ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
ТЕРЕНЕЦЬКА ІРИНА ПАЛЛАДІЇВНА
УДК 541.141:621.375.826
CпектроскопІя ТА лазерна фотохІмІя
провІтамІнУ D
01. 04. 05 - оптика, лазерна фізика
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеню
доктора фізико-математичних наук
Київ 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті фізики Національної Академії наук України
Науковий консультант: доктор фізико-математичних наук, професор,
член-кореспондент НАН України
Соскін Марат Самуїлович
Інститут фізики НАН України,
завідуючий відділом оптичної квантової електроніки
Офіційні опоненти: доктор фізико-математичних наук, професор
Ящук Валерій Миколайович
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
завідуючий кафедрою експериментальної фізики
доктор фізико-математичних наук, професор
Харкянен Валерій Миколайович
Інститут фізики НАН України,
завідуючий відділом фізики біологічних систем
доктор фізико-математичних наук, професор
Фекешгазі Іштван Вінцеєвич
Інститут фізики напівпровідників імені В.Є.Лашкарьова НАН України,
завідуючий лабораторією нелінійних оптичних систем
Провідна установа: Інститут теоретичної фізики
імені М.М. Боголюбова НАН України, м. Київ.
Захист відбудеться “_23_ “ жовтня 2006 р. о 1430 на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.23 в Київському національному
університеті імені Тараса Шевченка за адресою:
03680, м. Київ, проспект Академіка Глушкова 2, корп. 1, ауд. 200.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського
національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:
01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий ”_21_“ вересня 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.23,
доктор фізико-математичних наук, професор Поперенко Л.В.
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Застосування лазерів до дослідження біологічних процесів, що відбуваються в природі під дією сонячного випромінювання, є важливим розділом лазерної фізики - актуальної області досліджень, яка знаходиться на перетині ряду наукових дисциплін – оптики і спектроскопії, хімічної фізики, біофізики і біохімії. Протягом останніх трьох десятиліть перехід від використання лазерів з наносекундною тривалістю імпульсу до піко- і фемтосекундного діапазону та розвиток різноманітних методів лазерної спектроскопії спричинив відкриття численних надшвидких фотохімічних реакцій, швидкість яких у деяких випадках перевищує швидкість коливальної релаксації.
З цієї точки зору дослідження поширених в природі фотохімічних реакцій органічних молекул з полієновим хромофором - від простих дієнів та триєнів аж до зорового хромофору ретіналю, - що відбуваються із синглетних збуджених станів, час життя яких не перевищує одиниць пікосекунд, є надзвичайно актуальними. До числа таких біологічно важливих реакцій належить і синтез вітаміну D11 Термін “вітамін D” вживають в загальному значенні, хоча відомі дві різні хімічні сполуки. Вітамін D2 (С28Н44О) синтезується під дією УФ випромінювання з ергостерину (провітаміну D2) переважно в рослинах, а вітамін D3 (С27Н44О) – з 7-дегідрохоле-стерину (7-ДГХ, провітаміну D3) в шкірі людини і тварин. , який відбувається в рослинах і в шкірі людини під дією сонячної ультрафіолетової (УФ) радіації (Рис.1).
Процес синтезу вітаміну D складається з двох основних стадій – фотохімічної, на якій з провітаміну D утворюється превітамін D шляхом УФ індукованого розкриття гексадієнового кільця, і термохімічної стадії, на якій превітамін D пере-творюється у вітамін D шляхом внутрішньомолекулярного переносу протона [1].
Дослідження розгалуженого ланцюга фотохімічних реакцій, що лежать в основі синтезу вітаміну D, зіграли важливу роль в розвитку молекулярної фотохімії. Протягом багатьох років вітамін D, створюваний самою природою, його ізомери та їх характерні реакції є джерелом інформації для розвитку нових ідей і продовжують бути відправною точкою для фундаментальних досліджень аж до сьогодні. Особливо важливим є принцип конформаційного контролю фотопродуктів [1,2], який пояснює різноманітність фотоперетворень превітаміну D, згідно з яким геометрія молекули (конформація триєнової системи р-електронів), що підлягає фотоактивації, обумовлює структуру і стереохімію фотопродуктів.
Рис.1. Основні фото- і термореакції синтезу вітаміну D:
цифри біля стрілок – квантові виходи () окремих фотоперетворень [1].
Завдяки низькому енергетичному бар’єру внутрішньомолекулярного обертання навколо одинарного зв’язку С5-С6 конформери превітаміну D знаходяться в динамічній рівновазі, а їх співвідношення визначається будовою молекули (стеричний фактор) і взаємодією з оточенням (температура, в’язкість, полярність розчинника). У той же час участь цих конформерів в основних фотореакціях (рис.1) різна. Так, вважається [2], що фотоциклізація Pre > Pro, Pre > L (а також термореакція Pre > D) відбувається при збудженні первинної cZc-Pre конформації превітаміну D, тоді як цис-транс ізомеризація в тахістерин є найбільш ефективною з розгорнутої конформації tZc-Pre (Рис.2).
Рис.2. Два пласких конформери превітаміну D.
При ламповому ініціюванні збудження молекул превітаміну D завжди відбувається в конформаційно рівноважному стані. При ініціюванні ж фотосинтезу превітаміну D короткими лазерними УФ імпульсами перед дослідником виникає ціла низка запитань фундаментального характеру: яким чином такий режим опромінення відіб’ється на кінетиці фотореакції? Чи буде однаковим концентраційний склад фотопродуктів при одній і тій же дозі опромінення та чи виконується при цьому закон взаємозамінності Бунзена-Роско?
Тому дослідження динаміки встановлення конформаційної рівноваги превітаміну D за умов збудження фотореакції короткотривалими інтенсивними лазерними імпульсами і розробка адекватної математичної моделі фотореакції, яка враховує специфіку інтенсивного лазерного опромінення, також є актуальною задачею.
Незважаючи на те, що гексатриєновий хромофор превітаміну D є одним із най-простіших полієнів, до цього часу все ще залишається невизначеним, який із бага-тьох можливих каналів його фотоперетворень буде найбільш ефективним. Це зу-мовлює актуальність пошуку шляхів цілеспрямованого впливу на канали фоторе-акції як за рахунок властивостей ініціюючого лазерного випромінювання, так і шля-хом впливу реакційного середовища на конформаційний розподіл превітаміну D.
Застосування лазерів для ініціювання фотореакцій є важливим ще й з точки зору оптимізації ряду фотохімічних процесів, які використовуються в хімічній і фармацевтичній промисловості. Тому з появою лазерних джерел УФ діапазону у 80-х роках минулого сторіччя з’явились роботи [3-6], спрямовані на оптимізацію стадії фотосинтезу превітаміну D.
Головна практична проблема полягає в тому, що на стадії УФ опромінення провітаміну D (рис.1) поряд з потрібним фотопродуктом - превітаміном D, - туво-рюються продукти його побічних фотореакцій. Оскільки співвідношення цільового й побічних фотопродуктів залежить від спектрального складу УФ випромінювання, практично важливим завданням є детальне дослідження цієї залежності від довжини хвилі ініціюючого опромінення за допомогою перестроюваного лазера. Можна очікувати, що таке дослідження буде корисним і для розробки УФ ламп з оптимальним спектром випромінювання.
Крім того, актуальність теми дисертаційної роботи зумовлена ще й нагальною екологічною проблемою вимірювання біологічно активної УФ сонячної радіації тоді, коли витончення озонового шару призводить до підвищення її інтенсивності на земній поверхні, а, з іншого боку, зростання забруднення атмосфери стримує проникнення життєво важливої УФ радіації в біосферу.
Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відділі оптичної квантової електроніки Інституту фізики НАН України в рамках відомчих тем НАН України: “Розробка нових лазерних і голографічних принципів керування параметрами когерентних світлових пучків і розробка на їх основі спектроскопії збуджених середовищ і лазерної метрології”, № держреєстрації 01840017277 (1984-1989); “Динамічна голографія конденсованих середовищ і фізика перестроюваних лазерів”, № держреєстрації 01900029482 (1990-1993); 1.4.1.В/55 “Динамічна голографія і лазерна фізика нелінійних середовищ та біооб’єктів”, № держреєстрації 0194U024082 (1994-1997); 1.4.1.В/40 “Нелінійна лазерна динаміка оптичних вихорів, фоторефрактивних взаємодій і біосистем”, № 01198U002138 (1998-2000); 1.4.1.В/66 “Фізична оптика когерентних світлових полів, утворених за допомогою багатохвильових взаємодій в нелінійних середовищах і біооб’єктах”, № 0101U000352 (2001-2003); 1.4.1.В/107 “Структура складних світлових полів і світлоіндуковані процеси в конденсованому стані”, № 0104U003218 (2004-2006).
Робота була підтримана наступними проектами, виконаними під науковим керівництвом автора: ДКНТ України №4/664 “Новий підхід до фотосинтезу превітаміну D: від спектрального до конформаційного контролю фотопродуктів” (1992-1993); Міжнародного наукового фонду U63000 и U63200 (разом з Урядом України) “Лазери в фотохімії провітаміну D: конформаційні та спектральні ефекти” (1994-1996); Європейської комісії з Програми DG12 “Розробка біологічних дозиметрів для моніторингу впливу сонячної УФ радіації на біосферу та здоров’я людини”, шифр "BIODOS" (1997-1998); УНТЦ Гр-50 “Eкологічний моніторинг біологічно активної “антирахітної” сонячної УФ радіації в Kиєві і в Антарктиді та розробка “ВітаD” біодозиметру” (2002 – 2005). Частина досліджень виконувалась в рамках НДР з Ленінградським хім.-фарм. об’єднанням “Октябрь”: “Розробка методу двоступеневого опромінення ергостерину в технології виробництва вітаміну D2” (договір № 172/90-16а від 18.05.1990) та “Розробка аналітичних методів контролю процесу фотосинтезу вітаміну D2” (договір № 270/91-16 від 07.12.1991).
Метою роботи є визначення закономірностей впливу параметрів лазерного випромінювання (довжини хвилі, інтенсивності, тривалості імпульсу) на фотофізичні та фотохімічні процеси в реакції фотосинтезу превітаміну D для пошуку шляхів цілеспрямованого впливу на його конформаційний розподіл та канали фотоперетворень у різних середовищах. Практична мета роботи полягала у розробці методу спектрофотометричного аналізу багатокомпонентної суміші фото-ізомерів провітаміну D з урахуванням її фотодеградації, пошуку шляхів оптимізації стадії фотосинтезу превітаміну D, а також розробці дозиметру біологічно активної сонячної УФ радіації на основі фотосинтезу превітаміну D (in vitro).
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:
1. Розробити метод спектрального концентраційного аналізу багатокомпонентної суміші фотоізомерів для дослідження кінетики фотореакції в реальному часі (розділ 2);
2. За допомогою перестроюваного лазера дослідити вплив довжини хвилі УФ випромінювання на кінетику фотореакції і вихід фотопродуктів (розділ 3);
3. Дослідити вплив інтенсивності опромінювання на кінетику фотосинтезу превітаміну D при ініціюванні пікосекундними лазерними імпульсами і розробити адекватну математичну модель фотореакції (розділ 4);
4. Дослідити вплив реакційного середовища на конформаційну рівновагу превітаміну D, ефективність каналів його фотоперетворень і механізм фотореакції (розділ 5);
5. На основі даних, отриманих за допомогою перестроюваного лазеру, визначити шляхи оптимізації стадії фотосинтезу в технології виробництва вітаміну D з використанням лампових джерел УФ випромінювання різного спектрального складу (розділ 6);
6. Дослідити можливості дозиметрії біологічно активної УФ радіації Сонця та штучних джерел, використовуючи реакцію фотоізомеризації провітаміну D in vitro (розділ 7).
Об’єктом дослідження є реакція фотосинтезу превітаміну D (in vitro), що лежить в основі природного процесу синтезу вітаміну D.
Предмет дослідження - фотофізичні і фотохімічні процеси, які відбуваються при лазерному ініціюванні фотосинтезу превітаміну D в різних середовищах, та їх вплив на кінетику фотореакції і формування кінцевих фотопродуктів.
Методи дослідження. В роботі експериментальні спектральні дослідження кінетики фотореакції поєднувались з її математичним моделюванням за допомогою системи кінетичних диференційних рівнянь, а також залучались спрощені моделі, що наочно демонструють виявлення досліджуваних ефектів. Абсорбційна УФ спектроскопія була основним методом слідкування за ходом фотореакції, а для концентраційного спектрального аналізу було развинуто оригінальний метод, який враховував незворотну фотодеградацію утворюваної багатокомпонентної суміші фотоізомерів. Для дослідження впливу довжини хвилі лазерного УФ випромінювання на кінетику фотореакції було розвинуто методи прецизійного вимірювання довжини хвилі та підвищення спектральної яскравості перестроюваних лазерів на розчинах органічних барвників (ЛРОБ)
Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що вперше
1. На відміну від загальноприйнятого хроматографічного аналізу, застосовано новий методологічний підхід до систематичних досліджень кінетики фотоізомеризації провітаміну D в умовах імпульсного лазерного опромінення, який полягає в поєднанні УФ абсорбційної спектроскопії з математичним моделюванням кінетики фотореакції та застосуванні спеціально розвинутого експресного спектрофотометричного аналізу сумішей фотоізомерів вітаміну D із урахуванням їхньої фотодеградації.
2. При дослідженні впливу довжини хвилі опромінювання на кінетику фотореакції виявлено новий спектральний ефект, а саме, різке підвищення ефективності необоротного каналу, яким звичайно нехтували, при опроміненні провітаміну D на червоному крилі його смуги поглинання (л>300нм). Числовими розрахунками доведено неадекватність загальноприйнятого фотостаціонарного наближення при ініціюванні фотореакції в цій спектральній області та експериментально доведено необхідність врахування фотодеградації фотоізомерної суміші при концентраційному аналізі.
3. За допомогою теоретичного аналізу кінетики розгалужених фотореакцій з конформаційно рухливим інтермедіатом виявлено залежність виходу кінцевих фотопродуктів від інтенсивності опромінення, що пов’язано із збудженням нерівно-важних конформерів. Експериментально встановлено, що таке порушення закону взаємозамінності відбувається не за рахунок нелінійних ефектів, а при більш низь-кій інтенсивності I << 1/уф, ніж потрібно для насичення поглинання (де ф ~ 10-13c – час життя збудженого синглетного стану провітаміну D, а у – переріз поглинання).
4. Виявлено вплив інтенсивності на квантові виходи і канали фотоперетворень превітаміну D внаслідок збудження його нерівноважних конформерів, і реалізовано конформаційно селективну фотохімію із суттєвим зниженням виходу побічного транс-ізомеру тахістерину при опроміненні провітаміну D з інтенсивністю I 1/2, де 2 125пс - час встановлення конформаційної рівноваги превітаміну D.
5. Спостережено нетривіальний ефект уповільнення фотоізомеризації провітаміну D зі зростанням інтенсивності опромінення в межах 1/ > I >1/1, де 1 5пс - час термалізації (коливальної релаксації) утворюваного превітаміну D. При цьому збудження "гарячої" молекули превітаміну D спричинює зростання імовірності зворотного замикання гексадієнового кільця, що проявляється як ефект "молекулярної пам’яті".
6. Виявлено вплив реакційного середовища не тільки на ефективність, але й на механізм цис-транс ізомеризації превітаміну D. Так, адсорбція на поверхні кремнезему знижує її ефективність через зсув конформаційної рівноваги превітаміну D. В той же час ефективність цис-транс ізомеризації значно збільшується при розчиненні провітаміну D в нематичному рідкому кристалі (РК), що зумовлено проявом її некласичного (hula-twist) механізму.
Практичне значення отриманих результатів.
1. На основі проведеного аналізу деструктивного впливу необоротного каналу в умовах лампового опромінення розчинів провітаміну D з високими технологічними концентраціями (0,1-0,2%), видано практичні рекомендації щодо зміни режиму опромінення, що дозволило суттєво знизити фотодеградацію в умовах виробництва і підвищити вихід превітаміну D.
2. Вперше запропоновано нетрадиційне використання фоточутливих молекул стероїдів для безконтактного методу фотоорієнтації нематичних рідких кристалів, актуального в технології виробництва різноманітних рідкокристалічних приладів.
3. Запропоновано і розроблено новий спектрально селективний метод дозиметрії біологічно активної УФ радіації (D-дозиметр), в основу якого закладено спектральний контроль фотосинтезу превітаміну D (in vitro), а також шляхом розчинення провітаміну D в РК матриці розроблено персональний біодозиметр УФ радіації з візуальною оцінкою поглинутої УФ біодози.
Особистий внесок здобувача. Усі результати, які включені до дисертації, одержано за визначальної особистої участі здобувача. В роботах з перестроюваних лазерів (1*-7*) автор приймав участь в експериментальних вимірюваннях, інтер-претації отриманих результатів і підготовці публікацій. Розробка спектральної методики досліджень з лазерного ініціювання фотоізомеризації провітаміну D (8*-10*,12*-14*,28*,30*,47*) належить автору, який особисто проводив всі спектральні вимірювання. Постановка задачі спектрофотометричного концентраційного аналізу і участь в розробці алгоритму програми (23*) належить автору. Розробка адекват-них теоретичних моделей фотореакції (17*,18*,21*, 29*,40*) проводилась за ініціа-тивою автора і його безпосередній участі. Розрахунки кінетики фотореакції і її дослідження з метою оптимізації лампової технології (19*-20*) виконані автором, а співавтори проводили хроматографічний аналіз і виробничі випробування. Автору належить ідея і постановка задачі досліджень фотореакції в гетерогенних середо-вищах (11*,15*,22*,26*) і рідких кристалах (33*,35*,41*,43*-45*,53*-54*,56*), які виконані аспірантами під його керівництвом. Автору належить ідея дозиметрії біоактивного сонячного УФ випромінювання за допомогою спектрального спосте-реження за кінетикою фотосинтезу превітаміну D (23*,24*,31*,51*,55*), а також ідея рідкокристалічного персонального УФ біодозиметру з візуальною оцінкою отриманої дози (33*,37*,39*,42*,50*,52*), які досліджені в рамках наукових проектів під керівництвом автора. Всі експерименти з тестування D-дозиметра (32*,36*), опроміненню ексимерними лампами (38*) і лазерами (47*) виконані автором особисто на обладнанні, наданому зарубіжними колегами.
Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертації доповідались і обговорювались на багатьох конференціях, симпозіумах і нарадах, основні з яких вказані нижче: IV, V і VI Всесоюзні конференції ”Оптика лазеров”, Ленінград (1984, 1987, 1990); V і VI Всесоюзні наради з фотохімії: Суздаль (1985), Новосибірськ (1989); Міжнародні конференції з когерентної і нелінійної оптики: XIII КіНО’88, Мінськ і XIV КіНО’91, Ленінград; VII Всесоюзна конференція із взаємодії оптичного випромінювання з речовиною, Ленінград (1988); XVI, XVIII, XX IUPAC Symposia on Photochemistry: Finland (1996), Germany (2000), Spain (2004); International Conferences “Laser Applications in Life Sciences”: Moscow (1990), Minsk (1994), Finland (1997), Lithuania (2002); 8th, 9th, 12th Vitamin D Workshops: France (1991), USA (1994), The Netherlands (2003); SPIE Conference on Biomedical Optics, USA (1994); 15th International Conference on Coherent and Nonlinear Optics ICONO’95, Russia; International Conferences on Photochemistry: England (1995); Poland (1997); Russia (2001), Japan (2003); 2nd International Workshop on Biological UV-Dosimetry, Hungary (1996); European Conference on Atmospheric UV Radiation, Finland (1998); International Conference “Physics of Biologic Systems”, Ukraine (1998); International Conferences “Biologic Effects of Light”: Switzerland (1999), USA (2001); International Conferences on Liquid Crystals: United Kingdom (2002), Slovenia (2004); Міжнародні конференції з атмосферної радіації: МСАР-2002, MCAP-2004, Росія; 2nd International Congress on Ultraviolet Technologies, Austria (2003); International Congress on Biometeorology, Germany (2005).
Публікації. Основні результати дисертаційної роботи опубліковано в 51 статті у фахових наукових виданнях, багатьох тезах міжнародних конференцій, одному авторському свідоцтві і двох патентах України.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 7 розділів та висновків обсягом 308 сторінок, містить 129 рисунків і 19 таблиць. Перелік використаної літератури включає 258 найменувань і займає 24 сторінки.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі міститься загальний огляд теми дослідження, обґрунтовано її актуальність, сформульовано мету та задачі досліджень, відображено новизну, наукове і практичне значення отриманих результатів, методи досліджень, зв’язок роботи з науковими темами, особистий внесок здобувача у вирішення проблеми, а також коротко наведено зміст розділів дисертації.
В першому розділі відображено сучасні уявлення про механізми фотохімічних реакцій на основі розгляду багатомірних поверхонь електронної потенціальної енергії в основному S0 і збудженому S1 станах в залежності від ядерних координат. Систематичні дослідження молекулярних деформацій показали, що поверхні S1 і S0 в багатьох випадках мають реальні перетини з розмірністю (n-2) в формі перевернутого конуса. Саме наявність конічних перетинів (КП), які досягаються без суттєвих бар’єрів, забезпечує неперервну траєкторію молекули з S1 в S0 та може пояснити надшвидкі фотореакції (піко- і фемтосекундного діапазону) та внутрішню конверсію. Крім того, КП також діє як точка розгалуження траєкторії відносно декількох реакційних каналів з формуванням різноманітних фотопродуктів [7].
Застосування лазерних джерел світла відкриває нові можливості керування хімічними реакціями. Поєднання таких властивостей лазерного випромінювання, як висока інтенсивність, монохроматичність, поляризація, когерентність, перестроюваність частоти дозволяє впливати на швидкості і перерізи фотореакцій. З іншого боку, лазери дозволяють детектувати та ідентифікувати продукти реакції і аналізувати їх внутрішній стан з надзвичайно високою чутливістю.
Багаторічні дослідження фотоізомеризації провітаміну D [1] виявили суттєву залежність концентраційного складу фотоізомерної суміші, утворюваної при УФ опроміненні провітаміну D, від довжини хвилі. Це демонструє рис.3, на якому приведено кінетики фотореакції, розраховані за допомогою системи кінетичних диференційних рівнянь [8] для двох різних довжин хвиль.
Тому перші роботи з лазерного ініціювання фотоізомеризації провітаміну D [3-5], які з’явились на початку 80-х років минулого століття, мали на меті підвищення виходу превітаміну саме завдяки вибору довжини хвилі та режиму лазерного опромінювання.
Рис.3. Розраховані кінетики фотоізомеризації провітаміну D при опроміненні на довжині хвилі 254 нм (а) і 295 нм (б). (Позначення див. Рис.1).
Але цим роботам, на нашу думку, притаманний ряд недоліків. Так, в усіх роботах автори нехтували наявністю слабкого (=0.039) необоротного каналу фотоперетворень Pre>Tox [9], тобто при концентраційному аналізі сумма концентрацій 4-х основних фотоізомерів завжди вважалась рівною 100%. Саме за таких умов було виявлено [5] різку (dramatic) зміну розрахованого квантового виходу Pre>L в межах вузького спектрального діапазону 300-305нм. При порівнянні результатів робіт [3,5] незрозумілою є значна відмінність складу сумішей при опроміненні різними типами лазерів на близьких довжинах хвиль 305 і 308 нм, при цьому, однак, автори вказують тільки середню енергію лазерних імпульсів, тоді як важливою є густина потужності (інтенсивність) в опромінюваному об’ємі. Ще одним недоліком можна вважати те, що при дослідженні співвідношення Pre/T в залежності від тривалості лазерного імпульсу в роботі [5] велика різниця в інтенсивності піко- і наносекундного випромінювання залишилась поза увагою авторів, а в запропонованій моделі не враховувалась конформаційна рухливість молекул превітаміну D. Ці недоліки було враховано при виконанні систематичних досліджень в рамках дисертаційної роботи.
Другий розділ носить методичний характер. Він містить відомості про розроблені способи підвищення спектральної яскравості випромінювання імпульсних ЛРОБ шляхом переключення добротності зв’язаних резонаторів [1*,4*,6*] та прецизійного електронного перестроювання довжини хвилі випромінювання ЛРОБ за допомогою акустооптичного дефлектора на кристалі TeO2 [2*,5*,7*]. При цьому керування довжиною хвилі генерації шляхом зміни частоти f високочастотного генератора, який живить акустооптичну комірку, дозволяє синтезувати спектр випромінювання лазера, структура якого корелює з особливостями спектра поглинання досліджуваної речовини і, таким чином, імітує спектральну маску при кореляційному спектральному аналізі багатокомпонентних сумішей [3*].
Однак, відсутність характерної структури в спектрах поглинання фотоізомерів провітаміну D унеможливлює застосування кореляційного аналізу суміші фотоізомерів вітаміну D. Як правило, з цією метою застосовують хроматографічний аналіз (HPLC), недоліком якого є значні витрати часу, пов’язані з необхідністю маніпуляцій з розчином.
На нашу думку, незважаючи на те, що спектри поглинання основних 4-х фотоізомерів перекриваються в одному спектральному діапазоні (рис.4), якісні висновки щодо кінетики
Рис.4. Спектри поглинання основних 4-х фотоізомерів: Pro - провітамін D, Pre - превітамін D, T – тахістерин, L - люмістерин
фотореакції та формування основних фотопродуктів можна робити на основі спостережень за зміною УФ спектру поглинання розчину провітаміну D в процесі УФ опромінення. Очевидно, що накопичення тахістерину повинно супроводжуватись поміт-ним зростанням оптичної густини (ОГ). В той же час наслідком переважного накопичення превітаміну D буде зниження ОГ на л = 282нм і зростання на л = 260нм, яка відповідає максиму-му поглинання превітаміну D. Стабілізація спектру протягом деякого періоду УФ опромінювання свідчить про встановлення динамічної рівноваги поміж основними фотоізомерами, так званого фотостаціонарного стану, а наступне зниження ОГ на стадії “переопромінення” зумовлено необоротними фотоперетвореннями превітаміну в токсистерини Pre>Тох (оскільки їх спектр поглинання є зсунутим в короткохвильову область по відношенню до спектрів основних фотоізомерів Pro, Pre, T і L).
Для кількісного аналізу суміші фотоізомерів вітаміну D спектрофотометричний метод з використанням методу найменших квадратів вперше було запропоновано в роботі [10] без урахування незворотної фотодеградації суміші фотоізомерів. Тобто сумарна процентна частка фотопродуктів, які утворювалися при УФ опроміненні, по відношенню до концентрації вихідного провітаміну D завжди приймалася рівною 100%. Додатковим недоліком [10] була систематична поява від’ємних концентрацій компонентів, присутніх в малій кількості, або відсутніх зовсім, що не має фізичного сенсу.
Тому в розвинутому нами спектрофотометричному аналізі [23*] обчислювані концентрації Ci вже входили у вираз оптичної густини у вигляді квадратів величин Ci = чi2 (i = 1,2,3,4). Значення чi визначались як такі, що надають мінімум функціоналу
, | (2.1)
де перший доданок – звичайний статистичний критерій, який визначається середньо-квадратичним відхиленням обчислюваних та виміряних оптичних густин сумішей, що аналізуються, при N значеннях л:
. |
(2.2)
Тут - виміряна оптична густина на довжині хвилі лj, - експериментальна похибка її визначення, а - обчислювана оптична густина на цій же довжині хвилі лj:
. | (2.3)
Для врахування необоротної фотодеградації 4-х компонентної фотоізомерної суміші в функціонал , що мінімізується, введено додатковий доданок , так звану “штрафну” функцію:
. |
(2.4)“
Штрафна” функція контролює відмінність сумарної концентрації 4-х основних фотоізомерів від одиниці (100%) в межах невизначеності ?с << 1, тобто при суттєвому зменшенні їх сумарної концентрації внаслідок фотодеградації досягнення мінімального значення функціонала (2.1) стає неможливим в заданому інтервалі довжин хвиль.
Тестування розробленого методу аналізу включало в себе перевірку його адекватності шляхом порівняння з результатами хроматографічного аналізу, а також відтворюваності і стійкості результатів аналізу по відношенню до початкових умов [20*,34*]. Розкид вимірюваних концентрацій Pre і T не перевищував ± 1,5%, а для люмістерину і провітаміну D він був вищим (до 4%), що зумовлено подібністю спектрів поглинання Pro і L (див. рис.4).
У третьому розділі наведено результати досліджень кінетики фотоізомеризації провітаміну D в умовах наносекундного лазерного опромінення другою гармонікою ЛРОБ в широкому спектральному діапазоні 260_305нм, а також ексимерними KrF і XeCl лазерами, які генерують на = 248нм і = 308нм.
Розчин 7-дегідрохолестерину (7-ДГХ, провітаміну D3) в етанолі (С = 10-5моль/л) опромінювався в кварцевій кюветі товщиною 1см. Перед опроміненням для видалення кисню через розчин борботували аргон, потім кювету герметизували. В процесі опромінення розчин перемішу-вався магнітною мішалкою. Потужність лазерного випромінювання контролювалась приладом ІМО-2. Для спостереження за ходом фотореакції перед початком опромінення і після фіксованих доз реєструвались УФ спектри поглинання на приладі “Specord UV-VIS”.
Рис.5. Трансформація спектру поглинання розчину 7-ДГХ (1) при опроміненні XeCl лазером протягом 0,5хв. (2), 1хв. (3), 1,5хв. (4), 2хв. (5), 2,5хв. (6), 3хв. (7), 3,5хв. (8), 4хв. (9), 5хв. (10), 5хв. (11), 6хв. (12), 8хв. (13), 10хв. (14), 12хв. (15) і 16хв. (16).
Перший же експеримент з опроміненням ексимерним XeCl лазером (л = 308 нм, Рср ~ 300 мВт, фімп ~15 нс, f = 20 Гц) і спостере-женням за трансформацією спектра 7-ДГХ виявив неочікувані особи-вості (Рис.5): із зростанням дози опромінення не спостерігалось стабілізації УФ спектра, характерної для фотостаціонарного стану [9*,10*], а падіння оптичної густини в області поглинання 7-ДГХ з одночасним її зростанням в короткохвильовій області на л=252нм свідчило про необоротне перство-рення вихідного 7-ДГХ в фото-продукт, відмінний від основних 4-х фотоізомерів (порівняти спектр 16 на рис.5 із спектрами рис.4).
Непричетність двоквантових процесів до незвичайної кінетики фотоізомеризації 7-ДГХ було доведено при варіюванні інтенсивності лазерного випромінювання в діапазоні 102ч108 Вт/см2.
З іншого боку, опромінення розчину 7-ДГХ за допомогою перестроюваного ЛРОБ із інтенсивністю 104ч106 Вт/см2 виявило суттєву різницю в кінетиці фотореакції в залежності від довжини хвилі. При збудженні в межах 248_295нм фотореакція відбувалась в повній відповідності до традиційної схеми, тоді як при збудженні на довгохвильовому краю (л>305нм) спостерігався “аномальний” хід фотореакції без встановлення фотостаціонарного стану.
Як довів теоретичний аналіз, основною причиною зростання ефективності необоротного каналу є перерозподіл співвідношення коефіцієнтів поглинання Pro і Pre з довгохвильового боку від точки їх перетину на л=300нм (див. рис.4), внаслідок чого різко зростає швидкість необоротних фотореакцій Рre>Тох по відношенню до швидкості утворення превітаміну D (Рrо> Рre) (Рис.6).
Рис.6. Розрахована спектральна залежність швидкості необоротних фотореакцій Рre>Тох відносно швидкості утворення превітаміну Рrо>Рre.
Цей висновок підтверджують чисельні розрахунки кінетики фотореакції при опроміненні на довжинах хвиль лопр= 295нм і 308нм, проведені за двома схемами: одна включає тільки оборотні фотореакції, а друга доповнена каналом необоротних фотоперетворень Рre> Тох і описується наведеною нижче системою рівнянь [13*,14*]. |
3.1)
3.2)
3.3)
3.4)
3.5)
Тут Ni(t) – концентрації фотоізомерів, i = 1…5 відповідає Pro, Pre, T, L і Tox, fkj – передаточна функція (в сек-1): fkj = 0.38·10-20akjеj(л), де Ца – густина падаючого потоку фотонів (фотон /см2с); цkj – квантовий вихід перетворення j>k, і еj(л) – молярний показник поглинання фотоізомеру (j) на довжині хвилі л. Розраховані кінетики приведено на рис.7.
Рис.7. Розрахована кінетика без урахування каналу Pre > Tox при лопр=295нм (а) і лопр=308нм (б) і з його врахуванням (в) і (г) відповідно. Sum – сумарна концентрація: Sum = [Pro] + [Pre] + [T] + [L].
Із співставлення рис.7а) і б) з в) і г) очевидним є слабкий вплив необоротного каналу Рre>Тох при опроміненні на 295нм. Однак, для лопр= 308нм врахування реакцій Рre>Тох кардинально змінює кінетику фотореакції: швидке зменшення сумарної концентрації 4-х фотоізомерів (Sum) внаслідок накопичення токси-стеринів починається з самої ранньої стадії фотолізу, внаслідок чого суттєво (майже в два рази) знижується максимальна концентрація Рre і Т, а сумарна концентрація 4-х основних фотоізомерів у цей момент зменшується майже до 80%!
Результати цих розрахунків було експерименттально підтверджено (Рис.8) при опроміненні розчину 7-ДГХ в етанолі XeCl лазером (л=308нм, імп=16нс) з інтенсивністю ~ 3.5·106 Вт/см2 [47*] і, таким чином, було доведено, що існуюче
Рис.8. Кінетика фотоізомеризації 7-ДГХ в етанолі при опроміненні XeCl лазером.
уявлення про несуттєвість необоротного каналу є хибним при довгохвильовому опроміненні, і використання схеми фотореакції, яка містить тільки оборотні фотоперетворення, і концен-траційного аналізу, який не враховує фото-деградацію суміші основних 4-х фотоізомерів, є некоректним. На нашу думку, саме неадекватний концентраційний аналіз і є причиною виявлених в роботі [5] “драматичних змін” квантових виходів в області 300_305нм, розрахованих за виміряними концентраціями.
У розділі 4 приведено результати досліджень кінетики фотореакції при високоінтенсивному пікосекундному лазерному опроміненні, оскільки, як відомо, інтенсивність ініціюючого випромінювання відноситься до числа факторів, які контролюють канали фотохімічних реакцій. Відомо, що при інтенсивному лазерному опроміненні внаслідок двоступеневого поглинання з’являються нові канали фотоперетворень з високозбуджених станів, які приводять до появи нетрадиційних фотопродуктів. В цьому випадку, змінюючи єдиний параметр - інтенсивність опромінення, можна стимулювати якісно різні типи фотоперетворень і селективно утворювати фотохімічні продукти з високим квантовим виходом.
Нами на прикладі простої моделі розгалуженої фотореакції з конформаційно рухливим проміжним фотопродуктом (Рис.9) проаналізовано вплив інтенсивності на вихід кінцевих фо топродуктів [21*]. Поглинання світла переводить молекули
Рис.9. Модель фотореакції з конформаційно рухливим проміж- ним фотопродуктом: А – вихідна молекула, В1 і В2 – дві конформації проміжного фотопродукту В, C і D – кінцеві фотопродукти.
А, В1 і В2 в електронно збуджені стани зі швидкістю, пропорційною відповідним перерізам поглинання уi,см2 і густині потоку фотонів n,фотон·cм-2с-1. Релаксація збуджених молекул відбувається або в основний вихідний стан з константами ki,c-1, або в основний стан фотоізомеру з константами гi, c-1, при цьому зi = гi / (ki + гi) _ квантова ефективність фотохімічної реакції. Оборотні темнові перетворення конформерів В1-В2 характеризуються константами q+ і q- (с-1), при цьому важливо, що q+ і q- << гi, ki [11].
Розв’занням відповідної системи рівнянь отримано наступний вираз для відношення концентрацій кінцевих фотопродуктів с і d в межі t> ?:
. | (4.1)
З (4.1) виходить, що, в залежності від інтенсивності опромінення n можна виділити два граничних випадки. При низький інтенсивності співвідношення концентрацій c і d не залежить від інтенсивності, а якщо інтенсивність висока, то відношення концентрацій кінцевих фотопродуктів c і d є пропорційним до інтенсивності і стає тим більшим, чим більшою є швидкість збудження первинного конформеру В1 у порівнянні зі швидкістю його темнового перетворення в В2 :
. (4.2)
Цей висновок є важливим для органічного синтезу, оскільки відкриває можливість підвищення виходу кінцевого фотопродукту С, вихід якого при ламповому опроміненні є низьким внаслідок низької імовірності стерично напруженої конформаціі В1 в рівноважному конформаційному розподілі..
Оцінки показують, що для типових значень у = 10–17 см2 і констант конформаційних переходів q = 1010с-1 [12] необхідної інтенсивності (густини потоку фотонів) n>1027фотон·см-2с-1 можна досягти при пікосекундному лазерному опроміненні. При цьому імовірність двоступеневого збудження буде незначною, оскільки швидкості релаксації збуджених станів суттєво перевищують швидкості конформаційних перетворень [12].
Експериментальні дослідження впливу інтенсивності на кінетику фотоізомеризації 7-ДГХ при її ініціюванні пікосекундними лазерними імпульсами виконувались в Інституті спектроскопії РАН. Джерелом високоінтенсивного УФ випромінювання був YAG:Nd3+-лазер з перетворенням частоти генерації в четверту гармоніку (л = 266 нм), тривалістю імпульсу ~23пс при частоті повторення 1Гц і середній енергії в імпульсі ~1ч2 мДж. В процесі опромінення енергія кожного лазерного імпульса вимірювалась каліброваним піроелектричним фотоприймачем, до якого відводилась частина світлового пучка і сигнал з якого потрапляв на цифровий осцилограф С9-8, з’єднаний з комп’ютером для контролю заданої дози. Зміна інтенсивності лазерного випромінювання в об’ємі розчину відбувалась за допомогою довгофокусної кварцевої лінзи (F =102 см), при цьому варіювання розміру світлової плями на передній стінці кювети від 0.3 до 0.003 см2 і застосуванні ослаблюючих фільтрів дозволяло змінювати інтенсивність опромінення в межах 1011ч1014 Вт/м2.
Розчини 7-ДГХ в етанолі (V=2 см3, С=5.10-5 моль/л) опромінювались в герметизованих кварцевих кюветах товщиною 1см. Перед опроміненням розчини борботувались аргоном і в процесі опромінення ефективно перемішувались завдяки вібрації від звукового генератора з частотою ~20Гц. Періодично після опромінення заданими дозами (100-200мДж) кювету з розчином переносили для реєстрації УФ спектрів поглинання на спектрофотометрі “Specord М400”. Було проведено декілька серій таких експериментів з різною інтенсивністю ініціюючого випромінювання.
Як згадувалось раніше, при короткохвильовому УФ опроміненні накопичується значна кількість тахістерину, що приводить до підвищення оптичної густини зразка з часом опромінення аж до досягнення фотостаціонарного стану. Перші ж експерименти [12*] виявили суттєву залежність максимального приросту оптичної густини від інтенсивності при однаковій дозі лазерного опромінення (Рис.10).
Рис.10. Трансформація спектра поглинання розчину 7-ДГХ до (1) і після лазерного опромінення дозами: 100 (2), 200 (3), 400 (4), 600 (5) и 800мДж (6) з інтенсивністю 1.3.1012 Вт/м2 (а) і 6.1013 Вт/м2 (б).
Зниження приросту оптичної густини при більш високій інтенсивності опромінення посередньо свідчить про зниження накопичення тахистерину, що узгоджується з результатом роботи [5], проте, не знаходить пояснення в рамках запропонованої там моделі. З урахуванням послідовності процесів, що відбуваються при розкритті гексадієнового кільця [11], нами було запропоновано і проаналізовано модель [29*], яка враховує конформаційну рухливість молекули превітаміну D, пояснює отриманий нами результат і не протирічить результатам роботи [5]. Розкриття гексадієнового кільця Pro відбувається у збудженому електронному стані 2А1 (Рис.11), і молекула Pre утворюється в коливально-збудженому основному стані. Первинна конформація cZc-Pre з’являється через ф1=5.2пс [12], а потім шляхом внутрішньомолекулярного обертання навколо зв’язку С5-С6 встановлюється конформаційна рівновага Pre протягом часу ф2 = 125пс.
Рис.11. Енергетична діаграма фотореакції Pro>Pre і послідовної конформаційної релаксації молекули превітаміну D.
Виходячи із схеми на рис.11 з урахуванням умови насичення поглинання I > (уф)-1, можна очікувати, що при опроміненні Pro лазерними імпульсами тривалістю фімп (ф1<фімп<ф2) в міру підвищення інтенсивності опромінення I спочатку буде зростати імовірність збудження нерівноважних конформерів новоутворюваних молекул Pre, в той час як для двоступеневого збудження Prо потрібна більш висока інтенсивність. А оскільки цис-транс ізомеризація найбільш ефективна із tZc-Pre конформеру [6], то, підвищуючи інтенсивність опромінення можна суттєво знизити вихід тахістерину за рахунок переважного збудження cZc-Pre конформерів. Модельні розрахунки [21*] і наступні експерименти [28*] підтвердили це припущення, що демонструє Рис.12. Неважко побачити, що з більш високою інтенсивністю опромінення накопичення T суттєво зменшується, однак, максимально досяжна концентрація Pre збільшується не так помітно, як передбачали чисельні розрахунки. В той же час спостерігається новий непередбачуваний ефект суттєвого сповільнення розпаду Prо.
Рис.12. Концентраційна кінетика при лазерному опроміненні 7-ДГХ в етанолі з інтенсивністю 1.3.1012Вт/м2 (а) і 6.1013Вт/м2 (б).
Одна з гіпотез, яка могла б пояснити цей ефект, припускає можливість виникнення наведеного поглинання етанолу під час високоінтенсивного опромінення. Як результат, ефективне число фотонів, що впливають на молекули 7-ДГХ, може суттєво зменшитися (за рахунок поглинання розчинником), наслідком чого і буде спостережене уповільнення фотореакції. Для перевірки цієї гіпотези було досліджено залежність пропускання етанолу і розчину 7-ДГХ від інтенсивності лазерного випромінювання в кюветах різної товщини (рис.13).
Рис.13. Залежність пропускання (Т,%) етанолу (а) в кюветах товщиною 1 (1), 2 (2), 5 (3) і 10мм (4) і розчину 7-ДГХ (б) в кюветах товщиною 1 мм (С = 5·10-4 моль/л) (1) і 1см (С = 5·10-5 моль/л) (2) від інтенсивності лазерного випромінювання на довжині хвилі 266 нм.
Виявилось, що, дійсно, з підвищенням інтенсивності в кюветах товщиною 1 см пропускання етанолу суттево знижується, при цьому ефект слабшає в міру зменшення товщини шару розчиннику. Тому, щоб звести до мінімуму вплив двофотонного поглинання розчиннику, було проведено додаткові дослідження фотореакційної кінетики в тонких (1мм) кюветах (С = 5.10-4моль/л), в яких, однак, також виявилось сповільнення фотореакції [28*].
Механізм спостереженого явища, - ефект “молекулярної пам’яті”,- можна пояснити на основі сучасних уявлень про фотоізомеризацію провітаміну D [7,12]. Після поглинання фотона молекула переходить на поверхню збудженого стану, рухається у напрямі до збудженої cZc* конформації превітаміну D, а потім через конічний перетин (КП) переходить в основний стан превітаміну D. В міру просування молекули цим маршрутом збільшується відстань поміж атомами вуглецю С9 і С10, що, нарешті, призводить до розриву цього зв’язку. Можна уявити, що внаслідок високої інтенсивності опромінення I ? 1/уф1 стає можливим збудження "гарячої" молекули превітаміну (cZc+*-Pre) ще до проходження воронки КП, коли її геометрія ще не зазнала радикальної зміни (атоми вуглецю С9 і С10 ще не надто віддалені один від одного). Тоді при її збудженні буде велика імовірність зворотного замикання гексадієнового кільця, тобто квантовий вихід зворотного фотоперетворення “гарячої” молекули превітаміну D cZc*-Pre>Pro може бути набагато більшим за той, який