 + 95% O2. Після фарбування зрізи переносили в базовий розчин, в якому їх додатково витримували протягом 40 хв. для повної деестерифікації зонда фура-2/АМ.

Флуоресцентна кальційметрія. Флуоресцентний сигнал реєстрували на довжинах хвиль 360 та 390 нм. Реєструючи відносну зміну інтенсивності флуоресценції при збудженні двома довжинами хвиль, можна розрахувати [Ca2+]i у клітинах за формулою, яка була запропонована Грінкевичем і співавторами в 1985 р. (Grynkiewicz G. et al. 1985):

[Ca2+]i = Kd b (R - Rmin)/(Rmax - R)

Значення констант, що входять у рівняння одержані внаслідок калібрування склали: Rmin= 0.9; Rmax= 19 і b= 26. Параметр Кd становив 224 нмоль/л.

Експериментальна установка для двохвильового вимірювання концентрації цитозольного кальцію. Основними елементами установки є: джерело світла, система зміни фільтрів, мікроскоп, фотоелектронний помножувач (ФЕП), модуль попередньої обробки сигналу та комп'ютер. Як джерело збуджуючого світла використовували ртутну лампа потужністю 50 ват. Періодична зміна фільтрів для збудження флуоресценції здійснювалась за допомогою обертання колеса з двома інтерференційними фільтрами з максимумами пропускання 360 і 390 нм. Частота обертання колеса складала 5 Гц. Керування системою зміни фільтрів здійснювалося за допомогою модуля попередньої обробки фірми Luigs und Neumann, Німеччина.

Оптична частина установки була змонтована на базі мікроскопа Axioskop, Zeiss, Німеччина. Розділення потоків збуджуючого світла та флуоресценції здійснювалось за допомогою дихроїчного дзеркала. Світло, що пройшло через фільтр у шляху збудження флуоресценції, відхилялось дихроїчним дзеркалом та фокусувалось на об'єкті за допомогою високоапертурного іммерсійного об'єктива (60х, цифрова апертура 0.9). Відбитий флуоресцентний сигнал пропускався дихроїчним дзеркалом, і після проходження через інтерференційний фільтр з максимумом пропускання 510 нм подавався на ФЕП.

За допомогою модуля попередньої обробки компенсували автофлуоресценцію та підсилювали сигнал, який після цього оцифровувався та зберігався на комп’ютері за допомогою цифрового інтерфейсу TIDA (Гейдельберг, Німеччина).

Розчини і реактиви. Фізіологічний розчин, який використовували для виділення спинного мозку (інкубаційний) містив (у мМ): NaCl - 125; KCl - 5; CaCl2 - 2.5; MgSO4 - 1.5; NaHCO3 - 25; KH2PO4 - 1.6; глюкоза – 10, рН – 7.4, при постійному оксигенуванні сумішшю 5% CO2 + 95%2. Температуру розчину підтримували на рівні 4С протягом усього процесу виділення та виготовлення зрізів. Базовий фізіологічний розчин, який використовували під час експериментів, а також при фарбуванні зрізів зондом фура-2/АМ містив (у мМ): NaCl - 128; KCl - 2; CaCl2 - 2.5; MgSO4 - 1.5; NaHCO3 - 25; KH2PO4 - 1.6; глюкоза – 10, рН – 7.4, при постійному оксигенуванні сумішшю 5% CO2 + 95% O2 , температура розчину підтримувалася на рівні 32С. Безкальцієвий фізіологічний розчин одержували з базового розчину шляхом еквімолярної заміни CaCl2 на MgCl2 та додаванням хелатора Ca2+ – EGTA (5 мМ). В усіх експериментах із зрізами спинного мозку, до базового розчину додавали блокатор потенціал–керованих Na+ каналів – тетродотоксин у концентрації 1 мкМ. Розчин Тироде, який використовували при аплікації агоністів та антагоністів, а також для одержання гіперкалієвого розчину, містив (у мМ): NaCl - 140; KCl - 4; CaCl2 - 2; MgCl2 - 2; HEPES/NaOH - 5; глюкоза - 10; pН - 7.4. Для одержання гіперкалієвого розчину 50 мМ Na+ у розчині Тироде ізоосмотично заміщали на 50 мМ K+. Фура-2/АМ була одержана від компанії Molecular Probes, (Eugene, OR, США); тетродотоксин від компанії Alomone Labs Ltd. (Єрусалим, Ізраїль); всі інші солі та реагенти від компанії Sigma-Aldrich Chemie Gmb. (Deisenhofen, Німеччина).

Під час експериментів було використано шість груп тварин :

- інтактні (далі - контрольні) тварини відповідного віку (група 1);

- контрольні тварини, що одержували німодипін у тім же режимі, що й діабетичні (група 2)

- контрольні тварини, що одержували еналаприл у тім же режимі, що й діабетичні (група 3);

- тварини з СТЗ-індукованим діабетом (група 4);

- тварини з СТЗ-індукованим діабетом, що одержували з їжею протягом трьох тижнів блокатор дигідропіридинчутливих кальцієвих каналів, що вільно проникає через гематоенцефалічний бар'єр - німодипін (група 5);

- тварини з СТЗ-індукованим діабетом, що отримували протягом трьох тижнів вазодилатор, що не проникає через гематоенцефалічний бар'єр – еналаприл (група 6).

У розділі 3 „Результати досліджень” визначено особливості впливу хронічного введення німодипіну на поведінкові реакції СТЗ-діабетичних та контрольних тварин, здійснено аналіз впливу німодипіну на зміни в нейрональній кальцієвій сигналізації, що супроводжують розвиток порушень больової чутливості. Для прояснення питання щодо ролі вазодилаторного ефекту німодипіну в опосередкуванні цього впливу, було вивчено ефект хронічного введення еналаприлу, який має потужний вазодилаторний ефект і не проникає через гематоенцефалічний бар’єр. В експериментах брали участь 21 контрольна тварина, 5 контрольних тварин, що одержували німодипин; 6 контрольних тварин, що одержували еналаприл, 26 тварин зі СТЗ-індукованим діабетом; 12 СТЗ-діабетичних тварин, що одержували німодипин і 8 СТЗ-діабетичних тварин, що одержували еналаприл. Під час проведення експериментів не було виявлено достовірного впливу хронічного введення німодипіну чи еналаприлу на концентрацію глюкози в плазмі крові піддослідних тварин, яка складала 6.90.2 мM (n=21), 7.11.5 мM (n=5), 82 мM (n=6), 29.5 6.5 мM (n=26), 266 мM (n=12), 25 4 мМ(n=8) для тварин з груп I-VI відповідно.

Вимірювання змін больової чутливості. Формаліновий тест. Як основні больові реакцій було обрано лизання та самочинне посмикування кінцівки, в яку проведено ін’єкцію. При цьому характер розвитку реакції посмикування мав яскраво виражений двофазний характер (перша, “гостра” фаза, тривалістю близько 10 хв., та друга, “тонічна” фаза, перебіг якої, відбувався без яскраво виражених максимумів та припинявся до 85-90 хв.) (Рис. 1). За умов розвитку СТЗ-індукованого діабету інтенсивність реакції в першій фазі достовірно зростала у порівнянні з контрольними тваринами (від 19±6 с (n=13) в контролі до 72±8 с (n=12) в діабеті, р<0.05), а у другій фазі достовірно зменшувалась (з 444±27 с в контролі до 369±25 с при діабеті, p<0.05). Введення німодипіну діабетичним тваринам зменшувало інтенсивність реакції в першій фазі (до 40±8 с (n=6), p<0.05), не досягаючи контрольних значень (p<0.05); при цьому інтенсивність реакції в другій фазі достовірно не змінювалась (355±87 с). Введення еналаприлу діабетичним тваринам доствовірно не впливало на інтенсивність реакції як в першій, так і в другій фазі (76±26 с та 371±53 с (n=5)).

Друга больова реакція - лизання вколотої кінцівки, також характерна при виникненні больового рефлексу. Характер розвитку даної реакції був дуже схожий на перебіг реакції посмикування (Рис. 2). За умов розвитку СТЗ-індукованого діабету інтенсивність реакції в першій фазі також достовірно зростала у порівнянні з контрольними тваринами (від 18±3 с (n=13) в контролі до 62±13 с (n=12) в діабеті, р*<0.05), а у другій фазі достовірно зменшувалась (з 384±25 с в контролі до 253±25 с при діабеті, p*<0.05). Введення німодипіну діабетичним тваринам зменшувало інтенсивність реакції в першій фазі (до 24±14 с (n=6), p#<0.05), достовірно не досягаючи контрольних значень (p*<0.05); при цьому інтенсивність реакції в другій фазі достовірно не змінювалась (244±46 с). Введення еналаприлу діабетичним тваринам доствовірно не впливало на інтенсивність реакції як в першій, так і в другій фазі (75±25 с та 240±34 с (n=5)).

Введення як німодипіну, так і еналаприлу інтактним тваринам не справило достовірного впливу на больові поведінкові реакції.

Метод “гаряча поверхня. Було встановлено, що поріг больової чутливості для всіх піддослідних тварин складав 42С. При підвищенні температури поверхні від 43 до 46С не спостерігалося достовірних відмінностей у швидкості больової реакції у тварин, однак уже при 47-48С ці розбіжності досягали достовірності. (Рис. 3) Так, у СТЗ-діабетичних щурів, поміщених на гарячу поверхню з температурою 48С, час виникнення больової реакції достовірно зростав у порівнянні з контрольними тваринами (8,5±0,5 с (n=15), p*<0.05) і складав 67±7 с (n=12). Введення німодипіну діабетичним тваринам достовірно зменшувало час виникнення больової реакції (19±6 с (n=8), p#<0.05). Введення еналаприлу діабетичним тваринам також достовірно зменшувало час виникнення больової реакції при 48С (26±4 с (n=6), p#<0.05). Час виникнення больової реакції у діабетичні тварини після введення як німодипіну, так і еналаприлу достовірно відрізнявся (p*<0.05) від часу контрольних (інтактних) тварин. Таким чином, введення німодипіну і еналаприлу діабетичним тваринам сприяє частковій компенсації у них термічної гіпоалгезії. Введення як німодипіну, так і еналаприлу інтактним тваринам не справило достовірного впливу на час виникнення больової реакції.

Зміни кальцієвої сигналізації в ноцицептивних нейронах за умов стрептозотоцин-індукованого діабету. Вплив німодипіну на порушення больової чутливості в СТЗ-діабетичних тварин, виявлений в ході спостереження за поведінковими реакціями під час тесту „гаряча поверхня” та формалінового тесту, міг бути опосередкованим змінами в функціонуванні структур, що відповідають за проведення ноцицептивної інформації. Той факт, що на реакції контрольних тварин введення німодипіну не впливало, дає підстави припустити, що ефект німодипіну повґязаний, в першу чергу, з його впливом виключно на структури, функціонування яких зазнавало порушень під час розвитку діабету. Моніторинг коливань внутрішньоклітинної концентрації [Ca2+]i в сенсорних нейронах набуває особливого значення не тільки для прояснення механізмів дії німодипіну на сенсорну чутливість, але й для більш детального розуміння ролі окремих нейрональних структур в виникненні різних типів болю.

Характер змін кальцієвих сигналів у вторинних сенсорних нейронах під впливом хронічного введення німодипіну. В ході досліджень [Ca2+]i у вторинних ноцицептивних нейронах, розташованих в ділянках ламіни I та substantia gelatinosa дорсального рога спинного мозку, не було виявлено достовірних відмінностей рівня базального кальцію в нейронах тварин усіх досліджених груп. Деполяризацію клітин викликали аплікацією гіперкалієвого розчину з концентрацією іонів К+ - 50 мМ. Введення німодипіну діабетичним тваринам достовірно зменшувало пікову амплітуду деполяризаційних транзієнтів в нейронах діабетичних тварин, що отримували німодипін (448±23 нМ (n=51), p*<0.05, p#<0.05). Істотної різниці значень пікових амплітуд кальцієвих транзиєнтів, викликаних деполяризацією, у тварин з інших груп виявлено не було (636±36 (n=28), 593±43 (n=30), 610±44 (n=22) для тварин з груп І, ІІ і ІІІ та 564±51 (n=38) 607±39 (n=20) для тварин з груп ІV та VI) (Рис. 4).

При аналізі кінетики спаду деполяризаційних [Ca2+]i транзиєнтів у нейронах ДР спинного мозку СТЗ-діабетичних тварин було виявлено суттєве збільшення рівню залишкового [Ca2+]i, який реєстрували на 60-тій секунді після початку деполяризації (збільшення від 147±16нМ (n=22) в контролі до 176±19 (n=24) в нейронах діабетичних тварин (p*<0.05)). Введення як німодипіну, так і еналаприлу діабетичним тваринам не призводило до достовірних змін рівню залишкового [Ca2+]i (161±16 (n=39), та 155±40 нМ (n=20)) (Рис.5). Введення як німодипіну, так і еналаприлу контрольним тваринам також не справило достовірного впливу на рівень залишкового [Ca2+]i.

Зміни у функціонуванні кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму. Ріанодин-чутливе депо Ca2+. Для вивчення роботи ріанодин-чутливого депо, ми використовували той факт, що кофеїн здатний знижувати поріг активації ріанодинового рецептора кальцієм до рівня, якого достатньо щоб базальний [Ca2+]i викликав його активацію та наступне вивільнення Ca2+ з депо. Зменшення амплітуди [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних аплікацією 30 мМ кофеїну, в нейронах діабетичних тварин (108±14 (n=19)) у порівнянні з контрольними (196±16 (n=18), p<0.05), після введення німодипіну майже повністю компенсувалось (154 12 nM (n=33), p#<0.005, p*>0.8) (Рис.6). Введення еналаприлу діабетичним тваринам лише частково компенсувало зменшення амплітуди кофеїн-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів до рівня 122±19 нМ (n=15), що достовірно відрізнявся від амплітуд кофеїн-індукованого вивільнення [Ca2+]i в нейронах як діабетичних і контрольних (р#<0.05, p*<0.05), так і діабетичних тварин, що отримували німодипін (p<0.05). Введення як німодипіну, так і еналаприлу контрольним тваринам не справляло достовірного впливу на амплітуди кофеїн-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів в нейронах ДР спинного мозку.

Слід зазначити, що існує популяція нейронів ДР спинного мозку, у яких аплікація кофеїну не приводить до зміні концентрації цитозольного кальцію. Причому частка таких нейронів достовірно більше в групі діабетичних тварин, ніж у контрольній групі (р<0.05). Прикладання німодипіну і еналаприлу не змінювало достовірно частки нейронів, що генерують кальцієві відповіді на кофеїн (p>0.2). Так, якщо в контролі аплікація кофеїну не призводила до виникнення кальцієвого транзієнту в 6% досліджених нейронів, а в діабеті не „відповіли” на кофеїн 24% нейронів (р<0.05), то серед нейронів німодипін- та еналаприл- діабетичних щурів, не відреагували на аплікацію кофеїну 21% і 28% досліджених клітин. У цілому, терапія не змінювала достовірно частки нейронів, що генерують кальцієві транзиенти у відповідь на аплікацію кофеїну.

Ефект прямої дії дигідропіридинів на функціонування кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму.

Після виявлення ефекту збільшення амплітуди кофеїн-індукованого [Ca2+]і транзиєнту в нейронах СТЗ-діабетичних тварин під впливом хронічного введення німодипіну, виникла необхідність перевірки існування прямої дії дигідропіридинів на функціонування кальцієвих депо. Для цього ми використовували безпосередню аплікацію німодипіну на нейрони ДР спинного мозку СТЗ-дібетичних та контрольних тварин. Присутність в зовнішньоклітинному розчині 40 мкМ німодипіну не призводила до достовірних змін амплітуди кофеїн-індукованих [Ca2+]і транзиєнтів ні в нейронах контрольних, ані в нейронах діабетичних тварин (18719 nM (n=8) та 9722 nM (n=6), (Рис. 7)).

Ефект іономіцину. Для дослідження ємності Ca2+ депо ЕР, ми використовували антибіотик іономіцин. Іономіцин у концентраціях менших чи рівних 1 мкМ призводить до вивільнення Ca2+ з обох типів депо ЕР за ріанодин та InsР3 незалежним механізмом (Smith et al. 1989).

Зменшення амплітуди [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних аплікацією 1 мкМ іономіцину в безкальцієвому зовнішньоклітинному розчині в нейронах діабетичних тварин (68±6 (n=19)) у порівнянні з контрольними (120±11 (n=15), p<0.05), після хронічного прикладання німодипіну частково компенсувалось (92 9 nM (n=14), p#<0.05, p*<0.05 (Рис.8)). Введення еналаприлу діабетичним тваринам також частково компенсувало зменшення амплітуди іономіцин-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів до рівня 80±6 нМ (n=7, р#<0.05, p*<0.05). Введення як німодипіну, так і еналаприлу контрольним тваринам не справляло достовірного впливу на амплітуди іономіцин-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів в нейронах ДР спинного мозку.

Усі вищенаведені результати свідчать про те, що вивільнення кальцію з депо эндоплазматичного ретикулуму (ЕР), як у результаті дії кофеїну, так і під дією іономіцину, перебуваючи у значно пригніченому стані за умов розвитку діабету, частково відновлюється при хронічному прикладанні нимодипіну.

Обговорення результатів.

В представленій роботі виявлено вплив тривалого введення німодипіну одночасно на симптоматичні проявлення дібетичної нейропатії та на кальцієвий гомеостаз в нейронах ДР спинного мозку. Важливим результатом є встановлення факту нормалізуючого впливу хронічного введення німодипіну на порушення кальцієвого гомеостазу та на функціонування Са депо ЕР, що корелювало з частковою компенсацією симптомів діабетичної нейропатії. Особливо слід підкреслити, що хронічне введення німодипіну призводило до значних змін в поведінкових реакціях та нейрональній кальцієвій сигналізації тільки діабетичних тварин, не впливаючи на контрольних, що вказує на існування нейрональних дигідропіридин-чутливих механізмів, що починають відігравати значну роль в проведенні ноцицептивної інформації саме під час розвитку діабету.

В методах дослідження нейропатій широко використовується формаліновий тест, як модель гострого болю з наступною фазою тонічної або інфламаторної болі (Hunskaar S., 1987, Kamei A., 2001). Больовий ефект формаліну має двофазний характер, різні фази якого мають різну анальгетичну чутливість. Вважається, що перша фаза відповідає за прямий вплив на ноцицептивні нейрони, тоді як друга зумовлена запальними процесами та біллю, викликаною запаленням, знімається дією антизапальних фармакологічних речовин (Hunskaar S., 1987). Під час СТЗ-індукованого діабету відбувається посилення больової реакції на гострий біль і одночасне послаблення больової реакції на тонічний “інфламаторний” біль, що може свідчити про те, що індукція цукрового діабету диференційовано змінює механізми, що відповідають за різні типи болю (Kruglikov et al. 2004). Ми спостерігали потужний нормалізуючий вплив німодипіну на больові реакції тільки в першій фазі формалінового тесту, в той час як достовірного впливу на інтенсивність реакцій під час другої фази взагалі не було виявлено. Ці результати можуть вказувати на те, що збільшеня впливу дигідропіридинів за умов діабету відбувається перважно в тих структурах, що відповідають за проведення сигналів госторго болю. Дослідження змін температурної чутливості дозволило встановити, що термічна гіпоалгезія, яка розвивається у СТЗ-діабетичних тварин (Fox et al. 1999, Kamei et al. 2000), може бути частково скомпенсована хронічним введенням німодипіну.

Таким чином, хронічне введення німодипіну СТЗ-діабетичним щурам супроводжується значними змінами больової чутливості. Необхідно підкреслити, що в даних ескпериментальних умовах не було знайдено жодних достовірних ознак впливу німодипінової терапії на больову чутливість контрольних тварин, що вказує на значне підсилення ролі дигідропіридин-чутливих структур в умовах розвитку цукрового діабету.

Останнім часом усе більше уваги приділяється дослідженню порушень нейронального Ca2+ гомеостазу, які не лише супроводжують, а й цілком імовірно, є однією з причин, що призводять до розвитку діабетичних нейропатій (Biessels and Gispen 1996,2002). Постсинаптичне збільшення [Ca2+]i є важливим тригером, що може активувати швидкі або довготривалі зміни синаптичної передачі ). Дослідження струмів через дигідропіридинчутливі кальцієві канали та оцінка їх участі в нейрональній кальцієвій сигналізації (Kostyuk P. et al 1995, Hall K. 1996, Voitenko N. 2000) продемонстрували збільшення їх внеску в кальцієву сигналізацію за умов розвитку СТЗ-діабету, але в той же час амплітуда кальцієвих транзиєнтів, викликаних деполяризацією, залишалась незмінною (Kruglikov et al. 2004). Активація L-типу Ca2+ каналів в нейронах ДР може мати специфічне значення для опосередкування повільних Ca2+ потоків, що сумуються та сприяють поступовому й тривалому підвищенню збудливості (Baranauskas G., 1998). Відповідно, корекція такого збільшення L-канал-опосередкованих кальцієвих потоків при хронічному введенні німодипіну може відігравати значну роль в виникненні корегуючого впливу німодипіну на порушення больової чутливості при діабеті. З цією гіпотезою добре узгоджується виявлене зменшення амплітуди деполяризаційних кальцієвих транзиєнтів в нейронах СТЗ-діабетичних щурів, що отримували німодипін. Таким чином, хронічне введення німодипіну здатне значно впливати на кальцієвий гомеостаз в нейронах ДР виключно діабетичних тварин. Такий вплив може пояснюватись не тільки корекцією збільшення L-канал-опосередкованих кальцієвих потоків , а може бути зумовлениий нормалізуючою дією дигідропіридинів на метаболічні механізми, що опосередковують виникнення оксидативного стресу при діабеті (Cominacini et al. 2003).

Новим і несподіваним результатом було встановлення факту корегуючого впливу хронічного введення німодипіну на амплітуди кальцієвих транзиєнтів при вивільненні Ca2+ з кальцієвих депо ЕР. З літератури відомо, що наслідком порушень нейронального кальцієвого гомеостазу може стати зменшення активності Ca2+ -АТФаз ЕР (Belke et al. 2004), що може приводити до зменшення вмісту Ca2+ в кальцієвих депо ЕР (на це опосередковано вказує зменшення амплітуди іономіцин-індукованих Ca2+ транзиєнтів) при діабеті. Отже, нормалізуючий вплив німодипінової терапії на амплітуди кофеїн- та іономіцин-індукованих Ca2+ транзиєнтів може бути результатом підвищення [Ca2+]in в кальцієвих депо ЕР (Рис. 9). Таке підвищення може обумовлюватись покращенням роботи Ca2+ -АТФаз ЕР (SERCA) внаслідок дії німодипіну на порушення нейронального кальцієвого гомеостазу при діабеті.

Можливий і прямий вплив німодипіну на функціонцвання кальцієвих депо ЕР. В аксонах нейронів ДР було показано існування функціонального взаємозвґязку між L-типом Ca2+ каналів та ріанодиновими рецепторами (RyRs) . Існування такого звґязку може призводити до постійного спустошення кальцієвих депо ЕР за рахунок „підтікання” Ca2+ через RyRs, опосередкованого надлишковою активністю L-типу кальцієвих каналів при діабеті . Тривале та регулярне введення німодипіну може прямо блокувати надлишкову активність L-каналів і, як наслідок, впливати на витік Ca2+ з депо ЕР, опосередкований L-канал-RyRs-комплексом. В наших експериментах прямого впливу німодипіну на вивільнення Ca2+ через RyRs не спостерігалось. Це може вказувати на те, що хоча L-канал-RyRs-комплекс-опосередкований витік кальцію робить незначний внесок в кальцієву сигналізацію, довготривала гіперактивність цього механізму може стати однією з причин розвитку серйозних порушень нейронального кальцієвого гомеостазу при діабеті (Biessels et al. 2002).

Приймаючи до уваги можливість непрямої дії німодипінової терапії на нервову систему внаслідок потужного вазодилаторного ефекту німодипіну та той факт, що за умов діабету значно зменшується кровопостачання структур ЦНС , логічно припустити, що виявлений нормалізуючий ефект німодипіну на функціонування нейронів ДР може пояснюватись покращенням кровопостачання нервової системи в цілому. Щоб перевірити це припущення, частина піддослідних тварин отримувала еналаприл. Еналаприл токож є вазодилатором, але його вазодилаторна дія опосередковується зовсім іншими механізмами, ніж ефект німодипіну (Aihara et al. 2005,. Крім того, еналаприл не здатний проникати через гематоенцефалічний барґєр , що дозволяє виключити можливість його прямого впливу на нейрони. Нами встановлено, що в даних умовах хронічне введення еналаприлу СТЗ-діабетичним щурам здатне частково компенсувати порушення сенсорної чутливості та нейрональної кальцієвої сигналізації, але вираженість компенсаторних змін при використанні німодипіну була набагато вищою. Так, введення еналаприлу, на відміну від німодипіну, не впливало достовірно на поведінкові реакції під час формалінового тесту. Достовірну відмінність ефектів еналаприлу та німодипіну ми спостерігали також при дослідженні їх впливу на амплітуди кофеїн-індукованих кальцієвих транзиєнтів в нейронах СТЗ-діабетичних щурів. Схожа тенденція зберігалась і при дослідженні вивільнення кальцію з депо по ріанодин- та IP3-незалежному механізму. Приймаючи до уваги ці спостереження, логічно припустити, що виявлений вплив хронічного введення німодипіну не може бути обумовленим виключно його вазодилаторним ефектом - відчутну роль відіграє і прямий вплив німодипіну на сенсорні нейрони.

Таким чином, проведені дослідження вказують на можливі клітинні механізми, функціонування яких лежить в основі змін передачі ноцицептивної інформації сенсорними нейронами та впливає на больові поведінкові реакції щурів зі СТЗ-індукованим діабетом (Рис. 9). Одержані результати свідчать про можливість часткової корекції порушень больової чутливості, функціонування внутрішньоклітинних Ca2+-модулюючих структур у сенсорних нейронах щурів із СТЗ–індукованим діабетом уже на ранніх етапах захворювання за допомогою хронічного введення німодипіну.

Висновки

1. Здійснено аналіз змін больових поведінкових реакцій і кальцієвої сигналізації в нейронах дорсального рогу спинного мозку щурів, що були викликані хронічним прикладанням німодипіну в умовах розвитку стрептозотоцин-індукованого діабету.

2. В експериментах, проведених з використанням формалінового тесту, показано, що хронічне прикладання німодипіну призводить до достовірних змін у больовій чутливості щурів зі стрептозотоцин - індукованим діабетом. Інтенсивність реакцій у першій фазі формалінового тесту, фізіологічно відповідальної за гострий біль, у діабетичних тварин, що одержували німодипін, була достовірно нижче, ніж у діабетичних, але достовірно вище, ніж у контрольних. Інтенсивність реакції в другій "тонічній" фазі у таких тварин не відрізнялась достовірно від діабетичних, залишаючись достовірно вищою, ніж у контрольних.

3. В експериментах, проведених з використанням методу "гаряча поверхня", не виявлено достовірних відмінностей больового порогу у відповідь на термічний стимул у щурів зі стрептозотоцин - індукованим діабетом, що одержували німодипін, від контрольних і діабетичних тварин. Швидкість больової реакції при температурі 48 С у діабетичних щурів, що одержували німодипін, була достовірно менше, ніж у контрольних, що свідчить про наявність у них термічної гіпоалгезії; однак даний параметр у цих тварин достовірно вище, ніж у діабетичних, що говорить про часткове відновлення термальної чутливості.

4. Показано, що базальний рівень [Ca2+]і не відрізняється достовірно в нейронах тварин усіх досліджених груп. Хронічне введення німодипіну не впливало на рівень залишкового Ca2+ після деполяризації. Амплітуда [Ca2+]і транзієнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією, у нейронах щурів із групи тварин зі СТЗ-індукованим діабетом, що одержували німодипін, була достовірно менше, ніж у нейронах тварин з усіх інших досліджених груп.

5. Показано достовірне збільшення амплітуди кальцієвого транзиєнту, викликаного аплікацією кофеїну у нейронах діабетичних щурів, що одержували німодипін. Разом з тим, амплітуда такого транзиєнту була достовірно менше, ніж у нейронах контрольних тварин.

6. Показано, що в нейронах контрольних і діабетичних щурів пряма аплікація німодипіну на нейрони дорсального рогу спинного мозку не впливає на вивільення кальцію з ріанодин - чутливого депо ЕР.

7. Показано достовірне збільшення амплітуди кальцієвого транзиєнту, викликаного аплікацією іономіцину в безкальцієвому розчині в нейронах діабетичних щурів, що одержували німодипін. Разом з тим, амплітуда такого транзиєнту достовірно менша, ніж у нейронах контрольних тварин.

8. Здійснено аналіз змін больових поведінкових реакцій і кальцієвої сигналізації в нейронах дорсального