ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ
УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ
ТРЯПІЦИНА Наталія Василівна
УДК 575:636.082:573.4
ПОЛІМОРФІЗМ ФРАГМЕНТІВ ДНК ТА ОСОБЛИВОСТІ ГЕНОМНОЇ
ОРГАНІЗАЦІЇ ДЕЯКИХ ВИДІВ ССАВЦІВ І ДВОДОЛЬНИХ РОСЛИН
03.00.15 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата сільськогосподарських наук
Київ – 2006
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано в Інституті агроекології Української Академії аграрних наук
Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук, професор
Глазко Валерій Іванович
Завідувач відділу радіоекології
Інституту агроекології УААН
Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, професор
Димань Тетяна Миколаївна
Білоцерківський аграрний університет,
завідувач кафедри екотрофології
кандидат біологічних наук,
Балацький Віктор Миколайович,
Інститут свинарства УААН
завідувач лабораторії генетики
Провідна установа: Київський національний аграрний університет
при Кабінеті Міністрів України, м. Київ
Захист відбудеться 11 травня 2006 р. об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.371.01 Інституту агроекології УААН за адресою: 03143, м.Київ, вул. Метрологічна,12.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології УААН за адресою: м. Київ, вул..Метрологічна,12.
Автореферат розіслано 11 квітня 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат хімічних наук Л.І.Моклячук
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. При вирішенні теоретичних і прикладних завдань сільськогосподарської генетики необхідно мати високополіморфні молекулярно-генетичні маркери, які б дозволяли адекватно оцінювати рівень генетичної мінливості сільськогосподарських видів рослин і тварин а також споріднених з ними диких видів (Глазко, Созинов, 1993; Сиволап, 1998).
В останні роки стали інтенсивно використовуватися маркери, отримання яких базується на ампліфікації різних класів повторюваної ДНК, зокрема мікросателітної (ISSR-PCR-маркери) (Caetano-Annoles, 1995; Wolfe et al., 1998; Gupta et al., 1998) і транспозонної (IRAP-PCR-маркери) (Waugh et al., 1997; Kalendar et al., 1999; Leigh et al., 2003). Обидва класи маркерів є фрагментами геномної ДНК, що фланковані інвертованими повторами. Основною їх перевагою є високий рівень поліморфізму та відтворення, що робить можливими міжлабораторні порівняння. Недоліком цих маркерів є відсутність інформації про функції й хромосомну локалізацію. Це ускладнює інтерпретацію даних, які отримуються з їх використанням, оскільки не дозволяє оцінити рівень нейтральності цих маркерів до дії добору та їх універсальність для визначення генотипів рослин і тварин на всіх таксономічних рівнях. Не визначені також чіткі критерії для цілеспрямованого підбору цих маркерів для роботи з рослинними і тваринними геномами, що сприяло б ефективнішому їх використанню при паспортизації геномів, MAS-селекції, оцінці внутрішньопородньої, внутрішньосортової й внутрішньопопуляційної генетичної мінливості, вивченню генетичних наслідків впливу різних факторів добору, у тому числі стресових.
З огляду на це, розробка нових підходів до оцінки рівня інформативності молекулярно-генетичних маркерів, що базуються на використанні характеристик із фізичним і математичним змістом, і виявлення найбільш інформативних ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркерів для оцінки генетичної мінливості сільськогосподарських видів рослин і тварин є актуальними.
Зв'язок роботи з науковими прогамами, планами, темами. Дослідження проводилися відповідно до тематичного плану науково-дослідних робіт Інституту агроекології УААН за темою: „Теоретично обгрунтувати і розробити практичні заходи щодо екологічного використання природоресурсного потенціалу агроландшафтів з метою забезпечення сталого розвитку аграрного виробництва і покращання якості життя людини” (номер державної реєстрації 0101U003298), підпрограма „Теоретично обгрунтувати і застосувати на практиці методи сільськогосподарської біотехнології для цілеспрямованого формування сталих агросистем” (номер Державної реєстрації 0101U003296).
Мета і задачі досліджень. Метою дослідження була оцінка інформативності, універсальності та нейтральності до дії добору ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркерів залежно від особливостей досліджуваних геномів (сільськогосподарські види рослин і тварин та споріднені дикі види) і від характеристик локусів повторюваної ДНК, що їх фланкують (мікросателітні послідовності з ди- і тринуклеотидними субповторами та транспозонні послідовності).
Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:
1. Провести порівняльний аналіз поліморфізму молекулярно-генетичних маркерів, отриманих із використанням ди- і тринуклеотидних мікросателітних праймерів у геномах ссавців (на прикладі диких і доместикованих представників підродини Bovinae) і рослин (на прикладі диких і доместикованих представників підродини Phaseoleae).
2. На підставі сімейного аналізу дослідити поліморфізм, успадкування і нейтральність до дії факторів добору ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркерів, а також оцінити можливі мутаційні події в поколіннях групи великої рогатої худоби, що відтворюється в умовах хронічної дії низькодозового радіоактивного випромінювання.
3. Оцінити універсальність ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркерів для використання в оцінці та паспортизації геномів рослин і тварин.
4. Дослідити залежність рівня поліморфізму ISSR-PCR-маркерів від композиційних і термодинамічних характеристик фланкуючих їх локусів ди- і тринуклеотидних мікросателітних послідовностей.
Об'єкт досліджень – поліморфізм молекулярно-генетичних ISSR-PCR-маркерів і IRAP-PCR-маркерів та фактори, що його визначають у доместикованих і диких представників рослин і тварин.
Предмет досліджень – геноми доместикованих та споріднених з ними диких видів рослин і тварин.
Методи досліджень. У роботі було використано загальноприйняті методики виділення й очищення рослинної і тваринної ДНК. Для отримання мультилокусних ампліфікаційних спектрів використано метод полімеразної ланцюгової реакції у двох модифікаціях (ISSR-PCR, IRAP-PCR). Для отримання електрофоретичних спектрів продуктів ампліфікації використано метод агарозного горизонтального гель-електрофорезу. Статистичну обробку результатів, кореляційний і регресійний аналіз проведено із використанням статистичних програм. Для розрахунків генетичних дистанцій (Nei, 1976) та побудови філогенетичних дендрограм використано пакет програм Phylip 3.65. Для розрахунків термодинамічних показників олігодуплексів використано програму Oligonucleotide Properties Calculator Version 3.07.
Наукова новизна отриманих результатів. Уперше показано, що молекулярно-генетичні маркери двох типів (ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркери), які раніше вважалися селекційно-нейтральними, у тварин піддаються тиску добору. Виявлено, що в ISSR-PCR- маркерів відповідь на дію добору залежить від термодинамічних характеристик мікросателітних локусів, що їх фланкують. Визначено найбільш інформативні ISSR-PCR-маркери для внутрішньопороднього та внутрішньопопуляційного типування великої рогатої худоби, а також для філогенетичного аналізу представників підродини Bovinae.
Розроблено методику оцінки внутрішньопопуляційної генетичної мінливості у ВРХ, яка ґрунтується на сімейному аналізі поліморфізму й успадкування ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів. У рослин (дикі і культурні представники підродини Phaseoleae) вперше виявлена залежність між рівнем поліморфізму ISSR-PCR-маркерів і термодинамічними характеристиками мікросателітних локусів, що їх фланкують. Показано, що ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними послідовностями з високими термодинамічними характе-ристиками є перспективними для визначення генотипів сої на міжвидовому рівні, а з низькими термодинамічними показниками – для оцінки генотипів сортів сої.
Розроблено новий підхід до оцінки і підбору мікросателітних праймерів при вирішенні конкретних генетичних задач, що ґрунтується на використанні композиційних і термо-динамічних характеристик олігодуплексів між праймером і матричною ДНК.
Науково-практична цінність отриманих результатів. Проведено оцінку впливу хронічного низькодозового радіактивного випромінювання на модельну групу тварин для прогнозування його наслідків на види сільськогосподарських тварин і людину. У відповідь на дію факторів екологічного стресу виявлено переважне відтворення гетерозигот у дочірньому поколінні F2 порівняно з батьківським поколінням F0 та порушення в передачі від батьків до потомків алельних варіантів певних ISSR-PCR- та IRAP-PC-локусів. Паспортизовано генотипи 13-ти сортів сої з використанням ISSR-PCR-маркерів. Виявлено найперспективніші ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркери для оцінки генетичної мінливості тварин і рослин на різних таксономічних рівнях. Розроблено метод цілеспрямованого підбору мікросателітних праймерів для вирішення ряду завдань сільськогосподарської генетики з використанням ISSR-PCR-маркерів.
Апробація результатів досліджень. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися й обговорювалися на засіданнях вченої ради Інституту агроекологии і біотехнології в 2001-2005р.; на Міжнародній науково-практичній конференції „Перспективы развития животноводства в третьем тисячелетии” 2001р., м.Суми; на Міжнародній конференції ISAG (International Society for Animal Genetics) 2002 р., м. Геттінген, Німеччина; на VII з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів, 2002 р. Крим; на науково-практичній конференції „Новітні методи досліджень біологічних об'єктів”, 2004 р., м. Біла Церква; на міжнародній науковій конференції „Сучасний стан і перспективи розвитку генетики сільськогосподарських тварин”, 2004 р., м. Київ.
Особистий внесок здобувача полягає в узагальненні літературних даних; розробці програми й виконанні запланованих досліджень; аналізі, інтерпретації, та підготовці результатів досліджень до публікацій і апробації; розробці методики розрахунків; форму-люванні висновків.
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 6 наукових праць, у тому числі 4 у фахових виданнях ВАК України.
Структура й обсяг дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 176 сторінках комп'ютерного тексту. Робота складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, висновків, рекомендацій виробництву, заключення та списку використаної літератури, що містить 238 найменувань переважно зарубіжних авторів. Дисертаційна робота містить 43 таблиці, 14 рисунків, 19 фотографій.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури містить загальні характеристики повторюваної ДНК двох класів – мікросателітної та транспозонної. Приділено увагу особливостям розповсюдження цих послідовностей у різних геномах, їх походженню, біологічному значенню та факторам, що визначають високий рівень їх поліморфізму. Розглянуто галузі застосування цих повторюваних послідовностей для отримання різних молекулярно-генетичних маркерів. Узагальнені дані щодо використання ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів для вирішення різних генетичних завдань.
Матеріали і методи досліджень. Матеріалом дослідження слугували рослини 4-х видів підродини Phaseoleae: Glycynia Max. (13 сортів), Glycynia soya (4 дикі усурійські популяції), Glycynia tomentella, Glycynia clandestine та тварини 4-x видів підродини Bovinae: Bison bonasus, Bison bison, Bos frontalis та Bos taurus. Останній вид був представлений зоопарковими тваринами анколє-ватусі та групою голштинізованої великої рогатої худоби, яка відтворюється в умовах хронічної дії низькодозового випромінювання (200 Ки/км2) в господарстві Новошепеличі. Ця група представлена 8-ма родинами, три з яких походять від корів, які перебували в цій місцевості ще до аварії 1986-го року, та 5 родин – від корів, що були завезені в господарство із поліських відносно чистих (<5Ки/км2) районів. Всі тварини, за виключенням корів покоління F0, походять від одного і того ж плідника – бугая Урана, який також переніс катастрофу в цій самій місцевості.
Таблиця 1
Вивчені види тварин і рослин
Протестовані види рослин і тварин | Кількість | Походження
Bos Taurus (голштинізована велика рогата худоба) | 32 | Господарство Новошепеличі
Bison bonasus (зубр) | 9 |
Біосферний заповідник Асканія- Нова
Bison bison (бізон) | 5
Bos frontalis
(Bibos gauros frontalis) (гаял) | 7
Bos taurus macrocerus (анколе-ватусси) | 3
Glycynia Max.
Cорти: Харківська, Новосибірська, Кировоградська, Колективна, Білосніжка, Іскра, Юго-западна, Скороспєлка, Барвиста, Чарівниця степу, Крепиш, Успіх, S0412, Барвиста, Крістал) | 13 сортів | ВІР ім.Н.І.Вавілова,
Росія
Glycynia.tomentella
Glycynia clandestine
Glycynia soya
19.95, 6/95, 83/95, 166/98, 1050/11 | 5 диких популяцій | ВНДІ сої, м. Бла-говєщенськ, Росія
Вихідним матеріалом для досліджень у тварин були зразки крові (лейкоцити), у рослин– етиольовані проростки насіння. Тваринна та рослинна ДНК виділялася за методикою із використанням СТАБ.
Отримання мультилокусних ампліфікаційних спектрів проводилося згідно Zietkiewicz et al.,1991. Умови ПЛР для динуклеотидних праймерів включали початкову денатурацію при 95єС – 2 хв. і наступних 37 циклів : 95єС – 30 сек., 55єС – 30 сек., 72єС – 2 хв. 30 сек. Кінцевий синтез 72єС – 7 хв. Для тринуклеотидних праймерів використовувалися ті ж самі умови ампліфікації, за винятком температури підпалу – 58єС. Для ПЛР із праймерами до LTR соєвого ретротранспозону SIRE-1 витримувалися наступні умови: 95С – 2 хв. Та наступні 30 циклів: 94С – 30 сек., 58С – 30 сек., 72С – 2 хв. Кінцевий синтез 72С – 7 хв.
У роботі були використані 14 мікросателітних праймерів з ди- і тринуклеотидними субповторами, що мають якірні нуклеотиди (табл.2), а також 1 сайт-специфічний праймер до довгих кінцевих повторів соєвого ретротранспозону SIRE-1 із послідовностю: 5’-GCA CTT ATG CAA GTG GGA TCA GC-3’.
Таблиця 2
Використані в роботі мікросателітні праймери
праймер | 5'фланк | %GC | 3’фланк
(AC)9G | 5'-ACA CAC | 52% | CAC ACG-3'
(GA)9C | 5'-GAG AGA | 52% | AGA GAC-3’
(GT)10C | 5’-GTG TGT | 52% | TGT GTC-3’
(CT)9G | 5'-CTC TCT | 52% | TCT CTG-3’
(АСС)6 G | 5'-АСС ACC | 68% | CCA ССG-3'
(AGC)6G | 5'-AGC AGC | 68% | GCA GCG-3'
(AGC)6C | 5'-AGC AGC | 68% | GCA GCC-3’
(AGC)6Т | 5'-AGC AGC | 63% | GCA GCТ-3’
(TCG)6G | 5'-TCG-TCG | 68% | CGT CGG-3’
(CAC)7А | 5'- CAC CAC | 63% | ACC АСА-3’
(CAC)7Т | 5'- CAC CAC | 63% | ACC АСТ-3’
GT(CAC)7 | 5’-GTC ACC | 65% | ACC CAC-3'
(СТС)6А | 5’-СТС CTC | 63% | TCC ТСА-3'
(СТС)6С | 5’-СТС CTC | 63% | TCC ТСС-3'
Продукти ампліфікації розділяли методом электрофорезу в 2%-ному агарозном гелі з додаванням бромистого етидію і візуалізували під УФ променями. Для фотографування використовували плівку з високою роздільною здатністю Мікрат-300. Розміри фрагментів визначалися за допомогою маркеру молекулярних мас Step Ladder DNA S7025 (SIGMA).
Для обробки експериментальних даних були використані популяційно-біометричні методи, а також розроблена в дисертаційній роботі методика оцінки внутрішньопуляційної генетичної мінливості, основана на використанні сімейного аналізу поліморфізму і успад-кування ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів. При цьому припускали, що вони успадковуються згідно законів Менделя. Кожен продукт ампліфікації в спектрі розглядався як наявність домінантного алеля в окремому локусі.
Для розрахунків генетичних відстаней та побудови філогенетичних дендрограм було використано пакет програм Phylip 3.65. Термодинамічні показники олігодуплексів праймер-матрична ДНК (ДG – енергія Гибса, ДH – ентальпія, ДS – ентропія) було розраховано із використанням програми Oligonucleotide Properties Calculator Version 3.0.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Порівняльгий аналіз поліморфізму ISSR-PCR-маркерів в тваринних і рослинних геномах. За допомогою ISSR-PCR-маркерів було оцінено рівень генетичної мінливості у доместикованих і споріднених з ними диких представників тварин і рослин. Всього у 5-ти представників підродини Bovinae було виявлено 219 ISSR-PCR-локусів. Між дикими представниками підродини Bovinae і великою рогатою худобою не виявлено достовірної різниці за часткою поліморфних локусів (Р) і за часткою локусів з низькою частотою зустрічальності (ц<0,3) в спектрах усіх праймерів. Не відзначено також достовірної різниці між дикими представниками підродини і великою рогатою худобою за рівнем середньої гетерозиготності (Hav). Це свідчить про те, що рівень генетичної мінливості, який виявляється з використанням ISSR-PCR-маркерів, у диких представників підродини Bovinae є порівняним із рівнем генетичної мінливості у великої рогатої худоби (табл.3).
Таблиця 3
Показники генетичної мінливості у підродини Bovinae, виявлені з використанням мікросателітних праймерів
Праймери | Дикі представники підродини Bovinae | ВРХ
P | H av | ц<0,3 | P | H av | ц<0,3
(AGC)6G | 0,850 | 0,310 | 0,307 | 0,846 | 0,363 | 0,307
(AGC)6C | 0,758 | 0,286 | 0,380 | 0,842 | 0,302 | 0,320
(AGC)6T | 0,777 | 0,408 | 0,275 | 0,769 | 0,354 | 0,231
(ACC)6G | 0,805 | 0,391 | 0,153 | 0,842 | 0,338 | 0,210
(TCG)6G | 0,850 | 0,358 | 0,166 | 0,833 | 0,355 | 0,250
GT(CAC)7 | 0,870 | 0,402 | 0,388 | 0,833 | 0,346 | 0,083
(AC)9G | 0,714 | 0,301 | 0,233 | 0,777 | 0,285 | 0,333
(GA)9C | 0,777 | 0,341 | 0,250 | 0,777 | 0,288 | 0,277
(GT)10C | 0,785 | 0,319 | 0,240 | 0,777 | 0,327 | 0,285
(CT)9G | 0,833 | 0,304 | 0,166 | 0,555 | 0,317 | 0,111
Маркерні індекси (Мі) показали, що для представників підродини найбільш інформативними є спектри, отримані з використанням тринуклеотидних мікросателітних праймерів.
Серед дендрограм філогенетичних взаємовідносин, побудованих на основі розподілу алельних варіантів ISSR-PCR-локусів між проаналізованими видами підродини Bovinae, найбільшою мірою сучасним уявленням відповідала дендрограма, отримана із використанням маркерів, фланкованих тринуклеотидними мікросателітними послідовностями (рис.1,б), що ймовірно є наслідком різної еволюційної історії відповідних мікросателітних послідовностей в геномі представників підродини. При порівнянні дендрограм, що були побудовані із урахуванням розподілу алельних варіантів ISSR-PCR-локусів, отриманих із застосуванням різних праймерів, найбільш нестабільним виявилося положення виду Bibos gauros frontalis (гаял).
Рис.1. Дендрограми генетичних взаємовідносин між проаналізованими представниками підродини Bovinae, побудовані на основі генетичних дистанцій М. Нея, які було розраховано відповідно до розподілу алельних варіантів локусів, виявлених а) з використанням динуклеотидних праймерів (AC)9G, (CT)9G, (GA)9C і (GT)10 C; б) з використанням тринуклеотидних праймерів (AGC)6C, (AGC)6G, (AGC)6T, (ACC)6G та GT(CAC)7.
За аналізу генетичної мінливості видів сої з використанням методу ISSR-PCR виявлено 109 локусів, 84 з яких виявилися поліморфними (77%). Всього у культурних сортів було виявлено 74 амплікони, а у диких представників сої – 97. Незважаючи на це, рівень генетичного поліморфізму, виявлений з використанням ISSR-PCR-маркерів, отриманих із використанням 7-ми мікросателітних праймерів, у культурних і диких представників сої достовірно не відрізнявся як ні за жодним із праймерів, так і в цілому за сумою усіх виявлених ISSR-PCR-маркерів (табл. 4).
Таблиця 4
Показники генетичної мінливості у культурних і диких представників сої
Праймер | Сорти культурної сої | Види дикої сої | ц<0,3
P | Hav | P | Hav
(AGC)6C | 0,764 | 0,72 | 0,714 | 0,42 | 0,235
(AGC)6G | 0,500 | 0,43 | 0,705 | 0,46 | 0,250
(AGC)6T | 0,555 | 0,41 | 0,444 | 0,28 | 0,285
(TCG)6G | 0,375 | 0,42 | 0,769 | 0,54 | 0,307
(ACC)6G | 0,200 | 0,19 | 0,714 | 0,32 | 0,285
(GA)9C | 0,428 | 0,29 | 0,692 | 0,51 | 0,384
(AC)9G | 0,785 | 0,57 | 0,500 | 0,37 | 0,268
Не було також виявлено достовірної різниці між показниками генетичної мінливості у культурних сортів і диких представників сої, отриманими окремо за допомогою ди- і тринуклеотидних праймерів, а також між маркерними індексами три- та динуклеотидних праймерів.
Аналіз ампліфікаційних фрагментів у спектрах ампліфікації за їх молекулярною масою дав змогу виявити істотну різницю між ампліфікаційними спектрами великої рогатої худоби та диких представників підродини Bovinae. В спектрах диких тварин частка ампліконів з високою (більше 2000 пн.) та низькою молекулярною масою (до 1000 пн) істотно перевищувала відповідний показник у спектрах великої рогатої худоби (р<0,05). Відповідно, в спектрах великої рогатої худоби вищою була частка ампліконів із середньою (від 1000 пн до 2000 пн) молекулярною масою (Р<0,01). У сої основна відмінність між спектрами диких рослин і спектрами сортів спостерігалась за часткою ампліконів із високою молекулярною масою, яка у диких видів була вищою (р<0,05). В двох інших інтервалах частка ампліконів у диких і культурних рослин була порівнянною.
Аналізуючи спектри, отриманні із вкористанням окремо ди- і тринуклеотидних мікросателітних праймерів, у тварин виявлено достовірну різницю між часткою ампліконів з високою (більше 2000 пн.) та низькою (до 1000 пн) молекулярною масою (р<0,05). Зокрема, ці показники були вищими в спектрах тринуклеотидних праймерів. У рослин достовірних відмінностей між спектрами ди- та тринуклеотидних праймерів не виявлено.
Виявлено також достовірну різницю між спектрами тварин і рослин за часткою висококонсервативних локусів, які відтворювалися в спектрах у всіх вивчених видів. У рослин частка таких локусів значно нижча порівняно з тваринами (р<0,01). Це може свідчити про істотніші структурні відмінності між геномами диких і культурних рослин, ніж між геномами диких і доместикованих тварин, що, ймовірно, може бути пов'язаним із насиченням геному культурної сої повторюваними послідовностями, яке може супроводжувати доместикацію рослин. У тварин і у рослин серед висококонсервативних локусів спостерігали як моно-, так і поліморфні. Як у рослин, так і у тварин між спектрами, отриманими окремо з використанням ди- та тринуклеотидних праймерів, за показником частки висококонсервативних локусів достовірних відмінностей не виявлено.
Оцінка рівня селективної нейтральності ISSR-PCR та IRAP-PCR маркерів. З метою оцінки селективної нейтральності ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів виконано дослідження з виявлення генотоксичних ефектів хронічної дії низькодозового випромінювання у 3-х поколіннях модельної групи великої рогатої худоби, що відтворюється в умовах радіоактивного забруднення. Проведено порівняльний аналіз поліморфізму і успадкування алельних варіантів ISSR-PCR- та IRAP-PCR-локусів. У сумі використання 11-ти мікросателітних праймерів дало змогу виявити 162 ISSR-PCR-маркери, 134 з яких були поліморфними. З урахуванням всіх виявлених маркерів між проаналізованими поколіннями тварин не було виявлено достовірної різниці за часткою поліморфних локусів (Р), хоча за деякими праймерними системами було відмічено достовірні зміни як у дочірньому поколінні F1, так і в поколінні F2. За аналізу в поколіннях рівня гетерозиготності, розрахованого на основі сімейного аналізу (Hc), виявлено достовірні зміни цього показника за 8-ма праймерними системами із 11-ти використаних (табл.5).
Таблиця 5
Динаміка зміни розрахункової гетерозиготності (Нc) між поколіннями групи досліджених тварин ( P0,05, P0,01, P0,001)
Праймер | Розрахункова гетерозиготність (Нc)
F0 | F1 | F2
(AC)9G | 0,174 | 0,253 | 0,428
(GA)9C | 0,333 | 0,222 | 0,310
(CT)9G | 0,287 | 0,222 | 0,444
(AGC)6G | 0,243 | 0,310 | 0,538
(AGC)6C | 0,215 | 0,236 | 0,457
(ACC)6C | 0,287 | 0,202 | 0,525
(CTC)6C | 0,224 | 0,242 | 0,571
(CTC)6A | 0,607 | 0,370 | 0,571
(CAC)7A | 0,310 | 0,387 | 0,573
(CAC)7T | 0,228 | 0,249 | 0,356
GT(CAC)7 | 0,291 | 0,249 | 0,499
При зворотньому схрещуванні корів покоління F1 та батька (Урана) можна було б очікувати зростання інбридингу в поколінні F2. Таке схрещування має зумовлювати зростання інбридингу і зменшення гетерозиготності в поколінні F2 у порівнянні з гетерозиготністю в батьківських поколіннях (F0, F1). Однак аналіз експериментальних даних показав, що сумарно в спектрах усіх 11-ти праймерів в групі досліджених тварин виявлено достовірне збільшення розрахункової гетерозиготності в дочірньому поколінні F2 порівняно з поколіннями F0 і F1 (P0,001) (табл.6).
Таблиця 6
Розрахункова (Нс) та очікувана гетерозиготність (Hex) у поколіннях досліджуваних тварин, розраховані з використанням ISSR-PCR-маркерів ( P 0,001)
Показник | F0 | F1 | F2
Коефіцієнт інбридингу | 0 | 0 | 0,250
Очікувана гетерозигот-ність (Hex) | 0,2900,069 | 0,2900,069 | 0,2130,060
Розрахункова гетерозиготність (Нсalc) | 0,2900,069 | 0,2670,046 | 0,4410,079
У F0 як очікувану гетерозиготність (Hex) розглядали сумарну розрахункову за спектрами усіх праймерів і припускали, що вона має зберегтися в поколінні F1, оскільки в цьому поколінні коефіцієнт інбридингу дорівнює 0. У поколінні F2 коефіцієнт інбридингу дорівнює 0,250 і гетерозиготність, що спостерігається, мала б зменшитися від F1 приблизно на 25 %. Однак цього не відбувається, і в поколінні F2 розрахункова гетерозиготність статистично достовірно (Р<0,001) збільшується. Таке збільшення може свідчити про ймовірне пристосувальне значення гетерозигот у популяційно-генетичній відповіді на дію низькодозового іонізуючого випромінювання. Можна очікувати, що переважне відтворення гетерозигот у F2 реалізується як на рівні предзиготичної селекції гамет, так і внаслідок ранньої ембріональної смерті гомозигот.
Аналіз поліморфізму і успадкування 162 локусів не виявив нових продуктів ампліфікації, появу яких можна було б розцінювати як мутаційну подію (рис.2). Однак у потомстві відзначалося порушення рівновірогідного розподілу алельних варіантів локусів порівняно з батьківським поколінням. Аналіз очікуваної частоти зустрічальності домінантних алелів (fex) та частоти зустрічальності домінантних алелів, що спостерігається (fob) по поколіннях у досліджуваних родинах показав, що в більшості родин (у 6-ти з 8-ми) спостерігали достовірні відмінності між цими показниками (табл.7), причому в 4-х родинах такі зміни відбувалися вже в поколінні F1 .
Приклади спектрів продуктів ампліфікації (ампліконів) представлені на рис. 2
A 1 2 3 4 5 B 1 2 3 4 5 6 7
Рис.2. Спектри ампліконів, отримані для родини Бети із використанням праймерів: а)(CT)9G ( 1- 49, 2 - 178, 3- 113, 4 - 113, 5 - 175,); b) (ACC)6G (1- маркер, 2 - Уран, 3 - Бета, 4 -175, 5 - 113, 6 - 172, 7 - 49).
Таблиця 7
Очікувана частота зустрічальності домінантних алелів (fex) і частота, що спостерігається (fob) усереднена за всіма ISSR-PCR- локусами у кожній родині досліджуваної групи тварин
( P 0,05, P 0,01, P 0,001).
Родини | Покоління F1 | Покоління F2
fex | fob | fex | fob
Альфа | 0,490±0,40 | 0,546±0,041 | 0,421±0,038 | 0,368±0,037
Бета | 0,541±0,038 | 0,464±0,037 | 0,469±0,037 | 0,417±0,038
Гама | 0,490±0,040 | 0,546±0,041 | 0,560±0,038 | 0,393±0,037
6803 | 0,474±0,038 | 0,428±0,038 | 0,452±0,035 | 0,324±0,035
6824 | 0,519±0,041 | 0,366±0,040 | 0,408±0,040 | 0,382±0,040
6827 | 0,494±0,034 | 0,359±0,031
6843 | 0,477±0,039 | 0,353±0,038 | 0,400±0,038 | 0,351±0,037
4789 | 0,524±0,041 | 0,509±0,041
Імовірно, що у такий спосіб в умовах хронічної дії низькодозового випромінювання в групі досліджуваних тварин підтримується рівень генетичного поліморфізму, необхідний для розширення їх адаптивних можливостей.
Аналогічні зміни в генетичній структурі групи тварин було виявлено із використанням IRAP-PCR-маркерів. Серед 31 виявленого локусу 25 виявилися поліморфними. За аналізу показника частки поліморфних локусів (P) по поколіннях відзначалося його достовірне зменшення (P 0,001) у поколіннях F1 і F2 у порівнянні з поколінням F0 (табл.8).
Таблиця 8
Показники, які характеризують генетичну мінливість групи ВРХ, що відтворюється в зоні відчуження Чорнобильської АЕС, розраховані з використанням IRAP-PCR-маркерів
( P 0,05, P 0,01, P 0,001).
Показник | Покоління
F0 | F1 | F2
Розрахункова гетерози-готність (Hс) | 0,361±0,089 | 0,384±0,097 | 0,457±0,146
Очікувана гетерозигот-
ність (Hех) | 0,361±0,089 | 0,361±0,089 | 0,249±0,048
Коефіцієнт інбридингу | 0 | 0 | 0,25
Частка поліморфних локусів (P) | 0,935±0,031 | 0,548±0,063 | 0,483±0,063
Аналіз поліморфізму і успадкування IRAP-PCR-маркерів із урахуванням коефіцієнту інбридингу показав, що, як і в описаному вище випадку для ISSR-PCR-маркерів, у F2 розрахункова гетерозиготність (Нс) статистично вірогідно (Р<0,001) перевищує очікувану (Нех), замість того, щоб зменшитися від значення в поколінні F1 приблизно на 25 %.
Таким чином, обидва класи маркерів: і ISSR-PCR-маркери, що є фрагментами геномної ДНК, фланкованими локусами інвертованих мікросателітніх повторів, і IRAP-PCR-маркери, що являють собою ділянки ДНК між специфічними інвертованими послідовностями довгих кінцевих повторів (LTRs) соєвого ретротранспозону SIRE-1, дали змогу виявити в модельній групі тварин підвищення рівня гетерозиготності в поколінні F2 проти очікуваної, відповідно до коефіцієнту інбридингу. Отже, незважаючи на те, що у всіх дочірніх поколіннях модельної групи тварин відбувається схрещування з одним і тим самим бугаєм Ураном, в ній не спостерігається збільшення гомозигот, а, отже, зниження генетичної різноманітності.
Такі зміни, з одного боку, можуть свідчити про ймовірне пристосувальне значення гетерозигот у популяційно-генетичній відповіді на хронічну дію низькодозового іонізуючого випромінювання, з іншого боку – опосередковано відзеркалювати факт утрати спеціалізації. Порушення рівновірогідного розподілу алельних варіантів локусів порівняно з батьківським поколінням F0 вже у поколінні F1 підтверджує здатність генотипу КРС до швидкої адаптаційної перебудови у відповідь на дію нового фактору добору вже на міжгенераційному рівні.
Достовірні зміни рівня гетерозиготності та відхилення від розподілу батьківських алельних варіантів локусів у дочірніх поколіннях відповідно до законів Менделя, разом свідчать про те, що обидва типи маркерів не є селективно нейтральними.
Поліморфізм сортів сої. У роботі з паспортизації 13 сортів сої було використано 7 мікросателітних праймерів. У культурної сої загалом було виявлено 74 ISSR-PCR-локуси, 39 з яких були поліморфними (Р=52,7%) (табл.9).
Таблиця 9
Характеристика поліморфних ISSR-PCR-локусів у сортів сої
Праймер | Кількість полі-морфних локусів | Розміри ампліконів (пн) | Індекси
локусів
(AGC)6C | 14 | 400
550
600
650
700
800
850
900
950
1100
1150
1500
1550
1600 | A
B
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
О
(AGC)6G | 7 | 575
700
750
775
1200
1250
1700 | A
B
C
D
E
F
G
(AGC)6T | 5 | 350
450
550
600
1600 | A
B
C
D
E
(TCG)6G | 2 | 1400
1600 | A
B
(ACC)6G | 1 | 950 | A
(GA)9C | 3 | 1400
1500
1600 | A
B
C
(AC)9G | 7 | 650
1200
1300
1400
1500
1600
1700 | A
B
C
D
E
F
G
Серед 74 виявлених лише 4 локуси були сортоспецифічними, що становить лише 5,4 % від загальної кількості. У свою чергу частка локусів з низькою частотою зустрічальності у вибірці (ц<0,3) становила серед усіх виявлених 27,0 %, що для генотипування 13 сортів вважалося недостатнім. Тому для створення формул генотипів протестованих сортів сої в даній роботі були використані усі виявлені поліморфні ISSR-PCR-локуси.
Поліморфним локусам у спектрі кожного мікросателітного праймеру в порядку зростання їх молекулярної маси присвоєні індекси, позначені літерами латинського алфавіту. Кожному використаному мікросателітному праймеру відповідно були присвоєніі порядкові номери, позначені арабськими цифрами.
Формула генотипу кожного сорту сої, таким чином, включає перелік усіх виявлених у спектрах ампліфікації ДНК цього сорту поліморфних ISSR-PCR-локусів. Після порядкового номеру праймера в круглих дужках зазначена послідовність індексів, кожний з яких відповідає певному поліморфному ISSR-PCR-локусу (табл.10).
Табл.10
Формули генотипів протестованих сортів сої, розраховані з використанням ISSR-PCR-маркерів
Сорт | Формула паспорту
Харківська | 1(CFNO) 2(AE) 3(ABC) 6(AC) 7(DG)
Новосибірська | 1(ABCDEGIKO) 2(B) 3(ABCD) 6(C) 7(CDEF)
Кіровоградська | 1(DFHLO) 2(C) 3(A) 4(A) 6(AC) 7(CEF)
Колективна | 1(DEIMN) 2(E) 6(AC) 7(ACEF)
Білосніжка | 1(CDFIKM) 2(AE) 3(AE) 6(ABC) 7(BCFG)
Іскра | 1(CDEGIKLO) 2(BE) 3(AD)6(ABC) 7(ADE)
Юго-Западна | 1(CEMO) 2(A) 3(ADE) 6(ABC) 7(BCG)
Скороспєлка | 1(CEIO) 3(CD) 5(A) 6(A) 7(CEG)
Барвиста | 1(ABEMO) 2(BE) 3(E) 6(AB) 7(ACF)
S0512 | 1(ABDEFO) 2(E) 3(AD) 6(AC) 7(CEG)
Успіх | 1(CFMN) 2(G) 3(D) 6(BC) 7(ACE)
Крєпиш | 1(CEMO) 2(D) 3(D) 4(AB) 7(ACG)
Чарівниця | 1(ACEFMNO) 2(AB) 3(AD) 5(A) 7(ACF)
Кількість індексів в отриманих формулах генотипів коливається від 11 у сортів Скороспілка, Крєпиш і Успіх до 19 – у сорту Новосибірська. В середньому у кожній із 13 формул враховано по 42,19 % від усіх поліморфних локусів. Для створення переважної більшості формул генотипів сортів сої використано по 5 мікросателітних праймерів із 7-ми застосованних.У культурних і у диких рослин сої рівень поліморфізму IRAP-PCR-маркерів виявився досить низьким – всього 20 %, тому ці маркери не були використані для створення формул генотипів сортів сої. Дендрограми, побудовані із урахуванням розподілу алельних варіантів усіх виявлених ISSR-PCR- та IRAP-PCR-локусів дозволили згрупувати вивчені сорти сої у 4 основні кластери.
Залежність рівня поліморфізму ISSR-PCR-маркерів від характеристик фланкуючих їх мікросателітних локусів. Проведено кореляційний аналіз між показниками генетичної мінливості, розрахованими на основі експериментальних даних у рослин і тварин, з одного боку, та термодинамічними характеристиками олігодуплексів праймер-матрична ДНК, розрахованих із використанням програми Oligonucleotide Properties Calculator Version 3.07, з іншого боку. У культурних і у диких рослин сої рівень поліморфізму ISSR-PCR-маркерів виявився залежним від термодинамічних характеристик фланкуючих їх мікросателітних локусів, що відповідають олігодуплексам між праймерними послідовностями і матричною ДНК. Для культурних рослин сої цей зв’язок між ознаками носить характер зворотньої кореляції, а для диких рослин – прямої. Іншими словами, кореляційні зв’язки між однаковими проаналізованими ознаками у рослин сої на внутрішньовидовому і на міжвидовому рівнях відрізняються знаком кореляції (рис.3).
Рис.3. Графіки кореляції між показником частки поліморфних ISSR-PCR-локусів (Р) в спектрах у культурних (А) та диких (Б) рослин сої та ентальпії (ДH) олігодуплекса праймер-матрична ДНК (Інтервал довіри 95 %).
На підставі розрахованих кореляційних коефіцієнтів між виявленими достовірно пов’язаними ознаками, зокрема показником частки поліморфних локусів Р у культурних і диких рослин сої і такими термодинамічними характеристиками мікросателітних локусів, як ентальпія та ентропія (ДH і ДS), був проведений регресійний аналіз, що дозволив дістати математичний вираз залежності однієї ознаки від іншої. Були проаналізовані випадки з найвищим рівнем достовірності. У такий спосіб були розраховані коефіцієнти регресії, що дозволяють завчасно, при плануванні експерименту оцінити перспективність мікросателітних праймерів для роботи з геномною ДНК культурних і диких рослин сої. Зокрема,
Р j (cult)= 2,667- 0,013 x ДHj (1)
Р j (wild)=-0,361+ 0,006 x ДHj (2), де
Р j (cult) – частка поліморфних локусів в спектрах j-го праймера для сортів сої;
Р j(wild) – частка поліморфних локусів в спектрах j-го праймера для диких представників сої; ДHj – зміна ентальпії при утворенні олігодуплекса j-й праймер - матрична ДНК.
Для тварин підродини Bovinae найбільш поліморфними виявилися ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними локусами з найвищими показниками ентальпії (ДН) та ентропії (ДS). До цієї категорії серед проаналізованих належать лише тринуклеотидні мікросателітні локуси. Відповідна залежність для випадку з найвищим рівнем імовірності задається наступним співвідношенням:
Р j Bovinae = - 0,026+0,462 x ДS j (3), де
Р j Bovinae – частка поліморфних локусів в спектрах j-го праймера у представників підродини Bovinae,
ДS j – зміна ентропії (ДS) при утворенні олігодуплексу j-й праймер - матрична ДНК.
Виявлено, що як додатковий критерій добору праймерів для отримання високоінформативних ISSR-PCR-маркерів при вивченні геномів представників підродини Bovinae можна рекомендувати праймери з високими термодинамічними показниками їх 5’-фланків.
Проведено також кореляційний аналіз між значеннями середніх відхилень від очікуваного розподілу в потомстві частоти батьківських домінантних алелів (Dabs), з урахуванням зміни знака аналізованого показника, і характеристиками дуплексів праймер-матрична ДНК. Виявлено, що відхилення частоти домінантних алелів від очікуваної в поколінні F1 було тим значнішим, чим вищою або нижчою була термостабільність фланкуючих їх послідовностей. Це показує, що, по-перше, мікросателітні послідовності, які фланкують виявлені ISSR-PCR-локуси перебувають під селективним тиском добору, а по-друге, цей тиск проявляється з більшою імовірністю у відносно термостабільних мікросателітних послідовностях, та мікросателітних послідовностях із низьким рівнем термостабільності. Вираз такої залежності, отриманий із використанням регресійного аналізу, дав змогу розрахувати термодинамічні показники мікросателітних локусів, які є найбільш селективно-нейтральними. Зокрема, на рівні достовірності 95%, значення ентальпії, при яких Dabs j = 0, дорівнює:
ДНj=161,8±0,084 (4)
Серед використаних в роботі праймерів оптимально відповідає цій вимозі праймер (AC)9G, а також найближчі до нього за термодинамічними характеристиками праймери: (CTC)6C, (CTC)6A, (AGC)6C, та (AGC)6G, які можуть бути рекомендовані для аналізу філогенетичних взаємовідносин в підродині Bovinae як найнейтральніші до дії добору. Для оцінки внутрішньовидової та внутрішньопопуляційної генетичної мінливості, виходячи із формул (3) та (4), доцільно використовувати ISSR-PCR-маркери, фланковані високополіморфними мікросателітними локусами із високими термодинамічними характеристиками, до яких серед проаналізованих належать послідовності із субповторами (САС) та (АСС).Встановлено, що праймери (CT)9G, (GA)9C та (AGC)6T з низькими термодинамічними характеристиками, які також є чутливими до дії добору і краще відбивають найближчу генетичну історію виду, зважуючи на низький рівень поліморфізму ISSR-PCR-маркерів, які вони фланкують, доцільно використовувати для оцінки внутрішньовидової та внутрішньопопуляційної генетичної мінливості у комплексі із більш інформативними праймерами.
ВИСНОВКИ
1. Рівень генетичної мінливості за ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерами у диких та доместикованих представників підродини Bovinae у тварин та підродини Phaseoleae у рослин є порівняним. За ISSR-PCR- маркерами генетична мінливість і у тварин, і у рослин залежить від композиційних та термодинамічних характеристик локусів, які фланкують ці маркери.
2. Із застосуванням розробленої в дисертаційній роботі методики оцінки внутрішньопопуляційної генетичної мінливості, що ґрунтується на сімейному аналізі, вперше доведено, що ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркери, які раніше вважалися селективно-нейтральними, у тварин (велика рогата худоба) піддаються тиску добору.
3. У великої рогатої худоби тиску добору більшою мірою піддаються ISSR-PCR-маркери, які фланковані відносно термостабільними мікросателітними послідовностями (показник ентальпії ДНj>180 ккал/моль), а також мікросателітними послідовностями із низьким рівнем термостабільності (показник ентальпії ДНj<155 ккал/моль).
4. Найбільш нейтральними до дії добору і відповідно більш інформативними для виявлення філогенетичних взаємовідносин в підродині Bovinae є ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними локусами із середніми термодинамічними характеристиками, зокрема з показником ентальпії близьким до ДНj=161,8±0,084 ккал/моль.
5. У великої рогатої худоби за оцінки внутрішньопопуляційної мінливості доцільно використовувати високополіморфні ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними локусами із високими термодинамічними характеристиками (показник ентальпії ДНj>180 ккал/моль), оскільки вони більшою мірою дозволяють оцінити найближчу генетичну історію виду.
6. В групі великої рогатої худоби, що відтворюється в умовах хронічної дії низькодозового випромінювання, достовірно збільшується рівень гетерозиготності у дочірньому поколінні F2 порівняно з батьківським поколінням F0, що може свідчити про пристосувальне значення гетерозигот у популяційно-генетичній відповіді на дію низькодозового іонізуючого випромінювання.
7. З використанням ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів у дочірніх поколіннях групи великої рогатої худоби, що відтворюється в умовах хронічної дії низькодозового випромінювання, не виявлено подій, які можна було б розцінювати як мутаційні.
8. За паспортизації рослинних геномів критерії підбору мікросателітних праймерів для аналізу генетичної мінливості у культурних і диких рослин сої відрізняються: для визначення генотипів сортів сої доцільно застосовувати ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними локусами з низькими термодинамічними характеристиками (показник ентальпії ДНj<170 ккал/моль), а для оцінки диких видів сої – відповідно ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними локусами з високими термодинамічними характеристиками (показник ентальпії ДНj>170 ккал/моль).
РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ
1. Для підтримання характеристик породи в популяціях великої рогатої худоби, що відтворюється в умовах хронічної дії низькодозового випромінювання, необхідно враховувати здатність їх генотипу до швидкої адаптаційної перебудови вже на міжгенераційному рівні, що проявляється в підвищенні рівня гетерозиготності і, отже, у зниженні рівня спеціалізації породи.
2. При проведенні внутрішньопородньої та внутрішньопопуляційної оцінки генотипів великої рогатої худоби доцільно застосовувати найбільш поліморфні ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними повторами з високими термодинамічними характеристиками, зокрема мікросателітними субповторами (САС) та (АСС), що є чутливішими до
