НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ШУЛЬГА ОЛЕНА ВІКТОРІВНА
УДК 632.4:635.82
ЗБУДНИКИ ЗЕЛЕНОЇ ПЛІСЕНІ (TRICHODERMA SPP.) ЛІКАРСЬКОГО ЇСТІВНОГО ГРИБА ШІІ-ТАКЕ
/LENTINULA EDODES (Berk.) Pegl./
ТА БІОЛОГІЧНЕ обҐрунтування заходів ОБМЕЖЕННЯ
ЇХ РОЗВИТКУ
06.01.11 – фітопатологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2006
Дисертацією є рукопис
Роботу виконано в Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України
Науковий керівник – кандидат біологічних наук
Григанський Андрій Пилипович,
Національний аграрний університет,
доцент кафедри фітопатології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, доцент
Слюсаренко Олександр Миколайович,
Одеський національний університет ім. І.І. Мечнікова,
професор кафедри ботаніки
кандидат біологічних наук,
старший науковий співробітник
Крючкова Лариса Олексіївна,
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,
старший науковий співробітник
відділу фізіології росту і розвитку рослин
Провідна установа – Харківський національний аграрний університет
ім. В.В. Докучаєва, кафедра фітопатології,
Міністерство аграрної політики
України, м. Харків
Захист відбудеться 29 вересня 2006 року о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.02 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус №3, аудиторія 65
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус №4, кім. 41
Автореферат розісланий 28 серпня 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Мороз М.С.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Культивовані гриби на ринку сільськогосподарської продукції України представлені переважно печерицею двоспоровою /Agaricus bisporus (J. Lge) Imbach/ і в меншій мірі гливою звичайною /Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm./. Останнім часом починають культивувати й інші важливі їстівні види шапинкових грибів, насамперед шіі-таке /Lentinula edodes (Berk.) Pegl./. Попит на цей їстівний гриб зростає не лише завдяки його високим поживним якостям, а також цінним лікарським властивостям: онкостатичним, антисклеротичним, антивірусним тощо. Тому гриби шіі-таке можна розглядати як продукт не лише харчового, а й лікувально-профілактичного напряму, як цінну сировину для отримання фармацевтичних препаратів (Бухало А.С. та ін., 1996; Низковская О.П., 1983; Breene W., 1990; Chang S., 1999).
Пристосування традиційних культиваційних прийомів до регіональних умов і субстратів України, а також створення нових технологій обмежується рядом факторів, які зменшують ефективність виробництва цього цінного лікарського їстівного гриба.
Незважаючи на те, що в Україні промислове вирощування шіі-таке тільки починає розвиватися, його виробництво часто несе значні збитки від ураження грибами роду Trichoderma Pers.: Fr., які спричиняють масовий розвиток "зеленої плісені”. Аналіз результатів багатьох наукових досліджень свідчить, що види роду Trichoderma належать до найбільш поширених контамінантів культури шіі-таке, як за вирощування екстенсивним способом на деревних відрубках, так і за інтенсивного вирощування на збагачених тирсових субстратах (Liao Y., 1993; Badham E, 1991; Przybylowicz P., 1990). Поява плісені на субстраті або на плодових тілах не лише знижує якість отриманої продукції, а й призводить до значних втрат врожаю, часто до повного його загибелі (Ohmasa M., 1995; Rinker D., 2005; Savoie J. et al., 2001). Відомості про поширення та шкідливість зеленої плісені під час культивування шіі-таке в Україні дуже обмежені, що в свою чергу ускладнює діагностику фітосанітарного стану грибних господарств та не дозволяє дати об’єктивну оцінку ролі цього захворювання у втратах та недоборах урожаю культури. У нових умовах господарювання потребують перегляду та вдосконалення як технологія вирощування шіі-таке в закритому ґрунті, так і заходи захисту культури від хвороб. Вирішення цих питань є своєчасним та надзвичайно актуальним.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводили згідно тематичному плану кафедри фітопатології Національного аграрного університету (тема: “Роль факультативних і сапротрофних паразитів в етіології патогенного процесу рослин, біологічне обґрунтування заходів обмеження їх розвитку”. Номер державної реєстрації – 0198 U 004122).
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення поширення та шкідливості зеленої плісені, а також шляхів обмеження її розвитку в умовах промислового культивування їстівних грибів шіі-таке.
Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:
- визначити поширеність, розвиток та шкідливість зеленої плісені в умовах інтенсивного вирощування їстівного гриба шіі-таке;
- встановити діагностичні ознаки хвороби;
- з’ясувати видовий склад збудників зеленої плісені та їх співвідношення;
- визначити основні еколого-біологічні особливості грибів роду Trichoderma – збудників зеленої плісені;
- вивчити взаємовідносини збудників захворювання (Trichoderma spp.) з різними сортами та штамами шіі-таке (Lentinula edodes);
- провести оцінку стійкості різних штамів шіі-таке до збудників зеленої плісені;
- встановити вплив найважливіших елементів технології культивування на конкурентноздатність шіі-таке щодо збудників зеленої плісені;
- дослідити in vitro вплив фунгіцидів на ріст та розвиток Trichoderma spp. та L. edodes.
Об’єкт дослідження. Гриби роду Trichoderma – збудники зеленої плісені шіі-таке; штами їстівного гриба шіі-таке (Lentinula edodes).
Предмет дослідження. Взаємовідносини збудників зеленої плісені з культивованим грибом шіі-таке; еколого-біологічні особливості грибів роду Trichoderma; уражуваність штамів шіі-таке; фактори, які впливають на розвиток хвороби; заходи обмеження її шкідливості.
Методи дослідження. Мікологічні (методи серійних розведень та культури накопичення) – для виділення збудників зеленої плісені в чисту культуру з подальшим визначенням їх родової належності; вивчення впливу екологічних факторів на розвиток Trichoderma spp., дослідження біології патогену; з’ясування характеру взаємовідносин культивованого гриба шіі-таке з представниками роду Trichoderma. Молекулярно-біологічний – для ідентифікації видів роду Trichoderma. Фітопатологічний – для дослідження динаміки розвитку захворювання залежно від екологічних умов, з’ясування стійкості штамів шіі-таке. Математично-статистичний – для оцінки достовірності отриманих результатів.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в Україні досліджено поширення та розвиток зеленої плісені на грибах шіі-таке /Lentinula edodes (Berk.) Pegl./, а також видовий склад, біологічні та екологічні особливості її збудників.
Установлено, що серед збудників зеленої плісені шіі-таке домінують представники роду Trichoderma Pers.: Fr. Ідентифіковано 23 штами, які належать до 5-ти видів цього роду, серед яких найбільш поширеним і шкідливим (70,3%) є T..
Уперше досліджено основні типи взаємодії між L. edodes та грибами роду Trichoderma. З’ясовано, що патогенні властивості штамів Trichoderma залежать як від температурного фактору, так і від особливостей штамів. У більшості випадків патогенність досліджених ізолятів зростала з підвищенням температури.
Створено (у співавторстві) сорти шіі-таке: Риф та Адмірал, які характеризуються підвищеною продуктивністю та стійкістю до зеленої плісені. Вони зареєстровані в Реєстрі сортів рослин, рекомендованих для поширення в Україні в 2004, 2005, 2006 рр. (Авторські свідоцтва № 0443, № 0444; 2004 р.).
Проведено оцінку різних сортів та штамів шіі-таке за їх стійкістю до зеленої плісені. Серед 23 досліджуваних сортів та штамів шіі-таке найбільш стійкими виявилися: Адмірал, Риф, ІВК 714, ІВК 1658 (уражуваність до 15%), а найбільш сприйнятливими – ІВК 1628, ІВК 1627 (уражуваність 90-100%).
Досліджено in vitro вплив бензимідазольних фунгіцидів на радіальний ріст та розвиток Trichoderma spp. та L. edodes. Встановлено, що використання фундазолу, 50% з.п. (д.р. беноміл) та дерозалу, 50% к.с. (д.р. карбендазим) у концентрації 10 мг/л повністю пригнічує ріст та розвиток більшості штамів Trichoderma harzianum у чистій культурі, за винятком Т1 і Т4. При цьому не відмічено негативного впливу препарату на ріст та розвиток міцелію L..
Практичне значення одержаних результатів. Установлені симптоми зеленої плісені на грибах шіі-таке та шкідливість хвороби дозволяють більш достовірно проводити її діагностику та оцінювати спричинені економічні втрати. Створено колекцію штамів грибів роду Trichoderma Pers.: Fr., які викликають зелену плісень на грибах шіі-таке при вирощуванні в умовах грибних підприємств України. Найбільш патогенні штами триходерми можуть бути використані для створення штучного інфекційного фону в селекційному процесі, достовірної оцінки стійкості сортів та штамів Lentinula edodes (Berk.) Pegl. до хвороби. Досліджено еколого-біологічні особливості виявлених штамів роду Trichoderma, що має важливе значення для прогнозування розвитку зеленої плісені та розробки заходів обмеження її розповсюдження.
Виявлено фактори, які підвищують стійкість шіі-таке до зеленої плісені. Надалі їх слід використовувати при розробці заходів обмеження розвитку хвороби.
Впроваджено у виробництво сорт шіі-таке Адмірал, який, окрім підвищеної стійкості до зеленої плісені, сприяв прибавці врожаю на 0,7% у порівнянні з іншими використаними штамами.
Особистий внесок здобувача. Авторкою за її безпосередньої участі виконано виробничі та лабораторні дослідження. На основі одержаних результатів особисто здійснено аналіз, теоретичне обґрунтування та узагальнення досліджень, що відображено в наукових працях, які вийшли друком; сформульовано основні положення дисертаційної роботи; зроблено висновки і подано рекомендації виробництву.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на “The Third international medicinal mushroom conference” (Вашингтон, CША, 2005), 9-й Пущинській школі-конференції молодих учених "Биология – наука ХХІ века" в Пущинському науковому центрі Російської Академії наук (Пущино, 18-22 квітня 2005 р.); 5-й Міжнародній конференції "Mushroom Biology and Mushroom Products" (Шанхай, КНР, 8-12 квітня 2005 р.); Третьому Всеросійському конгресі з медичної мікології в Центральному домі вчених Російської академії наук (Москва, 24-25 березня 2005 р.); на Міжнародній науковій конференції "Інтегрований захист рослин на початку ХХІ століття" в Інституті захисту рослин УААН (Київ, 1-5 листопада 2004 р.); Міжнародній науковій конференції "Биология, систематика и экология грибов в природных экосистемах и агрофитоценозах" в Інституті експериментальної ботаніки ім. В.Ф. Купрієвича НАН Білорусі (Мінськ, 20-24 вересня 2004 р.); Х з’їзді Товариства мікробіологів України в Одеському національному університеті ім. І.І. Мечнікова (Одеса, 15-17 вересня 2004 р.); ХІІ Міжнародному симпозіумі "Нетрадиционное растениеводство" (Алушта, 5-12 вересня 2004 р.); ІІ Міжнародній конференції "Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти" у Львівському національному університеті ім. І. Франка (Львів, 18-21 серпня 2004 р.); Другому всеросійському конгресі з медичної мікології (Москва, 24-25 березня 2004 р.); ХVI Міжнародному конгресі "The science and cultivation of edible and medicinal fungi" (Маямі, США, 14-17 березня 2004 р.); XIV Конгресі Європейських мікологів (Ялта, 22-27 вересня 2003 р.); конференціях науково-педагогічних працівників, наукових співробітників та аспірантів факультету захисту рослин НАУ (Київ, 2003, 2004 рр.).
Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 17 наукових праць, у тому числі: 6 статей в наукових журналах, 2 авторські свідоцтва на сорти грибів, 9 у матеріалах наукових конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 177 сторінках машинописного тексту, що включає 24 таблиці, 37 рисунків. Вона містить вступ, 9 розділів, висновки, 5 додатків. Список використаної літератури налічує 256 найменувань, з яких 201 іноземною мовою.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури висвітлено стан вивчення проблеми як в Україні, так і за її межами. Наведені дані щодо історії дослідження зеленої плісені шіі-таке, її морфологічних ознак, спеціалізації збудників роду Trichoderma, поширення, шкідливість та екологічні особливості хвороби. Подано інформацію про шляхи та причини поширення збудників зеленої плісені. Висвітлено сучасний стан заходів захисту їстівних грибів від хвороби.
Аналіз джерел літератури показує актуальність теми дисертаційної роботи, підтверджує доцільність проведення досліджень, спрямованих на вивчення шкідливості зеленої плісені та заходів обмеження її розвитку.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Відбір зразків та експериментальні дослідження проводили в 2002-2004 рр. на спеціалізованих грибних підприємствах (грибівницях) з вирощування шіі-таке, які розташовані в Луганській, Миколаївській, Одеській, Херсонській, Хмельницькій, Київській областях та в м. Києві.
Видову належність грибів роду Trichoderma визначали за морфологічними ознаками (особливості будови міцелію, характер формування спороношення, розмір та форма фіалід, фіалоспор або конідій, хламідоспор, розгалуження конідієносців, колір колонії, ростові параметри) з використанням сучасних таксономічних підходів (Chaverri P., 2003). Для підтвердження результатів, одержаних традиційними методами для всіх штамів, проведено ідентифікацію методом PCR-аналізy за допомогою ITS послідовностей (Lava-Sanchez P. et al., 1972). ДНК виділяли з чистих культур Trichoderma spp., вирощених на сусло-агаровому середовищі, методом СТАВ за Gerrits van den Ende & De Hoog (1999). Провели порівняння отриманих результатів з даними GenBank sequences провели, використовуючи модифікацію пошукової системи Internet BLAST - програму BlastN 2.1.1 Національного Центру біотехнологічної інформації Австрії (Dickinson M., 2003). Молекулярно-біологічна ідентифікація двадцяти трьох ізолятів грибів роду Trichoderma була проведена спільно з докторами біологічних наук Р. Пьодером та М. Кірхмайером у Мікробіологічному інституті Інсбрукського університету (Австрія).
Ступінь ураження субстратних блоків у виробничих умовах визначали візуально у відсотках від загальної площі за 5-бальною шкалою, розробленою співробітниками кафедри фітопатології Національного аграрного університету (А.П. Григанський та ін., 2002), де: 0 – ураження відсутнє, бал 1 – уражено 1-5% площі, бал 2 – уражено 6-25% площі, бал 3 – 26-50%, бал 4 – 51-75%, бал 5 – понад 75%.
У дослідах з визначення швидкості росту L. edodes як щільне живильне середовище використовували нехмільне агаризоване пивне сусло. Вплив температури на ріст і розвиток Trichoderma spp. культуру гриба вивчали на живильних середовищaх КГА та Чапека в чашках Петрі за температур інкубування 15, 20, 25, 30 і 35°С. Для цього з краю колонії лабораторним свердлом вирізали диски міцелію діаметром 5 мм і переносили в чашки Петрі (Петр С., 1978). Щоденно вимірювали радіус колоній та відмічали появу морфологічних структур – конідій. Зміни у морфології росту колоній досліджуваних штамів описували та фотографували.
Вплив джерел вуглеводневого та азотного живлення на фізіологічні властивості грибів роду Trichoderma spp. досліджували на середовищі Чапека. Сахарозу середовища замінювали однією із досліджуваних сполук: глюкозою, ксилозою, порошковою целюлозою, розчинним крохмалем, мальтозою, фруктозою, лактозою.
Дослідження взаємодії культур L. edodes і Trichoderma spp. при сумісному вирощуванні в парних культурах проводили за методикою Samuels G. et al. (2002). Диск міцелію діаметром 5мм, 8-денної культури L. edodes був інокульований з краю 90 мм чашки Петрі, заповненої 15 мл 2%-го сусло-агарового середовища. Після 5-ти діб інкубації культури L. edodes середовище чашки Петрі інокулювали міцелієм 4-добової культури триходерми з використанням агарового диску, який розміщували з протилежного боку чашки Петрі на відстані 4 см від міцеліального диску L. edodes. Ріст культур обох видів досліджували при температурі 25±1 °С протягом 28 діб. Досліди проводили в пяти повтореннях. Як контроль використовували чисті культури L. edodes та Trichoderma spp.
Створення продуктивних і конкурентноздатних до збудників зеленої плісені сортів шіі-таке Риф та Адмірал було здійснено у співпраці із завідуючим відділом фітопатології та ентомології Селекційно-генетичного інституту УААН, м. Одеса, к.б.н. О.В. Бабаянц.
Статистичну обробку результатів обліків і спостережень проводили за стандартними методиками за допомогою прикладного пакету Statistica 6.0. (Боровиков В.П., 2000; Kempton R., 1997). Для отриманих результатів розраховували середнє
арифметичне, його похибку та стандартне відхилення. Пошаровий розподіл досліджуваних ознак на гомогенні групи проводили за тестом Дункана (Steel R., Torrie J., 1980).
Поширення, розвиток та шкідливість
зеленої плісені шіі-таке
Результати фітопатологічних обстежень, проведених нами протягом 2002-2004 рр. у грибівницях з вирощування шіі-таке, засвідчили про значну розповсюдженість зеленої плісені. Однак показники поширення та розвитку останньої в різних грибних господарствах були неоднакові і залежали від ряду факторів. Вищу шкідливість хвороби спостерігали в грибівницях, де для знезараження субстрату застосовували пастеризацію (при температурі 75 °С протягом 8-12 год.). Так, під час обростання субстрату (інкубації) на цих підприємствах ураженість субстрату шіі-таке зеленою плісенню становила відповідно 44,0 та 77,3%, а ступінь розвитку – 21 і 46,7%. Найменші показники поширення (10,6 і 16%) та розвитку (1,5 і 2,3%) хвороби відзначено на підприємствах, де для знезараження субстрату використовували стерилізацію при 121°С протягом 2 год.
На різних фермах втрати врожаю шіі-таке коливалися від 1% до 74%.
Як показали мікробіологічні аналізи зразків субстрату на основі дубової тирси, після жорсткої стерилізації при температурі 121°C в умовах надлишкового тиску (1,2 атм) протягом 2 годин ефективність знезараження субстрату від мезофільної мікобіоти значно зростає. В зразках субстрату, які пройшли жорстку стерилізацію після термообробки (протягом 10 днів) знайшли лише бактерії роду Bacillus. Вибраковка субстратних блоків, приготовлених за такого режиму термообробки, становила 11,5±1,2%, що на третину менше ніж при пастеризації.
Діагностичні ознаки зеленої плісені шіі-таке
У результаті спостережень за ростом і розвитком шіі-таке в закритому ґрунті було встановлено, що збудники зеленої плісені уражують даний гриб на всіх стадіях його виробничого циклу. Виявлено такі типи прояву хвороби: зміна забарвлення ураженого посівного міцелію та субстрату, некрози, муміфікація та гниль плодових тіл.
Характер взаємодії патогену з культивованим грибом значною мірою залежить від зайнятої ним початкової площі. Ступінь ураження субстрату зеленою плісенню буває настільки сильним, що може повністю пригнітити ріст міцелію шіі-таке.
Досить часто міцелій шіі-таке при контакті з колонізованими триходермою ділянками формує бараж (коричневий валик чи лінія, утворені скупченням нерухомих повітряних гіф міцелію шіі-таке), який призупиняє подальше розростання Trichoderma spp. Таке відбувалось за умови колонізації міцелієм L. edodes понад 60% субстрату та порівняно нездночної ділянки, зайнятою зеленою плісенню. В такому разі міцелій шіі-таке не лише призупиняє подальше розповсюдження патогену, а й спроможний наростати на його колонії.
Видовий склад збудників зеленої плісені шіі-таке
Видовий склад збудників зеленої плісені L. edodes визначали, відбираючи зразки ураженого субстрату та хворих плодових тіл із ознаками цього захворювання. З використанням мікроморфологічних та молекулярно-біологічних методів з’ясовано, що збудниками зеленої плісені в умовах України є гриби родів Trichoderma Pers.: Fr., Penicillium Link., Gliocladium Corda і Aspergillus Link. Серед них 86% від кількості отриманих ізолятів займають представники роду Trichoderma (рис. 1).
У результаті 3-х річних досліджень (2002-2004 рр.) нами встановлено видовий склад представників роду Trichoderma в грибівницях з вирощування шіі-таке (рис.2). Так, серед 37 ізолятів цього роду, 26 (70,3%) належали до T. harzianum Rifai; 4 (10,8%) – до T. koningii Oudem; 2 (5,4%) – до T. viride Pers.: Fr. і по одному (2,7%) були визначені як T. citrinoviride Bissett та T. hamatum (Bon.) Bainer. Три ізоляти (8,1%) ми не змогли віднести до жодного виду (Trichoderma sp.).
Вид T. harzianum був ізольований з уражених матеріалів, зібраних з усіх семи досліджених ферм по вирощуванню шіі-таке. Це свідчить про домінування та широке розповсюдження T. harzianum у культиваційних приміщеннях досліджуваних грибівниць.
Таким чином, нами встановлено, що серед мікроміцетів, які викликають зелену плісень при вирощуванні шіі-таке, домінують представники роду Trichoderma (86%), серед яких найбільш поширений вид T. harzianum (70,3%). Це було також підтверджено результатами молекулярно-біологічного аналізу виділених ізолятів триходерми.
Біолого-екологічні особливості видів
роду Trichoderma
Вивчення фізіологічних особливостей вегетативної та генеративної фаз розвитку грибів роду Trichoderma дозволяє проводити науково обґрунтований підбір умов культивування і контролювати розвиток даного патогену.
Велике значення в біології триходерми та здатності до ураження нею субстратних блоків має притаманна їй особливість розвиватися в різному діапазоні температур. Було досліджено вплив температури на життєздатність та антагоністичну властивість збудників зеленої плісені. Спостереження за ростом та розвитком штамів T. harzianum Т5, Т10, Т13, Т19 проводили за різних температур у діапазоні від 15 до 35°С на середовищах: картопляно-глюкозному (КГА) і Чапека.
Установлено, що розвиток вищезгаданих штамів T. harzianum на обох типах середовищ можливий у широкому інтервалі температур – від 15 до 35°С з оптимальною швидкістю росту мікроміцетів у діапазоні останніх від 25 до 30°С. Склад середовища мав певний вплив на швидкість росту колоній зеленої плісені. Так, на середовищі Чапека загалом спостерігали уповільнення росту колоній усіх штамів T. порівняно з КГА. При цьому була зафіксована більша розбіжність у швидкості міцеліального росту серед даних штамів на середовищі Чапека, ніж на КГА. Це виявлялося у значному варіюванні між максимальним та мінімальним радіусами колоній. Так, при температурі 25°С радіус колоній T. harzianum Т5 на середовищі Чапека досягав 29 мм, а T. harzianum Т19 – 60,35 мм. На середовищі КГА варіювання за даної температури було незначним. Радіуси колоній усіх досліджуваних штамів за температури 25°С становили 54,0; 53,25; 55,3; 51,6 мм відповідно, з максимальною різницею 1,65 мм.
Таким чином, штами T. harzianum здатні рости в досить широкому діапазоні температур, але найінтенсивніший ріст відбувається при 25°С. Проте слід зазначити, що для T. harzianum Т10 найбільші радіуси колоній були зафіксовані при 30°С на цих середовищах (КГА та Чапека) і становили 54,4 і 64,35 мм за 72 год. відповідно. Найповільніші показники росту на обох середовищах мав штам T. Т5 за всіх досліджуваних температур. Усі інші штами триходерми змінювали свої ростові показники залежно від температури та складу середовища.
Від останнього залежала також оптимальна температура для міцеліального росту патогенів. Для штаму Т10 вона становила: на середовищі Чапека – 25°С, на КГА – 30°С, а для Т19 – відповідно 30 і 25°С; для Т13 найбільші показники росту на обох середовищах були зафіксовані при температурі 30°С.
Повний цикл розвитку штамів T. harzianum триває 3 доби. Початок різних фаз та їх тривалість у досліджених штамів має специфіку: поява ростової пори відбувається протягом 19,2-24,0 год., а масове утворення спор – через 61-72 години (при температурі 25 °С).
При дослідженні впливу джерел живлення на інтенсивність росту міцелію та спороутворення T. harzianum було встановлено, що найбільша кількість конідій утворилась на середовищі з сахарозою як єдиного джерела вуглецю (10,8х105 конідій на 1 см2 міцеліальної плівки). На середовищах з крохмалем, мальтозою і фруктозою вихід конідій був нижчим у 38-94 рази порівняно зі сахарозою. Із джерел азоту ефективним був азотнокислий натрій (10,8x105 шт./см2). Окрім нього, утворенню конідій дослідженого штаму сприяли середовища з глікоколом, аргініном і виннокислим амонієм: вихід конідій становив 2,9х105; 2х105; і 1,7х105 шт./см2 відповідно. Найменшу кількість конідій забезпечувало середовище із цистеїном як джерелом азоту. Вихід конідій при цьому був нижчий у 67 разів порівняно з азотнокислим натрієм і становив 1,6х104 шт./см2.
За результатами дослідження можна зробити висновок, що введення до складу субстрату живильних додатків, багатих на сахарозу, лактозу і глюкозу (як джерел вуглецю) та NaNO3, гістидину, аспарагіну і пептону (як джерел азоту) позитивно впливає на утворення конідій триходерми. Отже, при розробці субстратних формул з метою профілактики зеленої плісені слід уникати використання речовин, багатих на зазначені компоненти або планувати серію профілактичних заходів.
Особливості взаємовідносин in vitro
Trichoderma spp. та L. edodes
При вивченні характеру взаємовідносин штамів L. edodes і Trichoderma spp. в лабораторних і виробничих умовах було доведено, що гриби роду Тrichoderma проявляють різний ступінь антагоністичної активності стосовно міцелію їстівного культивованого гриба шіі-таке.
Результати досліджень показали, що за умов сумісного росту ізолятів Trichoderma spp. та штамів L. edodes перші виявляли антагоністичну дію лише після контакту колоній.
Згідно з нашими спостереженнями за ростом і морфологією 414 варіантів парних культур досліджуваних штамів грибів, були встановлені основні прояви взаємодії Trichoderma spp. та L. edodes. Вони характеризувались певними морфологічними ознаками колоній досліджених штамів і були розподілені за ними на три основні типи: ТВ-І, ТВ-ІІ, ТВ-ІІІ.
Тип взаємодії ТВ-І характеризувався високою антагоністичною активністю Trichoderma, яка виражалась у повному пригніченні росту колонії шіі-таке відразу ж після контакту, з наступним наростанням колонії Trichoderma на колонію L. edodes протягом 4-5 днів. У багатьох випадках міцелій триходерми утворював концентричні ростові зони з більш щільно розміщеними гіфами в зовнішніх ділянках колоній (рис. 3). У гіфах шіі-таке часто спостерігали лізис клітин.
Тип взаємодії ТВ-ІІ. При середній антагоністичній активності Trichoderma відбувався обмежений ріст L. edodes з утворенням специфічної зони пригнічення червонувато-коричневого кольору шириною 5-6 мм (рис. 4).
Для типу взаємодії ТВ-ІІІ характерна низька антагоністична активність грибів роду Trichoderma. В перші дні взаємодії між досліджуваними грибами спостерігали гальмування росту шіі-таке порівняно з контролем. Через 3-4 дні на межі контакту колоній грибів утворювались досить чіткі міцеліальні валики L. edodes, що складались із скупчення міцеліальних тяжів, якими шіі-таке продовжував свій ріст на поверхні колонії Trichoderma (рис. 5). Таким чином, міцелій шіі-таке був спроможним обмежувати ріст деяких штамів Trichoderma spp.
Найчутливішими до дії триходерми виявились штами L. edodes ІBК1627 та ІBК1628, при взаємодії з якими 90% усіх штамів Trichoderma spp. показали високу антагоністичну активність (ТВ-І). Найбільшу резистентність до дії грибів роду Trichoderma зафіксовано в таких сортів та штамів шіі-таке, як: Риф, Адмірал, ІВК , ІВК 1658.
Аналогічні результати з вивчення взаємодії різних штамів L. edodes з Trichoderma spp. також були отримані у дослідах з парною культурою на тирсовому середовищі, що відтворює умови промислового культивування шіі-таке.
Таким чином, вивчення взаємодії між культивованим грибом шіі-таке та ізолятами роду Trichoderma, виділених із різних грибівниць України, дозволило встановити найбільш агресивні штами патогену: T. harzianum (Т2, Т8, Т10, Т11, Т19), T. (Т1), T. citrinoviride (Т21) та Trichoderma sp. (T22, T24).
Спостереження за сумісним культивуванням штамів L. edodes з грибами роду Trichoderma показали, що прояви антагоністичної взаємодії двох організмів залежать від температури.
Зростанню агресивності Trichoderma spp. щодо шіі-таке в більшості випадків сприяло підвищення температури інкубації субстратних блоків з 15 до 30°С. Але також, для деяких штамів, а саме: T. hamatum Т1, T. koningii (Т3, Т18), T. harzianum (Т8, Т14) було відмічено зниження агресивності щодо L. edodes з підвищенням температури інкубації. При зміні температури в окремих випадках змінюється характер взаємовідносин між їстівним грибом і збудниками хвороби.
Вплив умов культивування на стійкість шіі-таке
до зеленої плісені
Для обмеження проростання конідій та міцеліального росту Trichoderma spp. можна використовувати природну здатність культивованих грибів шіі-таке утворювати антибіотики та екстрацелюларні ензими, за допомогою яких вони руйнують клітинні стінки патогену, що діє в синергізмі з призупиненням колонізації ним субстрату (Schrimbock M. et al., 1994). На думку Samuels G. (1996), Tsuneda A., (1993), Trichoderma spp. і L. edodes мають здатність утворювати дані сполуки in vitro з кількісною різницею між штамами, яка виникає під впливом умов навколишнього середовища.
На здатність L. edodes протистояти дії Trichoderma spp. впливає ряд факторів, які пов’язані з балансуванням між потенційними можливостями кожного антагоніста й умовами навколишнього середовища. Спроможність шіі-таке протистояти і навіть конкурувати з триходермою може бути відображенням вибору сприятливих для шіі-таке умов, таких як температура інкубації, вміст живильних домішок, рівень вологості, тривалість стерилізації субстрату, а також регулювання рівня кислотності та підбору мікроелементів.
Метою наших досліджень було виявити умови культивування, які підвищують конкурентноздатність шіі-таке щодо найбільш поширеного збудника зеленої плісені Trichoderma harzianum. Це має значення для розробки заходів захисту шіі-таке від зеленої плісені.
Установлено чітку залежність ростових параметрів міцелію L. edodes від кількості домішок у субстраті. Дані, наведені в таблиці 1, відображають значну різницю у здатності шіі-таке конкурувати з патогеном, яка залежить від вмісту живильних домішок (пшеничних висівок).
Таблиця 1 - Вплив вмісту поживних домішок (пшеничних висівок) у субстраті на конкурентну здатність L. edodes щодо T. harzianum
Вміст домішок
(пшенич. висівки), % | Швидкість наростання міцелію L. edodes, мм/добу | Ширина зони наростання міцелію
L. edodes, мм | Адмірал | ІВК 714 | ІВК 1627 | Адмірал | ІВК 714 | ІВК 1627 | 0 | 0,00 a* | 0,00 a | 0,00 | 0,00 a* | 0,00 a | 0,00 | 5 | 0,00 a | 0,00 a | 0,00 | 0,00 a | 0,00 a | 0,00 | 10 | 0,80 ±0.03 e | 0,77 ±0.02 e | 0,00 | 24,00 ±0.79 e | 23,10 ±0.65 e | 0,00
15 | 0,95 ±0.02 f | 0,93 ±0.02 f | 0,00 | 28,50 ±0.50 f | 27,90 ±0.74 f | 0,00
20 | 0,73 ±0.02 d | 0,69 ±0.03 d | 0,00 | 21,90 ±0.74 d | 20,70 ±0.84 d | 0,00 | 25 | 0,61 ±0.01 c | 0,57 ±0.02 c | 0,00 | 18,30 ±0.45 c | 17,10 ±0.74 c | 0,00
30 | 0,45 ±0.02 b | 0,40 ±0.02 b | 0,00 | 13,50 ±0.50 b | 12,00 ±0.61 b | 0,00
40 | 0,00 a | 0,00 a | 0,00 | 0,00 a | 0,00 a | 0,00
*Примітка: a, b, c, d… - пошаровий розподіл досліджуваних ознак на гомогенні групи за тестом Дункана (від меншого показника до більшого). Цифрові дані для кожного ізоляту з однаковими літерами не значно відрізняються один від одного (Р ? 0,05). Середнє п’яти повторень
Відсутність живильних домішок у субстраті або їх високий рівень (30-40%) не лише не стимулюють конкурентну здатність шіі-таке, а іноді й призводять до повного призупинення росту міцелію їстівного гриба, сприяючи тим самим росту і розвитку патогена T. harzianum. Найвищу швидкість наростання (0,80 та 0,95 мм за добу) міцелію їстівного гриба спостерігали при відносно невисоких вмістах живильних домішок – від 10 до 15% відповідно. При рівні домішок 30% швидкість росту міцелію в досліджуваних штамів шіі-таке знижується до 0,40-0,45 мм за добу. Подальше збільшення живильних домішок призвело до колонізації субстратних блоків шіі-таке зеленою плісенню.
В цих умовах майже однаково конкурентноздатними до збудника зеленої плісені були сорт шіі-таке Адмірал та штам ІВК 714, з деякою перевагою Адміралу. Штам ІВК 1627 не виявив конкурентноздатності за жодних створених умов. Тобто, підбираючи сприятливі умови культивування, необхідно також зважати й на штам культивованого гриба.
Суттєво впливає на конкурентну здатність L. edodes також вологість субстрату (табл. 2). Найвищі показники швидкості наростання та ширини зони наростання міцелію L. edodes ми спостерігали за вологості субстратних блоків у межах 50-55% залежно від штаму шіі-таке. Для штаму ІВК 714 найвища швидкість наростання була за вологості субстрату 50% (0,84 мм за добу), для сорту Адмірал – 55% (0,83 мм/добу). Із підвищенням вологості субстрату була відмічена тенденція зменшення конкурентноздатності. Штам L. edodes IBК 1627 не виявив конкурентноздатності за будь-якого значення вологості.
Таблиця 2 - Вплив вологості субстрату на конкурентну здатність
L. edodes щодо T. harzianum
Вологість
субстрату, %Швидкість наростання
міцелію L. edodes, мм/добу | Ширина зони наростання
міцелію L. edodes, мм | Адмірал | ІВК 714 | ІВК 1627 | Адмірал | ІВК 714 | ІВК 1627 | 40 | 0,58 ±0.03 c* | 0,55 ±0.05 c | 0,00 | 17,40 ±1.52 c | 16,50 ±0.87 c | 0,00 | 45 | 0,71 ±0.04 d | 0,63 ±0.04 d | 0,00 | 21,90 ±0.71 d | 18,90 ±2.07 d | 0,00 | 50 | 0,80 ±0.06 def | 0,84 ±0.05 f | 0,00 | 24,00 ±0.82 e | 25,20 ±1.15 f | 0,00 | 55 | 0,83 ±0.04 ef | 0,78 ±0.03 e | 0,00 | 24,90 ±1.43 f | 23,40 ±0.05 e | 0,00
60 | 0,78 ±0.04 de | 0,77 ±0.04 e | 0,00 | 23,40 ±1.14 e | 23,10 ±0.74 e | 0,00
65 | 0,47 ±0.03 b | 0,40 ±0.04 b | 0,00 | 14,10 ±0.74 b | 12,00 ±1.22 b | 0,00 | 70 | 0,00 a | 0,00 a | 0,00 | 0,00 a | 0,00 a | 0,00 | *Примітка: a, b, c, d… - пошаровий розподіл досліджуваних ознак на гомогенні групи за тестом Дункана (від меншого показника до більшого). Цифрові дані для кожного ізоляту з однаковими літерами не значно відрізняються один від одного (Р ? 0,05). Середнє пяти повторень
Важливе значення під час промислового вирощування грибів має рівень кислотності середовища. Регулювання рівня pH субстрату у виробничих умовах досягають внесенням карбонату кальцію (СаСО3) та сульфату кальцію (СаSO4). Дослідження показали, що середовище без додавання вищевказаних неорганічних домішок із кислотністю 5,8 відносно оптимальне для швидкості та ширини наростання шіі-таке на триходерму. При додаванні до субстрату 0,5% сульфату кальцію спостерігається підвищення швидкості ростових процесів як у сорту шіі-таке Адмірал, так й ІВК 714. Подібний процес спостерігається при наявності 2 і 4% сульфату кальцію в середовищі. Для сорту Адмірал показник швидкості наростання підвищився майже до 1 мм за добу, штам ІВК 714 засвідчив дещо менший рівень активності – 0,93 мм/добу (табл. 3). Сульфат кальцію виявився більш важливим для конкурентної здатності шіі-таке, ніж карбонат кальцію або варіант без додавання цих сполук.
Таблиця 3 - Вплив джерел кальцію на конкурентну здатність
L. edodes щодо T.
Штами
L. edodes | Джерела
кальцію | pH | Швидкість
наростання міцелію L., мм/добу | Ширина зони
наростання міцелію
L. edodes, мм
Aдмірал | Без додавання | 5,6 | 0,72 ±0.01 | b* | 21,60 ±0.42 | b
0,5% СаСО3 | 6,5 | 0,64 ±0.03 | a | 19,20 ±0.84 | a
0,5% СаSO4 | 5,4 | 0,93 ±0.02 | d | 27,90 ±0.74 | d
2% CaCO3 | 6,8 | 0,60 ±0.02 | a | 18,00 ±0.61 | a
2% CaSO4 | 5,5 | 0,99 ±0.03 | e | 29,70 ±1.1 | e
4% CaCO3 | 6,4 | 0,79 ±0.03 | c | 22,30 ±0.97 | c
4% CaSO4 | 5,7 | 1,10 ±0.08 | f | 33,00 ± 2.49 | f
ІВК 714 | Без додавання | 5,6 | 0,68 ±0.03 | c | 20,40 ±0.96 | c
0,5% СаСО3 | 6,5 | 0,59 ±0.03 | b | 17,70 ±0.84 | b
0,5% СаSO4 | 5,4 | 0,88 ±0.02 | d | 26,40 ±0.65 | d
2% CaCO3 | 6,8 | 0,51 ±0.01 | a | 15,30 ±0.45 | a
2% CaSO4 | 5,5 | 0,93 ±0.02 | e | 27,90 ±0.74 | e
4% CaCO3 | 6,4 | 0,72 ±0.03 | c | 21,50 ±0.79 | c
4% CaSO4 | 5,7 | 0,97 ±0.02 | f | 29,10 ±0.74 | f
ІВК 1627 | Без додавання | 5,6 | 0,00 | - | 0,00 | -
0,5% СаСО3 | 6,5 | 0,00 | - | 0,00 | -
0,5% СаSO4 | 5,4 | 0,00 | - | 0,00 | -
2% CaCO3 | 6,8 | 0,00 | - | 0,00 | -
2% CaSO4 | 5,5 | 0,00 | - | 0,00 | -
4% CaCO3 | 6,4 | 0,00 | - | 0,00 | -
4% CaSO4 | 5,7 | 0,00 | - | 0,00 | -
*Примітка: a, b, c, d… - пошаровий розподіл досліджуваних ознак на гомогенні групи за тестом Дункана (від меншого показника до більшого). Цифрові дані для кожного ізоляту з однаковими літерами не значно відрізняються один від одного (Р ? 0,05). Середнє пяти повторень
При вивченні впливу умов термічної обробки найвищі показники конкурентноздатності шіі-таке були відзначені за тривалості стерилізації протягом 4 годин (табл.4). Проте вони залежать не лише від умов термічної обробки, а й від сорту чи штаму L. edodes. Так, сорт шіі-таке Адмірал проявляв високий ступінь конкурентноздатності за всіх умов стерилізації. Швидкість наростання міцелію даного cорту коливалася в межах від 0,76 мм (при тривалості стерилізації 0,5 годин) до 0,99 мм (при 4-х годинах).
Отже, нашими дослідженнями встановлено, що найвищу стійкість до T. штами L. edodes проявляють при вологості субстрату 50-55%. Зниженню поширення та розвитку інфекції сприяють: стерилізація субстрату протягом 4 год., вміст пшеничних висівок у субстраті 10-15% та сульфату кальцію 2-4% (рН 5.5-5.7).
Таблиця 4 - Вплив тривалості стерилізації на конкурентну здатність
L. edodes щодо T. harzianum
Штами
L. edodes | Період
стерилізації субстрату за 120°C, год. | Швидкість наростання міцелію L. edodes, мм/добу | Ширина зони
наростання міцелію L. edodes, мм | Aдмірал | 0,5 | 0,76 ±0.01 | a* | 22,80 ±0.65 | a | 1 | 0,82 ±0.04 | b | 24,60 1.14 | b | 2 | 0,95 ±0.04 | cd | 28,50 ±0.5 | c | 4 | 0,99 ±0.02 | d | 29,70 ±0.97 | d | 6 | 0,83 ±0.04 | b | 24,90 ±0.74 | b | ІВК 714 | 0,5 | 0,38 ±0.06 | a | 14,00 | a
1 | 0,51 ±0.04 | b | 16,50 ±0.5 | b
2 | 0,63 ±0.07 | c | 18,80 ±1.1 | c
4 | 0,88 ±0.03 | e | 26,40 ±0.55 | e
6 | 0,77 ±0.03 | d | 23,10 ±1.14 | d
ІВК 1627 |
