АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ

СЕРГУТІНА СВІТЛАНА ЮРІЇВНА

УДК 615.38.382 + 576.858 + 547.869.2 + 535-31

ІНАКТИВАЦІЯ ПРОСТИХ ТА СКЛАДНИХ МОДЕЛЬНИХ ВІРУСІВ

У ПЛАЗМІ ДОНОРСЬКОЇ КРОВІ

(експериментальні дослідження)

14.01.31 – гематологія та трансфузіологія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті гематології та трансфузіології АМН України

Науковий керівник - доктор медичних наук, професор

Тимченко Анатолій Сергійович,

Інститут гематології та трансфузіології АМН України,

завідувач лабораторії проблем виробничої

трансфузіології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук,

старший науковий співробітник

Матяш Віктор Іванович,

Інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л.В.Громашевського АМН України,

головний лікар

доктор біологічних наук

Дружина Микола Олександрович,

Інститут експериментальної патології, онкології і

Радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України,

завідувач відділу радіобіології

Провідна установа - Науковий центр радіаційної медицини АМН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться „ 20 ” березня 2006 р. о 13 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 в Інституті гематології та трансфузіології АМН України за адресою: 04060, м. Київ-60, вул. М.Берлинського,12

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гематології та трансфузіології АМН України за адресою: 04060, м. Київ-60, вул. М.Берлинського,12

Автореферат розісланий „ 17 ” лютого 2006 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Г.П.Гащук

1

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Вірусна контамінація плазми донорської крові становить головну причину небезпеки гемотрансфузій внаслідок трансмісивної передачі вірусних інфекцій (Голосова Т.В. и соавт., 2003; Перехрестенко П.М. та співват., 2005). Тому пошук шляхів і методів інактивації вірусів у донорській плазмі є актуальною проблемою як у медичному, так і в соціальному аспекті (Deicamp U. et al., 1997; Голосова Т.В. и соавт., 1998; Тимченко А.С., 2000; Glynn S.А. et al., 2001; Видиборець С.В., 2002; Афонин Н.И., 2003).

Для проведення вірусінактивації плазми та її препаратів використовують наступні методи: теплову обробку (Bridonneau P. et al., 1996; Зубкова Н.В. и соавт., 2002; Ажигирова М.А. и соавт., 2004), хімічні та фізичні методи (Klein H.G. et al., 1998; Аграненко В.А. и соавт., 2002; Solheim B.G. et al., 2003; Суханов Ю.С. и соавт., 2003), поєднання фізичних і хімічних способів (Lin L. et al., 1997; van Rhenen D. et al., 2000; Corash L., 2001). Усі вищезазначені методи, які використовуються на теперішній час, недосконалі та мають обмеження. Так, тепловий метод вірусінактивації, який широко застосовується в Центрах крові при виробництві біопрепаратів із донорської плазми, не може бути використаний при отриманні специфічних гама- та макроглобулінів, оскільки теплова обробка цих препаратів різко знижує їх специфічну активність і конформує білкові молекули. Така обробка за технологією виробництва цих препаратів не допускається (Trejo S.R. et al., 2003; Ажигирова М.А. и соавт., 2004). Сольвент-детергентний метод, який широко застосовується за кордоном для знезараження плазми, на жаль, є неефективним по відношенню до простих вірусів (наприклад, гепатиту А й парвовірусу В19) і не дає гарантії повної безпеки плазми крові та її препаратів, які були знезаражені цим методом (Baudoux E. et al., 1998; Тимченко А.С. і співавт., 2001, Nifong T.P. et al., 2002).

Для інактивації простих і складних вірусів у плазмі донорської крові перспективним методом є застосування ультрафіолетового опромінення (УФО) (Elliot D.J., 1995; Карандашов В.И. и соавт., 1997). Для посилення фотобіологічного ефекту використовуються фотосенсибілізатори – хімічні речовини природного або синтетичного походження (Ben-Hur E. et al., 1997; Axarlis S. et al., 1998; Prince A.M. et al., 2000; Маковецька О.Ю. і співавт., 2001; Shuyler R., 2002). Одним із таких фотосенсибілізаторів є представник фенотиазінових барвників метиленовий синій (МС). За кордоном були проведені дослідження із використання МС та його аналогів для інактивації клітинних компонентів (еритроцитів, тромбоцитів) і плазми крові, але одержані дані представляють ноу-хау трансфузійної виробничої технології, тому неповно відображені в науковій літературі. Крім того, для опромінення фотосенсибілізованих МС зразків плазми та компонентів

крові використовувались джерела, які випромінювали видиме світло (довжини хвиль 550-700 нм) (Mohr H. et al., 1997; Skripchenko A. et al., 1997; Redecker-Klein A. et al., 1998; Wagner S.J., 2002).

2

Враховуючи вищезазначене, проблема пошуку умов і режимів, які необхідні для інактивації простих і складних вірусів у плазмі донорської крові, залишається актуальною, що й зумовило вибір теми дисертаційної роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота безпосередньо пов’язана з виконанням загальнодержавної „Програми розвитку донорства крові та її компонентів на 2002-2007 рр.” і виконувалась у рамках науково-дослідної роботи Інституту гематології та трансфузіології АМН України „Дослідження вірусінактивуючої дії ультрафіолетового опромінення і фотосенсибілізації на РНК- та ДНК-вмісні віруси в плазмі крові” (шифр АМН.Ф.03.01, № держреєстрації 0103U000682).

Мета дослідження. Вивчити механізми фотодинамічної вірусінактивуючої дії ультрафіолетового опромінення та фотосенсибілізатора метиленового синього для визначення оптимальних умов їх комбінованого застосування з метою інактивації простих і складних модельних вірусів у плазмі донорської крові.

Задачі дослідження:

1. Вивчити спектри поглинання й флуоресценції плазми донорської крові і МС для уточнення механізмів фотодинамічної вірусінактивуючої дії фотосенсибілізатора.

2. Визначити умови застосування фотосенсибілізатора МС для інактивації простих і складних модельних вірусів у плазмі донорської крові.

3. Вивчити генотоксичну дію МС в різних дозах та режимах уведення на гепатоцити експериментальних тварин (щурів).

4. Установити оптимальні дозо-часові режими УФО для вірусінактивації контамінованої модельними вірусами плазми крові людини.

5. Вивчити ступінь інактивації простих і складних модельних вірусів у плазмі донорської крові при комбінованій дії МС і УФО.

6. Визначити вплив УФО та МС окремо, а також при їх комбінованому застосуванні на електрофоретичну рухливість білків плазми крові.

7. Вивчити можливість видалення МС із фотомодифікованої вірусінактивованої донорської плазми.

8. Розробити експериментальний пристрій для проведення УФО плазми донорської крові.

Об’єкт дослідження: плазма донорської крові, модельні штами простих (віруси поліомієліту) і складних (віруси везикулярного стоматиту) вірусів, фотосенсибілізатор (МС), УФО (довжина хвилі – 254 нм).

Предмет дослідження: ефективність фотодинамічної інактивації простих і складних вірусів у плазмі крові при використанні УФО та МС.

3

Методи дослідження: спектрально-люмінесцентні (визначення спектрів поглинання, спектрів флуоресценції та збудження флуоресценції) – для уточнення механізму вірусінактивуючої дії комбінованого застосування УФО та МС; вірусологічні (титрування вірусовмісного матеріалу методом граничного розведення за цитопатичною дією на культуру клітин, метод бляшкоутворення в перещеплювальних культурах клітин під бентонітовим покриттям, реакція нейтралізації) – із метою визначення ефективності вірусінактивуючої дії фотосенсибілізатора та УФО на модельні віруси окремо та при їх комбінованому застосуванні. Для визначення генотоксичної дії МС використовувався цитогенетичний метод (ана-телофазний метод визначення хромосомних аберацій у гепатоцитах щурів). Якісну оцінку фракційного складу білків плазми крові проводили за методом електрофоретичного розділення в поліакриламідному гелі (ПААГ). Для видалення МС із фотосенсибілізованої плазми були застосовані фізичні методи (ультрафільтрація через фільтри та хроматографічне розділення за допомогою TSK-гелю). Статистична обробка результатів проведена методом варіаційної статистики з використанням критерію Стьюдента-Фішера.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в Україні обґрунтована можливість застосування МС як фотосенсибілізатора в ультрафіолетовій області світлового спектра, де він поглинає УФ-випромінювання з довжиною хвилі 220-350 нм, для проведення фотодинамічної вірусінактивації донорської плазми.

Доведена залежність вірусінактивуючої дії МС від його концентрації та терміну попередньої інкубації в контамінованій модельними вірусами донорській плазмі, а також підібрані оптимальні умови застосування фотосенсибілізатора (концентрація МС 1 ? 10-5 моль/л, тривалість попередньої інкубації – одна година) для інактивації простих і складних модельних вірусів у плазмі крові.

Визначені дозо-часові режими комбінованого застосування фотосенсибілізатора МС та УФО для проведення ефективної інактивації простих і складних модельних вірусів у плазмі крові людини, які не призводять до суттєвих змін плазмових білкових компонентів.

Вивчена генотоксична дія МС в залежності від дози й режимів уведення фотосенсибілізатора на клітини печінки лабораторних тварин (щурів) і доведена безпечність МС в концентрації, яка є ефективною для фотодинамічної вірусінактивації донорської плазми крові (1 ? 10-5 моль/л).Уперше показана висока ефективність хроматографічного методу видалення залишків МС із фотомодифікованої вірусінактивованої плазми донорської крові із застосуванням TSK-гелю марки “Toyopearl” (Японія).

Практичне значення одержаних результатів. Отримані експериментальні дані показали принципову можливість вірусінактивації донорської плазми крові при комбінованому

4

застосуванні МС і дозованого УФО, що може стати основою для розробки промислової технології інактивації вірусів у плазмі крові.

На основі отриманих даних розроблено й сконструйовано експериментальну модель “Пристрою для знезаражування рідини”, яка захищена деклараційним патентом України (декл. патент UA № 7835, МКП 7 C 02 F 1/32. Пристрій для знезаражування рідини: декл. патент UA № 7835, МКП 7 C 02 F 1/32 Тимченко А.С., Бондар В.В., Сергутіна С.Ю. (Україна); Інститут гематології та трансфузіології АМН України. - № 20041109664; Заявл. 24.11.2004; Опубл. 15.07.2005, Бюл. № 7. – 3 с), яка може бути зразком для промислового застосування.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто вивчена й проаналізована науково- патентна література за темою дослідження, визначена актуальність та ступінь вивчення проблеми, сформульовані мета й задачі роботи, підібрані методи досліджень. Автором самостійно виконані спектрально-люмінесцентні, вірусологічні дослідження, а також проведено вивчення цитогенетичної дії фотосенсибілізатора в експерименті на лабораторних тваринах (щурах). Представлені в дисертаційній роботі результати досліджень, статистична обробка, їх аналіз та інтерпретація, а також наукові виводи належать авторові.

Проведення вірусологічних досліджень було здійснено на кафедрі вірусології КМАПО ім. П.Л.Шупика МОЗ України за консультаціями к.б.н. І.І.Бойка і к.б.н. О.П.Трохименко. Вивчення генотоксичної дії МС на гепатоцити щурів виконано в лабораторії генетичної епідеміології Інституту гігієни і медичної екології ім. А.М.Марзеєва АМН України за консультацією к.м.н. Н.В.Брезицької. Визначення складу білкових фракцій плазми крові та очищення фотомодифікованої вірусінактивованої донорської плазми проведено за консультацією д.б.н. І.О.Лісняка. При виконанні спектрально-люмінесцентних досліджень автор консультувалась із к. ф.-м. н. В.В.Бондарем.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені та обговорені на Міжнародній науково-практичній конференції “Спектроскопія в спеціальних застосуваннях” (Київ, 2003), XIV Конгресі Європейського міждисциплінарного товариства гемотерапії та гемофереза (Прага, Чехія, 2003), Російській науково-практичній конференції “Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии” (Санкт-Петербург, 2004), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Биофизические и клинические эффекты ультрафиолетовой радиации” (Євпаторія, 2004), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Сучасні проблеми трансфузіології” (Харків, 2004), науково-практичній конференції „Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання” (Київ, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, з яких 4 статті – у наукових журналах та збірниках, 5 – тези доповідей. Одержано деклараційний патент України на “Пристрій для знезаражування рідини” (№ 7835).

5

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, п’яти розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел літератури (129 - російською та українською мовами, 98 - іноземних). Основний обєм дисертації викладений на 156 сторінках машинописного тексту, містить 14 таблиць і 23 рисунки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. У дослідах використовували зразки свіжозамороженої карантинізованої протягом 6 місяців донорської плазми (СЗП), яка згідно “Закону України про донорство крові та її компоненти” № 239/95-ВР від 23.06.1995, була попередньо протестована на антитіла до ВІЛ 1 і 2 типів, вірусного гепатиту С (анти-HCV), HBsAg і сифіліс та не містила вищезазначених агентів. Контамінацію донорської плазми проводили вірусовмісною рідиною з попередньо визначеною інфекційною активністю модельних простих (вірус поліомієліту (ВП), другого типу Себіна, штам Р-712, Ch, 2 ab) і складних (вірус везикулярного стоматиту (ВВС), штам Індіана) вірусів. Для культивування модельних вірусів (ВП і ВВС) використовували перещеплювану культуру клітин Нер 2 – культура клітин карциноми гортані.

Для визначення ефективності інактивації простих і складних вірусів у дослідних зразках застосовані наступні вірусологічні методи: метод титрування в перещеплюваних культурах клітин Нер 2 за бляшкоутворенням під бентонітовим покриттям за В.П.Широбоковим (1986); метод граничного (кінцевого) розведення в мікротитрувальних планшетах за цитопатичною дією (ЦПД) на культуру клітин Нер 2 (“Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита”, ВОЗ, 1998). Загалом було проведено 8564 визначень за допомогою вірусологічних методів досліджень. У досліди з використанням ВП були взяті тільки зразки донорської плазми крові, в яких за реакцією нейтралізації титр антитіл до поліовірусу не перевищував 1:2 - 1:4.

Для проведення фотосенсибілізації донорської плазми був застосований реактив МС (С16Н18ClN3S Ч 3H2O) виробництва фірми “Merck” (Німеччина) з молекулярною масою 374, із якого для досліджень готували 0,1, 0,4 і 1,0 % розчини, а також молярні - у концентраціях від 1 ? 10-1 до 1 ? 10-6 моль/л.

Дослідження фотоабсорбційних і фотолюмінесцентних властивостей плазми донорської крові й розчинів МС окремо та їх сумішей (спектри поглинання, флуоресценції та збудження флуоресценції) проводили з використанням спектрофотометрів СФ-46 (ЛОМО, Росія) і Specord UV-VIS (Карл-Цейс, Німеччина), а також спектрофлуориметра MPF-4 (Hitachi, Японія). Загалом було проведено 1362 досліди із визначення спектрів поглинання й 544 визначення спектрів

6

флуоресценції та збудження флуоресценції. За результатами спектрально-люмінесцентних досліджень розраховували коефіцієнт молярної екстинкції та товщину поглинаючого шару донорської плазми (її було враховано при розробці приладу для УФ-опромінення донорської плазми) за законом Бугера-Ламберта-Бера:

Д = lg (I0/ I) = е Ч с Ч l, (1)

де Д – оптична густина зразка;

I0 – інтенсивність падаючого випромінювання, квант/с ? см2;

I – інтенсивність випромінювання, яке пройшло через шар речовини, квант/с ? см2;

е – поглинаюча здатність речовини (молярний коефіцієнт екстинкції), л/моль ? см;

с – концентрація речовини, моль/л;

l – товщина поглинаючого шару дослідного розчину (тобто глибина проникнення випромінювання в розчин), см.

Для проведення УФ-опромінення біопроб була розроблена й сконструйована експериментальна модель “Пристрою для знезаражування рідини”, яка захищена деклараційним патентом України № 7835 (Рис. 1). Даний пристрій, на відміну від аналогів, дозволяє використовувати дозоване УФО з довжиною хвилі 254 нм. Дозу опромінення контролювали напівпровідниковим детектором (кремнієвим фотодіодом) КВАНТ-1 (Україна). Дозу УФО розраховували за формулою:

Н = Еповн Ч tопр, (2)

де Н – доза УФО біопроб, Дж;

Еповн – повна енергетична освітленість, Вт;

tопр – час опромінення, с.

Підбір доз опромінення проводили при фіксованому об’ємі плазми крові (20 мл) і заданій енергетичній освітленості (Еповн = 0,5 Вт) у місці розташування кварцової трубки. Для забезпечення ламінарного потоку плазми крові та рівномірного її опромінення пристрій був розташований вертикально, рівномірна подача плазми відбувалася через нижній патрубок за допомогою перистальтичного насоса НП-1М (Росія). Швидкість потоку плазми розраховували в залежності від дози опромінення.

Для визначення впливу факторів фотодинамічного методу вірусінактивації вивчали фракційний склад білків плазми крові дослідних зразків із використанням ПААГ. Лінійний градієнт концентрацій ПААГ у розділяючому гелі складав 7-20 %. Розділення проводили за допомогою приладу для вертикального електрофорезу фірми “Pharmacia” (Швеція).

7

Рис. 1. Експериментальна модель пристрою для знезаражування рідини.

Дослідження генотоксичної дії МС у різних дозах та режимах уведення на клітини печінки щурів лініі Вістар проводили при використанні ана-телофазного методу (Тимченко О.І., 1991). В експерименті використані 28 щурів-самців масою від 180,0 до 220,0 г, які утримувались за стандартним раціоном Інституту гематології та трансфузіології АМН України.

Досліди, що супроводжувались больовим синдромом, виконували під ефірним наркозом. Гепатектомію проводили за методикою Higgins G.M. et al. (1931). Гістологічні препарати готували за загальноприйнятою методикою (Волкова О.В. и соавт., 1982). Загалом було проаналізовано 2800 гепатоцитів у стадії ана-телофази ядерного циклу.

Видалення залишків МС із фотомодифікованої вірусінактивованої донорської плазми проводили за допомогою фільтрів фірм “Cuno” (Франція) та “Millipore” (США) із розміром пор від 0,20 до 0,45 мкм, а також за хроматографічним методом із використанням TSK-гелю “Toyopearl” марки HW-40 (“Akasaka”, Японія) із діапазоном розділення 100-10000 Д. Залишковий вміст МС у плазмі крові після його видалення визначали спектрофотометричним методом при довжині хвилі 661 нм (Метод. рекомендации, 1978).

Математичну обробку отриманих результатів проводили з використанням пакету прикладних програм “STATISTICA” на комп’ютері з програмним забезпеченням “Excel”

8

(Бойко О.В., 2004) та методів варіаційної статистики (Стрелков Р.Б., 1999). Результати аналізу вважали достовірними при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження вірусінактивуючої дії МС та УФО на контаміновану простими й складними модельними вірусами донорську плазму проводили в декілька етапів.

На першому етапі, для уточнення механізмів фотодинамічної вірусінактивації донорської плазми УФ-опроміненням, були вивчені спектри поглинання, спектри флуоресценції й збудження флуоресценції молекул білків плазми крові, а також фотосенсибілізатора МС. Проведеними дослідженнями в двох спектральних областях (короткохвильовій - 220-350 нм, УФ-область (рис. 2), і довгохвильовій - 550-700 нм, область видимого світла (рис. 3)) спектрів поглинання плазми донорської крові було встановлено, що білки плазми крові поглинають світло лише в УФ-області. При цьому спектр поглинання плазми крові (розведення 1:100) має одну широку смугу з максимумом при довжині хвилі (?) біля 290 нм (рис. 2, крива 2), утворення якої зумовлено участю в поглинанні трьох ароматичних амінокислот (триптофану, тирозину й фенілаланіну) із переважним внеском триптофану (Ю.А.Владимиров и соавт., 1989).

Механізм вірусінактивуючої дії МС як фотосенсибілізатора зумовлений його високою спорідненістю до поверхневих структур і нуклеїнових кислот вірусів (Pedrau J.R. et al., 1933). Унаслідок опромінення МС відбувається утворення синглетного (хімічно високоактивного) кисню, який є діючим фактором процесів інактивації вірусів: через окислення основ нуклеїнових кислот, переважно гуанінових, відбувається деструкція нуклеїнової кислоти вірусів, яка втрачає здібність до реплікації (Baker A. et al., 1993; Khan A.U. et al., 1995).

Аналіз отриманих даних свідчить про те, що, завдяки здатності МС поглинати УФ-випромінювання, він може виконувати функцію фотосенсибілізатора в УФ-області світлового спектра, і, тим самим, генерувати утворення хімічно активного (синглетного) кисню. Крім того, враховуючи дані наукової літератури та результати власних досліджень спектрів поглинання, спектрів флуоресценції та збудження флуоресценції плазми крові й розчинів МС окремо та їх сумішей без УФО і після УФ-обробки, було доведено, що молекули білків плазми крові та МС, які беруть участь у поглинанні УФ-випромінювання, взаємодіють між собою (це виражалось зміною як положення смуг поглинання цих речовин, так і їх інтенсивності). При цьому спостерігається передача поглиненої енергії УФ-випромінювання від молекул білків плазми донорської крові молекулам фотосенсибілізатора МС (Wagner S.J. et al., 1993; Владимиров Ю.А., 2001), що теж

9

Рис. 2. Спектри поглинання МС, плазми донорської крові та їх суміші в УФ-області спектра (200-350 нм): крива 1 – розчин МС (концентрація 2 ? 10-5 моль/л); крива 2 – плазма крові (розведення 1:100); крива 3 – суміш (плазма крові (розведення 1:100) + розчин МС (кінцева концентрація в плазмі - 1 ? 10-5 моль/л)); крива 4 – та ж суміш + УФО (доза 20 Дж); крива 5 – сума ординат кривих 1 й 2; крива 6 – суміш (плазма крові (розведення 1:60) + розчин МС (кінцева концентрація 1 ? 10-5 моль/л)); крива 7 - та ж суміш + УФО (доза 20 Дж).

призводить до утворення синглетного кисню – одного з вірусінактивуючих агентів.

Таким чином, нами було показано, що механізм фотосенсибілізуючої вірусінактивуючої дії МС обумовлений не тільки його власною здатністю поглинати енергію УФ-випромінювання, але й можливістю отримувати її від білків плазми донорської крові, які теж поглинають світло в цій області спектра.

У ході спектрально-люмінесцентних досліджень була також розрахована товщина поглинаючого шару плазми донорської крові (тобто глибина проникнення УФ-променів у плазму), яка дорівнювала ~ 100 мкм, а також підібрано діапазон робочих концентрацій МС, коли зв’язування фотосенсибілізатора з білками плазми крові найбільш ефективне.

Установлено, що для проведення фотосенсибілізації МС донорської плазми його оптимальними концентраціями є такі, що не перевищують величину 1 ? 10-5 моль/л. При збільшенні концентрації МС понад 1 ? 10-5 моль/л зростає кількість димерів фотосенсибілізатора,

10

Рис. 3. Спектри поглинання МС і суміші плазми донорської крові з фотосенсибілізатором у видимій області спектра (500-700 нм): крива 1 – розчин МС (концентрація 2 ? 10-5 моль/л); крива 2 – розчин МС (2 ? 10-5 моль/л) + УФО (доза 20 Дж); крива 3 – суміш (плазма крові (розведення 1:100) + розчин МС (кінцева концентрація - 1 ? 10-5 моль/л)); крива 4 – та ж суміш + УФО (доза 20 Дж); крива 5 – суміш (плазма крові (розведення 1:60) + розчин МС (кінцева концентрація - 2 ? 10-5 моль/л)); крива 6 - та ж суміш + УФО (доза 20 Дж).

котрі утворюються в реакційному середовищі та блокують його взаємодію з білками плазми крові (Bergmann O.K. et al., 1963).

Наступним етапом було дослідження вірусінактивуючої дії МС у залежності від концентрації та терміну попередньої його інкубації з контамінованою донорською плазмою. Для цього плазму крові людини попередньо інфікували модельними простими (ВП) і складними (ВВС) вірусами з вихідною інфекційною активністю вірусів у плазмі 6,83 lg ТЦД50/мл та 5,17 lg ТЦД50/мл відповідно. При застосуванні МС у концентраціях від 1 ? 10-3 до 1 ? 10-6 моль/л і тривалості попередньої його дії протягом трьох годин було встановлено, що найбільш ефективною по відношенню як до складних, так і простих вірусів є концентрація, яка дорівнює 1 ? 10-5 моль/л. Ступінь інактивації вірусів ВВС через 3 години після додавання МС до інфікованої плазми максимально складав 74,3 % при концентрації 1 ? 10-5 моль/л, тоді як при інших досліджених концентраціях він коливався від 42,0 до 54,9 %. Максимальне зменшення вихідної інфекційності ВП по закінченню трьох годин теж спостерігалося при вищезазначеній кінцевій концентрації МС у плазмі крові. При цьому ступінь інактивації складав 53,6 %, тоді як при інших концентраціях

11

фотосенсибілізатора він був меншим і коливався від 29,3 до 43,9 %. Крім того, було виявлено, що при збільшенні (до 1 ? 10-3 моль/л) та зменшенні (до 1 ? 10-6 моль/л) концентрації МС у плазмі крові ступінь вірусінактивації знижувався. Це пояснюється зменшенням кількості “активних” молекул фотосенсибілізатора в реакційному середовищі або через його димеризацію, або через нестачу “активних центрів” МС. При визначенні найбільш ефективного терміну попередньої інкубації фотосенсибілізатора МС із контамінованою модельними вірусами плазмою крові було встановлено, що динаміка вірусінактивації складається з двох фаз: швидкої й повільної. Тривалість швидкої фази становила одну годину, повільної – дві. Установлено, що найбільш ефективно інактивація як ВП, так і ВВС відбувалась у першу фазу: уже через одну годину інкубації контамінованої плазми з розчинами МС інфекційна активність вірусів максимально знижувалась на 41,4 % (із 6,83 до 4,00 lg ТЦД50/мл) і 48,3 % (із 5,17 до 2,67 lg ТЦД50/мл) відповідно. Протягом наступних двох годин ступінь зниження інфекційності простих вірусів у плазмі коливався від 5,0 до 12,2 %, складних вірусів – від 6,4 до 26,0 % в залежності від кінцевої концентрації фотосенсибілізатора в інфікованій вірусами донорській плазмі. Враховуючи це, в подальшому попередню інкубацію МС у плазмі крові, яка була контамінована простими та складними модельними вірусами, проводили протягом однієї години, що не суперечить даним наукової літератури (Klein-Struckmeier A. et al., 1997; Mohr H. et al., 1997; Skripchenko A. et al., 2000; Wagner S.J., 2002).

Після визначення оптимальної концентрації МС та терміну попередньої інкубації фотосенсибілізатора з інфікованою донорською плазмою було вивчено ефективність вірусінактивуючої дії дозованого УФО без додавання МС, а також після попередньої інкубації з фотосенсибілізатором протягом однієї години. Інфікування плазми крові проводили вірусовмісною рідиною, при цьому вихідна інфекційна активність для ВП у плазмі складала 6,83 lg ТЦД50/мл, для ВВС - 5,33 lg ТЦД50/мл. Вивчення дії дозованого (від 30 до 75 Дж) УФО як самостійного вірусінактивуючого агента на ступінь інактивації простих і складних вірусів у плазмі крові показало його неефективність у застосованих дозах відносно даних вірусів (рис. 4 і 5). Так, при опроміненні контамінованої ВП плазми в дозі 30 Дж інфекційна активність вірусу знижувалась на 1,33 lg ТЦД50/мл (що складає 19,4 %), тоді як при 75 Дж – на 2,50 lg ТЦД50/мл (36,6 %) (рис. 4). При УФО плазми, яка була контамінована ВВС, теж не було досягнуто повної інактивації вірусів у жодній з використаних доз (рис. 5). Навіть при опроміненні в дозі 75 Дж інфекційність ВВС зменшувалась із 5,33 до 2,83 lg ТЦД50/мл (тобто на 46,9 %).

Для дослідження ефективності вірусінактивуючої дії комбінованого застосування МС (при кінцевій концентрації 1 ? 10-5 моль/л і попередній інкубації протягом однієї години) та дозованого

УФО на прості й складні модельні віруси в плазмі крові людини були застосовані дози УФО від 30 до 75 Дж.

12

Рис. 4. Інактивація вірусу поліомієліту в плазмі донорської крові

Рис. 5. Інактивація вірусу везикулярного стоматиту в плазмі донорської крові

13

За результатами проведених досліджень установлено, що повна інактивація ВВС із вихідною інфекційною активністю 5,33 lg ТЦД50/мл спостерігалась при дозі УФО 60 Дж, тоді як інактивація ВП (із вихідною інфекційністю вірусу в плазмі крові 6,83 lg ТЦД50/мл) - при дозі 75 Дж (рис. 4 і 5).

Таким чином, проведені експериментальні дослідження показали можливість ефективної інактивації модельних простих і складних вірусів у плазмі донорської крові при комбінованому застосуванні дозованого УФО й фотосенсибілізатора МС.

Незважаючи на позитивні вищезазначені результати з фотодинамічної інактивації вірусів у плазмі, наступним етапом досліджень було визначити, чи є безпечним МС у концентрації, яка застосовується для фотодинамічної вірусінактивації донорської плазми. Виходячи з механізму дії МС (пошкоджує основи нуклеїнових кислот - ДНК або РНК), він є потенційним мутагенним фактором, який може викликати руйнування генетичного апарату клітини. Для того щоб переконатися в безпечності концентрації МС, яка використовується для фотосенсибілізації, в експерименті in vivo була вивчена генотоксична дія різних доз та режимів уведення фотосенсибілізатора на гепатоцити щурів лінії Вістар. Для цього піддослідним тваринам уводили розчини МС у дозах (від 20 до 30 мг/кг маси тіла), які дорівнювали або перевищували толерантні дози цієї речовини для щурів (Mohr H. еt al., 1995). Через 24 години по закінченню введення МС проводили часткову гепатектомію для стимулювання проліферації клітин печінки, а ще через 30 годин після первинної гепатектомії брали тканину печінки для вивчення цитогенетичних змін у гепатоцитах щурів. Результати проведених досліджень визначення генотоксичної дії фотосенсибілізатора, які наведені в таблиці, свідчать про те, що як доза введеного МС, так і кратність його застосування статистично достовірно не впливали на частоту виникнення гепатоцитів з аберантними хромосомами у всіх дослідних групах по відношенню до контролю. Враховуючи отримані дані проведених досліджень, а також те, що безпечна добова доза МС для людини складає 1-2 мг/кг (Mohr H. еt al., 1995), ми можемо стверджувати, що застосована для фотодинамічної вірусінактивації донорської плазми концентрація МС, яка дорівнює 1 ? 10-5 моль/л (тобто 3,74 мг/л), є безпечною для людини.

Важливе значення також мало визначення впливу МС і УФО на фракційний склад білків плазми крові, яке проводили з використанням електрофоретичного розділення в градієнтному ПААГ (7-20 %). Аналіз отриманих результатів свідчить про те, що як застосування МС у концентрації 1 ? 10-5 моль/л та тривалості попередньої інкубації протягом однієї години й дозованого УФО окремо, так і комбіноване їх застосування не призводило до формування агрегатів і додаткових смуг білкових молекул. Незначні зміни, які були відмічені в електрофореграмах, зумовлені природною високою рухливістю деяких плазмових пептидів (наприклад, в-ліпопротеїнів) в електричному полі, а також незначними конформаційними

14

Таблиця

Частота аберантних гепатоцитів у щурів під дією метиленового синього

Група

спостере-ження |

Кількість піддослідних щурів, шт. |

Доза МС,

мг/кг |

Кратність уведення, рази |

Період між останнім уведенням МС і первинною гепатекто-мією, години |

Кількість проаналізо-ваних ана-телофаз |

Аберантні гепатоцити *, %

(М ± m)

I (контроль) |

7 |

- |

3 |

- |

700 |

6,60 ± 0,51

II |

7 |

20 |

3 |

24 |

700 |

6,83 ± 0,48,

p > 0,05 **

III |

7 |

30 |

1 |

72 |

700 |

6,40 ± 0,51,

p > 0,05 **

IV |

7 |

20 |

1 |

168 |

700 |

7,17 ± 1,37,

p > 0,05 **

Примітки:

1. * - частка аберантних клітин на 100 гепатоцитів у стадії пізньої анафази та ранньої телофази;

2. ** - достовірність розбіжностей даних (р) по відношенню до контрольної групи спостереження.

15

змінами в лабільних білкових фракціях (б1-антитрипсін, С1-С3 компоненти комплементу). Вони не впливають на якість основних фракцій плазмових пептидів.

Таким чином, при проведенні електрофоретичних досліджень установлена відсутність впливу на білки донорської плазми факторів фотодинамічної дії (дозованого УФО й МС), які використовуються для вірусінактивації в застосованих режимах.

Для вирішення задачі щодо видалення залишків МС (кінцева концентрація 1 ? 10-5 моль/л, яка відповідає вмісту фотосенсибілізатора 3,74 мг/л) із фотомодифікованої вірусінактивованої донорської плазми було застосовано фільтрацію через префільтри (ширина пор 0,45 мкм) та стерилізуючі (ширина пор 0,20 мкм) фільтри фірм “Cuno” із зета-потенціалом і “Millipore”. Однак, незважаючи на те, що після фільтрації кількість МС у плазмі крові зменшувалась від 3,7 до 2,2- 2,7 мг/л, повністю видалити фотосенсибілізатор не вдалося. Тому, для очистки фотомодифікованої плазми крові від МС було застосовано метод колонкової хроматографії з носієм TSK-гелем “Toyopearl” марки HW-40 (“Akasaka”, Японія). Діапазон розділення речовин у цьому носії (згідно паспорта реактиву) становить 100-10000 Д, тоді як молекулярна маса МС дорівнює 374. При виконанні очистки фотомодифікованої вірусінактивованої плазми даним методом на виході з колонки отримано плазму в тому ж об’ємі, що був внесений у хроматографічну колонку. При цьому залишковий вміст МС в очищеній плазмі крові не перевищував 0,5 мг/л. Тобто, вихідна концентрація фотосенсибілізатора після процедури видалення зменшувалась у 7,4 рази.

Таким чином, було встановлено, що метод колонкової хроматографії із застосуванням TSK-гелю “Toyopearl” HW-40 дозволяє майже повністю видалити внесений у плазму крові людини для проведення фотодинамічної вірусінактивації фотосенсибілізатор МС.

Отже, в результаті проведених досліджень була доведена можливість ефективної інактивації контамінованої простими та складними модельними вірусами донорської плазми при комбінованому застосуванні дозованого УФО та фотосенсибілізатора фенотиазінового ряду МС, а також розроблена й сконструйована на цій основі експериментальна діюча модель „Пристрою для знезаражування рідини” (деклараційний патент України № 7835).

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що полягає в експериментальному визначенні режимів та умов фотодинамічного методу інактивації донорської плазми, яка контамінована модельними простими (вірус поліомієліту) і складними (вірус везикулярного стоматиту) вірусами. Показана ефективність комбінованого застосування

16

фотосенсибілізатора фенотиазінового ряду метиленового синього та дозованого ультрафіолетового опромінення з метою отримання вірусобезпечної плазми крові донорів.

2. Установлено, що інактивація простих і складних модельних вірусів у плазмі донорської крові більш ефективна при її попередній обробці фотосенсибілізатором МС у концентрації 1 ? 10-5 моль/л протягом однієї години та УФО в дозі 75 Дж.

3. Показано, що при використанні фотодинамічного способу інактивації відбувається знезараження модельних вірусів поліомієліту і везикулярного стоматиту, які були внесені в донорську плазму з кінцевою інфекційною активністю 6,83 lg ТЦД50/мл і 5,33 lg ТЦД50/мл відповідно, відбувалось при використанні фотодинамічного способу інактивації, при цьому інфекційність модельних вірусів знижується до нуля.

4. Визначено, що механізм знезаражування контамінованої донорської плазми крові при комбінованому використанні МС та УФО полягає в ультрафіолетовій активації фотосенсибілізатора, а також у фотодинамічному ефекті синергічної дії МС і УФО.

5. Показано, що інактивація простих і складних модельних вірусів за фотодинамічним методом у запропонованому режимі не викликає агрегації білків вірусінактивованої плазми крові людини.

6. Доведена відсутність генотоксичної дії фотосенсибілізатора МС у вірусінактивуючій концентрації на гепатоцити білих щурів лінії Вістар.

7. Установлено, що ефективним способом видалення фотосенсибілізатора МС із фотомодифікованої вірусінактивованої плазми крові є метод хроматографії з використанням TSK-гелю “Toyopearl” (діапазон сорбції 100-10000 Д), який дозволив у модельних умовах зменшити вміст МС у 7,4 раза (від 3,7 до 0,5 мг/л), що не перевищує безпечну для людини дозу, яка дорівнює 1-2 мг/кг маси.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Отримані експериментальні дані показали принципову можливість вірусінактивації плазми донорської крові при комбінованому застосуванні фотосенсибілізатора метиленового синього та дозованого УФ-опромінення, що може слугувати основою для розробки промислової технології інактивації вірусів у донорській плазмі і створення доповнень до існуючих регламентів виготовлення білкових препаратів на станціях переливання крові України.

Виготовлена експериментальна модель „Пристрою для знезаражування рідини” (деклараційний патент України № 7835), яка може стати основою для промислової лінії зі знезараження плазми крові людини в закладах Служби крові України та інших медичних закладах.

17

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю. Профилактика вирусных инфекций при гемотрансфузиях // Гігієна населених місць. – 2003. – Вип. 41. – С. 399-405. Здобувачем здійснено підбір та аналіз наукової літератури, проведено критичний аналіз різних способів інактивації біопрепаратів крові, здійснено порівняльний аналіз архівного матеріалу щодо ступеня вірусінактивації плазми донорської крові при її фракціонуванні за Коном та сольвент-детергентним методом.

2. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю. Безопасность гемотрансфузий: проблемы карантинизации, вирусинактивации и донорства // Укр. журнал гематології та трансфузіології. – 2003. - № 5 (3). – С. 44-49. Здобувачем проведено аналіз сучасних методів інактивації біопрепаратів крові та шляхів вирішення проблеми безпеки гемотрансфузій, проведено узагальнення архівного матеріалу визначення ступеня інактивації модельних вірусів у плазмі крові при її фракціонуванні за Коном та сольвент-детергентним методом.

3. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю., Бондар В.В. Изучение механизмов фотодинамической инактивации вирусов в плазме крови // Міжвідомчий зб. „Гематологія і переливання крові”. – Харків: “НТМТ”, 2004. – Вип. 32, т. 1. - С. 126-131. Здобувачем проведено спектрально-флуоресцентні й вірусологічні дослідження для визначення механізму фотосенсибілізуючої дії метиленового синього та ступеню вірусінактивуючої дії комбінованого застосування фотосенсибілізатора та УФО, виконано статистичний аналіз та узагальнення результатів.

4. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю., Бондар В.В., Недилько С.Г. Спектрально-люминесцентные свойства плазмы донорской крови при фотохимической инактивации вирусов // Укр. журнал гематології та трансфузіології. – 2004. - № 4 (4). – С. 31-36. Здобувачем здійснено підбір спектрально-люмінесцентних методів дослідження, визначено ступінь інактивації вірусів у плазмі крові після комбінованого застосування МС і УФО, проведено статистичний аналіз та узагальнення отриманих результатів.

5. Декл. патент UA № 7835, МКП 7 C 02 F 1/32. Пристрій для знезаражування рідини: декл. патент UA № 7835, МКП 7 C 02 F 1/32/ Тимченко А.С., Бондар В.В., Сергутіна С.Ю. (Україна); Інститут гематології та трансфузіології АМН України. - № 20041109664; Заявл. 24.11.2004; Опубл. 15.07.2005. - Бюл. № 7. – 3 с.

6. Bondar V.V., Timchenko A.S., Sergutina S.Y. Investigation of inactivation of DNA- and RNA-contained viruses in human blood plasma // Book of Abstract: International Scientific and Practical Conference. – Kyiv, 18-21 June, 2003. – P. 59.

18

7. Timchenko A.S., Lisniak I.A., Boyko I.I., Sergutina S.Y., Pogodayeva L.K. Estimation of virus inactivation efficacy by means of Cohn’s spirit fractionation and solvent-detergent method // Prague 2003 Abstract Book. E.S.F.H. 14th Congress of the Interdisciplinary European Society for Haemapheresis and Haemotherapy. – Prague, September 10-13, 2003. – P. 62.

8. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю., Бондар В.В. Изучение механизмов и эффективности вирусинактивации плазмы крови с помощью фотосенсибилизаторов и ультрафиолетового облучения // Зб. праць науково-практич. конференції „Біофізичні і клінічні ефекти УФО”. – Євпаторія, 27-28 травня, 2004 р. – С. 88-89.

9. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю., Бондар В.В. Фотодинамическая инактивация вирусов плазмы крови // Материалы Российской науч.-практич. конференции “Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии”. – Санкт-Петербург, 8-10 июня, 2004 г. – С. 162-163.

10. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю. Зависимость вирусинактивирующей активности метиленового синего от концентрации и длительности фотосенсибилизации / Матеріали науково-практичної конференції „Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання”, 13-14 жовтня, 2005 р., г. Київ. // Укр. журнал гематології та трансфузіології. – 2005. - № 4 (дод.) (5). – С. 119-120.

АНОТАЦІЯ

Сергутіна С.Ю. Інактивація простих та складних модельних вірусів у плазмі донорської крові (експериментальні дослідження). – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового