АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ

Семеняка Володимир Іванович

УДК: 616 – 005. 1 - 08 + 616 - 07

ШЛЯХИ ПІДВИЩЕННЯ РЕПРЕЗЕНТАТИВНОСТІ СКРИНІНГОВОГО ДОСЛІДЖЕННЯ КОАГУЛЯЦІЙНОГО ГЕМОСТАЗУ

14.01.31. – гематологія та трансфузіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті гематології та трансфузіології АМН України

Науковий керівник доктор медичних наук Суховій Михайло Вікторович,

Інститут гематології та трансфузіології АМН України,

завідувач відділення хірургічної гематології та

гемостазіології.

Офіційні опоненти доктор медичних наук, професор

Лановенко Іван Іванович,

завідувач лабораторії

патофізіології крові Інституту гематології та

трансфузіології АМН України

доктор біологічних наук

Платонова Тетяна Миколаївна,

старший науковий співробітник відділу структури та

функції білку Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна

НАН України.

Провідна установа Київська медична академія післядипломної освіти

ім. П.Л. Шупика МОЗ України,

кафедра гематології та трансфузіології

Захист дисертації відбудеться “_21_” __березня__ 200_6_ року о _16 00_

год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 в Інституті гематології та трансфузіології АМН України за адресою: 04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту гематології та трансфузіології АМН України (04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12).

Автореферат розісланий “_18_” __лютого__ 200_6_ року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гащук Г.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнім часом зростає кількість захворювань, при яких спостерігаються патологічні зміни системи гемостазу протромботичного або прогеморагічного характеру. Смертність від тромбоемболій становить 40-70% від загальної смертності населення. У Європі частота тромбозів глибоких вен становить 160 випадків на 100 000 населення. У Франції на 55 млн. населення щорічно відзначається 150 000 нових випадків тромбозів глибоких вен нижніх кінцівок, а у США з населенням більш 200 млн., щорічно реєструється близько 600 000 пацієнтів з венозним тромбозом. В Англії 0,9% усіх госпіталізованих умирає від тромбоемболії легеневої артерії [Bergquist D. et al., 1994; Саенко В.Ф. и др., 1997; Перехрестенко П.М., 2002; Мишалов В.Г. и др., 2002; Мостовой Ю.М. та ін., 2004]. Значною залишається і захворюваність на геморагії. Якщо їхня причина неясна і адекватна терапія неможлива, кровотеча може призвести до тяжких ускладнень, інвалідизації хворого, а в деяких випадках – до смерті пацієнта [Ljung R. et al., 1990; Суховий М.В., 2001; Папаян Л.П, 1996; Нильсен И.М., 1999; Андреєв Ю.Н., 2002].

Незважаючи на інтенсивні дослідження в галузі гемостазіології, проблема залишається невирішеною та на сьогодні з медичної перетворилася на медико-соціальну.

Диференційна діагностика порушень функціонального стану системи гемостазу за клінічними ознаками має низьку достовірність. Для встановлення діагнозу необхідно проведення низки лабораторних тестів. Актуальним лабораторний контроль є і при проведенні моніторингу за лікуванням препаратами, що впливають на систему гемостазу. Для досліджень системи гемостазу було розроблено ряд лабораторних методів. Широко застосовується двохетапний підхід. Спочатку проводиться скринінг-дослідження окремих ланок реакцій тромбоутворення або тромболізу, а при виявленні змін вивчають активність реакцій ураженої ланки [Васильев С.А., 1997; Виговська Я.І, 1997; Платонова Т.Н. та ін., 2000; Баркаган З.С., Момот А.П.,2001; Бокарев И.Н., Суховій М.В. та ін., 2002; Greaves M., Chee Y–L., 2003]. Лабораторна діагностика пов’язана з труднощами, які значно зменшують репрезентативність аналізу: 1) система гемостазу відзначається високою варіабельністю – коливання активності окремих компонентів можуть змінюватися в нормі в широких межах під впливом чинників зовнішнього та внутрішнього середовища, а тому одним з основних завдань при діагностиці гемостазіопатій є створення репрезентативних референтних груп для порівняння показників пацієнтів з нормою та визначення типу і характеру перебігу патології [Заславская Р.М., 1994; Букарева Л.В., Плющ О.П., Вдовин В.В., 1995; Полунин А.В., Коршунова Н.К., Медведев Н.В., 2002; Данилов И.П., 2003; Киселёв В.И. и др., 2003]; 2) лабораторіями часто приймається норма, що подається у довідниках або пропонується розробниками реагентів і встановлена на зразках крові представників популяції, відмінної від тієї, яка обстежується цією лабораторією; 3) почасти, особи для встановлення референтних інтервалів добираються емпірично, без урахування факторів, що можуть впливати на активність гемостатичних реакцій; 4) методи, які включаються до скринінг-коагулограми, часто мають низьку аналітичну якість, не піддаються стандартизації; активність біологічних реагентів може змінюватися в залежності від виробника та серії випуску, що при передачі результатів із однієї клініки до іншої або зміні серії реагенту, може викликати похибки інтерпретації даних [Громашевская Л.Л., 2001; Гойда Г.З. та ін., 2002; Владимирова С.Г., Тарасова Л.Н., Савиных Е.Ю., 2003; Козлов А.А. и др., 2003; Магеровський Ю.В. та ін., 2004].

Таким чином, вимоги до виконання досліджень коагуляційного гемостазу на преанaлітичному та післяаналітичному етапах аналітичної процедури не розроблені в достатній мірі, що зменшує репрезентативність скринінгу системи згортання крові. Наведене визначає актуальність проблеми і обґрунтовує вибір теми дисертаційної роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась на базі відділення хірургічної гематології та гемостазіології Інституту гематології та трансфузіології АМН України в рамках науково-дослідної роботи „Вивчити етіологічні фактори та ключові патогенетичні механізми виникнення внутрішньосудинного згортання крові” (№ державної реєстрації – 0100U002734, строки виконання – 2000-2005 рр.).

Мета роботи. Підвищити якість аналітичної процедури на преанaлітичному та післяаналітичному етапах скринінгового дослідження коагуляційної ланки системи гемостазу.

. Задачі дослідження.

1. Сформувати репрезентативну референтну групу для встановлення меж нормальних значень показників скринінгових методів дослідження коагуляційної ланки системи гемостазу.

2. Встановити доцільність використання показника концентрації середньомолекулярних пептидів у сироватці крові як додаткового критерію добору осіб у референтну групу .

3. Провести превентивний аналіз діагностичної цінності і показників якості різних методів скринінгового дослідження коагуляційної ланки системи гемостазу.

4. Визначити оптимальні умови одержання матеріалу для дослідження коагуляційної ланки системи гемостазу.

5. Розробити новий розрахунковий метод оцінки тестів скринінгової коагулограми і вивчити його інформативність при обстеженні хворих з коагулопатіями.

Об’єкт дослідження. Коагуляційна ланка системи гемостазу

Предмет дослідження. Зміни активності компонентів системи гемостазу у хворих на гемостазіопатії та у здорових осіб, методи скринінгового дослідження системи згортання крові, реагенти, які використовуються при проведенні цих досліджень.

Методи дослідження. Клінічні; клініко-лабораторні; коагулологічні, гематологічні, біохімічні; математичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження, спрямоване на підвищення діагностичної цінності скринінгової коагулограми. Проведено відбір осіб до референтної групи відповідно до вимог міжнародних організацій по контролю якості лабораторних досліджень, отримано від них біологічний матеріал - кров з урахуванням особливостей функціонування системи гемостазу та встановлено реальні межі референтних інтервалів показників скринінгової коагулограми. Результати, одержані у ході вивчення референтної групи, можуть лягти в основу поглибленого вивчення референтних інтервалів на популяційному рівні і досліджень варіабельності гемостатичних реакцій під впливом факторів зовнішнього та внутрішнього середовища. Встановлена кореляційна залежність між активністю компонентів системи гемостазу та вмістом середньомолекулярних пептидів у сироватці крові, що довело можливість застосування цього маркеру ендоінтоксикації та прихованих патологічних процесів як одного із критеріїв відбору осіб до референтної групи. Вперше був проведений превентивний аналіз методів дослідження коагуляційного гемостазу з позицій доказової медицини, що дозволило визначити оптимальну групу методів для скринінг-коагулограми. Удосконалено післяаналітичний етап досліджень системи гемостазу – запропоновано використання референтного оціночного індексу для поліпшення інтерпретації результатів лабораторних досліджень згортання крові й показана його висока ефективність у пацієнтів із гемостазіопатіями. Розроблений референтний оціночний індекс дозволяє об’єктивно виявляти зміни гемокоагуляції незалежно від активності використаного реагенту. В цілому проведені дослідження дозволили встановити основні шляхи підвищення репрезентативності скринінг-коагулограми.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлення довірчих інтервалів за результатами дослідження осіб референтної групи дозволяє збільшити репрезентативність скринінгового дослідження системи гемостазу, зменшити число діагностичних помилок і в цілому – знизити частоту ускладнень геморагофілій і тромбофілій. Одержані у ході дослідження межі нормальних значень можуть бути використані в лабораторіях, які не мають можливості самостійно формувати референтні групи за умови дотримання вимог щодо якості методів, які використовуються та правил отримання матеріалу для дослідження. Виявлені характеристики репрезентативної референтної групи можуть використовуватися лабораторіями, які обслуговують групи населення, подібні етнічно та за географічними і соціальними умовами до обстежених здорових індивідуумів. Для відбору здорових осіб доцільним є використання методу визначення концентрації середньомолекулярних пептидів. Підвищення цього показника свідчить про непридатність зразків плазми для використання в якості референтних та запобігає необґрунтованому включенню до групи здорових осіб індивідуумів з прихованими патологічними процесами. Оптимізовано підбір методів дослідження системи гемостазу для використання в практиці клініко-діагностичних лабораторій. Удосконалено методологію оцінки абсолютних показників скринінгових клотингових тестів – розроблено референтний оціночний індекс, який дозволяє нівелювати міжсерійну різницю активності реагентів. Доведено, що використання запропонованої системи правил виконання преаналітичного та постаналітичного етапів скринінгової коагулограми дозволяє зменшити величину як систематичної, так і випадкової похибки, що підвищує репрезентативність досліджень.

Результати дисертаційної роботи можуть бути впроваджені в практику клініко-діагностичних лабораторій, лабораторій науково-дослідних інститутів та інших медичних установ, у яких проводиться визначення активності реакцій гемостазу.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проаналізована наукова література та патентна інформація з проблеми діагностики порушень коагуляційного гемостазу, розроблена програма і методологія роботи, здійснено планування всіх етапів дослідження. Самостійно сформульовані мета та задачі дослідження, виконано підбір осіб до референтної групи та груп хворих з ураженнями системи гемостазу. Автор особисто провів усі подані в дисертаційній роботі лабораторні дослідження. На основі отриманих даних автором проведено аналіз, систематизацію, статистичну обробку і узагальнення отриманих даних, обґрунтовані наукові висновки і практичні рекомендації.

Усі положення, що винесені на захист, розроблені автором особисто.

Апробація результатів роботи. За матеріалами дисертації зроблено доповіді на: семінарі для молодих вчених пам’яті О. Федоровського (Київ, 1998); VI Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2002); міжнародному симпозіуму “Гемостаз: проблеми та перспективи” (Київ, 2002); засіданні Київського міського науково-медичного товариства гематологів та трансфузіологів (Київ, 2003); науково-практичній конференції “Актуальні проблеми тромбозу і порушень гемостазу в клінічній медицині” (Київ, 2003): науково-практичній конференції “Сучасні проблеми трансфузіології” (Харків, 2004); науково-практичному семінарі “Вивчення гемостазу, діагностика, лікування” на базі сьомої міжнародної спеціалізованої виставки “ІНМЕД” (Київ, 2004).

Публікації. За результатами дослідження опубліковано 10 наукових праць. З них 4 – статті в фахових виданнях, які рекомендовані ВАК України та 4 – тези доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 117 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів, розділу, в якому викладені результати власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел (173 – російською та українською мовами та 39 – іноземних). Дисертація ілюстрована 18 таблицями та 19 малюнками. Бібліографічний список, ілюстрації і таблиці займають 26 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. У розділі подано сучасні уявлення про основні механізми нормального гемостазу, влив на процеси нормального та патологічного тромботворення різних чинників внутрішнього та зовнішнього середовища та висвітлено особливості варіювання активності окремих компонентів системи гемостазу під дією цих чинників. Представлено сучасні уявлення про методи діагностики порушень гемокоагуляції та контроль якості лабораторних досліджень.

Матеріали та методи дослідження. Для досягнення мети і виконання поставлених задач досліджено 55 практично здорових осіб віком від 25 до 42 років, які склали референтну групу (30 чоловіків та 25 жінок) та 120 хворих з порушеннями системи гемостазу. Вік пацієнтів коливався від 19 до 62 років. За характером клінічних проявів хворих розподілили на 2 групи. До I були віднесені пацієнти, у яких порушення згортання крові виявлялися геморагіями (51 особа) , до II – хворі з тромбозами, тромбогеморагіями та пацієнти з високим ризиком розвитку тромботичних ускладнень (69 осіб). Пацієнтів кожної групи було розділено на три підгрупи. Групу I склали хворі на гемофілію та хворобу Віллебранда (28 осіб) – підгрупа I1, хворі на гіпофібриногенемію (12 осіб) – I2, хворі на гіпопроконвертинемією (11 осіб) – I3, а групу II – хворі з гострими тромбофлебітами глибоких і поверхневих вен (30 осіб) – II1, хворі з тромбогеморагічним синдромом (10 осіб) – II2, пацієнти з різним ризиком розвитку тромботичних ускладнень (29 осіб) – II3. У підгрупі II3 залежно від числа факторів ризику виділено 3 категорії: ІII3 – хворі з 1 фактором ризику (10 осіб); ІІII3 – з 2 факторами ризику (10 осіб); ІІІII3 – з 3 факторами ризику (9 осіб).

Матеріалом дослідження була венозна і капілярна кров. Дослідження у хворих проводилося у динаміці на фоні лікування препаратами прокоагулянтної або антикоагулянтної дії.

У роботі використані наступні методи: визначення індексу маси

тіла за Кетле; визначення протромбінового часу (ПЧ) цільної плазми (ЦП), ПЧ розведеної плазми (РП), ПЧ капілярної крові (КК) [Иванов .Е.П., 1983]; часу рекальцифікації плазми (ЧРП) [Иванов .Е.П., 1983]; активованого часу рекальцифікації плазми (АЧРП) [Баркаган З.С., Момот А.П., 2001]; парціального тромбопластинового часу (ПТЧ) [Баркаган З.С., Момот А.П., 2001]; активованого парціального тромбопластинового часу (АПТЧ) [Баркаган З.С., Момот А.П., 2001]; концентрації фібриногену (КФ) [Баркаган З.С., Момот А.П., 2001];

активності антитромбіну III (АТ III) [Баркаган З.С., Момот А.П., 2001]; індексу максимальної активності (МА) аутокоагулограми (АКТ) [Иванов .Е.П., 1983], гематокритного числа (Ht) [Базарнова М.А., Морозова В.Т., 1988], концентрації середньомолекулярних пептидів (СМП) [Копылова Т.В. и др., 2000]. Для обробки даних використовували статистичні методи [Лакин Г.Ф., 1980; Меньшиков В.В., 2002]: визначення седньоарифметичного значення (М), моди та медіани вибірки, середньоквадратичне відхилення (S), коефіцієнту варіації (CV), показників ексцесу (Е) і асиметрії (Аs); проводились порівняльний аналіз вибіркових середніх за допомогою критерію Стьюдента; кореляційний аналіз.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ, ЇХ АНАЛІЗ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Особливості преаналітичного та постаналітичного етапів

скринінгової коагулограми

Створення репрезентативної референтної групи. Добір мікродонорів для встановлення референтних інтервалів АПТЧ і ПЧ проводився серед мешканців м. Києва виходячи з визначення статусу “здоров’я” та з використанням обмежуючих критеріїв, пов'язаних з наявністю тромботичних, геморагічних проявів в анамнезі; характером харчування; руховим режимом; статтю; шкідливими звичками; етнічною приналежністю; віком. Для визначення характеристик референтної групи, добраної із застосуванням означених критеріїв, визначалися середнє значення вибірки та його похибка, мода та медіана вибірки, Аs та Е розподілу за індексом маси тіла, віком та показниками АПТЧ та ПЧЦП.

Показник Аs вибірки жінок по ІМТ склав (-) 0,09, а E дорівнював 0,88. При цьому критерій помилки асиметрії tAs < 3 і критерій помилки ексцесу tE<3. Мо та Mе становили, відповідно, 23,40 та 23,00 при середньоарифметичному значенні 22,83±0,43. Аналогічні показники в чоловіків були наступними: As = (-) 0,05, E= (-) 0,87, а tAs < 3 і tE < 3, Mo=20,80, Mе=22,39, M=22,38, m=0,17. Не дивлячись на неспівпадання значень Mо, Mе та M, результати дослідження Аs та E дозволяють припустити, що розподіл досліджуваного показника носить нормальний характер і в генеральній сукупності. При цьому лівостороння асиметрія може бути результатом впливу розповсюджених у немедичному середовищі уявлень про “здорову людину”. І у жінок, і у чоловіків спостерігався плосковершинний розподіл досліджуваного показника.

Таким чином, якщо референтні індивідууми добираються за запропонованими правилами вірогідність потрапляння у референтну зону осіб з масою тіла, яка може вплинути на результат дослідження низька. Якщо показники ексцесу і асиметрії розподілу за ІМТ у групі не свідчать на користь нормального розподілу, то таку групу не можна вважати референтною.

Показники асиметрії та ексцесу розподілу за віком осіб референтної групи, склали, відповідно, (-) 1,60 та (-) 0,87. При цьому tAs > 3, а tE < 3. При цьому M= 32,75 р., m=0,66 р. , Mo= 34,00 р., Me=33,00 р.. Це вказує, що розподіл за віком осіб у межах референтної групи не підкоряється законові Гаусса-Лапласа. Тобто, при застосуванні обмежуючих критеріїв жорсткий віковий ценз не є обов’язковим.

При аналізі розподілу показників АПТЧ і ПЧ, (n=50), встановлено, що АsАПТЧ = 0,03 (tАs< 3), EАПТВ = (-) 0,50 (tE < 3), M=39,25 с, m=0,37 с, Mo= 40,10 с, Me= 38,51 с. Аналогічні показники для розподілу значень ПЧ склали 0,10 і 0,50 (tАs < 3 і tE < 3), 16,80 с, 0,16 с, 17,30 с, 17,10 с. Отримані дані дозволяють припускати, що в генеральній сукупності розподіл досліджуваних показників носить нормальний характер. Розподіл показників АПТЧ є плосковершинним, а ПЧ - крутовершинним. Критичними значеннями для Аs і E при числі спостережень 50 і 5% рівні значимості є точки 0,53 і 0,85 [Лакин Г.Ф., 1980]. Емпірично отримані значення асиметрії й ексцесу не перевершують цих значень, що підтверджує зроблений висновок про можливий характер розподілу досліджуваних показників у генеральній сукупності. Той факт, що розподіл за АПТЧ та ПЧЦП підпорядковується закону Гаусса-Лапласа свідчить про можливість використання відносно невеликої вибірки значень і визначення меж норми за стандартною формулою L= М±2S, де L - межа референтного інтервалу, М - середнє значення вибірки [Титов В.Н., 1995].

Середньомолекулярні пептиди – критерій добору осіб у референтну групу. Для визначення прихованих патологічних процесів, які здатні впливати на активність компонентів коагуляційного гемостазу, досліджувався вміст середньомолекулярних пептидів. В процесі дослідження було встановлено, що тенденція до нормалізації показників гемостазу супроводжувалася зменшенням концентрації СМП та кількості факторів ризику розвитку ускладнень з боку системи гемостазу. В осіб референтної групи показник знаходився у межах нормальних величин і становив (0,108±0,003) у.о. Модуль коефіцієнтів кореляції між досліджуваними показниками коагуляційної ланки системи гемостазу і концентрацією СМП залежно від ризику розвитку тромботичних ускладнень у хворих групи II3 коливався від |0,78| до |1,00|. Такі значення коефіцієнтів кореляції свідчать про те, що активність реакцій протромбіназотворення збільшується з підвищенням кількості факторів ризику розвитку тромбоутворення і концентрації СМП.

Таким чином, визначення концентрації середньомолекулярних пептидів може стати ефективним скринінговим методом виявлення прихованих патологій у осіб, що формально відповідають статусові “здоров’я” при підборі референтної групи.

Превентивний аналіз якості різних методів скринінгового дослідження системи коагуляційного гемостазу. Для оцінки глибини й інтенсивності проявів хвороби використовують об’єктивну інформацію, отриману за результатами лабораторних тестів, показники яких порівнюють з референтними інтервалами. Тому проводилося визначення відмінностей між референтними інтервалами тестів визначення ЧРП, АЧРП, АПТЧ і параметра МА АКТ, відомих з літературних джерел [Иванов Е.П., 1983; Баркаган З.С., Момот А.П., 1999, 2001] і існуючих у реальних умовах лабораторії при використанні реагентів виробників, які працюють на ринку України. Результати дослідження представлені в табл. 1.

Таблиця 1

Границі нормальних значень основних скринінгових клотингових тестів, с (n=55)

Тест

Границя | ЧРП | АЧРП | АПТЧ | МА АКТ

Нижня | 68,43 | 59,75 | 34,64 | 14,10

Верхня | 107,65 | 67,90 | 43,92 | 18,63

Границями нормальних значень для методу ЧРП за даними Е.П. Іванова (1982) вважається 60,00-120,00 с. Розроблювачі цього методу (Bergergof H. D., Roca L., 1954) при дослідженні плазми 40 практично здорових осіб установили референтний інтервал у межах від 84,00 до 122,00 с. Для АЧРП нормальними вважаються значення 60,00-70,00 с, для АПТЧ (за даними розроблювачів тест-набору АПТЧ-тест фірми “Технологія - Стандарт” (Росія)) - 35,00-45,00 с, а для параметра МА аутокоагуляційного тесту (по даними розроблювачів методу Berkarda B., Derman U., Akokan G. (1964)) - 8,40-16,40 с (показники АКТ подані в секундах і відображають час утворення згустку в реакційній суміші). Велична середньоквадратичного відхилення, яка є відображенням ступеня розсіювання варіант навколо середнього, визначає розмах норми. Зменшення розсіювання нормальних величин біля середнього в тесті АЧРП порівняно з ЧРП, говорить про те, що результати дослідження часу рекальцифікації плазми залежать від рівня контактної активації при підготовці проб до аналізу. Ще більшою мірою зменшує розсіювання введення в реакційну суміш аналога 3-го фосфоліпідного фактору тромбоцитів (ФФТ3) у тесті АПТЧ.

Реакції системи коагуляційного гемостазу, у своїй більшості, є взаємодіями ензимів зі специфічними для них субстратами і носять логарифмічний характер. Так, наростання активності ФВШП із 25,00% до 100,00% відповідає скороченню часу фібринотворення в пробірці з модельною сумішшю на 29 с, а підвищення з 100,00 % до 200,00 % відповідає скороченню часу усього на 5 с. Тому похибка при оцінці референтного інтервалу може кардинально вплинути на характер лікування.

Для встановлення чутливості різних методів до змін активності факторів внутрішнього шляху протромбіназотворення проводили дослідження ЧРП, АЧРП, АПТЧ та МА АКТ у хворих підгруп I1 та II1.

Середні значення усіх тестів відрізнялися від нормальних і, на перший погляд могли б використовуватися при діагностиці порушень системи гемостазу. При цьому необхідно відмітити, що МА АКТ чутливий до зниження активності ФВШП, але модою вибірки в підгрупі I1 було число 120,00 – максимальний час, що може реєструватися при проведенні аутокоагулограми. Цей факт свідчить про те, що при виконанні тесту на визначеному рівні активності ФВШП у модельній суміші гемолізат-кальцієвий мікс + плазма фібринотворний потенціал недостатній для формування повноцінного згустку навіть у тих випадках, коли проявів спонтанної кровоточивості не спостерігається.

При дослідженні частоти потрапляння в нормальні межі завідомо патологічних значень було встановлено, що найчастіше реєструються як нормальні показники ЧРП у хворих з гіперкоагуляцією.

Для інших тестів саме результати дослідження в підгрупі I1 рідше всього попадали в зону референтних значень. Можливо, це зв’язано з відсутністю для тесту ЧРП стандартизації за контактною активацією і вмістом ФФТ3. При гіперкоагуляції в межі довірчого інтервалу контактною активацією і вмістом ФФТ3. При гіперкоагуляції в межі довірчого інтервалу найчастіше потрапляли показники ЧРП, АЧРП та МА АКТ, а найрідше АПТЧ (6,67% випадків).

Таким чином, найефективнішим методом дослідження внутрішнього шляху протромбіназотворення як у хворих з гіперкоагуляцією, так і пацієнтів з гіпокоагуляцією, є визначення активованого парціального тромбопластинового часу.

Для скринінг-дослідження зовнішнього шляху протромбіназотворення застосовують ПЧКК, ПЧРП ПЧЦП та інші модифікації методу визначення протромбінового часу. Крім того, існує декілька способів оцінки результатів дослідження ПЧ (протромбіновий час; протромбіновий індекс, нормалізоване відношення, міжнародне нормалізоване відношення та ін.).

Для характеристики тесту визначення ПЧКК проводилося встановлення кореляції показників тестів ПЧРП і ПЧЦП у здорових осіб. Коефіцієнти кореляції склали, відповідно, (-)0,30 та (-)0,17. Аналогічний показник між значеннями протромбінового часу розведеної плазми і протромбінового часу цільної плазми становить 0,72. Т.ч., результати дослідження протромбінового часу венозної крові значною мірою відповідають один одному і не відповідають ПЧКК. Обернена кореляція між цими показниками свідчить про можливість додатковою активації гемостатичних реакцій капілярної крові ще до контакту з реагентом тромбопластину та початком реєстрації часу утворення згортку.

При визначенні відтворюваності ПЧРП та ПЧЦП враховували S, СV, попереджувальний інтервал (2S) і критичний інтервал (3S) (табл. 2).

Таблиця 2

Показники відтворюваності методів визначення протромбінового часу розведений і цільної нормальної пул-плазми (n=50)

Метод

Показник | Протромбіновий час розведеної плазми | Протромбіновий час цільної плазми

Стандартне відхилення , с | 0,75 | 0,45

Коефіцієнт варіації, % | 3,90 | 2,90

Попереджувальний

інтервал, с | 1,50 | 0,90

Критичний інтервал, с | 2,25 | 1,35

Згідно до отриманих даних, кращими показники відтворюваності були в тесті визначення ПЧЦП.

Крім того, розведення досліджуваної плазми в тесті ПЧРП призводить до зсуву результатів у відношенні атестованих для даної серії тромбопластину значень. Для встановлення чутливості методів визначення ПЧРП та ПЧЦП до змін концентрації й активності коагуляційних білків проводили вивчення показників протромбінового часу при розведенні референтної пулованої плазми (РПП) виробництва фірми “Технологія-стандарт” та нормальної пулованої плазм (НПП), отриманої від 14 мікродонорів із складу осіб референтної групи Встановлено, що додаткове розведення плазми при визначенні ПЧРП знижує реальну активність коагуляційних білків і концентрацію фібриногену в реакційній суміші і призводить до скривлення каліброваної кривої для ПЧРП уже при розведенні 1/4. Для методу визначення ПЧЦП такий зсув спостерігався лише при розведенні 1/8. У пацієнтів, перебіг захворювання яких може супроводжуватися гіпофібриногенемією, використання тесту визначення ПЧРП недоцільне і може приводити до помилок трактування результатів.

Таким чином оптимальним методом визначення активності факторів зовнішнього шляху протромбіназотворення є ПЧЦП.

Усунення факторів преаналітичного етапу, що знижують репрезентативність дослідження. Для запобігання впливу порушень аналітичної процедури на преаналітичному етапі виконання коагулограми на досліджувані показники були розроблені спеціальні рекомендації з добору осіб для одержання референтного матеріалу та забору матеріалу в пацієнтів. Для вивчення впливу порушення цих правил кров набиралася в 14 здорових осіб у лабораторії клініки хірургічної гематології і гемостазіології ІГТ АМН України з дотриманням запропонованих рекомендацій і в хірургічному відділенні міської клінічної лікарні №9 в тих умовах, що дотримуються звичайно при заборі матеріалу для коагулологічних досліджень. Проводилося дослідження показників відтворюваності тестів визначення АПТЧ і ПЧЦП як найбільш чутливих до різних факторів преаналітичного етапу серед скринінгових клотингових тестів. Було встановлено, що для тесту ПЧЦП стандартне відхилення і коефіцієнт варіації при рекомендованому заборі були в 1,21 рази менш, ніж при традиційному способі одержання крові, а для АПТЧ – в 1,90 рази. Таким чином, дотримання розроблених правил дозволило значно зменшити випадкову помилку дослідження.

Створення референтного оцінного індексу скринінг-дослідження коагуляційної ланки системи гемостазу й оцінка його репрезентативності. На постаналітичному етапі дослідження на перший план виступає інтерпретація отриманих абсолютних значень в умовах, коли активність реагентів коливається від серії до серії. Для деяких коагулологічних тестів (ПЧ, тромбіновий час) розроблено спеціальні індекси, що покликані нівелювати похибку, викликану цими коливаннями. Але існуючі методи не полишені недоліків. Між тим, у статистиці часто використовуються нормалізовані значення, що визначають ступінь відхилення варіанти вибірки від середнього значення вибірки. Визначення проводять за формулою N=(xi-м)/у, де xi – значення варіанти, м – середнє вибірки, у – середньоквадратичне відхилення вибірки. При проведенні лабораторних досліджень установлюється ступінь відхилення показника від референтного інтервалу, що для більшості методів, значення яких розподіляються по гауссіані, визначають як М±2S, де M – середнє вибірки нормальних значень, S - стандартне відхилення вибірки нормальних значень. Відхилення значень від середнього референтного інтервалу R=РОІ=(xi - M)/2S, де РОІ – референтний оціночний індекс. Для тестів, у яких збільшення досліджуваного показника свідчить про зменшення активності досліджуваного параметра (наприклад, АПТЧ і ПЧ), показники РОІ множаться на (-)1. Границями норми для референтного оцінного індексу є значення від (-)1 до (+)1. У таблиці 3 подано дані дослідження активності різних тромбопластинів (Т) з оцінкою за абсолютним значенням та РОІ.

Таблиця 3

Оцінка тесту визначення ПЧ при застосуванні тромбопластинів різних виготовлювачів в осіб референтної групи і пацієнтів підгруп

I2 і II3 , M±m

Група | Референтна група n=50 | Підгрупа I2

(до початку лікування) n=11 | Підгрупа II3

(2 тиждень лікування) n=29

Спосіб

оцінки

Реагент | ПЧ, с | РОІ | ПЧ, с | РОІ | ПЧ, с | РОІ

Т1 | 16,81±

±0,22 | 0,00±

±0,08 | 30,87±

±0,74 | -5,83±

±0,27 | 22,72±

±0,39 | -2,44±

±0,22

Т2 | 14,10±

±0,29 | 0,01±

±0,09 | 18,22±

±0,41 | -5,69±

±0,18 | 15,92±

±0,21 | -2,44±

±0,11

Т3 | 18,72±

±0,30 | 0,00±

±0,08 | 49,04±

±0,91 | 5,82±

±0,41 | 32,41±

±0,62 | -2,28±

±0,26

Примітка. Різниця активності Т достовірна між усіма типами реагенту.

Встановлено, що РОІ ПЧ практично не змінювався при використанні різних тромбопластинів у хворих I2 і II2 підгруп і осіб РГ, тобто був незалежний від властивостей реагенту. При цьому РОІ адекватно відображав зміни активності дефіцитних факторів при різних порушеннях гемостазу. Деякі коливання РОІ зв’язані, швидше за все, зі ступенем відтворюваності, характерної для використаного в роботі обладнання. Аналогічно дослідженням змін РОІ ПЧ проводилося дослідження РОІ АПТЧ із використанням часткових тромбопластинів (ЧТ) різних виробників (табл. 4).

Таблиця 4

Способи оцінки тесту визначення активованого парціального протромбінового часу при застосуванні часткових тромбопластинів різних виготовлювачів в осіб референтної групи і пацієнтів підгруп I1 і II2, M±m

Група | РГ ,

n=50 | Підгрупа

I1 (до

лікування), n=28 | Підгрупа II1 (після лікування), n=30

Спосіб

оцінки

Реагент | АПТЧ,с | РОІ | АПТЧ,с | РОІ | АПТЧ,с | РОІ

ЧТ1 | 39,32±

±0,42 | 0,00±

±0,08 | 56,52±

±0,59 | -3,20±

±0,05 | 33,68±

±0,11 | 1,11±

±0,02

ЧТ2 | 30,09±

±0,31 | 0,00±

±0,09 | 43,91±

±0,47 | -3,18±

±0,02 | 25,52±

±0,12 | 1,11±

±0,02

Примітка. Різниця активності часткових тромбопластинів достовірна

Як і РОІ ПЧ, РОІ АПТЧ практично не змінювався при різних показниках активності і дисперсії, властивої тому або іншому частковому тромбопластинові.

Факторами, здатними впливати на результати РОІ є: неправильний підбір мікродонорів для встановлення границь референтних інтервалів; помилки при заборі крові; недостатня кількість практично здорових осіб, що ввійшли в референтну групу. Порушення вимог зі встановлення границь референтних інтервалів веде не тільки до неправильного розрахунку пропонованого індексу, але й до інших помилок інтерпретації результатів дослідження.

Таким чином, уведення РОІ як одного з обов’язкових параметрів для оцінки результатів скринінгових клотингових тестів буде сприяти стандартизації досліджень системи гемостазу та методів їхньої інтерпретації.

Для вивчення здатності РОІ до відображення змін активності факторів згортання при застосуванні реагентів різних виготовлювачів при моніторингу терапії антикоагулянтами непрямої дії досліджувалися зміни РОІ ПЧ у пацієнтів підгрупи II3. Було встановлено, що можливості

абсолютних показників до відображення змін активності факторів протромбінового комплексу значно нижчі, ніж у РОІ ПЧ. Так, показник ПЧ, що відзначався через 6 тижнів після початку лікування, був більшим від початкового рівня на 61,54%, а РОІ ПЧ в аналогічний період спостереження зменшувався на 160,00%. Через 12 тижнів після початку терапії різниця з попереднім періодом спостереження становила для ПЧ 1,73%, а для РОІ ПЧ - 7,69%.

Аналізуючи динаміку змін абсолютних показників АПТЧ і РОІ цього тесту необхідно відзначити, що під час лікування показник АПТЧ, вимірюваний в абсолютних значеннях, у групі хворих гемофілією змінився на 10,62%, а в наступному – ще на 1,39%. РОІ АПТЧ при цьому змінювався більш виразно: збільшившись на 34,38% і 7,14% відповідно.

У пацієнтів, що одержувала препарати антикоагулянтної дії (підгрупа II1), час згортання в тесті АПТЧ збільшувався на 15,78% у період лікування і, додатково, на 1,8% у перші терміни після його закінчення. Значення РОІ зменшувалися стосовно початкових, відповідно, на 92,98% і в наступному – ще на 12,38%.

Такі виразні зміни РОІ порівняно зі змінами абсолютних значень дозволяють поліпшити якість лабораторного моніторингу за терапією препаратами, що впливають на систему гемостазу.

Таким чином, в результаті проведених досліджень встановлено причини низької репрезентативності досліджень коагуляційного гемостазу та визначено шляхи вирішення цієї проблеми. Доведено, що використання розроблених заходів по удосконаленню процедури виконання скринінгової коагулограми на преаналітичному та постаналітичному етапах дозволяє зменшити систематичну і випадкову помилку лабораторного аналізу, оптимізувати діагностику і моніторинг коагулопатій.

ВИСНОВКИ

1. У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення та розбір причин низької репрезентативності скринінгових досліджень коагуляційного гемостазу та визначено концептуальний шлях вирішення цієї проблеми, який полягає у підвищенні якості аналітичної процедури на всіх етапах виконання аналізу. Запропоновано способи підвищення діагностичної цінності скринінгового дослідження коагуляційної ланки системи гемостазу, які включають удосконалення методології формування репрезентативної референтної групи, вибір оптимальних засобів діагностики та інтерпретації отриманих результатів.

2. Показано, що добір осіб у референтну групу повинен проводитись виходячи з визначення статусу “здоров’я”, з використанням обмежуючих критеріїв, пов’язаних із наявністю гемостазіопатій в анамнезі, характером харчування, руховим режимом, статтю, шкідливими звичками, етнічною приналежністю, віком. Встановлено, що розподіл показників індексу маси тіла та досліджуваних показників коагулограми у референтній вибірці здорових індивідуумів підпорядковується закону Гаусса-Лапласа, а розподіл за віком не підпорядковується.

3. Доведено, що для підвищення достовірності результатів досліджень коагуляційної ланки системи гемостазу лабораторії повинні самостійно проводити встановлення меж нормальних значень досліджуваних показників на представниках популяції здорових осіб, які обстежуються в цій лабораторії.

4. Встановлено кореляційну залежність між показниками активності процесів гемокоагуляції та концентрацію середньомолекулярних пептидів при збільшенні ступеня ризику розвитку ускладнень з боку системи гемостазу, що свідчить про доцільність використання досліджуваного маркеру ендотоксикозу як критерію відбору здорових індивідуумів до референтної групи.

5. Доведено, що заміна методу скринінг-коагулограми, який має високу діагностичну цінність декількома тестами з низькою діагностичною цінністю приводить до зниження репрезентативності дослідження.

6. Визначено умови спеціальної підготовки пацієнта на преанaлітичному етапі та отримання матеріалу дослідження, які мінімізують можливий вплив на систему гемостазу факторів внутрішнього і зовнішнього середовища, сприяють підвищенню репрезентативності кінцевого результату аналізу.

7. Показана доцільність застосування розробленого методу оцінки показників тестів скринінгової коагулограми - референтний оціночний індекс. Доведено інформативність індексу при діагностиці та моніторингу перебігу гемостазіопатій; його незалежність від активності реагентів.

8. Аргументована необхідність модернізації підходів до досліджень системи гемостазу яка полягає у введенні стандартів виконання преаналітичного та постаналітичного етапів аналітичної процедури в лабораторіях всіх рівнів. Основними вимогами таких стандартів має бути дотримання єдиних правил формування референтної групи, вибору методів дослідження та їх інтерпретації.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Первинний добір практично здорових осіб проводиться відповідно до загальноприйнятого статусу “здоров’я”. При доборі осіб у референтну групу необхідно враховувати критерії, пов’язані з наявністю тромботичних, геморагічних проявів в анамнезі, характером харчування, руховим режимом, статтю, шкідливими звичками, етнічною приналежністю, віком, характером розподілу показників гемостазу. Для перевірки відповідності розподілу закону Гаусса можна використовувати показники ексцесу та асиметрії. Якщо спостерігається відхилення значень скринінгових клотингових тестів від гауссіани, це вказує на неадекватність підбору референтної групи. Для скринінгових клотингових методів дослідження коагуляційної ланки системи гемостазу (крім методу визначення часу рекальцифікації плазми) референтний інтервал визначається як M±2S. Для результатів дослідження часу рекальцифікації плазми межі референтного інтервалу визначаються як M±1,96S.

2. Для виявлення прихованих патологій, що можуть впливати на активність компонентів коагуляційного гемостазу та зменшувати репрезентативність референтної групи і довірчих інтервалів рекомендується використовувати дослідження середньомолекулярних пептидів. Підвищенні концентрації цього маркеру ендотоксикозу в сироватці крові обстежуваного пацієнта є аргументом на користь виключення із референтної групи.

3. Для покращення діагностики і моніторингу порушень коагуляційного гемостазу рекомендується використовувати величину критичного інтервалу (від 2S до 3S від середнього). Входження значення в цей інтервал свідчить про високу ймовірність латентної форми захворювання. Якщо значення тестів перебувають за межами інтервалу M±3S, то вірогідність того, що вони є нормальними, низька.

4. Для поліпшення інтерпретації результатів дослідження тестів, у яких використовуються реагенти з активністю, що змінюється, рекомендується використовувати референтний оцінний індекс, що розроблений на основі методу визначення нормалізованих значень. При проведенні лабораторних досліджень установлюється ступінь відхилення показника стосовно до референтного інтервалу за формулою РОІ = R = (xi - M)/nS, де xi – показник хворого, M – середнє арифметичне вибірки нормальних значень, n – коефіцієнт, який використовується при обчисленні границь норми для даного тесту. Для АПТЧ і ПЧ для зручності оцінки напрямку реакції значення R множаться на -1 ((-)1R=РОІ. Границями норми для РОІ є значення від (-)1 до (+)1.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Суховій М.В., Стариков А.В., Семеняка В.І., Авер’янов, Є.В., Гаврилюк О.І., Баронська Л.В., Демидюк П.Ф. Залежність між рівнем ендогенної інтоксикації та активністю компонентів коагуляційного гемостазу в осіб із підвищеним ризиком тромботворення // Міжвідомчий збірник “Гематологія і переливання крові”. – Київ, 2002 – Вип. 31. – С.113-117.

Дисертантом визначалися параметри активності компонентів системи гемостазу залежно від числа факторів ризику розвитку тромботичних ускладнень, рівень середньомолекулярних пептидів, проведено статистичну обробку отриманих даних.

2. Семеняка В.И., Суховий М.В. Исследование основных показателей качества различных методов определения протромбинового времени // Український журнал гематології та трансфузіології. – 2003. – №2. – С.35-39.

Дисертантом проведено превентивний аналіз якості різних модифікацій методу визначення протромбінового часу: виконані лабораторні тести, статистична обробка та зіставлення отриманих результатів.

3. Семеняка В.И., Суховий М.В., Томилин В.В. Особенности установления референтных интервалов функционалъных методов исследования коагуляционного звена гемостаза // Міжвідомчий збірник “Гематологія і переливання крові” – Харків, 2004 – Вип. 32. – С.276-282.

Дисертантом проведено підбір осіб до референтної групи, проведено всі лабораторні дослідження, статистичну обробку отриманих даних, визначено основні критерії, які вирізняють репрезентативність цієї групи.

4. Семеняка В.І. Новий розрахунковий індекс для оцінки показників протромбінового часу та активованого парціального тромбопластинового часу // Лабораторна діагностика. – 2004. – №3. – С.50-55.

5. Суховій М.В., Семеняка В.І. Діагностична ефективність різних методів скринінгового дослідження активності факторів внутрішнього шляху протромбіназотворення при гемостазіопатіях // Літопис травматології та ортопедії. – 2003. – № 3-4. – С.61-65.

Дисертантом проведено дослідження активності протромбіназотворення за внутрішнім шляхом у хворих із