Інститут молекулярної біології ТА генетики

Шкотова Людмила Василівна

УДК 543.553 + 543.6 + 543.9 + 577.152.1

РОЗРОБКА АМПЕРОМЕТРИЧНИХ БІОСЕНСОРІВ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ЛАКТАТУ, ЕТАНОЛУ ТА ГЛЮКОЗИ У ВИНОМАТЕРІАЛАХ

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в лабораторії біомолекулярної електроніки відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).

Науковий доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

керівник Дзядевич Сергій Вікторович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

провідний науковий співробітник лабораторії біомолекулярної електроніки відділу механізмів трансляції генетичної інформації.

Офіційні доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

опоненти Пирог Тетяна Павлівна,

Національний університет харчових технологій МОН України,

завідувач кафедри біотехнології мікробного синтезу;

доктор біологічних наук, професор

Говорун Дмитро Миколайович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

заступник директора з наукової роботи, завідувач відділу молекулярної біофізики.

Провідна Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, м. Київ.

установа

Захист дисертації відбудеться 23 травня 2006 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Академіка Заболотного, .

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (03143, Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150).

Автореферат розіслано 21 квітня 2006 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ферментний аналіз є незалежною частиною біоаналітичної хімії та ензимології і на сьогодні посідає одне із чільних місць у галузі контролю якості харчових продуктів, у тому числі напоїв. Контроль та оптимізація біотехнологічних процесів при виробництві вина в харчовій промисловості вимагають швидкої та достовірної інформації щодо концентрації субстратів та продуктів реакції. Крім того, завжди необхідні недорогі прилади для контролю якості отриманих продуктів. Незважаючи на те, що це досить давня проблема, деякі питання і досі не вирішені, або ж їхнє вирішення пов’язане з великими труднощами. Найчастіше в процесі ферментації утворюються багатокомпонентні суміші, які необхідно аналізувати одночасно, безперервно та бажано в режимі реального часу. Зазвичай, з цією метою використовують дорогу та громіздку апаратуру, яку досить важко ввести безпосередньо в технологічний процес. Недоліком цих методів є також довготривалість аналізів. Альтернативою можуть бути біосенсори – нові прилади аналітичної біотехнології. Проте, щоб зайняти нішу в цій галузі, такі прилади повинні бути недорогими та надійними, а методи аналізу – швидкими, простими у використанні, дешевими і, що дуже важливо, рентабельними. На разі не існує комерційних біосенсорів для перевірки якості сировини в процесі виробництва вина.

Постійний, одночасний та вибірковий моніторинг лактату, етанолу та глюкози необхідний у винному виробництві, адже ці параметри визначають якість та особливий аромат вина (Amerine et al., 1980). Знання цих величин дозволяє, у разі необхідності, швидко втрутитися у процес зброджування, попереджуючи значні економічні витрати. Дослідження останніх років показують високий потенціал використання біосенсорів у цій галузі (Luong et al., 1991; Warsinke, 1997). Біосенсори конкурують з іншими аналітичними методами щодо тривалості та вартості аналізів. Їхня основна перевага – швидкий відгук і висока специфічність, низька вартість і легкість обробки даних. Біосенсори базуються на різних типах перетворювачів, включаючи амперометричні (Дзядевич, 2002; Scheller et al., 1997; Luong et al., 1997). Вони мають ряд переваг порівняно з іншими датчиками, а саме: є недорогими, відносно простими у виробництві та застосуванні, з досить широким діапазоном вимірюваних концентрацій для багатьох практичних потреб.

Разом з тим існує нагальна потреба в одночасному визначенні декількох аналітів упродовж одного вимірювання. Це можна зробити за допомогою мультисенсора, який об’єднує у собі кілька чутливих елементів, розміщених на одному чипі (Silber et al., 1944; Happ et al., 1992). Значною перевагою при використанні таких систем є повністю автоматизований контроль процесу виробництва. До того ж, використання останніх досягнень мікроелектроніки та новітніх технологічних матеріалів дозволяє значно здешевити виробництво та забезпечити сумісність різних елементів аналітичних систем. Отже, нині це найперспективніші аналітичні методи. Проте при розробці таких систем постає ряд невирішених проблем. Так, при створенні таких аналітичних систем необхідно використовувати один тип перетворювачів; різні ферменти повинні функціонувати одночасно за одних і тих же умов; необхідно також забезпечити універсальність методів їхньої іммобілізації на поверхню перетворювачів.

Таким чином, розробка амперометричних ферментних біосенсорів для визначення лактату, етанолу та глюкози у виноробстві та оптимізація їхніх основних аналітичних параметрів для подальшого застосування є дуже актуальною проблемою.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану робіт лабораторії біомолекулярної електроніки відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України і виконувалася в рамках таких тем: “Розробка нових підходів для створення амперометричних біосенсорів для потреб біотехнології” (НДР НАНУ, № держ. реєстрації 0103U000074, 2003-2007 рр.); “Розробка монобіосенсорів та сенсорних масивів для біотехнології та харчової промисловості” (НДР Міністерства освіти і науки України № ДП/224-2003, № держ. реєстрації 0103U008703, 2003-2006 рр.); “Novel technology for fermentation process monitoring and quality control of alcoholic beverages based on enzyme electrodes and kits” (INTAS Grant № 00-0751, 2001-2004 рр.).

Мета і завдання дослідження. Основна мета роботи – розробити амперометричну ферментну біосенсорну систему для проведення аналізу лактату, етанолу та глюкози у вині та виноматеріалах.

Для виконання даної мети вирішували такі завдання:

1. Дослідити ефективність використання різних типів електродів як амперометричних перетворювачів.

2. Визначити шляхи ефективної іммобілізації лактатоксидази, алкогольоксидази та глюкозоксидази на поверхню амперометричних перетворювачів.

3. Розробити лабораторні прототипи ферментних біосенсорів для визначення концентрацій лактату, етанолу та глюкози у модельних розчинах та оптимізувати їхні аналітичні характеристики для подальшої роботи з реальними зразками.

4. Провести апробацію розроблених лабораторних прототипів біосенсорів для визначення лактату, етанолу та глюкози у реальних зразках вина та виноматеріалів і порівняти отримані результати з даними, отриманими за допомогою загальноприйнятих методик.

Об’єкт дослідження: ферментативне розщеплення лактату, етанолу та глюкози при амперометричному методі вимірювання.

Предмет дослідження: амперометричні ферментні біосенсори.

Методи дослідження: електрохімічні та біохімічні методи дослідження ферментативних реакцій, вольтамперометричний метод, методи іонної хроматографії та денситометрії дистиляту.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано переваги платинових друкованих електродів “SensLab” у порівнянні з іншими типами амперометричних електродів при розробці амперометричних біосенсорів для використання у виноробстві та подальшому впровадженні у виробництво.

Вперше досліджено різні, з точки зору технології, методи іммобілізації ферментів лактатоксидази, алкогольоксидази та глюкозооксидази на поверхню амперометричних перетворювачів і вибрано електрохімічну полімеризацію як універсальний метод іммобілізації для всіх досліджених оксидаз при одночасному їхньому використанні для контролю виробництва вина.

Вперше розроблено лабораторний прототип сенсорної системи на основі амперометричного перетворювача для аналізу лактату, етанолу та глюкози у реальних зразках виноматеріалів без попередньої обробки останніх, яка може бути застосована у харчовій промисловості для контролю та оптимізації процесу зброджування вина та контролю його якості.

Вперше проведено апробацію розроблених лабораторних прототипів амперометричних біосенсорів при кількісному аналізі лактату, етанолу та глюкози у вині та виноградному суслі в процесі його зброджування і продемонстровано кореляцію отриманих даних з результатами, отриманими загальноприйнятими методами.

Практичне значення одержаних результатів. Створено діючий лабораторний прототип біосенсорної системи на основі амперометричних перетворювачів, яка може бути основою комерційного пристрою для експресного аналізу лактату, етанолу та глюкози у вині та виноградному суслі в процесі його зброджування та застосована у виноробстві.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором самостійно проаналізовано наукову літературу за темою досліджень, разом із керівником розроблено програму проведення експериментів та підібрано методи вирішення поставлених завдань. Здобувачем особисто розроблено лабораторні прототипи амперометричних біосенсорів, проведено дослідження і оптимізацію їхніх аналітичних характеристик, підібрані оптимальні умови проведення аналізу субстратів у модельних розчинах та реальних зразках. За безпосередньої участі здобувача проведено експерименти з аналізу субстратів у реальних рідинах класичними методами. Результати досліджень обговорено та проаналізовано з науковим керівником д.б.н., ст.н.с. С.В. Дзядевичем. Частину експериментальних робіт із дослідження амперометричних перетворювачів виконано в тісному співробітництві з м.н.с. О.М. Щувайлом та пров. інж. А.Л. Бережецьким. Дисертантка вдячна за допомогу при розробці глюкозного амперометричного біосенсора к.б.н., ст.н.с. В.М. Архиповій; співробітникам Інституту винограду та вина „Магарач” Е.А. Сластья, Т.А. Жиляковій – за надану допомогу з аналізу субстратів методами іонної хроматографії та денситометрії дистиляту, д.б.н. М.В. Гончару з Інституту біології клітини НАН України (м. Львів) - за люб'язно наданий фермент алкогольоксидазу з Hansenula pоlymorpha C-105. Одержані результати висвітлено в спільних публікаціях.

Дисертантка висловлює вдячність д.б.н., професору, академіку НАН України Г.В. Єльській і д.б.н., професору О.П. Солдаткіну за допомогу та велику увагу до дисертаційної роботи. Частину експериментів проводили спільно із іноземними колегами професором В. Шуманом (W. Schuhmann), професором Ж._М. Шовелоном (J.та професором К. Тран-Міном (C. Tran-Minh), яким дисертантка висловлює щиру вдячність. Результати досліджень опубліковані у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень представлені на 1-ій Чорноморській конференції з аналітичної хімії (Одеса, Україна, 2001); VII Міжнародній науково-технічній конференції „Пріоритетні напрямки впровадження в харчову промисловість сучасних технологій, обладнання і нових видів продуктів оздоровчого та спеціального призначення” (Київ, Україна, 2001); VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, Україна, 2002); Міжнародній конференції “Eurosensors XVI” (Прага, Чехія, 2002); Міжгалузевій конференції молодих науковців „Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2003” (Київ, Україна, 2003); Конференції молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології та генетики (Київ, Україна, 2003); Міжнародній конференції з сенсорів, електроніки та мікросистемних технологій (Одеса, Україна, 2004); Міжнародній конференції MADICA 2004 (Туніс, Туніс, 2004); Конференції – звіті з комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій” (Київ, Україна, 2005); XVIII Міжнародному симпозіумі з біоелектрохімії та біоенергетики (Коімбра, Португалія, 2005).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано у 5 статтях у фахових наукових журналах, 2 розширених працях наукових конференцій та тезах 8 доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, експериментальної частини, яка має 3 розділи, аналізу та узагальнення результатів досліджень, а також висновків та переліку використаних джерел, який налічує 168 найменувань. Роботу викладено на 144 сторінках машинописного тексту. Ілюстративний та числовий матеріал дисертації подано у вигляді 62 рисунків та 5 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. У роботі використано такі реактиви: глюкозооксидаза (ГОД) з Penicillium vitale виробництва фірми КНПО “Діагностикум” (Львів, Україна) з активністю 130 од. акт./мг; алкогольоксидаза (AOД) з Hansenula pоlymorpha C-105, люб'язно надана М.В. Гончарем (Інститут біології клітини НАН України, Львів, Україна) у вигляді суспензії ферменту в 50 мM фосфатному буфері, рН 7,5, що містив 70 % (NH4)2SO4 та 1 мМ EДTA (активність ферменту в розчині 6 од. акт./мг білка); лактатоксидаза (ЛОД) з Pediococcus species виробництва фірми “Sigma” (Німеччина) з активністю 31 од. акт./мг сухого матеріалу та 49 од. акт./мг сухого матеріалу; лактатоксидаза з Pediococcus species виробництва фірми “Fluka” (Швейцарія) з активністю 40 од. акт./мг сухого матеріалу; глюкоза виробництва фірми „Sigma-Aldrich Chimie S.а.r.l.” (Франція); 99% етанол виробництва фірми „Fluka” (Німеччина); лактат виробництва фірми “Sigma” (США); бичачий сироватковий альбумін (БСА) виробництва фірми „Sigma-Aldrich Chimie S.а.r.l.” (Франція); L-аскорбінова кислота виробництва фірми „Sigma-Aldrich Chimie S.а.r.l.” (Франція); K4[Fe(CN)6]3H2O виробництва фірми “Merck” (Німеччина); KCl виробництва фірми „Riedel-de Haen Laborchemikalien GmbH” (Німеччина); полі(етиленгліколь) ММ=1450 виробництва фірми “Sigma” (Швейцарія); 50% водний розчин глутарового альдегіду (ГА) виробництва фірми “Sigma – Aldrich Chimie S.а.r.l. ” (Франція); 5% розчин “Nafion” - суміш низькоаліфатичних спиртів та води виробництва фірми „Fluka” (Німеччина); смола Resydrol AY 498 w/35WA виробництва фірми “Slutia” (Австрія); мономер 3,4-етилендіокситіофен (ЕДТ) виробництва фірми “Baytron M” (Німеччина). Як буфер використовували фосфатний розчин (КН2РО42HPO412H2O) виробництва фірми „Baker Analyzed” (Нідерланди) та вітчизняного виробництва, його величина рН змінювалась залежно від співвідношення солей у межах 6,0–8,0 (Лурье, 1979). Використані реактиви мали кваліфікацію "ос. ч." та "х. ч.".

У роботі використано амперометричні електроди різного типу: платинові друковані електроди “SensLab” (SensLab GmbH, Лейпціг, Німеччина), електроди на основі графітових стрижнів типу RW-001 (Ringsdorffwerke GmbH, Бонн, Німеччина), платинові дискові електроди діаметром 1 мм, виготовлені безпосередньо у лабораторії, та мікроелектроди на основі вуглецевого волокна власного виробництва з довжиною робочої частини 500 мкм.

Визначення субстратів у реальних рідинах проводили у 4-х зразках вин різного типу, вироблених за умов мікровиноробства в Інституті винограду та вина „Магарач” та агрофірмою „Магарач”, а також у 29-ти зразках виноматеріалів на різних стадіях бродіння.

Методика визначення глюкози, етанолу та лактату у зброджуваному суслі та у винах за допомогою амперометричного біосенсора. Вимірювання лактату, етанолу та глюкози за допомогою амперометричного біосенсора проводили в 100 мМ фосфатному буферному розчині, рН 7,2 за кімнатної температури. Для отримання калібрувальної кривої до електрохімічної комірки додавали аліквоти концентрованих розчинів відповідних субстратів. Потім додавали пробу вина (5 мкл, що призводило до 1000-кратного розведення). Після отримання відгуку (час відгуку приблизно 1 хвилина) за допомогою калібрувальної кривої визначали концентрації відповідних субстратів у пробі вина. Після отримання кожного відгуку сенсор відмивали буферним розчином до стабілізації базового сигналу.

Контрольне визначення етанолу у зброджуваному виноматеріалі та у готових винах здійснювали за методом денситометрії дистиляту та стандартним ферментним набором „Алкотест”.

Контрольне визначення лактату у зброджуваному виноматеріалі та у готових винах проводили за допомогою методу іонної хроматографії.

Контрольне визначення глюкози в зброджуваному суслі та у винах проводили за допомогою стандартного ферментного набору „Діаглюк-2”.

Результати дослідження та їхнє обговорення.

Дослідження електрохімічних характеристик амперометричних перетворювачів. На першому етапі розробки амперометричних біосенсорів було вирішене завдання вибору найефективнішого за дизайном, розмірами і матеріалом перетворювача. У роботі були досліджені різні типи електродів (рис. 1):

· платинові друковані електроди “SensLab”,

· платинові дискові електроди,

· електроди на основі вуглецевого волокна,

· електроди на основі графітових стрижнів.

Рис. 1. Зовнішній вигляд амперометричних перетворювачів:

1 – електрод на основі графітових стрижнів;

2 – електрод на основі вуглецевого волокна;

3 – платиновий друкований електрод “SensLab”;

4 – платиновий дисковий електрод

.

Всі досліджені електроди демонстрували вольтамперограми, типові для відповідних матеріалів та дизайну, тому всі вони придатні в амперометрії.

Дослідження чутливості різних типів амперометричних перетворювачів до перекису водню показали переваги амперометричних електродів на основі вуглецевого волокна та амперометричних платинових друкованих електродів “SensLab” порівняно з іншими типами амперометричних перетворювачів (рис. ).

Рис. 2. Залежність струму амперометричних перетворювачів від концентрації перекису водню в експериментальній комірці (1 – платиновий дисковий електрод, 2 – графітовий стрижень, 3 – платиновий друкований електрод SensLab, 4 – електрод на основі вуглецевого волокна)

Значною перевагою платинових друкованих електродів “SensLab” є те, що вони виготовлені промислово, тобто можливе масове виробництво; електроди ж на основі вуглецевого волокна на разі виготовляють вручну безпосередньо в лабораторії. Тому у виноробстві запропоновано використовувати амперометричні біосенсори саме з платиновими друкованими електродами “SensLab”.

Розробка лабораторних прототипів амперометричних біосенсорів для аналізу лактату, етанолу та глюкози в модельних розчинах. В основі роботи амперометричних ферментних біосенсорів на основі лактатоксидази, алкогольоксидази та глюкозооксидози для визначення лактату, етанолу та глюкози лежать такі ферментативні реакції:

АОД

Етанол + О2 Ацетальдегід + Н2О2

ЛOД

L-Лактат +О2 Піруват + Н2О2

ГОД

Глюкоза + О2 Глюконолактон + Н2О2

Гідроліз субстратів супроводжується накопиченням електрохімічно активної речовини – пероксиду водню, що розкладається з утворенням електронів, які й реєструються амперометричним перетворювачем.

Дуже важливим моментом розробки біосенсора є вибір та розробка методу іммобілізації ферменту на поверхню амперометричного перетворювача. Цей метод має бути дешевим, технологічно зручним та простим. Було досліджено чотири різні за технологією методи іммобілізації:

· у парах глутарового альдегіду;

· у полімері Resydrol шляхом фізичної адсорбції;

· у полімері Resydrol шляхом електрохімічного нанесення;

· у полімері полі-(3,4-етилендіокситіафен) (ПЕДТ) шляхом електрохімічної полімеризації.

Було показано, що електрохімічна полімеризація ферментів є універсальним методом іммобілізації лактатоксидази, алкогольоксидази та глюкозооксидази на поверхню амперометричних перетворювачів. При масовому виробництві датчиків електрохімічна полімеризація є більш технологічним методом виготовлення біосенсорів, оскільки отримання перетворювачів, застосування схеми обробки даних та нанесення мембран можна здійснювати в одному технологічному циклі.

До того ж, як видно з табл. 1, сенсори з іммобілізованим електрохімічною полімеризацією ферментом у полімері ПЕДТ характеризуються дещо ширшим динамічним діапазоном роботи, ніж біосенсори з ферментами, іммобілізованими в інший спосіб. Попри трохи меншу величину відгуку, цей метод іммобілізації можна запропонувати для подальшої роботи як універсальний для всіх досліджених оксидаз.

Часто необхідно вимірювати лактат, етанол і глюкозу в розчині одночасно. Тому при розробці лабораторних прототипів необхідно було забезпечити однакові умови проведення експериментів.

Таблиця 1

Лінійний діапазон роботи розроблених біосенсорів залежно від методу іммобілізації ферменту на поверхню амперометричного перетворювача

Методи іммобілізації | Лінійний динамічний діапазон, мМ | Глюкозооксидаза | Алкогольоксидаза | Лактатоксидаза | у парах глутарового альдегіду | 0,03-8,0 | 0,08-0,64 | 0,008-0,5 | у полімері Resydrol методом фізичної адсорбції | 0,04-2,5 | 0,08-2,56 | 0,004-0,5 | у полімері Resydrol методом електрохімічного нанесення | 0,08-5,0 | 0,08-1,0 | 0,064-0,25 | у полімері ПEДT методом електрохімічної полімеризації | 0,05-8,0 | 0,08-10,0 | 0,05-1,6 | Встановлено, що зміни концентрацій фонового електроліту в буфері та зміни концентрації буфера не впливають на величину відгуку біосенсора (рис. 3, 4). Це є великою перевагою амперометричних сенсорів, тому що фізіологічні, культуральні рідини і харчові продукти мають високу іонну силу та буферну ємність, що значною мірою ускладнює використання кондуктометричних та потенціометричних сенсорів для таких аналізів.

Рис. 3. Залежність відгуку амперометричного глюкозного біосенсора від концентрації фонового електроліту в буфері

Рис. 4. Залежність відгуку амперометричного глюкозного біосенсора від концентрації буферного розчину

Таким чином, було розроблено лабораторні прототипи амперометричних біосенсорів для аналізу лактату, етанолу та глюкози в модельних розчинах, вибрано найкращий метод іммобілізації та досліджено їхні аналітичні характеристики .

Аналіз глюкози, етанолу та лактату у вині та суслі в процесі його зброджування за допомогою розроблених амперометричних біосенсорів. Добре відомо, що всі рідини містять велику кількість домішок, наприклад, у напоях міститься велика кількість аскорбінової кислоти, що при аналізі призводить до отримання неспецифічного сигналу. З метою зменшення впливу факторів досліджуваного середовища на характеристики амперометричних біосенсорів запропоновано на поверхню ферментної мембрани нанести додаткову нафіонову мембрану.

Було всебічно вивчено роботу такого сенсора за різних умов на прикладі глюкозного біосенсора. Показано, що нафіонова додаткова мембрана незначно, порівняно з іншими типами мембран, знижує чутливість самого амперометричного датчика до пероксиду водню, що важливо при використанні його для створення біосенсорів.

Встановлено, що за наявності додаткової нафіонової мембрани значно зменшується чутливість глюкозного біосенсора до аскорбінової кислоти (рис. 5). Цей ефект можна пояснити тим, що при використанні додаткової негативно зарядженої мембрани спостерігається обмеження дифузії аскорбінової кислоти всередину мембрани, а це дозволяє використовувати розроблений біосенсор для аналізів реальних зразків вина.

На рис. 6 представлено калібрувальну криву глюкозного сенсора з додатковою нафіоновою мембраною в буферному розчині та в присутності у ньому 0,05 мМ аскорбінової кислоти.

Рис. 5. Калібрувальні криві глюкозного амперометричного біосенсора для аскорбінової кислоти з додатковою нафіоновою мембраною (1) і без неї (2)

Рис. 6. Калібрувальні криві глюкозного амперометричного біосенсора при додаванні в буферний розчин 0,05 мМ аскорбінової кислоти: (1) - без додаткової нафіонової мембрани; (2) - з додатковою нафіоновою мембраною, (3) - з додатковою нафіоновою мембраною без додавання аскорбінової кислоти

З рисунку видно, що калібрувальна крива для глюкози, отримана в присутності аскорбінової кислоти, лише незначно вище калібрувальної кривої для глюкози без аскорбінової кислоти. Глюкозний біосенсор з додатковою нафіоновою мембраною та без неї характеризується подібною залежністю величини відгуку біосенсора від концентрації глюкози.

Використання біосенсорів на практиці часто лімітоване їхньою стабільністю при зберіганні та операційною стабільністю. Тому було досліджено ці характеристики розроблених амперометричних ферментних біосенсорів і показано цілком задовільну операційну стабільність сенсора для визначення етанолу (величина відгуку падала на 1,8 % за добу безперервної роботи на аналізаторі „OLGA” з використанням проточної системи) (рис. 7). Операційна стабільність інших біосенсорів була також задовільною.

Відгуки біосенсорів на субстрати мали високу відтворюваність, стандартне відхилення не перевищувало 5%. Стабільність розроблених біосенсорів при зберіганні становить 30-45 днів.

Рис. 7. Операційна стабільність амперометричного біосенсора для визначення етанолу

Лабораторні прототипи розроблених біосенсорів апробовано при аналізі 4-х зразків вина різного типу (табл. 2) та 29-ти зразків виноматеріалів на різних стадіях бродіння при різних температурах протягом 13 діб, проведених в умовах мікровиноробства в Інституті винограду та вина „Магарач” (табл.3). Отримані дані продемонстрували цілком задовільну кореляцію з результатами, отриманими методами денситометрії дистиляту, іонної хроматографії (ІХ) та стандартних ферментних наборів „Алкотест” та „Діаглюк”.

Таблиця 2

Порівняльний аналіз етанолу, лактату та глюкози у вині

Зразок |

Етанол,

% об. (±0,06) | Глюкоза,

г/100 см3 (±0,2) | Лактат,

г/100 см3 (±0,1)

Біо-

сенсор | Ареометр | Алкотест | Біо-сенсор | Ареометр | Діаглюк | Біо-сенсор | ІХ | Каберне-Совіньйон | 14,8 | 11,4 | 10,8 | 0,18 | 0,16 | 0,0 | 25,5 | 25

Шардоне | 8,2 | 10,9 | 10,8 | 0,09 | 0,08 | 0,0 | 37,4 | 30

Херес | 19,5 | 18,6 | 20,7 | 2,23 | 2,5 | 2,6 | 16,2 | 11

Данко | 14,8 | 16,8 | 16,6 | 10,8 | 12,0 | 10,16 | 2,1 | 1

Таблиця 3

Порівняльний аналіз етанолу, лактату та глюкози у виноградному суслі в процесі його зброджування при температурі 17С

№ проби | Доба | Глюкоза, г/100 см3 | Спирт, % об. | Лактат, г/100 см3

Ареометр1 | Біо-

сенсор2 | Ареометр1 | Біо-

сенсор2 | Алкотест3 | ІХ4 | Біо-сенсор2

1 | 0 | 20,2 | 13,86 | 0 | 0 | 0 | 0,4 | 3,1

2 | 1 | 18,22 | 12,8 | 0,04 | 0,05 | 0,51 | 0,4 | -

3 | 1,3 | - | 10,8 | - | 0,36 | 0,51 | 0,7 | 3,2

4 | 2 | 12,9 | 7,55 | 1,57 | 0,45 | 1,19 | 1,4 | -

5 | 3 | 6,91 | 7,2 | 4,19 | 4,3 | 3,08 | 2,1 | 2,6

6 | 4 | 3,37 | 3,96 | 6,03 | 5,6 | 4,78 | 2,1 | -

7 | 5 | 1,59 | 3,4 | 7,07 | 6,0 | 6,75 | 2,1 | 2,9

8 | 6 | - | 1,13 | - | 7,3 | 7,45 | 2,1 | 3,1

9 | 7 | 0,2 | 1,44 | 10,09 | 9,2 | 9,47 | 3,5 | 3,5

10 | 8 | - | 1,55 | - | 10,5 | 10,67 | 2,1 | 4,4

11 | 9 | 0,16 | 1,03 | 12,4 | 10,5 | 11,35 | 1,4 | -

12 | 10 | - | 0,9 | - | 12,3 | 13,69 | 2,1 | 2,5

13 | 11 | - | 1,03 | - | 13,3 | 12,33 | 2,8 | 2,3

14 | 12 | - | 1,03 | 13,3 | 13,4 | 13,22 | - | -

15 | 13 | 0,14 | 0,59 | 13,4 | 12,2 | 13,26 | - | 3,1

Примітки:

1 – визначали методом денситометрії дистиляту;

2 – визначали за допомогою розроблених амперометричних біосенсорів;

3 – визначали стандартним ферментативним методом;

4 – визначали методом іонної хроматографії;

“–” – не визначали.

За допомогою розроблених біосенсорних систем вивчено також динаміку змін концентрацій глюкози, етанолу та лактату в процесі зброджування виноградного сусла при температурах бродіння 17 С і 26 С (рис. 8).

Рис. 8. Динаміка зміни концентрації лактату, етанолу та глюкози в процесі зброджування виноградного сусла при температурах бродіння 17 С (А) та 26 С (Б), отримана за допомогою розроблених ферментних амперометричних біосенсорів

Таким чином, розроблені лабораторні прототипи ферментних амперометричних біосенсорів можна з високим ступенем достовірності використовувати при контролі процесу зброджування вина. При цьому визначення за допомогою біосенсорів є простим та не потребує спеціальної підготовки проби, що зумовлює суттєві переваги з точки зору оперативності аналізу. При масовому виробництві біосенсорів вартість такого аналізу буде значно нижчою, ніж аналогічна для загальноприйнятих на сьогоднішній день методів контролю. Це уможливить значне розширення сфери використання ферментних амперометричних біосенсорів і може забезпечити економічний ефект.

ВИСНОВКИ

Вперше розроблено спеціалізовану амперометричну ферментну біосенсорну систему для визначення лактату, етанолу та глюкози у вині та виноматеріалах.

1. Доведено, що платинові друковані електроди “SensLab” є оптимальними для створення амперометричних біосенсорів для виноробства.

2. Встановлено, що електрохімічна полімеризація ферментів є універсальним методом іммобілізації досліджених оксидаз на поверхню амперометричних перетворювачів при використанні їх для контролю виробництва вина.

3. Показано, що використання додаткової нафіонової мембрани дозволяє уникнути впливу аскорбінової кислоти на величину відгуку амперометричних ферментних біосенсорів.

4. Розроблено лабораторні прототипи ферментних біосенсорів для аналізу лактату, етанолу та глюкози з такими аналітичними характеристиками:

§ лінійний діапазон роботи

сенсора на основі лактатоксидази – 0,05 – 1,6 мМ лактату;

сенсора на основі алкогольоксидази – 0,08 – 5 мМ етанолу;

сенсора на основі глюкозооксидази – 0,05 – 8 мМ глюкози;

§ час відгуку для всіх біосенсорів 30 – 60 с;

§ операційна стабільність – 5 днів;

§ стабільність при зберіганні – 30 – 45 днів.

5. Апробація розроблених лабораторних прототипів амперометричних біосенсорів при кількісному аналізі лактату, етанолу та глюкози у вині та у виноградному суслі в процесі його зброджування показала кореляцію отриманих даних із загальноприйнятими методиками.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Щувайло О.Н., Данилейко (Шкотова) Л.В., Архипова В.Н., Дзядевич С.В., Ельская А.В., Сеспуглио Р., Солдаткин А.П. Разработка микробиосенсоров на основе углеродных волокон для определения глюкозы, ацетилхолина и холина in // Біополімери і клітина. – 2002. – Т. 18, № . – С. 489 – 495.

Особистий внесок здобувача — проведення експериментів із оптимізації роботи амперометричного перетворювача для створення біосенсора для визначення глюкози, аналіз наукових даних та написання статті проводилось за безпосередньої участі дисертантки.

2. Данилейко (Шкотова) Л.В., Щувайло О.Н., Архипова В.Н., Солдаткин А.П., Дзядевич С.В. Разработка амперометрического ферментного биосенсора на основе углеродного волокна и иммобилизированной глюкозооксидазы // Біополімери і клітина. – 2003. – Т. 19, № 1. – С. – 80.

Особистий внесок здобувача — самостійно проведено експерименти із розробки та оптимізації роботи амперометричного біосенсора для визначення глюкози, власноруч написано основну частину статті.

3. Шкотова Л.В., Солдаткин А.П., Дзядевич С.В. Адаптация амперометрического ферментного биосенсора для анализа глюкозы в винах // Український біохімічний журнал. – 2004. – Т. 76, № 3. – С. 114 – 121.

Особистий внесок здобувача — самостійно виконано експерименти із адаптації роботи амперометричного глюкозного біосенсора для проведення аналізів у вині за допомогою використання додаткової нафіонової мембрани, власноруч написано основну частину статті.

4. Шкотова Л.В., Сластья Е.А., Жилякова Т.А., Солдаткин О.П., Шуманн В., Дзядевич С.В. Амперометричний біосенсор для аналізу етанолу у вині та у виноградному суслі в процесі його ферментації // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77, № 1. – С. 96 – 103.

Особистий внесок здобувача — самостійно виконано експерименти із розробки та оптимізації роботи амперометричного біосенсора для визначення етанолу у виноматеріалах та порівняння отриманих даних з класичними методами, власноруч написано основну частину статті.

5. Шкотова Л.В., Горюшкіна Т.Б., Сластья Е.А., Солдаткін О.П., Тран_Мін К., Шовелон Ж._М., Дзядевич С.В. Амперометричний біосенсор для аналізу лактату у вині та у виноградному суслі в процесі його ферментації // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77, № 5. – С. 123-130.

Особистий внесок здобувача — самостійно виконано експерименти із розробки та оптимізації роботи амперометричного біосенсора для визначення лактату у виноматеріалах та порівняння отриманих даних з класичними методами, власноруч написано основну частину статті.

6. Бережецький А.Л., Щувайло О.М., Архипова В.М., Шкотова Л.В., Шовелон Ж._М., Солдаткін О.П., Дзядевич С.В. Дослідження та оптимізація різних перетворювачів для створення амперометричних біосенсорів // Sensor Electronics and Microsystem Technologies. – 2005. – №. 2. – Р. 55 – 62.

Особистий внесок здобувача — виконано частину експериментів із дослідження роботи різних типів амперометричних перетворювачів, обговорення отриманих результатів та написання статті проводилось за безпосередньої участі дисертантки.

7. Данилейко (Шкотова) Л.В., Решетняк Л.Р., Щувайло О.М., Архіпова В.М. Оптимізація роботи глюкозного амперометричного біосенсора на основі карбонового ультрамікроелектрода // VII Міжнародна науково-технічна конференція. Наукові праці Українського державного університету харчових технологій. – 2001. – № 10. – С. 142 – 144.

Особистий внесок здобувача — самостійно виконано експерименти із оптимізації роботи амперометричного біосенсора для визначення глюкози.

8. Dzyadevych S.V., Schuvailo O.M., Danileiko (Shkotova) L., El’skaya A.V., Arkhypova V.N., Cespuglio R., Soldatkin A.P. Development of amperometric enzyme biosensors based on carbon fibre microelectrode for in-vivo determination of glucose, choline and acetylcholine // Book of the 16th European Conference on Solid-State Transducers, Prague: “Czech Technical University”, 2002. – P. 1159 – 1162.

Особистий внесок здобувача — участь у проведенні експериментів із розробки амперометричного біосенсора на основі вуглецевого волокна для визначення глюкози.

9. Schuvailo O., Danileiko (Shkotova) L., Arkhypova V., Dzyadevych S., Cespuglio R., Soldatkin A. Development and design of carbon-fibre electrodes for creating of amperometric enzyme biosensors for medicine and food industries // Book of 1st Black Sea Basin Conference on Analytical Chemistry. – Odessa (Ukraine), 2001. – P. 40.

Особистий внесок здобувача — проведення частини експериментів із розробки амперометричних біосенсорів на основі вуглецевого волокна для визначення глюкози.

10. Щувайло О.М., Данилейко (Шкотова) Л.В., Сеспугліо Р., Дзядевич С.В. Використання іммобілізованих ферментів в біосенсорах для визначення in vivo глюкози, ацетилхоліну та холіну // Матеріали VIII Українського біохімічного з’їзду. Український біохімічний журнал. – 2002. – Т. 74, № 4б. – С. 203.

Особистий внесок здобувача — проведення експериментів із дослідження роботи амперометричних перетворювачів на основі вуглецевого волокна.

11. Данилейко (Шкотова) Л.В. Використання амперометричного ферментного біосенсора для аналізу глюкози в напоях // Міжгалузева конференція молодих науковців. Український біохімічний журнал.–2003. – Т. 75, № 5. – С. .

12. Danyleyko (Shkotova) L.V., Dzyadevich S.V. Amperometric glucose biosensor for analysis of glucose in beverages // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. – Kiev (Ukraine), 2003. – P. 146.

Особистий внесок здобувача — самостійно виконано експерименти із розробки амперометричного глюкозного біосенсора для проведення аналізів у напоях.

13. Shkotova L.V., Dzyadevich S.V., Schuhmann W. Development of biosensor based on amperometric transducer and immobilized alcohol oxidase in Resydrol polymer for detection of ethanol // International Conference on Sensors Electronics and Microsystem technology. – Odessa (Ukraine), 2004. – P. 214.

Особистий внесок здобувача — самостійно виконано експерименти із розробки амперометричного алкогольного біосенсора.

14. Shkotova L.V., Soldatkin A.P., Schuhmann W., Dzyadevіch S.V. Amperometric biosensor for detection of ethanol based on alcohol oxidase immobilized inside electrochemically deposited resydrol film // MADICA 2004. – Tunis (Tunisie), 2004. – P. .

Особистий внесок здобувача — самостійно виконано експерименти із розробки амперометричного біосенсора для визначення етанолу.

15. Шкотова Л.В., Солдаткін А.П., Дзядевич С.В. Розробка амперометричних біосенсорів для аналізу етанолу, лактату та глюкози у вині та у виноградному суслі в процесі його ферментації // Конференція-звіт з комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій”. – Київ (Україна), 2005. – С. 86.

Особистий внесок здобувача — самостійно виконано експерименти із розробки амперометричних біосенсорів для визначення глюкози, етанолу та лактату у виноматеріалах.

16. Shkotova L.V., Goryushkina T., Jaffrezic N., Soldatkin A., Dzyadevych S. Development of biosensors for detection of ethanol, lactate and glucose in beverages and fermentation processes // Bioelectrochemistry-2005 – XVIII International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 3rd Spring Meeting of Bioelectrochemistry. – Coimbra (Portugal), 2005 – Р. 188.

Особистий внесок здобувача — самостійно виконано експерименти із розробки амперометричних біосенсорів для визначення глюкози, етанолу та лактату у вині та у виноградному суслі в процесі його ферментації та порівняння отриманих даних з даними отриманими класичними методами.

АНОТАЦІЯ

Шкотова Л.В. Розробка амперометричних біосенсорів для визначення лактату, етанолу та глюкози у виноматеріалах. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. – Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2006.

Дисертацію присвячено розробці біосенсорних систем на основі амперометричних перетворювачів для аналізу лактату, етанолу та глюкози в процесі зброджування вина і безпосередньо у вині та оптимізації їхніх основних аналітичних параметрів.

Всебічно досліджено аналітичні характеристики та ефективність роботи різних типів амперометричних перетворювачів. Вивчено різні, з точки зору технології, методи іммобілізації ферментів глюкозооксидази, алкогольоксидази та лактатоксидази на поверхню амперометричних перетворювачів та вибрано універсальний для всіх досліджених оксидаз метод іммобілізації. Визначено шляхи поліпшення основних аналітичних характеристик розроблених біосенсорів з метою їхньої адаптації до роботи за промислових умов. Створено діючий лабораторний прототип ферментної сенсорної системи для визначення глюкози, етанолу та лактату у виноматеріалах; за її допомоги проведено кількісний аналіз цих речовин у вині та у виноградному суслі в процесі його зброджування. Проведено порівняння розробленої аналітичної системи зі стандартними методиками, продемонстровано кореляцію отриманих даних.

Ключові слова: біосенсор, амперометричний перетворювач, ферменти, глюкоза, етанол, лактат, вино, виноградне сусло.

АННОТАЦИЯ

Шкотова Л.В. Разработка амперометрических биосенсоров для определения лактата, этанола и глюкозы в виноматериалах. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. – Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2006.

Винная продукция, как один из элементов пищевой промышленности, на всех стадиях производства должна проходить технико-химический контроль, цель которого состоит в определении компонентов, которые входят в состав сусла и вина, а также определение их влияния на качество продукта. В отличии от неживых, стерилизованных консервированных продуктов вино представляет собой сложную, постоянно меняющуюся биологическую систему с замкнутым циклом химических и биохимических реакций а также физико-химических процессов. Таким образом в пищевой промышленности, особенно в виноделии, актуальной является задача разработки биосенсоров. Главное преимущество таких приборов — высокая скорость получения результатов с высокой специфичностью и достоверностью, а также низкая цена и легкость обработки данных. Кроме этого, они не требуют высокой квалификации обслуживающего персонала.

В этом направлении очень интересным является разработка сенсоров для постоянного, одновременного и селективного определения лактата, этанола и глюкозы. Мониторинг этих веществ может быть показателем степени качества и органолептических характеристик полученного продукта и позволит избежать образования некоторых нежелательных компонентов в процессе сбраживания вина, предупреждая значительные экономические потери. На сегодняшний день еще не существует коммерческих биосенсоров для проверки качества сырья в процессе производства вина.

Главная цель диссертационной работы - создание сенсорной системы на основе одного типа амперометрических преобразователей для проведения анализа лактата, этанола и глюкозы в процессе сбраживания вина и непосредственно в вине, а также оптимизация их основных аналитических параметров для дальнейшего использования в составе мультисенсоров.

В диссертационной работе проведен детальный анализ различных амперометрических ферментных биосенсоров, которые могут быть использованы как в качестве анализаторов в пищевой промышленности, так и для контроля биотехнологических процессов. Биосенсоры, основанные на амперометрическом методе измерения, обладают рядом преимуществ: на сегодняшний день это самые простые в применении и дешевые аналитические методы анализа, они имеют достаточно широкий диапазон измерения концентраций для многих практических применений.

Впервые всесторонне исследованы аналитические характеристики и эффективность работы различных типов амперометрических преобразователей с целью их дальнейшего применения в составе биосенсоров для виноделия. Для разработки амперометрических биосенсоров предложено использовать платиновые печатные электроды “SensLab”, изготовляемые промышленно.

Впервые проведен анализ разных, с точки зрения технологии, методов иммобилизации лактатоксидазы, алкогольоксидазы и глюкозооксидазы на поверхность амперометрических преобразователей. В качестве универсального метода иммобилизации для всех исследованных оксидаз при одновременном их использовании для контроля производства вина выбрана электрохимическая полимеризация. Преимущество этого метода состоит в том, что изготовление преобразователей, нанесение биологических мембран и применение схемы обработки данных можно