АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

ТОРЯНІК Еріка Леонідівна

УДК 615.275.4.015:547.595.6

Похідні 2-оксоіндолін-3-гліоксиловоЇ кислоти – потенційні антиГІПОКСАНТИ з антиОКСИДАНТНИМИ властивостями

14.03.05 – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано на кафедрі патологічної фізіології Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоровя України, м. Харків

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор,

заслужений діяч науки та техніки України,

Березнякова Алла Іллівна,

Національний фармацевтичний університет

МОЗ України, м. Харків

завідувач кафедри патологічної фізіології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук

Літвінова Надія Володимирівна

Інститут фармакології та токсикології АМН України,

головний науковий співробітник

доктор медичних наук, професор,

Савченкова Лариса Василівна

Луганський державний медичний

університет МОЗ України,

завідувач кафедри клінічної фармакології

Провідна установа: Національний медичний університет

ім. О.О. Богомольця МОЗ України,

кафедра фармакології з курсом клінічної фармакології

Захист відбудеться 17.01. 2007 р. о 1500 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д. 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е.Потьє, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е.Потьє, 14).

Автореферат розісланий 15.12.2006 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.26.550.01.

кандидат біологічних наук І.В. Данова

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Останніми роками накопичується багато експериментальних фактів та результатів клініко-лабораторних досліджень стану вільно-радикального перекісного окислення ліпідів (ПОЛ) при різних фізіологічних та патологічних станах – від максимального фізичного навантаження, наприклад, під час спортивних змагань, до інфаркту міокарда, променевої хвороби, раку та агональних станів (В.А. Барабой и соавт., 1997; Ю.І. Губський та ін., 2004; С.А. Строев и соавт., 2006; Т.Е. Шумилина и соавт., 2006). Будь-яке значне напруження функціонування живої системи, зумовлене впливом незвичайних за силою та тривалістю дії зовнішніх агентів, супроводжується посиленням окислювального метаболізму, збільшенням продукції активних форм кисню та активацією процесу ПОЛ, здатного подолати бар’єр антиоксидантного захисту. Таким чином, зовнішній стрес-вплив разом з внутрішніми передумовами є компонентом причинного комплексу, що детермінує розвиток активації системи ПОЛ (Е.Н. Амосова и соавт., 1999; П.А. Галенко-Ярошевский и соавт., 2000; K. Kashiwagi, 2005).

У зв’язку з необхідністю корекції даних процесів постійно проводиться пошук нових антиоксидантів та антигіпоксантів (Н.А. Горчакова і співавт., 2000; О.А. Беркович и др., 2002; И.С. Чекман и соавт., 2003; 2005).

Достатньо вивчені зміни, які відбуваються в різних системах організму при гіпоксії. Так, при цій патології встановлено підвищення інтенсивності процесів ПОЛ, утворення вільних радикалів (ВР) в мітохондріях, мембранах ендотеліальних клітин, які пошкоджують мембранні структури та роботу іонних насосів (А.В. Курята и соавт., 2004; A. Mastaloudis et al., 2006). В наслідок порушення проникності мембрани підсилюється потік кальцію усередину клітини та надходження кальцію з депо, що призводить до перевантаження кальцієм мітохондрій, подальшому роз’єднанню дихання, окислювального фосфорилювання та активації протеолітичних ферментів (А.В. Вьюшина и соавт., 2005; Т.Е. Шумилова и соавт., 2006; C. Rivera et al., 2005). Доведено, що ушкодження міокарда при гіпоксії зумовлено не тільки гіпоксією та метаболічними порушеннями в тканини серцевого м’яза, але і молекулярно-клітинними змінами, що є причиною утворення вільних радикалів при відновленні кровотоку в ішемізованому міокарді (О.В. Коркушко и соавт., 2004; Ж.А. Донина и соавт., 2005; Н.С. Меркульева и соавт., 2006). Збільшення ВР при гіпоксії характеризується різким незворотнім інгібуванням активності антиоксидантних ферментів супероксиддисмутази (СОД), каталази (КАТ) та ін. в ішемізованій тканині (Д.Э. Коржевский и соавт., 2006; С.А. Строев и соавт., 2006; B.N. Finck et al., 2002).

Таким чином, під час гіпоксії міокарду ПОЛ є наслідком “депресивного зниження вмісту кисню в сукупності з гальмуванням антиоксидантних систем” (И.С. Чекман и др., 2003; 2005;
D. Aronson et al., 2002). При цьому, відновлення кровотоку створює надлишок молекулярного кисню та порушує нормальну діяльність серцевого м’яза (И.Л. Телкова и др., 2004; К.А. Садоха, 2006; A. Janosi et al., 2003).

У міокарді, незалежно від причин виникнення гіпоксії, набувають розвитку однотипові зміни, пов’язані з дефіцитом кисню та продуктів аеробного окислення. Активізується гліколіз, підвищується концентрація пірувату і лактату в кардіоміоцитах, що зумовлює виникнення ацидозу і процесів автоокислення (Н.А. Соколова и соавт., 2002). Кардіоміоцити в цей період втрачають здатність утримувати іонний баланс і акумулюють значну кількість іонів Na+, які при реперфузії активно обмінюються на Са2+ (И.Н. Смирнова и соавт., 2006). В результаті гіпоксії та ацидозу знижується пул циклічних нуклеотидів, зменшується концентрація АДФ, відбувається відновлення дихального ланцюга та інгібіція зворотного електронного транспорту в мітохондріях (В.В. Гацура, 2004). Неповне одно- або двохвалентне відновлення кисню зумовлює “феномен втрати” – випадання його активних форм з дихального ланцюга та накопичення їх в кардіоміоцитах, незважаючи на обмеження притоку крові до серцевого м’яза. Отже, вже в перші хвилини гіпоксії необхідні препарати, які попереджають руйнування АТФ, зменшують продукцію ВР та підвищують скоротність серцевого м’яза (В.Т. Долгих, 2002; С.А. Бойцов, 2003;
L. Kritharides, et al., 2002, Ю.Н. Беленков и соавт., 2004; E.J. Schaefer et al., 2004).

Викладене зумовлює необхідність розробки нових схем лікування та способів захисту серцевого м’яза від гіпоксії (О.В. Стефанов та ін., 2002; О.О. Мойбенко та ін., 2003;
О.И. Писаренко и соавт., 2003; А.И. Мартынов, 2004). У цьому відношенні особливе значення набувають антигіпоксанти та антиоксиданти. Однак досить обмежена їх номенклатура та наявність побічних ефектів свідчать про необхідність подальшого пошуку нетоксичних та достатньо ефективних препаратів (В.В. Болотов и соавт., 1999; В.П. Черных, 2002; И.С. Чекман и др., 2003).

Перспективною щодо цього є група похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти. Гліоксилова кислота та її індольні гетероцикли малотоксичні, здатні виконувати роль антагоністів і модуляторів цАМФ та запускати каскад біохімічних перетворень різних ферментних систем
(Х.У. Садыков и др., 2001). Вони досі мало відомі і практично не вивчені. Наявність таких видів біологічної активності, як токолітична та анальгетична, у речовин цього класу (В.В. Болотов та співав., 2000) дозволяє очікувати й антиоксидантні та антигіпоксичні властивості. Дані з цього приводу в літературі відсутні, що обумовлює актуальність таких досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у рамках науково-дослідної програми Національного фармацевтичного університету “Фармакологічні дослідження біологічно-активних речовин і лікарських засобів синтетичного та природного походження, їх застосування у медичній практиці (№ держ. реєстр. 0103U000478).

Мета дослідження. Дослідити антигіпоксичні та антиоксидантні властивості нових похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти, визначити серед них найбільш ефективну сполуку та встановити її лікувально-профілактичну ефективність за умов емоційно-больовому стресі.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

1. Визначити гостру токсичність (ЛД50) для мишей 23 нових похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти;

2. Визначити антигіпоксичну дію на моделі гострої гіпоксичної гіпоксії та встановити залежність “структура-активність” в ряду похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти;

3. На етапі скринінгу виявити та відібрати для подальшого вивчення сполуку, яка проявляє виражену антигіпоксичну дію;

4. Дослідити антигіпоксичні властивості найбільш ефективної у скринінгових дослідженнях сполуки на різних моделях гіпоксичних станів у порівнянні з мексидолом;

5. Вивчити антирадикальну та антиокислювальну активність відібраної сполуки на моделях in vitro у порівнянні з антиоксидантами та мексидолом;

6. Дослідити лікувально-профілактичну ефективність оксоіндоліну за умов in vivo на моделі емоційно-больового стресу у щурів (вплив на скорочувальну функцію серця, стан гемодинаміки, енергетичний обмін міокарда, рівень процесів ПОЛ та активність ферментів антиоксидантного захисту);

7. Провести дослідження супутніх видів фармакологічної активності (протизапальна, антимікробна, діуретична) найбільш активної речовини (оксоіндоліну);

8. Вивчити загальнотоксичну дію оксоіндоліну на органи та системи організму в хронічному експерименті.

Об’єкт дослідження – 23 похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти.

Предмет дослідження – антигіпоксичні та антиоксидантні властивості похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти.

Методи дослідження – фармакологічні, токсикологічні, фізіологічні, біохімічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше доведено, що похідні 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти проявляють виражені антигіпоксичні та антиоксидантні ефекти. Встановлено, що ці сполуки належать до мало токсичних та практично нетоксичних речовин (ЛД50 при внутрішньоочеревинному введенні знаходиться в діапазоні від 400 мг/кг до 3750 мг/кг маси тіла тварин). Вперше визначено, що найбільш активна сполука (під умовною назвою оксоіндолін) у дозі 18,6 мг/кг при одноразовому профілактичному введенні за умов гемічної, нормобаричної, гіпобаричної та гістотоксичної гіпоксії (білі миші) вірогідно подовжує життя тварин у 3; 3,5; 3,1; та 4,25 рази, відповідно, і в цьому відношенні не поступається препарату порівняння мексидолу. Це свідчить про наявність у сполуки значних антигіпоксичних властивостей. За широтою терапевтичної дії оксоіндолін в 29,7 разів перевищує мексидол.

Вперше встановлено, що за умов in vitro оксоіндолін проявляє виразну антирадикальну і антиокислювальну активність, за впливом на ці показники перевершує препарат порівняння.

За умов емоційно-больового стресу оксоіндолін проявляє виразну кардіопротекторну дію: нормалізує показники електрокардіограми та гемодинаміки, значно інгібує утворення первинних, вторинних та кінцевих продуктів вільнорадикального окислення; призводить до збільшення активності ферментів антиоксидантного захисту в тканині міокарду та крові; збільшує утилізацію енергії макроергічного зв’язку міокардіальними клітинами, не викликаючи виснаження запасів макроергів, що сприяє покращанню скоротливої функції серцевого м’яза.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлена залежність “структура-активність” в ряду похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти, що дозволяє проводити цілеспрямований пошук сполук з антигіпоксичними і антиоксидантними властивостями серед її похідних. В ряду похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти виявлена сполука (умовна назва оксоіндолін), яка за антигіпоксичною активністю не поступається препарату порівняння мексидолу, але перевершує його за антиоксидантною активністю та широтою терапевтичної дії. Виявлені супутні фармакологічні ефекти оксоіндоліну: протизапальний, діуретичний та антимікробний. Оксоіндолін проявляє антигіпокcичну та антиоксидантну дію за умов емоційно-больового стресу, не справляє пошкоджуючої дії на органи і системи експериментальних тварин у хронічному експерименті, що дозволяє рекомендувати його подальше вивчення.

Матеріали дисертації впроваджено у навчальний процес і використовуються у лекційному курсі та при проведенні практичних занять на кафедрах фармакології: Луганського медичного університету, Львівського медичного університету, Запорізького медичного університету, Української медико-стоматологічної академії, Буковинського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз даних наукової літератури, відпрацьовані моделі та методи досліджень, виконано експериментальні дослідження (скринінгові дослідження антигіпоксичної та діуретичної активності, а також визначення гострої токсичності 23 похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти проведено разом з аспірантом кафедри патофізіології НФаУ Шевцовим І.І.), проведено статистичний аналіз і узагальнення результатів дослідження, сформульовано висновки, здійснено написання та оформлення дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення та висновки дисертаційної роботи оприлюднені та обговорені на V Всеукраїнській науково-практичній конференції “Клінічна фармація в Україні” (Харків, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції “Наукові дослідження – теорія та експеримент” (Полтава, 2005), VІ Національному з’їзді фармацевтів України (Харків, 2005), Міжнародній науково-практичній конференції “Розвиток наукових досліджень’2005” (Полтава, 2005), Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів “Від фундаментальних досліджень до медичної практики” (Харків, 2005), Науковій конференції молодих вчених “Актуальні проблеми геронтології та геріатрії. Пам’яті академіка В.В. Фролькіса” (Київ, 2006), ІІІ Міжнародній медико-фармацевтичній конференції студентів та молодих вчених (Чернівці, 2006), 68-ій підсумковій науково-практичній конференції молодих вчених “Актуальные проблемы клинической, экспериментальной, профилактической медицины и стоматологии” (Донецк, 2006), Х Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Харьков, 2006).

Публікації. За матеріалами дослідження опубліковано 13 наукових робіт, із них 5 статей у наукових фахових журналах, рекомендованих ВАК України, та 8 робіт у матеріалах з’їздів, конгресів та конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 179 сторінках машинопису та включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів дослідження, 7 розділів власних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих результатів, висновки, список посилань, який містить 214 джерел (149 вітчизняних, 65 зарубіжних). Робота ілюстрована 4 рисунками, 53 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експерименти виконано на 720 нелінійних білих мишах масою 18,0-20,0 г, 365 нелінійних білих щурах масою 180,0-220,0 г. Тварин отримували з віварію ЦНДЛ Національного фармацевтичного університету. Для виключення впливу сезонних та добових коливань (С.Е. Золотухин и соавт., 1991) на показники, які вивчали, основні дослідження були проведені в осінньо-зимовий період у ранкові години. Усі маніпуляції, які можуть спричиняти біль, були проведені під етамінал-натрієвим наркозом (40 мг/кг) внутрішньоочеревинно (О.В. Стефанов, 2001). Досліди здійснювали згідно з „Правилами проведення робіт з використанням експериментальних тварин” (Страсбург,1986), Наказ МОЗ УССР №32 від 22.02.88.

Об’єктами дослідження були 23 оригінальні речовини: аміди та ефіри – нові похідні 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти, синтезовані на кафедрі аналітичної хімії Національного фармацевтичного університету під керівництвом професора В.В. Болотова (рис. 1).

Гостру токсичність нових сполук вивчали на білих нелінійних мишах різної статі при внутрішньоочеревинному введенні. Розрахунок середньосмертельної дози нових похідних проводили за методом Кербера (Л.Н. Сернов, В.В. Гацура, 2000). Середньосмертельну дозу оксоіндоліну вивчали на двох видах тварин – білих нелінійних мишах масою 20,0±2,0 г і білих нелінійних щурах масою 190,0±10,0 г різної статі при внутрішньоочеревинному і внутрішньошлунковому шляхах уведення. Оцінку токсичності здійснювали за загальноприйнятою класифікацією К.К.Сидорова (1973).

(І)

(ІI)

(IІІ)

Рис. 1. Структурні формули 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти (І), амідів (ІІ) та ефірів (ІІІ)

Антигіпоксичну активність нових похідних досліджували на моделі гострої гіпоксичної гіпоксії, а оксоіндоліну – на моделях гострої гістотоксичної, гемічної, нормобаричної, гіпобаричної гіпоксій, відповідно до методичних рекомендацій (Л.Д. Лукьянова, 1990). Оцінку антигіпоксичної активності проводили за показником середньої тривалості життя експериментальних тварин за умов профілактичного введення досліджуваних сполук. У цих та більшості інших експериментів як препарат порівняння використовували відомий антигіпоксант – мексидол.

Для оцінки антирадикальної та антиокислювальної дії оксоіндоліну in vitro використовували класичні методи спектрофотометрії та біохемілюмінесценції (А.В. Арутюнян и соавт., 2000; Ю.І. Губський та співав., 2002). Антирадикальну активність вивчали на моделі взаємодії оксоіндоліну із стабільним радикалом дифенілпікрилгідразину (ДФПГ) (Ю.І. Губський та співав., 2002), здатність „перехоплювати” гідроксильні та супероксидні радикали визначали, використовуючи відповідно дезоксирибозний метод (B.Halliwell et al., J.M.C.Gutteredge et al. 1987) та реакцію перетворення адреналіну в адренохром (H.P. Misra, I. Fridovich, 1972). Антиокислювальну активність оксоіндоліну визначали у модельній системі ліпопротеїнів яєчного жовтка за інгібуванням накопичення продуктів, що реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК-активні продукти) (Г.И.Клебанов и др., 1988)., а також за показниками Fe2+ - ініційованої біохемілюмінесценції (Ю.І. Губський та співав., 2002). Для визначення стану процесів ПОЛ за умов in vivo досліджували рівень продуктів ліпопереокислення у тканині міокарду та крові щурів – кон’югованих дієнів та триєнів, ТБК-активних продуктів, шифових основ. Визначали активність ферментів антиоксидантного захисту – супероксиддисмутази (СОД) та каталази (КАТ).

Антигіпоксичну і антиоксидантну активності оксоіндоліну в дослідах in vivo вивчали за умов емоційно-больового стресу (Ф.П. Ведяев, Т.М. Воробьева, 1983). Вибір експериментальної моделі емоційно-больового стресу пов’язаний з тим, що гіпоксія викликає в міокарді активацію вільно-радикального окиснення з ушкодженням кардіоміоцитів (А.В. Арутюнян и соавт., 2000; П.Ф. Литвицкий, 2002) і змінами роботи серцевого м’яза, електричної активності серця, кардіогемодинаміки, змінами концентрації аденілових нуклеотидів і ферментів антиоксидантного захисту. У цих дослідах ефект оксоіндоліну визначали за показниками ЕКГ та гемодинаміки, за низкою показників, що характеризують стан метаболічних процесів та енергозабезпечення міокарду, а також стан процесів ПОЛ та активність ферментів антиоксидантного захисту

Антиексудативну дію оксоіндоліну вивчали на моделі гострого карагенінового запалення (Ф.П. Тринус и соавт., 1987); діуретичну – за методом Є.Б.Берхіна (1977); антимікробну активність визначали in vitro та in vivo (Г.Н. Першин, 1971; С.М. Навашин, И.П. Фомина, 1982; Н.И. Филимонова, 1999), гематологічні дослідження проводили за загальноприйнятими методами
(В.С. Камышников, 2000). Одержані результати експериментів піддавали обробці методами параметричної статистики з використанням критерію t-Ст’юдента (Л.Н. Сернов, В.В. Гацура, 2000), зміни вважали статистично вірогідними при р ? 0,05.

Результати дослідження та їх обговорення. Першим етапом нашої роботи стало вивчення гострої токсичності, антигіпоксичної дії та встановлення залежності “структура-активність” в ряду 23-х нових сполук – похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти, серед яких 13 амідів і 10 ефірів. Нами встановлено, що значення ЛД50 досліджених сполук коливалося в межах від 400 до 3750 мг/кг, що дозволяє віднести їх до малотоксичних і практично нетоксичних речовин, тобто до V та VІ класу токсичності згідно з класифікацією К.К. Сидорова (1973). Серед амідів найбільшу антигіпоксичну дію на моделі гострої гіпоксичної гіпоксії у мишей виявили сполуки під шифром 1, 6, 7, 19, 27, активність яких перевищувала препарат порівняння – мексидол (табл.1). Слід відмітити, що весь вивчений нами ряд амідів показав виразну антигіпоксичну активність та є перспективним для подальшого дослідження. При вивченні ефірів нами встановлено, що вони також мають антигіпоксичну активність і цікаві для подальшого вивчення, особливо сполуки під шифрами Е-39, 26, 1425.

При аналізі “структура-активність” в ряду похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти нами встановлено, що антигіпоксична активність залежить від природи, положення замісника і структури радикалу. Введення метильної групи в бензильний радикал призводить до підвищення антигіпоксичної активності. Таким чином, на етапі скринінгу для подальшого вивчення була відібрана сполука під шифром 27, яка проявила виразну антигіпоксичну активність на моделі гострої гіпоксичної гіпоксії та найменшу токсичність. Сполука умовно названа оксоіндоліном (рис.2).

Таблиця 1

Антигіпоксична активність нових похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти на моделі гострої гіпоксичної гіпоксії у білих щурів (n = 10)

Шифр сполуки | Середня тривалість життя, хв | Активність відносно контролю, % | Активність відносно мексидолу, % | аміди | 1 | 72±0,26 | 200 | 131*,** | 2 | 51±0,32* | 142 | 93 | 3 | 44±0,48* | 112 | 80 | 4 | 49±0,62* | 136 | 89 | 5 | 48±0,42* | 133 | 87 | 6 | 72±0,79* | 164 | 131** | 7 | 69±0,64 | 191 | 125** | 8 | 49±0,24* | 136 | 89 | 9 | 52±0,30 | 142 | 94 | 18 | 59±0,15 | 164 | 107*,** | 19 | 69±0,18* | 164 | 125** | 27 | 81±0,38 | 225 | 147** | 28 | 48±0,58* | 133 | 87 | ефіри | Е-38 | 42±0,22 | 117 | 76 | Е-39 | 68±0,28 | 189* | 127** | ЕПК | 34±0,30 | 94 | 62 | ГК | 42±0,36 | 117 | 76 | 8 | 30±0,16 | 83 | 55 | 26 | 70±0,20 | 195* | 124** | 28 | 45±0,38 | 125 | 81 | 1427 | 40±0,36 | 111 | 72 | 1407 | 48±0,68 | 133 | 87 | 1425 | 62±0,62 | 172* | 113** | Контроль | 36±0,42 | 100 | 65 | Мексидол | 55±0,52* | 153 | 100 | 2-оксоіндолін-3-гліоксилова кислота | 37±0,26 | 103 | 67 | Примітки: 1. * - р ? 0,05 по відношенню до контролю; 2. ** - р ? 0,05 по відношенню до мексидолу.

Рис. 2. Структурна формула оксоіндоліну

Значення ЕД50 оксоіндоліну, встановлене за умов внутрішньоочеревинного введення білим щурам становить 18,6 мг/кг. ЛД50 при внутрішньоочеревинному введенні білим мишам і щурам становить 1800 мг/кг і 1583 мг/кг відповідно. ЛД50 при внутрішньошлунковому введенні встановити не вдалося (ЛД50 4500 мг/кг).

Наступним етапом наших досліджень стало вивчення антигіпоксичної дії оксоіндоліну при різ-них видах експериментальних гіпоксій. Як і у скринінгових дослідженнях препаратом порівняння був обраний мексидол, який за даними літератури (Н.А. Кузнецов и соавт., 2003) проявляє виразну антигіпоксичну дію. Експериментально встановлено, що оксоіндолін нижчий за токсичністю, ніж мексидол, та перевершує його за ефективністю. Антигіпоксичний індекс, який характеризує широту терапевтичної дії, у оксоіндоліну майже у 30 разів більший, ніж у препарату порівняння (табл. 2).

Таблиця 2

Порівняльна характеристика антигіпоксичної активності оксоіндоліну при внутрішньоочеревинному введенні щурам

Досліджувана речовина | ЕД50, мг/кг | ЛД50, мг/кг | Терапевтичний індекс (ЛД50/ЕД50) | Відносний терапевтичний індекс

Оксоіндолін | 18,6 | 1583 | 85,8 | 29,7

Мексидол | 140,0 | 405 | 2,89 | 1

Як показали дослідження, оксоіндолін проявив антигіпоксичні властивості на всіх використаних моделях гострих гіпоксій: гемічній, нормобаричній, гіпобаричній, гістотоксичній (рис. 3). Його ефективність була вищою, ніж у мексидолу при гістотоксичній та гемічній гіпоксії у 1,2 і 1,3 разів відповідно (р<0,05). На моделях нормобаричної і гіпобаричної гіпоксії антигіпоксична активність досліджуваної сполуки та мексидолу практично однакова – тривалість життя експериментальних тварин становила по відношенню до контролю 244,6% і 204,1% у випадку профілактичного введення оксоіндоліну; 242,1% і 200,9% - мексидолу. Слід зазначити, що при гемічній гіпоксії спостерігали найбільш низьку антигіпоксичну активність оксоіндоліну та мексидолу – 197% і 165,9% відповідно. Отримані нами дані збігаються з результатами інших авторів стосовно мексидолу (О.М. Важнича, 2001; Н.А. Кузнецов и др., 2003; И.Н. Смирнова и соавт., 2006).

Тривалість життя експериментальних тварин при гострій гістотоксичній гіпоксії складала 327,9%, при нормобаричній гіперкапнічній гіпоксії 244,6%, при гострій гіпобаричній гіпоксії 204,1% та гострій гемічній гіпоксії 197% (контроль прийнято за 100%). При цьому профілактичне введення досліджуваної речовини подовжувало тривалість життя мишей у 2 - 3,3 рази по відношенню до контролю.

Рис. 3. Вплив профілактичного введення оксоіндоліну на тривалість життя мишей за різних видів гострих гіпоксій, %

Примітка: * - р<0,05 у порівнянні з контролем.

Відомо, що гістотоксична гіпоксія виникає внаслідок порушення в системі утилізації кисню на фоні достатнього постачання його тканинам. При цьому інгібуються ферменти біологічного окиснення, що призводить до роз’єднання окиснення і фосфорилювання та до енергетичного голодування клітин (Л.Д.Лукьянова, 2002; И.В. Зарубина, 2004; S. Bagis et al., 2005). Механізми антигіпоксичної активності мексидолу обумовлені стабілізацією біологічних мембран та енергетичного обміну клітин, активацією енергосинтезуючих функцій мітохондрій, підвищенням ефективності реакцій дихального ланцюга за рахунок сукцинату (Н.А. Кузнецов и др., 2003;
З.А. Суслина и соавт., 2003; И.Н. Смирнова и соавт., 2006). Враховуючи, що оксоіндолін і мексидол виявили високу активність на даній моделі кисневого голодування, можна припустити, що нова речовина має близькі до мексидолу механізми реалізації антигіпоксичного ефекту.

Однією з головних патогенетичних ланок гострої нормобаричної і гострої гіпобаричної гіпоксії є гіпоксемія та гіпер- чи гіпокапнія (О.М. Важнича, 2001; Н.А. Кузнецов и др., 2003;
И.Н. Смирнова и соавт., 2006). Виявлена висока активність оксоіндоліну за цих видів гіпоксій, на нашу думку, може бути пов’язана зі зменшенням чутливості тканин до нестачі кисню.

Введення метгемоглобіноутворювача при гемічній гіпоксії призводить до зниження кисневої ємності крові внаслідок нездатності метгемоглобіну транспортувати кисень (Л.Д.Лукьянова, 2002). Оскільки одним з механізмів антигіпоксичної дії мексидолу є вплив на рівень гемоглобіну крові за рахунок стабілізації біологічних мембран еритроцитів, можна зробити припущення, що ефективність оксоіндоліну, яка перевищувала таку препарату порівняння, пов’язана з аналогічним механізмом, що оптимізує клітинне дихання.

Мексидол, як вже було зазначено, проявляє не тільки антигіпоксичні, але й виразні антиоксидантні властивості. У зв’язку з цим було доцільно провести дослідження з виявлення антиоксидантних властивостей оксоіндоліну. Дослідженнями, проведеними in vitro згідно методичних рекомендацій (А.В. Арутюнян и соавт., 2000; Ю.І. Губський та співав., 2002), встановлено наявність високої антирадикальної активності оксоіндоліну на моделі його взаємодії із стабільним радикалом дифенілпікрилгідразину (ДФПГ). Так, оксоіндолін у концентрації 10-5 М вже через 10 хв знижує вихідну концентрацію ДФПГ майже на 35 %, через 60 хв – на 67 % та через 120 хв – на 76 %. За умов зазначеної моделі антирадикальна активність оксоіндоліну значно перевершує таку мексидолу, близька до показника дибунолу та дещо поступається кверцетину у еквімолярних концентраціях. Наявність високої антирадикальної активності оксоіндоліну, а саме, здатність перехоплювати гідроксильні та супероксидні радикали, було підтверджено також за умов інших моделей іn vitro; у цих дослідах активність оксоіндоліну була близькою до показника референтних речовин – етанолу, манніту (табл. 3) та відновленого глутатіону (табл.4. ) відповідно.

Таблиця 3

Здатність оксоіндоліну “вловлювати” гідроксильні радикали за дезоксирибозним методом в дослідах in vitro (n=5)

Концентрація препаратів, мкг/мл | Ступінь інгібування, %

етанол | манніт | оксоіндолін

0,10 | 38,7±4,1 | 21,6±3,6* | 34,4±2,9**

0,18 | 49,6±4,7 | 26,4±3,2* | 36,1±4,2

0,20 | 51,1±6,2 | 31,2±3,6* | 39,6±3,9

0,36 | 66,7±2,3 | 38,2±4,1* | 40,2±4,6*

0,40 | 74,5±8,1 | 43,9±6,3* | 42,8±5,5*

0,60 | 88,4±8,6 | 51,0±6,2* | 50,9±6,1*

0,80 | 91,1±8,9 | 60,2±5,2* | 58,9±7,3*

Примітки: 1. * - р0,05 по відношенню до етанолу; 2. ** - р0,05 по відношенню до манніту.

Крім того, за умов використання модельної системи ліпопротеїнів яєчного жовтка оксоіндолін інгібував утворення ТБК-активних продуктів, але дещо менше у порівнянні з іонолом.

Разом з тим, при дослідженні антиокислювальної активності, яку визначали за параметрами Fe2+ - ініційованої біохемілюмінесценції у модельній системі ліпопротеїнів яєчного жовтка, ні оксоіндолін, ні мексидол у діапазоні концентрацій 10-6 - 10-4 М не викликали вірогідних змін інтенсивності швидкого спалаху, але оксоіндолін перевершував мексидол за показником площі світлосуми реакції БХЛ. Таким чином, дослідженнями, що було проведено in vitro на декількох моделях, показано наявність у оксоіндоліну високої антирадикальної та певної антиокислювальної активності, за якими він дещо поступається антиоксидантам, але значною мірою перевершує мексидол.

Таблиця 4

Здатність оксоіндоліну “вловлювати” супероксидні радикали (in vitro, n=5)

Концентрація препаратів, мкг/мл | Ступінь інгібування, %

відновлений глутатіон (GSH) | оксоіндолін

3 | 39,1±1,4 | 34,0±1,1

5 | 51,6±1,1 | 56,4±1,2

6 | 69,9±1,2 | 64,8±1,3

12 | 86,7±1,4 | 81,5±1,2

25 | 89,8±1,5 | 83,9±1,3

50 | 92,9±1,6 | 87,0±1,4

100 | 98,9±1,8 | 92,1±1,6

Ці дані, а також результати досліджень ефективності за різних видів гострих гіпоксичних станів зумовили проведення поглиблених досліджень оксоіндоліну in vivo. Для таких експериментів було обрано модель емоційно – больового стресу у щурів, яка характеризується розвитком гіпоксії міокарду, активацією вільно-радикального окиснення з ушкодженням кардіоміоцитів (А.В. Арутюнян и соавт., 2000; П.Ф. Литвицкий, 2002), відповідними змінами роботи серцевого м’яза, електричної активності серця, кардіогемодинаміки та порушеннями метаболізму.

У цих дослідах оксоіндолін або мексидол як препарат порівняння вводили щурам з профілактичною метою (одноразово внутрішньошлунково за 2 год до початку експерименту), а при лікувальному введенні (внутрішньошлунково щодоби протягом 3 діб) у дозах ЕД50 (18,6 мг/кг маси тіла або 140 мг/кг відповідно).

Нами вивчено більш 20 показників діяльності серцевого м’яза, що характеризують його функцію та особливості метаболізму, а також стан процесів ліпопереокислення. З’ясовано, що емоційно-больовий стрес супроводжується певними змінами показників ЕКГ та гемодинаміки, біохімічними порушеннями, що свідчать про зниження інтенсивності аеробного окислення та посилення гліколітичних процесів, зменшення рівня АТФ та сумарного пулу макроергів (табл. 5), а також про посилення процесів ПОЛ у міокарді. За цих умов на 30 % знижувались показники роботи серця та індекс енергетичних витрат.

Застосування оксоіндоліну за умов емоційно-больового стресу призводить до статистично вірогідного зменшення рівнів первинних, вторинних та кінцевих продуктів вільно-радикального окислення у тканині міокарду та крові експериментальних тварин (рис. 4). У той самий час відбувається зростання активності ферментів антиоксидантного захисту. Зокрема, за 24 год після моделювання стресу активність СОД у міокарді підвищується більше ніж у 2 рази.

Таблиця 5

Вплив оксоіндоліну на показники метаболізму та енергозабезпечення міокарду у щурів через

24 год після моделювання емоційно-больового стресу (n = 6-10)

Показники | Групи тварин

Інтактні | ЕБС

(контроль) | ЕБС

+ оксоіндолін | ЕБС

+ мексидол

Вміст глікогену, мг% | 1,95 ± 0,40 | 0,87 ± 0,09* | 1,94 ± 0,16** | 1,84 ± 0,18**

Вміст молочної кислоти, мг% | 2,73 ± 0,43 | 7,88 ± 0,10* | 2,40 ± 0,41** | 2,52 ± 0,16**

Активність гліколізу, мг молочної кислоти на 1 г тканини | 0,60 ± 0,04 | 2,12 ± 0,09* | 0,52 ± 0,04** | 0,48 ± 0,02**

Активність фосфорилази, мг Рн на 1 г тканини | 1,60 ± 0,01 | 3,62 ± 0,19* | 1,59 ± 0,01** | 1,56 ± 0,02**

Активність Г-6-ФДГ, мкмоль НАДФ/мг білку •хв | 437 ± 7,1 | 892 ± 8,8* | 1859 ± 6,8** | 1436,5 ± 6,0**

Вміст АТФ, мкмоль/г тканини | 2,0 ± 0,09 | 1,35 ± 0,08* | 1,90 ± 0,03** | 1,10 ± 0,04*

Загальний вміст аденілових нуклеотидів, мкмоль/г тканини | 3,45 ± 0,12 | 2,85 ± 0,13* | 3,48 ± 0,08** | 3,00 ± 0,20

Активність Са2+-залежної АТФ-ази, мкмоль Рн/мг білку •хв | 1,87 ± 0,15 | 0,75 ± 0,13* | 1,40 ± 0,16** | 1,40 ± 0,17**

Примітки: 1.* - р ? 0,05 у порівнянні з інтактною групою, 2. ** р ? 0,05 у порівнянні з контролем.

Введення оксоіндоліну призводить також до нормалізації ЕКГ, багатьох біохімічних показників, що характеризують стан метаболічних процесів; збільшення утилізації енергії макроергічного зв’язку міокардіальними клітинами без виснаження запасів макроергів ( АТФ+АДФ+АМФ підвищувалася на 35% в порівнянні з відповідними показниками тварин без лікування).

Можна припустити, що певну позитивну роль у цих процесах відіграє зростання активності Са2+-залежної АТФ-ази (у 1,7 разів порівняно з нелікованими тваринами). За усіма дослідженими показниками оксоіндолін не поступався мексидолу, а за антиоксидантною активністю значно перевершував препарат порівняння.

Рис. 4. Вплив оксоіндоліну на вміст продуктів ПОЛ та активність СОД у міокарді щурів

через 24 год після моделювання емоційно-больового стресу

Таким чином, експериментально доведено, що лікувально – профілактичне введення оксоіндоліну за умов емоційно-больового стресу призводить до нормалізації показників скоротливої функції міокарду та гемодинаміки, сприяє кращому енергозабезпеченню міокарда, зменшенню рівня продуктів ПОЛ та підвищенню активності ферментів антиоксидантного захисту. Результати цих експериментів підтвердили наявність антигіпоксичних та антиоксидантних властивостей оксоіндоліну за умов in vivo.

Дані літератури свідчать про те, що похідні 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти мають й інші види активності (Д. Бурбулине та співавт., 1996; В.П. Черних, 1998; С.В. Ковалева, 1999; С.М. Дроговоз, 2001). Крім антигіпоксичних та антиоксидантних властивостей сполуки нами було досліджено також антиексудативну, антимікробну та діуретичну дію оксоіндоліну. Встановлено, що оксоіндолін проявляє антиексудативну (у дозі 18,6 мг/кг вірогідно зменшує на 51,1% запальний набряк у мишей у порівнянні з контролем, практично не поступаючись вольтарену), діуретичну (перевищує ефект гіпотіазиду в 1,4 рази) і антимікробну (інгібує зростання S. aureus, E. coli, B. subtilis, P. aeruginosa та сприяє більш доброякісному перебігу генералізованої гнійної інфекції).

Заключним етапом наших експериментів стало вивчення впливу оксоіндоліну на органи та системи в хронічному експерименті. Доведено, що оксоіндолін, введений внутрішньошлунково в дозах 18,6 мг/кг (ЕД50), 93 мг/кг (5 ЕД50) і 186 мг/кг (10 ЕД50) протягом 6 місяців, не справляє негативного впливу на діяльність серцево-судинної системи, функціональний стан печінки та нирок, не змінює морфологічний склад периферичної крові.

Таким чином, проведені дослідження дозволили серед 23 нових похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти відібрати сполуку (оксоіндолін), яка виявила виразні антигіпоксичні та антиоксидантні властивості. За рівнем антигіпоксичної дії вона не поступається мексидолу, а за антиоксидантною – перевершує препарат порівняння. Ще однією позитивною рисою оксоіндоліну є значно більша ніж у мексидолу широта терапевтичної дії.

ВИСНОВКИ

В роботі експериментально обґрунтовується доцільність використання нового аміду 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти як антигіпоксанта з антиоксидантними властивостями.

1. ЛД50 23 нових похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти (внутрішньошлункове введення білим мишам) коливається в межах від 400 мг/кг до 3750 мг/кг маси тіла тварин, що дозволяє, згідно класифікації К.К. Сидорова, віднести сполуки до малотоксичних та відносно безпечних речовин, тобто до V-VI класу токсичності.

2. Встановлена залежність “структура-антигіпоксична дія” в ряду похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти, яка зумовлена природою, положенням замісника і структурою радикалу. Введенням метильної групи в бензильний радикал збільшує антигіпоксичну активність речовин.

3. На етапі скринінгу виділена найбільш активна та найменш токсична сполука (умовна назва оксоіндолін), яка в умовах гемічної, нормобаричної, гіпобаричної та гістотоксичної гіпоксії (білі миші) у дозі 18,6 мг/кг (одноразове внутрішньошлункове введення) вірогідно подовжує тривалість життя тварин у 3; 3,5; 3,1 та 4,25 рази, відповідно, і в цьому відношенні не поступається препарату порівняння мексидолу, що свідчить про наявність у сполуки значних антигіпоксичних властивостей. За широтою терапевтичної дії оксоіндолін в 29,7 разів перевищує мексидол.

4. Оксоіндолін проявляє виражену антирадикальну і антиокислювальну активність за умов in vitro: на 56% інгібує перетворення адреналіну в адренохром, не поступаючись препарату порівняння – відновленому глутатіону, на 66% зменшує рівень ТБК-активних продуктів у модельній системі ліпопротеїдів яєчного жовтка; на моделі взаємодії із стабільним радикалом дифенілпікрилгідразину перевершує антирадикальну активність мексидолу, але поступається іонолу у еквімолярних концентраціях.

5. За умов емоційно-больового стресу оксоіндолін при профілактичному введенні (18,6 мг/кг одноразово внутрішньошлунково) за 2 год до початку експерименту попереджує, а при лікувальному введенні (внутрішньошлунково щодоби протягом 3 діб) нормалізує показники електрокардіограми, знижує рівень первинних, вторинних та кінцевих продуктів вільнорадикального окислення у гомогенатах серцевого м’яза та крові (на 50 – 70 %) у порівнянні з контрольною групою тварин; сприяє підвищенню більш ніж у 2 рази супероксиддисмутазної активності; збільшує утилізацію енергії макроергічного зв’язку міокардіальними клітинами, не викликаючи виснаження запасів макроергів ( АТФ+АДФ+АМФ підвищується на 35% у порівнянні з показниками у тварин без лікування); у 1,7 разів збільшує активність Са2+-залежної АТФ-ази, що, в цілому, покращує скоротливу функцію серцевого м’яза.

6. Оксоіндоліну притаманні супутні ефекти: антиексудативний (вірогідно зменшує запальний набряк у мишей стосовно контролю на 51,1%, практично не поступаючи вольтарену), діуретичний (на рівні гіпотіазиду) і антимікробний (інгібує ріст S. aureus, E. coli, B. subtilis, P. aeruginosa та сприяє більш доброякісному перебігу генералізованої гнійної інфекції).

7. У хронічному експерименті оксоіндолін, застосований внутрішньошлунково у дозах 18,6 мг/кг (ЕД50), 5 ЕД50 (93 мг/кг) і 10 ЕД50 (186 мг/кг) протягом 6 місяців, не справляє негативного впливу на функціональний стан центральної нервової системи, діяльність серцево-судинної системи, функції печінки та нирок, не змінює морфологічний склад периферичної крові.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Пошук серед похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти сполук з діуретичною дією / Торянік Е.Л., Шевцов І.І., Березнякова М.Є., Болотов В.В., Колісник С.В. // Клінічна та експериментальна патологія. – 2005. – Т.ІV, №3. – С.95-97 (дисертантом проведено експериментальні дослідження щодо амідів 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти, підготовлено матеріал до друку).

2. Порівняльна оцінка антигіпоксичної активності аміду і ефіру в ряду нових похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти / Торянік Е.Л., Шевцов І.І., Березняков В.І., Колісник С.В. // Клінічна та експериментальна патологія. – 2005. – Т. ІV, №4. – С.83-85 (дисертантом проведено експериментальні дослідження щодо амідів 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти, статистичне опрацювання результатів).

3. Антиоксидантна активність нового похідного 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти / Торянік Е.Л., Березнякова М.Є., Шевцов І.І., Болотов В.В., Колісник С.В. // Проблеми екології та медицини. – 2005. – Т.9, №3-4. – С.14-16 (дисертантом проведено огляд літератури).

4. Фармакологічна дія аміду 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти / Торянік Е.Л., Березнякова М.Є., Шевцов І.І., Болотов В.В., Колісник С.В. // Проблеми екології та медицини. – 2005. – Т.9, №5-6. – С.6-7 (дисертантом проведено експериментальні дослідження щодо амідів 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти, статистичну обробку і аналіз отриманих результатів, підготовлено матеріал до друку).

5. Зв’язок “структура-дія-активність” в ряду похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти / Торянік Е.Л., Шевцов І.І., Березняков В.І., Колісник С.В. // Медична хімія. – 2006. - №1. – С.67-71. (дисертантом проведено дослідження щодо амідів 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти, статистичне опрацювання результатів досліджень, підготовлено матеріал до друку).

6. Поиск веществ, влияющих на мочевыделительную функцию почек, среди производных 2-оксоиндолов / Торяник Э.Л., Березнякова М.Е., Болотов В.В, Шевцов И.И., Колесник С.В. // Мат. V Всеукр. науково-практ. конф. “Клінічна фармація в Україні”. – Харків, 2005. – С.83.

7. Поиск субстанций, проявляющих антигипоксическую активность, в ряду производных 2-оксоиндолов / Торяник Э.Л., Березнякова М.Е., Болотов В.В., Шевцов И.И., Колесник С.В. // Мат. V Всеукр. науково-практ. конф. “Клінічна фармація в Україні”. – Харків, 2005. – С.82.

8. Гостра токсичність похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти / Торянік Е.Л., Шевцов І.І., Колісник С.В., Березнякова М.Є., Болотов В.В. // Мат. VІ Національного з’їзду фармацевтів України “Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України”. – Харків, 2005. – С.628.

9. Торянік Е.Л., Шевцов І.І. Антимікробна активність нових похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти // Мат. 68 итоговой науч.-практ. конф. молодых ученых “Актуальные проблемы клинической, экспериментальной, профилактической медицины и стоматологии”. – Донецк, 2006. – С.141-142.

10. Торянік Е.Л., Шевцов І.І., Березняков В.І. Антигіпоксична активність нових похідних 2-оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти у різних вікових групах // Мат. наук. конф. молодих учених “Актуальні проблеми геронтології та